선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

이 분석의 전반적인 목표는 모델 유기체인 C.Elegans에서 진균 감염의 영향을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 병원체 독성 인자, 숙주 면역 효과기 및 약물 발견과 같은 감염성 질환 분야의 주요 기계론적 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 두 가지 관점에서 숙주-병원체 상호 작용을 연구할 수 있는 실험적으로 다루기 쉬운 시스템이라는 것입니다.

빠르고 간편하며 비용 효율적인 시스템입니다. 이 특정 방법은 곰팡이 병원체에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 박테리아 또는 여러 유기체와 같은 다른 감염원에도 적용하여 살아있는 숙주에서 미생물 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 웜 픽을 만들려면 1.5cm 길이의 알루미늄 와이어 조각을 자른 다음 파스퇴르 피펫 끝에 약 0.5cm의 와이어를 조심스럽게 삽입하십시오.

분젠 버너 또는 알코올 램프를 사용하여 와이어가 피펫 팁의 원래 모양을 손상시키지 않고 파이펫에 단단히 부착될 때까지 화염 속에서 유리 파이펫 팁을 천천히 회전시켜 녹입니다. 마지막으로 집게를 사용하여 와이어 끝을 조심스럽게 구부려 작은 고리를 만듭니다. 많은 양의 웜을 새 플레이트로 빠르게 옮기려면 주걱을 사용하여 선택한 웜이 들어있는 NGM 한천 조각을 자릅니다.

그런 다음 절단된 조각을 제거하고 새 플레이트의 OP50 패치 가장자리에 앞면이 아래로 향하게 놓습니다. 웜을 개별적으로 옮기려면 웜 픽의 와이어가 빨갛게 될 때까지 화염을 피운 다음 화염에서 제거하고 몇 초 동안 식히십시오. 픽의 와이어를 사용하여 새 플레이트에서 자란 OP50 배양 패치를 부드럽게 긁어내어 픽의 와이어를 덮습니다.

와이어 끝을 덮고 있는 점성 배양은 벌레가 구덩이 끝에 달라붙게 만듭니다. 따라서 스와이프 동작을 사용하여 선택한 웜을 부드럽게 집습니다. 선택한 지렁이를 모으면 한천을 가로질러 배양물을 부드럽게 문질러 새 접시에 놓습니다.

그런 다음 와이어를 화염에 넣어 픽에 남아 있는 배양물을 제거합니다. 약 20마리의 성체 동물을 골라거나 덩어리로 만들어 50마이크로리터의 대장균 균주 OP50이 들어 있는 접시에 놓습니다. 하루에서 이틀 후에 난자를 모으려면 10ml의 M9 완충액으로 플레이트를 가득 채웁니다.

그런 다음 유리 혈청 피펫을 사용하여 한천 플레이트의 내용물을 휘젓고 부드럽게 교반하여 OP50에 달라붙은 성인 동물 또는 알을 방출합니다. 알과 성충이 들어 있는 모든 액체를 모으십시오. M9 및 OP50 용액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

튜브를 2, 100 x g에서 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 약 9ml의 상층액을 흡입합니다. 다음으로, 멸균수 2ml, 표백제 1ml, 0.25몰 수산화나트륨 1ml를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.

성체 동물의 약 70%가 용해된 것처럼 보일 때까지 반전으로 부드럽게 혼합합니다. 일반적으로 난자는 껍질 때문에 이 짧은 표백제 처리 중에 손상되지 않은 상태로 유지됩니다. 이 단계에서는 표백제에 대한 노출량을 제한하는 것이 중요합니다.

표백제에 장기간 노출되면 난자가 파괴됩니다. 계란 준비에 실패하면 표백제 노출 기간을 제한하거나 용액을 희석하십시오. 원뿔형 튜브를 990 x g에서 2분 동안 원심분리합니다.

펠릿을 방해하지 않고 상층액을 흡입하십시오. 그런 다음 펠릿을 10ml의 M9 버퍼에 재현탁시킵니다. 다시 회전하고 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 제거한 후 200마이크로리터의 M9 버퍼를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.

3-5밀리리터의 YPD를 멸균 시험관에 분주하고 멸균 루프를 사용하여 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 단일 콜로니를 접종합니다. 튜브를 섭씨 30도의 회전 드럼에 약 16-18시간 동안 놓습니다. 1.5 밀리리터 마이크로분리관 하나에는 C.albicans를 포함하고, 다른 하나는 OP50을 포함하도록 라벨을 붙인 다음 각 빈 튜브의 무게를 기록합니다.

하룻밤 사이에 배양된 C.albicans 배양 500마이크로리터를 C.Albicans라고 표시된 튜브로 옮깁니다. 그리고 1500 마이크로 리터의 OP50 배양을 OP50이라고 표시된 튜브에 넣습니다. 튜브를 16, 100 x g에서 10분 동안 원심분리한 다음 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 흡입합니다.

500마이크로리터의 멸균수를 사용하여 각 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 16, 100 x g에서 튜브를 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 흡입하십시오.

그런 다음 마이크로분리 튜브의 최종 중량을 기록합니다. 최종 중량에서 마이크로분리관의 초기 중량을 빼서 각 펠릿의 중량을 결정합니다. 멸균수를 사용하여 C.albicans 펠릿을 밀리리터당 10mg으로, OP50 펠릿을 밀리리터당 20밀리그램으로 재현탁합니다.

그런 다음 10 마이크로 리터의 50 밀리리터 당 스트렙토 마이신 용액, 2.5 마이크로 리터의 OP50 배양액, 0.5 마이크로 리터의 C.Albicans 배양 용액 및 7 마이크로 리터의 멸균 수를 결합하여 마스터 감염 믹스를 만듭니다.

대조판의 경우, C.albicans 배양량을 멸균수로 대체하여 마스터 믹스를 만듭니다. 그런 다음 마이크로피펫을 사용하여 20마이크로리터의 감염 혼합물 또는 OP50 제어 용액을 NGM 플레이트의 중앙에 시딩합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 계란을 준비한 후 해부 범위 아래에 있는 계란을 세십시오.

그리고 M9를 사용하여 마이크로리터당 약 5-6개의 건강한 계란 농도가 달성될 때까지 계란 용액을 희석합니다. 피펫을 사용하여 약 30개의 계란이 들어 있는 20마이크로리터 샘플을 박테리아 배양물과 플레이트 측면 사이의 준비된 NGM 플레이트에 분배합니다. 플레이트를 섭씨 20도에서 48시간 동안 배양합니다.

그런 다음 해부 현미경으로 각 판에 있는 살아있는 성충과 죽은 성충의 수를 세십시오.알루미늄 와이어로 머리를 두드리거나 접시를 두드려도 반응하지 않으면 동물의 죽음을 고려하십시오. 또한 Dar가 있는 벌레의 수를 세고 해부 현미경의 스테이지에 있는 플레이트를 빠르게 두드려 동물이 Dar를 가지고 있는지 확인합니다.

Dar가 없는 동물은 즉시 뒤로 이동하지만, Dar가 있는 동물은 방향을 바꾸기 위해 반복해서 탭해야 하거나 전혀 탭하지 않습니다. 격일로 남아 있는 성충을 골라서 새로운 감염 또는 대조판으로 옮깁니다. 이 시점에서 필요한 경우 매일 살아있는 벌레, 죽은 벌레 및 사라진 벌레의 수를 추적하여 생존 분석을 수행합니다.

최소한 이틀에 한 번씩 지렁이를 옮기는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 이 분석에서 점수가 매겨지는 성충이 자손에서 혼동되지 않도록 할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충은 6일 동안 C.albicans에 노출되어 감염 징후, 질병 진행 및 사망 징후를 관찰했습니다.

Dar 표현형은 생존 분석의 4일째에 가장 잘 보이며, 감염되지 않은 동물에서는 볼 수 없는 돌출된 항문 영역이 관찰됩니다. C.albicans에 감염된 기생충은 외음부 부위도 부종을 보이는 것으로 알려져 있습니다. 두 경우 모두 이 단계에 도달한 후에는 감염을 제거할 수 없습니다.

장 내강에서 C.Albicans의 집락화를 시각화하기 위해, 벌레는 RFP로 태그가 지정된 야생형 C.albicans를 먹여 집락 부위가 붉은색으로 형광을 발하게 했습니다. C.albicans는 분석 3일째까지 장 내강에 군집합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 감염된 기생충은 감염되지 않은 대조군에서 관찰된 것보다 더 심한 장 팽창을 보였습니다.

이 실험에서는 악성 C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1 이중 돌연변이에 의한 감염에서 살아남는 기생충의 능력을 테스트했습니다. 이중 돌연변이에 감염된 벌레는 대조군보다 통계적으로 유의하게 오래 산다. 이 두 유전자가 C.Elegans에 대한 C.albicans의 독성에 필요하다고 제안합니다.

일단 숙달되면이 기술의 각 부분은 지렁이의 수명 동안 매일 1-2 시간 안에 완료 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 감염원을 사용하고 있을 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 적절한 생물 안전 예방 조치를 취해야 합니다.

살아있는 숙주의 맥락에서 미생물 상호 작용을 연구하기 위해 추가 미생물 제제를 도입하는 것과 같이 이 기본 절차를 약간 수정할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 감염병 분야의 연구자들이 미생물 독성, 숙주 선천성 면역 반응 메커니즘 및 새로운 항균제의 발견을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 예쁜꼬마선충을 유지 및 조작하고 유기체를 사용하여 분자 수준에서 숙주 미생물 상호 작용을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

미생물 병원균 및 아지드화나트륨과 같은 화학 시약을 다루는 것은 위험할 수 있으므로 PPE 및 폐기물 처리 방법과 같은 적절한 안전 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.