샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상
2018년 1월 4일
이 프로토콜 전송 전자 현미경 검사 법이 부정적인 얼룩이 지기, 상세한 구조 및 면역-골드 라벨 exosomes에 특정 단백질의 위치를 확인 하려면 ultrathin 단면에 필요한 다양 한 기법을 설명 합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 정제된 세포외 소포체의 형태를 관찰하고 전자 현미경을 사용하여 세포외 소포체 내에서 특정 단백질 국소화를 수행하는 것입니다. 이 방법은 세포외 소포체 연구 기간의 주요 질문, 예를 들어 엑소좀 및 그 내부에 위치한 특정 단백질의 분류와 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 엑소좀 내부와 외부에 위치한 특정 단백질의 부분을 관찰하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.
이 기술의 의미는 암 및 박테리아 감염을 포함한 여러 질병의 진단을 보장하는 것입니다. 이 방법은 엑소좀에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 생물학적 샘플, 미세세포 배양 및 특정 단백질 국소화에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 개인은 면역금 입자의 비특이적 결합과 같은 오염을 일으키기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.
표준 기법을 사용하여 배양에서 엑소좀을 준비합니다. 그런 다음 HCT116 세포의 배양 상등액을 초원심분리하여 배지에서 엑소좀을 펠릿화합니다. 펠릿이 되면 배양 상등액을 조심스럽게 제거합니다.
정제된 엑소좀 펠릿을 고정하려면 PH 7.0의 0.1몰 솔듐 카코딜레이트 용액에 2.5%글루타르알데히드 1ml를 추가합니다. 지질 층별 소포를 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 정착액을 제거하고 펠릿을 0.1 몰 카코딜산 나트륨 완충 용액 1 밀리리터로 실온에서 10 분 동안 헹굽니다.
그런 다음 섭씨 4도에서 1시간 동안 1mL의 2% 오스뮴 테트록사이드로 샘플을 접붙입니다. 정착액을 제거하고 엑소좀 펠릿을 0.1몰 카코딜산 나트륨 완충액으로 3회 헹구고 10분마다 완충액을 교체합니다. 그런 다음 일련의 등급이 매겨진 아세톤 농도로 각각 10분 동안 흔들어 샘플을 탈수합니다.
다음으로, 세 부분의 아세톤과 한 부분의 저점도 임베딩 혼합물의 용액을 혼합합니다. 아세톤을 이 혼합물로 대체하고 샘플을 30분 동안 배양합니다. 저점도 매립 매체의 비율을 계속 증가시키고 각 단계마다 30분 동안 배양합니다.
마지막으로, 엑소좀 펠릿을 저점도 임베딩 혼합물의 100%에 실온에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 임베딩 몰드를 사용하여 샘플을 순수 저점도 임베딩 혼합물에 삽입하고 섭씨 65도에서 24시간 동안 굽습니다. 초박 절편기를 사용하여 60나노미터 두께의 절편을 준비합니다.
섹션을 니켈 그리드에 놓고 20분 동안 2% 우라닐 아세테이트로 일부를 이중 염색한 다음 10분 동안 구연산납으로 이중 염색합니다. 다음으로, 염색된 부분을 투과 전자 현미경에 넣고 80k볼트를 사용하여 샘플을 보고 노출 시간에 대한 자동 설정을 따릅니다. 엑소좀 이미지를 보고 현미경 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득하고 저장합니다.
먼저 60나노미터 두께의 염색되지 않은 절편을 50마이크로리터의 0.02몰 글리신 방울에 10분 동안 배양하여 유리 알데히드 그룹을 소멸시킵니다. 그런 다음 100마이크로리터의 증류수에 섹션을 각각 10분씩 3회 헹굽니다. 마지막 헹굼 후, 1%BSA가 함유된 PBS의 실온에서 절편을 1시간 동안 배양합니다.
그런 다음 50-100마이크로리터의 항-KRS 항체 방울에 그리드를 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 0.1%BSA가 함유된 PBS 한 방울에 각각 10분 동안 그리드를 5회 세척합니다. 그런 다음 그리드를 적절한 2차 항체 한 방울로 옮기고 실온에서 1시간 동안 절편을 배양합니다.
이제 그리드를 10분 동안 5회 세척하되 각각 0.1%BSA가 함유된 PBS를 별도로 떨어뜨립니다. 어둠 속에서 20분 동안 2% 우라닐 아세테이트로 섹션을 이중 염색한 다음 10분 동안 레이놀즈 납 시트레이트를 사용합니다. 염색된 부분을 투과 전자 현미경에 놓고 80k볼트를 사용하여 샘플을 보고 앞서 표시된 대로 이미지를 만듭니다.
음성 염색을 수행하려면 분리 후 정제된 엑소좀을 2%파라포름알데히드 1ml로 5분 동안 고정합니다. 얇은 폼바/탄소 필름으로 코팅된 200메시의 구리 EM 그리드를 1분 동안 글로우 방전으로 처리한 다음 그리드에 5-7마이크로리터의 엑소좀 현탁액을 로드하고 1분 동안 배양합니다. 엑소좀의 농도가 너무 높으면 농도를 적절한 수준으로 희석합니다.
즉시 EM 그리드 표면에 여과된 1% 우라닐 아세테이트 용액 약 20방울로 엑소좀을 염색합니다. 그리드 가장자리를 여과지와 접촉시켜 그리드에서 과도한 우라닐 아세테이트 용액을 제거한 다음 물 한 방울로 그리드를 빠르게 헹굽니다. 핀셋을 사용하여 테이블 위에 그리드를 놓고 배양 접시로 그리드를 부분적으로 덮습니다.
그리드를 실온에서 10분 동안 건조시킨 다음 그리드를 이미지화하거나 향후 관찰을 위해 전자 현미경 그리드 상자에 보관합니다. 얇은 formvar/carbon 필름 코팅된 200메쉬 구리 EM 그리드를 30초 동안 글로우 방전으로 처리하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 2% 파라포름알데히드 용액에 고정된 엑소좀을 5-7마이크로리터의 그리드에 넣고 5분 동안 배양합니다.
다음으로, PBS 100마이크로리터로 엑소좀을 10분씩 3회씩 헹굽니다. 엑소좀 함유 그리드를 50마이크로리터의 0.5몰 글리신 용액으로 10분 동안 처리하여 유리 알데히드기를 소멸시킵니다. 그런 다음 그리드를 1%BSA가 포함된 PBS 한 방울로 전송하고 30분 동안 차단합니다.
이제 50-100마이크로리터의 항-PD-L1 항체로 그리드를 실온에서 1시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 0.1%BSA가 함유된 PBS 5방울로 그리드를 각각 10분 동안 세척한 다음 그리드를 1시간 동안 2차 항체 한 방울로 옮깁니다. 다음으로, 0.1%BSA가 함유된 PBS 5방울로 그리드를 각각 10분 동안 세척한 다음 증류수 2방울로 그리드를 세척합니다.
완료되면 앞서 보여준 것처럼 2% 우라닐 아세테이트로 음성 염색을 수행하고 샘플을 이미지화하거나 향후 관찰을 위해 EM 그리드 상자에 보관합니다. 여기에서 관찰되는 엑소좀 형태는 음성 염색의 산물입니다. 이 엑소좀은 전형적인 컵 모양의 형태를 보여주는데, 이는 건조 과정에서 발생할 수 있는 인공물입니다.
엑소좀에서 특정 단백질의 위치와 같은 전체 마운트 면역금 염색을 사용하여 추가 정보를 얻을 수 있습니다. 여기서 흰색 화살표는 PD-L1의 위치를 나타냅니다. 단면화된 이미지에서 소포는 엑소좀의 구조적 특징으로 알려진 내강 구조를 보여주었습니다.
이들 역시 엑소좀에서 특정 단백질을 확인하기 위해 면역금으로 염색할 수 있습니다. 일단 숙달되면 면역금 염색 기법은 섬유질 세포에서 간단한 준비 및 절단을 거쳐 적절하게 수행될 경우 수행할 수 있습니다. 이 절차에 따라 이중 면역 염색과 같은 다른 방법을 수행하여 두 개의 서로 다른 단백질의 위치를 동시에 식별할 수 있습니다.
각 개발 후,이 기술은 생검에서 질병 진단을 탐색하기 위해 세포 외 소포체 분야에서 사용될 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 엑소좀 내의 특정 단백질 국소화를 확인하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 클로라이드레이트, 파라포름알데히드 및 오스뮴 테트록사이드와 같은 고정 용액으로 작업하고 있다는 것을 잊지 마십시오.사산화는 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 환기 흄 후드 및 라텍스 장갑과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.
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개요
이 프로토콜은 순수한 세포외 소포와 단백질 위치 확인에 중점을 두어 전자 현미경 기법을 설명합니다. 엑소좀 분류 및 이들이 포함하는 특정 단백질에 대한 이해를 높이는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 세포외 소포 연구
배경
- 세포외 소포는 세포 간 소통에서 중요한 역할을 합니다.
- 그들의 구조와 단백질 함량을 이해하는 것은 질병 진단에 필수적입니다.
- 전자 현미경은 소포의 형태에 대한 상세한 통찰력을 제공합니다.
- 특정 단백질의 위치는 그들의 기능적 역할에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.
연구 목적
- 세포외 소포의 형태를 관찰하기 위함입니다.
- 이 소포 내 특정 단백질을 위치 확인하기 위함입니다.
- 건강 및 질병 상태에서 엑소좀 생물학 이해에 기여하기 위함입니다.
사용된 방법
- 전자 현미경 기법.
- 시각화를 위한 음성 염색.
- 상세한 구조 분석을 위한 초박형 단면화.
- 특정 단백질 위치 확인을 위한 면역-금 라벨링.
주요 결과
- 순수한 세포외 소포의 상세한 형태가 관찰되었습니다.
- 엑소좀 내외부의 특정 단백질 위치 확인이 이루어졌습니다.
- 질병 상황에서 엑소좀의 역할에 대한 통찰력을 얻었습니다.
- 다양한 생물학적 샘플에 적용 가능한 방법론입니다.
결론
- 전자 현미경은 세포외 소포 연구에 효과적입니다.
- 특정 단백질 위치 확인은 엑소좀 기능에 대한 이해를 높여줍니다.
- 이 기법은 암과 같은 질병 진단에 영향을 미칠 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Transmission electron microscopy (TEM) enables high-resolution visualization of exosome morphology and specific protein localization, providing critical structural insights for target validation in extracellular vesicle research. This method supports mechanistic de-risking by confirming exosome identity and protein cargo, which are essential for biomarker development and therapeutic targeting. By delivering quantitative morphological and subcellular data, TEM enhances predictive confidence in preclinical models and informs go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through direct visualization of exosome morphology and protein localization.
- Operational Value: Provides biological de-risking by confirming exosome purity and structural integrity prior to functional assays.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by validating target engagement and subcellular protein distribution in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming exosome size, shape, and protein expression.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through ultrastructural characterization of extracellular vesicles.
- Screening Readiness: Highlights platform reuse potential for consistent compound evaluation in nanoparticle-based drug delivery studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through structural analysis of exosomes linked to cancer and bacterial infection contexts.
- Preclinical Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by linking exosome morphology to physiological status.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by verifying exosome biomarkers and protein cargo in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
TEM integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical work, enabling structural confirmation at each stage.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking via direct imaging of exosome ultrastructure.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through standardized negative staining and immuno-gold labeling protocols.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions, including vesicle size distribution and protein localization patterns.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment by linking exosome morphology to disease states such as cancer and infection.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, applicable across multiple extracellular vesicle studies and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in electron microscopy sample preparation and immunolabeling.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including TEM, ultramicrotome, and staining reagents.
- Cross-team standardization requirements for fixation, embedding, and antibody validation protocols.
- Adaptation considerations across model systems, including varying exosome sources and protein targets.
- Practical limitations supported by source material: risk of contamination and non-specific binding of immunogold particles during sample handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Exosome Block Preparation
3:38
Sectioning, Staining, and Imaging of the Exosome
4:27
Immuno-staining of Sections and Imaging
7:24
Whole Mount for Immunostaining
9:10
Results: Immunostained Exosome Sections Provide Insight to Their Protein Makeup
9:59
Conclusion
