태에서 Autophagy의 규제에 모성 비만과 관련 된 염증의 효과 연구 하는 기본 인간 Trophoblast 모델

이 영양막아세포 배양 모델의 전반적인 목표는 비만 관련 염증이 영양막아세포의 중요 경로 조절에 미치는 영향을 측정하는 것입니다. 이 제어 시스템의 주요 장점은 산모 비만의 맥락에서 TNF 알파 매개 염증과 태반의 유전자 조절 사이의 관계를 확립한다는 것입니다. 이 실험 시스템의 가장 큰 장점은 산모 비만의 맥락에서 TNF-알파 매개 염증과 태반의 유전자 조절 사이의 관계를 확립한다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Bailey Simon과 Matt Bucher입니다. 융모 조직은 분만 후 가능한 한 빨리, 가급적이면 30분 이내에 태반에서 샘플을 채취해야 합니다. 융모막판이 위를 향하게 하여 집게와 가위를 사용하여 태반 주변에서 2-3cm 안쪽으로 2-3개의 전체 두께 부분을 무작위로 절제합니다.

비정상적으로 보이는 태반 부위를 피한다. 융모막판과 기저판, 큰 혈관을 잘라냅니다. 생성된 융모 조직을 따뜻하고 완전한 배지에 놓습니다.

융모 조직 샘플링 후 30분 이내에 영양막 분리를 시작합니다. 실온 PBS로 채워진 50ml 원뿔형 튜브에 융모 조직의 각 조각을 넣고 부드럽게 저어 조직에 여분의 혈액을 방출합니다. PBS의 디캔트를 선택하고 새 PBS로 교체하십시오.

과도한 혈액이 대부분 제거될 때까지 PBS 헹굼을 반복합니다. PBS 헹굼은 조직이 완전히 헹궈질 때 연한 빨간색 또는 분홍색이 됩니다. 융모 조직을 멸균된 페트리 접시에 넣고 현미경 슬라이드를 사용하여 혈관에서 부드러운 융모 조직을 부드럽게 긁어내어 가능한 한 많은 혈관을 제거합니다.

가위를 사용하여 생성된 융모 조직을 잘게 다집니다. 다진 융모 조직을 트립신과 DNase의 특정 활성에 따라 계산된 부피에 따라 소화액이 있는 멸균 병으로 옮깁니다. 소화 병을 섭씨 37도의 수조에서 70rpm으로 35분 동안 흔들어 배양합니다.

35분 후 소화 병을 옆으로 기울이고 소화되지 않은 조직 조각이 병 바닥에 가라앉도록 합니다. 침전된 조직을 피하고 혈청학적 피펫으로 상등액을 조심스럽게 끌어냅니다. 100 미크론 세포 여과기를 통해 50 밀리리터 원뿔형 튜브 사이에 균등하게 상층액을 분배합니다.

남아 있는 침전 조직에 소화 용액을 추가하고 섭씨 37도의 수조에서 병을 배양하여 두 번째 소화를 시작합니다. 튜브 바닥에 있는 혈청학적 피펫에서 천천히 분주하여 첫 번째 소화 시 변형된 상등액 아래에 3-5ml의 신생아 송아지 혈청(NCS)을 부드럽게 층을 이룹니다. 영양아세포(trophoblast)와 NCS를 포함하는 변형된 상등액 사이의 반월판이 보여야 합니다.

NCS를 통해 상등액을 1, 250회 g, 20°C에서 15분 동안 원심분리한다. 생성된 펠릿에는 가장 낮은 층에 적혈구가 포함되고 영양막 세포가 포함된 흰색 층이 포함됩니다. 같은 방법으로 두 번째 및 세 번째 소화에서 상등액을 걸러냅니다.

변형된 상층액과 원심분리기 아래에 NCS를 1, 250회 g, 섭씨 20도에서 15분 동안 층을 이룹니다. 모든 상층액을 원심분리하고 NCS와 상층액을 제거한 후 각 펠릿을 5ml의 따뜻하고 완전한 배지에 다시 현탁시킨 다음 현탁액을 풀링합니다. 두 개의 50 밀리리터 원뿔형 튜브와 원심 분리기 사이에 세포 현탁액을 균등하게 나누고 섭씨 20도에서 15 분 동안 1, 250 회 g으로 원심 분리기를 나눕니다.

상층액을 부드럽게 제거하고 각 세포 펠릿을 6ml의 따뜻하고 완전한 배지에 다시 현탁시킵니다. 이 절차를 시작하려면 전달 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 4개의 밀도 구배 간에 균등하게 나누고 밀도 구배 위에 세포 현탁액을 천천히 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 최소 가속 및 감속으로 섭씨 20도에서 20분 동안 1, 250배 g의 밀도 구배를 원심분리합니다.

이것은 퇴적된 세포의 구별 가능한 띠를 생성해야 합니다. 영양막 세포를 포함하는 불투명 밴드에 도달할 때까지 밀도 구배 매체의 최상층을 천천히 조심스럽게 제거합니다. 영양막 밴드를 두 개의 50ml 원추형 튜브로 옮기고 따뜻하고 완전한 배지로 채웁니다.

튜브를 3-6회 부드럽게 뒤집어 혼합하고 섭씨 20도에서 15분 동안 1, 250회 g으로 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 각 세포 펠릿을 5ml의 따뜻하고 완전한 배지에 다시 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 결합하고 혈구계와 trypan blue를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다.

세포 계수 후 다음 단계는 세포를 플레이트하는 것입니다. 각 6개의 웰 플레이트에 웰당 300만 개의 세포를 플레이트로 만듭니다. 플레이트를 앞뒤로 그리고 좌우로 부드럽게 흔들어 세포를 고르게 분배합니다.

도금된 세포를 층류 통풍구에 약 30분 동안 그대로 두어 세포가 고르게 분포하고 침전되어 웰 바닥에 부착되기 시작할 수 있도록 합니다. 30분 후, 이산화탄소 5%와 습도 95%의 섭씨 37도 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다. 배양 24시간 후 현미경으로 영양막을 검사하여 부착과 적절한 영양막아세포 형태를 확인합니다.

세포는 배양 24시간 후에 처리할 수 있습니다. 세포에서 배양 배지를 흡입하고 웰당 2ml의 TNF 알파 보충 배지로 교체합니다. 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 다시 넣습니다.

TNF 알파 노출 24시간 후, TNF 알파 보충 배지를 완전한 배지로 교체합니다. 24시간 더 배양합니다. TNF 알파 제거 후 24시간이 지나면 배지를 흡인하고 실온 PBS로 세포를 부드럽게 헹굽니다.

갓 첨가된 프로테아제와 포스파타아제 억제제가 함유된 80마이크로리터의 얼음처럼 차가운 방사성 면역침전 분석 완충액을 각 웰에 직접 첨가합니다. 셀 스크레이퍼로 플레이트에서 셀을 제거합니다. 세포를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 치료 그룹 내에 웰을 모읍니다.

15초씩 최소 3회 간격으로 튜브를 높은 온도로 소용돌이쳐 세포를 얼음찜질합니다. 섭씨 4도에서 15분 동안 흔들면서 세포를 배양합니다. 튜브를 다시 높은 곳에서 소용돌이치십시오.

10, 000 시간 g에 분리기는 세포질 파편을 펠릿으로 만들기 위하여 4 섭씨 온도에 5 분 동안 이용한다. 상층액을 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 관심 단백질에 대한 Western blotting으로 분석할 때까지 세포 단백질 샘플을 섭씨 80도에서 보관하십시오.

72시간의 배양 후, 1차 영양막아세포에서 빨간색으로 표시된 사이토케라틴 7의 면역세포화학적 분석을 통해 세포가 다핵 세포 덩어리의 존재로 입증된 세포융합화를 겪었음을 확인했습니다. 더욱이, 역시 빨간색으로 표시된 비멘틴(vimentin)에 대한 면역세포화학적 분석에서는 오염성 섬유아세포가 거의 발견되지 않았습니다. 핵 카운터 염색은 두 이미지 모두에서 파란색으로 표시됩니다.

TNF 알파 처리는 밀리리터당 최대 250피코그램으로 루비콘 발현을 상향 조절했습니다. TNF 알파 농도가 밀리리터당 250피코그램 이상일 경우, 루비콘 발현 수준은 기준선으로 다시 감소했으며 심지어 그 이하로도 감소했습니다. 마찬가지로, 루비콘은 순수 대조군에 비해 여성 태아를 동반한 비만 임신에서 태반의 플래시 냉동 융모 조직 생검에서 유의하게 상향 조절됩니다.

일단 숙달되면, 융모 조직에서 영양막아세포를 분리하는 것이 적절하게 수행된다면 6-7시간 내에 완료될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 신중하고 효율적으로 작업할 수 있도록 재료와 시약을 미리 준비하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 세포 생물 에너지학을 측정하는 것과 같은 다른 분석을 수행하여 비만 자궁 내 환경의 염증이 영양막의 대사 능력에 영향을 미치는가와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 개발 방법은 태반 연구자가 영양막 기능에 대한 모계 환경의 영향을 확립할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청하면 세포 배양 실험을 위해 융모 조직에서 영양막아세포를 분리하는 방법과 영양막아세포의 중요 경로 조절에 대한 TNF 알파 매개 염증의 영향을 결정하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다. 인체 조직, 배양된 세포, DMSO, 아크릴아마이드 및 환원 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 PPE 착용 및 무균 기술 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.