Name: 선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 배우세요 선충 Caenorhabditis elegans를 이용한 진균 감염 관찰 방법으로 병원성 독성 인자와 숙주 면역 반응을 연구합니다. 이 실험은 감염성 질환 메커니즘 규명과 신약 개발에 활용됩니다.

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이 작품에서 수행 하 고 우스터 폴 리 테크닉 연구소에 의해 지원 되었다.

1. 선 충 류 성장 매체 (NGM)의 준비 <ol><li>대 1 L 미디어의 결합 20 g 한 천, 2.5 g 유기 질소 소스 (예:, bacto 펩), 그리고 3 세대 2 L 플라스 크에 염화 나트륨. 메 마른 물 975 mL을 추가.
	<li>추가 메 마른 저 어 바에서 <ol>입니다. 15 분;에 대 한 자동 미디어 pourer, 고압 배관 및 미디어를 사용 하는 경우 미디어 해야 압력가 마로 소독에 대 한 더 이상 높은 볼륨 이루어집니다.</li>
	</ol></li> <li>저 어 접시에 미디어를 설정 하 고 시원한 수.
	<ol><li>미디어 aseptically (약 60 ° C) 터치 따뜻한 되 면 추가 1 mL의 1 M MgSO 4 &#9679; H 2 O, 1 mL의 1 M CaCl 2, KPO 4, 25 mL 및 에탄올에 0.5% 콜레스테롤의 1 mL.</li>
		<li>붓고 미디어 (손으로 또는 자동 펌프) 층 류에서 35 m m x 10 m m 멸 균 페 트리 디쉬. 사용 하기 전에 1-2 일에 대 한 후드 건조 허용. 
		참고: 접시는 오염을 방지 하기 위해 4 ° C에 저장 되어야 합니다.</li>
	</ol></li></ol> 2. 웜 선택 만들기 <ol><li>알루미늄 와이어의 1.5 cm 조각 잘라. 신중 하 게 파스퇴르 피 펫의 끝에 삽입이 길이 약 0.5 c m.
	<ol><li>천천히 와이어는 안전 하 게 준수는 피 펫 피 펫 팁의 원래 모양에 타협 하지 않고 때까지 불꽃에 회전 하 여 유리 피 펫 팁을 녹여 분 젠 버너 또는 알콜 램프를 사용 하 여.</li>
	</ol></li></ol> 3. 대장균 문화 준비 <ol><li>Luria 국물 200 mL에 대장균 스트레인 OP50의 단일 식민지 접종 메 마른 루프를 사용 하 여. 37에 떨고 함께 밤새 품 어 ° c.</li>
	<li>액체 문화 사용한 다음 날 때 사용 중인 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다. 
	참고: 대장균 스트레인, OP50를 위한 음식 근원으로 사용 됩니다 C. 선 충. 이 문화에 대 한 사용할 수 있습니다 몇 개월 4에 저장 될 때까지 ° c.</li>
</ol> 4. 필수 C. 선 충 유지 보수 <ol><li>격판덮개의 센터에 준비 된 OP50 액체 문화의 약 50-100 µ L를 안보 여 NGM 대장균과 한 천 배지를 준비 하는 씨.</li>
	<li>접시를 커버 하 고 24 시간 실 온에서 건조 하도록 허용. 일단 건조, 접시 하룻밤 급속 한 성장에 대 한 37 ° C에 또는 느린 성장을 원하는 경우, 실내 온도에 유지.</li>
	<li>중 접시에 벌레를 추가 &#34; 청크, &#34; (프로토콜 단계 5 참조 &#34; 청크와 따기 웜 &#34;), 개별적으로, 벌레를 따기 또는 접시에 직접 웜 계란 배치 (프로토콜 단계 6을 참조 &#34; 계란 준비 &#34;).</li>
</ol> 5. 청크와 따기 웜 참고: &#34; 청크, &#34; C. 선 충 유지 보수에 공통 되는 연습을 말합니다. NGM agar 플레이트 웜, 포함 된 부분의 절단 하 고 또한 많은 과정에서 웜 전송 따라서 새로운 접시에이 조각을 전송, 포함 됩니다. 오염 또한 이와에서 접시에서 절단할 수 있습니다. 벌레를 따기는 agar의 무결성을 유지 하는 벌레는 agar에 구멍에서 손실 될 수 있기 때문에 중요 하다. 또한, 그것은 용 해는 agar 나 벌레를 방지 하기 위해 플레이트를 만지기 전에 냉각 선택 허용 하는 것이 중요.
<ol>많은 양의 새로운 접시에 벌레를 신속 하 게 전송 하려면 <li>NGM agar 주걱을 사용 하 여 선택한 웜 포함의 조각 잘라. 잘라 조각을 제거 하 고 그것에 게 아래로 얼굴을 배치 새로운 접시에 OP50의 잔디밭의 가장자리에.</li>
	<li>전송 프로토콜 단계 8.2에서 아래와 같이 개별적으로 웜 &#34; 생존 분석 결과, &#34; 벌레를 사용 하 여 선택. 때까지 빨간 벌레 선택에 와이어를 불꽃. 불꽃에서 그것을 제거 하 고 그것을 몇 초 동안 냉각 허용.</li>
	<li>선택에 와이어를 다루는 새로운 접시에 성장 하는 OP50 문화의 잔디밭을 긁어 부드럽게, 선택에는 와이어를 사용 하 여.</li>
	<li>점성 문화는 와이어의 끝을 다루는 게 벌레 선택의 끝에 막대기, 따라서 부드럽게 강타해 모션을 사용 하 여 선택한 웜 데리.</li>
	<li>선택한 벌레 수집 되 면 부드럽게는 agar에 걸쳐 문화를 강타해 새로운 접시에 그들을 놓습니다. 장소 선택에 남아 있는 문화를 제거 하는 화 염으로 와이어.</li>
</ol> 6. 계란 준비 <ol><li>따기 또는 청크 프로토콜 5 단계에 설명 된 대로 약 20 성인 동물 (20 ° C에서 성장 될 때 부 화 후 약 2-3 일) 장소 &#34; 청크와 따기 웜, &#34; 50 시드 접시에 E. 콜라가 긴장, OP50의 µ L.</li>
	<li>계란을 수집 하는 1-2 일 후 M9 버퍼의 10 mL와 함께 접시를 홍수. 유리 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 소용돌이 그리고 부드럽게 계란 OP50 또는 성인 동물에 붙어 출시를 한 접시에 내용을 선동. 계란과 성인을 포함 하는 모든 액체를 수집.</li>
	<li>M9 전송 및 OP50 솔루션으로 15 mL 원뿔 튜브. 2100 x g 2 분에 15 mL 원뿔 튜브 원심</li>
	<li>OP50 펠 렛을 방해 하지 않고 상쾌한의 약 9 mL를 발음.</li>
	<li>살 균 물 2 mL, 표 백제의 1 mL 및 0.25 M NaOH의 1 mL에 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>Lysed 성인 동물의 대부분 (약 70%)이 나타날 때까지 하는 반전으로 부드럽게 혼합; 일반적으로 계란 그대로 유지이 짧은 표 백제 처리 하는 동안 그들의 포탄 때문에. 990 x g 2 분에 원뿔 튜브 원심</li>
	<li>Aspirate 상쾌한은 펠 렛을 방해 하지 않고입니다. M9 버퍼의 10 mL에 펠 릿을 다시 중단.</li>
	<li>방해 펠 릿 없이 2 분 Aspirate 상쾌한 990 x g에 원뿔 튜브 원심. M9 버퍼의 200 µ L와 다시 일시 중단 공. 
	참고: 계란 준비 여러 실험 필요할 수 있습니다. 그들은 너무 오래를 위한 표 백제에 노출 된 경우 계란을 파괴 수 있습니다. 알이 부 화 하지 않습니다, 경우 표 백제 솔루션에서의 농도 감소 또는 감소 표 백제에 노출의 기간.</li>
</ol> 7. 감염 플레이트 설정 <ol><li>멸 균 시험관에 YPD의 3-5 mL를 분배 하 고 메 마른 루프를 사용 하 여 칸디 다 albicans에의 한 식민지와 예방.
	<ol><li>약 16-18 h 30에 대 한 회전 드럼에 튜브를 배치 ° c.</li>
	</ol></li> <li>라벨 1 개의 1.5 mL microfuge 관 C. albicans 및 다른 OP50를 포함 포함 하. 각 빈 관의 무게 기록.
	<ol><li>하룻밤 C. albicans 문화 관으로의 장소 500 µ L 표시 된 C. albicans (3.1 단계)에서 하룻밤 OP50 문화의 1500 µ L OP50를 표시 하는 튜브에.</li>
		<li>16100 g. Aspirate 상쾌한 방해 펠 릿 없이 x에서 10 분 원심 분리기.</li>
		<li>다시 살 균 물의 500 µ L 각 펠 릿을 일시 중단합니다. 16,100 x g.에서 5 분 동안 원심 분리기</li>
		<li>Aspirate 상쾌한은 펠 렛을 방해 하지 않고입니다. Microfuge 관의 최종 무게 기록.</li>
		<li>최종 무게에서 microfuge 관의 초기 무게를 빼서 각 펠 릿의 무게를 결정.</li>
	</ol></li> <li>살 균 수를 사용 하 여 다시 일시 중단 10 mg/ml, C. albicans 펠 릿 및 200mg/mL에 OP50 펠 릿. 스의 50 mg/mL 해결책의 10 µ L, OP50 문화의 2.5 µ L, 0.5 µ L의 C. albicans 문화, 및 살 균 물 7 µ L를 결합 하 여 믹스 마스터 감염 확인.
	<ol><li>컨트롤 플레이트, 살 균 물 C. albicans 문화의 볼륨을 대체 하 여 마스터 믹스 만듭니다. 감염 믹스 또는 OP50는 micropipette를 사용 하 여 NGM 센터 플레이트에 제어 솔루션의 20 µ L 씨. 
		참고: 약 100 웜 분석 중 통계적 의미를 확인 하기 위해 필요 합니다. 이 분석 결과 3 중에서 일반적으로 실행 됩니다. 따라서, 감염 믹스 x 3.2 뿐만 아니라 제어 솔루션 x 3.2 이루어집니다. 이러한 믹스 약간 넘는 3 전체 20 µ L 오류를 위한 공간을 허용 하는 각 접시에 시드는 되도록 원래 배 되도록 만들어집니다. 이 마스터 믹스 벌레의 인 두 너무 작으면 초기 애벌레 단계 (L1-L3) C. albicans 소비 때문에 만들어집니다. 에 대 한 노출 fluconazole ( 그림 3B) 같은 약리 에이전트, 에이전트는 감염 혼합물에 소개 된다. 에이전트의 농도 경험적으로 결정 됩니다. 그러나 예를 들어 그림 3B, 50 µ M에서에서 0, 12.5, 25, 50, 100 µ M Fluconazole 했다 또한 Fluconazole 표시 됩니다 동일한 프로토콜을 사용 하 여 테스트.</li>
	</ol></li></ol> 8. 항문 영역 변형 (Dar) 표현 형 및 생존 분석 결과의 분석 <ol><li>시각화 Dar 형 참고: Dar L3 단계에서 그리고 저쪽에 최고의 시각 이다. 스 웜 ( 그림 2A), 시간이 지남에 따라 더 저명한 되는 게시물 항문 지역에 작은 돌출으로 선물 한다.
	<ol><li>확인 동물에 신속 하 게 해 부 현미경의 스테이지에 접시를 활용 하 여 다 르, 스 지 없이 동물 스와 동물 것 해야 하는 동안 즉시 뒤로 이동 하는 경우 반복 반대로 그들의 방향 또는 그들은 도청의 라운드 그렇게을 모두 할 것입니다.</li>
	</ol></li> <li>생존 분석 결과 <ol><li>완료 계란 준비 프로토콜 6 단계에서 앞에서 설명한 &#34; 계란 준비 &#34;. 계산 절 개 범위에서 계란 그리고 µ L 당 약 5-6 건강 한 계란의 농도 달성 될 때까지 M9 계란 솔루션을 희석. 세균성 문화 접시의 측면 사이 지역에서 준비 NGM 접시에 약 30 계란을 포함 하는 20 µ L 샘플 분배를 피 펫을 사용 하 여 (달걀과 벌레 음식, OP50, 두 가지 점이에 있다).</li>
		<li>품 20 ° c에서 48 h에 대 한 번호판입니다. 해 부 현미경 아래 스와 벌레의 수 뿐만 아니라 각 접시에 라이브와 죽은 성인 벌레의 수를 계산 합니다. 스와 % 기록.</li>
		<li>머리에는 알루미늄 와이어 또는 도청에 의해 도청 되 고 응답 하지 않으면 죽은 동물을 고려.</li>
		<li>다른 매일 전송 나머지 어른 벌레 따기 프로토콜 5 단계에 설명 된 대로 &#34; 청크와 따기 웜, &#34; 새로운 감염 또는 컨트롤 플레이트에. 이 시점에서 필요한 경우 수행 생존 분석 결과 매일 라이브, 죽은, 그리고 누락 된 벌레의 수를 추적 하 여. 
		참고:이 분석 결과 수 있습니다 실행 2 주 동안, 계란 준비 시작. 또한, 계란 솔루션 해야 하지 수 적절 세균성 문화에 솔루션은 OP50를 죽 일 수 있는 백제의 흔적을 포함 수 있습니다. 솔루션 또한 있어야를 적절 하 게는 플레이트의 가장자리에서 약 0.5 c m로 계란 접시와는 agar의 측면 사이 갇혀 될 수 있습니다. 또한, 벌레의 급속 한 확산으로 인해 새로운 접시에 성인 전송은 그들의 자손에서 그들을 분리 하는 중요 한.</li>
	</ol></li> <li>생존 분석 <ol><li>생존 곡선 분석 소프트웨어를 사용 하 여 결과 분석 (재료의 목록 참조).</li>
		<li>비교 생존 곡선 Grehan Breslow Wilcoxon 메서드를 사용 하 여 (가정 하 초기 생존 시대에서 데이터는 최신 시간 보다 정확, 체중 데이터 따라) 뿐만 아니라 Logrank 통계 도구 45. 
		참고: 예를 들어 그림 4B에서 -C, C. albicans의 돌연변이로 치료 하는 벌레의 생존은 그에 비해 isogenic 야생-타입 컨트롤 또는 complementarystrains 치료.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

우리가 설명 하는 C. albicans 에 일생 노출 C. 선 충 감염 및 생존 시 금 하는 방법 다른 병원 체를 테스트를 수정할 수 있습니다. 다른 세균 이나 곰 팡이의 액체 문화 만든 하 고 비슷한 방식으로 C. 선 충 을 먹이 수 있습니다. 또한, 직렬 감염 분석 될 수 있습니다 설명, 한 병원 체에 애벌레를 먼저 노출 하 고 다음 성인 기에 도달 후 별도 병원 체를 포함 하는 새로운 접시에 동물을 전송 하 여.
이 분석 결과 수행 하는 동안 그것은 타이밍에 주의 깊은 관심을 지불 하는 것이 중요입니다. 첫째, 분석 결과 대 한 알을 수확 하기 위해 계란 준비를 완료 하는 때 그것은 계란 표 백제에 노출 되는 시간의 양을 제한 하는 중요 한. 계란을 풀어 표 백제 솔루션에서 성인을 분해 하는 데 필요한 시간의 양은 다릅니다. 표 백제 솔루션을 관리, 직후 웜 솔루션 해 부 현미경 밀접 하 게 지켜 수 해야 합니다. 벌레의 약 ...

C. 선 충 50 년 이상에 대 한 강력한 모델 생물으로 사용 되었습니다. 1960 년대, 남아 프리 카 공화국 생물학자 시드니 브 레너 선 충에서 세포 및 동물 생물학의 다양 한 측면을 연구 과학자의 긴 계보에 대 한 방법을 포장 신경 개발 공부 C. 선 충 의 사용을 개척. 크레이그 멜로 앤드류 불 그들의 RNAi 작업1에 대 한, 로버트 Horvitz 및 기관 발달에 apoptosis2,3,4, 그들의 작품에 대 한 존 Sulston 마틴 챌 노벨상 수 상자를 포함 하는이 계보 녹색 형광 단백질5에 그의 작품은. 이 모델 생물 전통적으로 지난 15 년 동안 분자 및 발달 생물학을 공부 하는 데 사용 되었습니다, 비록 연구원 C. 선 충 녹을 포함 하 여 다양 한 인간의 병원 균의 생물학 조사를 사용 하 여 시작 녹 농 균, 황색 포도상구균, 살 모 넬 라 enterica, Serratia marcescens6,7,8,,910. 이 연구 결과 밝혀 많은 인간 병원 체 상호 작용에 관련 된 메커니즘의 보존은 또한 선 충, 하지만에서이 모델 생물11,12에 고유한 일부 면역 메커니즘이 있습니다. 자연 속에서 C. 선 충 에서 다양 한 위협 으로부터 섭취 한 병원 체는 토양에 존재 하 고이 진화 하 고 그것의 창 자 루멘에 세련 된 타고 난 면역 체계를 유지 하는 강한 선택적인 압력을 제공 했다. 유전자 및 창 자 루멘의 보호에 관련 된 메커니즘의 대부분은 또한 높은 포유류11,13에 존재 하는 높은 보존 요소에 의해 조율 된. C. 선 충 은 따라서 살 모 넬 라 enterica14, Shigella boydii15또는16 비 브리 오 콜레라같이 위장 병원 체를 공부 하기 좋은 모델을 나타냅니다.
여기 우리는 C. albicans같은 전염 성 요원 연구 모델 호스트로 C. 선 충 의 놀라운 다양성을 강조 표시 합니다. C. 선 충 모델 호스트 저렴 하 고 일반적으로 칸디 다42를 공부 하는 데 사용 되는 마우스 모델 보다 시간이 소요 되는 독성에 대 한 높은 처리량 검열 수 있습니다.
이 연구에서 우리는이 모델 및 assosiated 생존 분석 결과 사용할 수 있는 안정적으로 호스트 타고 난 면역 이펙터 중화 감염, 독성, 드라이브 병원 체 결정 하는 중요 한 공부에 대 한 표시 및 약리 화합물 수 있는 병 인에 개입. 앞에서 설명한 분석 실험에 비슷하지,이 방법은 죽음43,44만 성인 보다는 성인, 애벌레 단계에서 동물의 일생 동안 공부 하는 병원 체에 노출의 수단을 제공 합니다. 요약 하면, 우리의 C. 선 충 - C. albicans 모델 뿐만 아니라 감염 및 면역 유전 기초 연구 뿐만 아니라 치료 적 개입에 대 한 새로운 화합물을 식별 사용할 수 있는 다양 하 고 강력한 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>한천(과립, 세균 등급)</td><td>Apex BioResearch 제품</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 와이어(95% Pt, 32 게이지)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss 도립 현미경</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans strain Bli-3</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤, 시그마 등급, 최소 99%</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>일회용 배양 튜브(20 x 150mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경(NI-150 고강도 조명기)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software)</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Miller's)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher</td><td>Scientific 10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Medium Petri Dish (35 X 10 mm)</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>353001 인산칼륨 일염기성</td><td>시그마</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>야생형 C. 알비칸스 SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>야생형 C. 예쁜꼬마선충</td><td>Caenorhabditis Genetics</td><td>Center N2</td><td></td></tr></tbody></table>

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

모델 호스트 꼬마 선 충 을 사용 하 여 미생물의 상호 작용을 공부 하는 방법을 설명 합니다. 미생물은 소장 질환에 대 한 기본 위치를 만드는 다이어트를 통해 소개 합니다. 선 충 장 구조상으로 그리고 기능적으로 포유류 창 모방 이며 투명 한 식민의 현미경 연구 의무가 만들기. 여기 우리가 병원 체 질병과 죽음을 발생할 수 있습니다 보여줍니다. 변경 된 독성을 나타내는 미생물 돌연변이 식별할 수 있습니다. 생물 스트레스를 보존된 타고 난 응답은 C. 선 충 호스트 타고 난 면역 상호 작용의 측면을 우수한 시스템. 우리는 듀얼 산화 효소 유전자에 있는 돌연변이와 호스트 반응성 산소 종 생성 수 없습니다 및 미생물 모욕을 저항할 수 없습니다 보여줍니다. 추가 제시 생존 분석 결과의 다양성 미생물 성장 억제제의 효과 연구에 사용할 수 있습니다 표시 하 여 설명 합니다. 이 분석 결과 또한 새로운 항진균 제의 개발에 대 한 대상으로 곰 팡이 독성 요소를 발견 하 고 더 호스트-미생물 상호작용을 폭로 하는 기회를 제공 사용할 수 있습니다. 이 분석 결과의 디자인 잘에 빌려준다 높은 처리량 전체 게놈 스크린을, 나중에 사용할 곳을 알아내는-보존 웜 수 하면 공부 비용 효과적이 고 매력적인 전체 동물 모델.

병 인 분석 결과 (그림 1) C. albicans 및 C. 선 충 을 사용 하 여 이전 우리의 실험실17,18 및20다른 연구소19,의해 설명 하고있다. C. 선 충 C. albicans 셀 벌레에 의해 신속 하 게 섭취 하 고 느린 운동을 일으키는 창 자 루멘에 축적을 보여주는 C. albicans 독성 연구를 사용 하 여 적중이 시연 항문 변형 지역 (Dar) (그림 2A), (그림 2B) 외 음부의 붓기, 고 소장 (<...

여기, 선물이 미생물 상호 작용을 공부 하는 다양 한 호스트 모델로 선 충 류 꼬마 선 충 .

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

이 분석의 전반적인 목표는 모델 유기체인 C.Elegans에서 진균 감염의 영향을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 병원체 독성 인자, 숙주 면역 효과기 및 약물 발견과 같은 감염성 질환 분야의 주요 기계론적 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 두 가지 관점에서 숙주-병원체 상호 작용을 연구할 수 있는 실험적으로 다루기 쉬운 시스템이라는 것입니다.빠르고 간편하며 비용 효율적인 시스템입니다. 이 특정 방법은 곰팡이 병원체에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 박테리아 또는 여러 유기체와 같은 다른 감염원에도 적용하여 살아있는 숙주에서 미생물 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 웜 픽을 만들려면 1.5cm 길이의 알루미늄 와이어 조각을 자른 다음 파스퇴르 피펫 끝에 약 0.5cm의 와이어를 조심스럽게 삽입하십시오.분젠 버너 또는 알코올 램프를 사용하여 와이어가 피펫 팁의 원래 모양을 손상시키지 않고 파이펫에 단단히 부착될 때까지 화염 속에서 유리 파이펫 팁을 천천히 회전시켜 녹입니다. 마지막으로 집게를 사용하여 와이어 끝을 조심스럽게 구부려 작은 고리를 만듭니다. 많은 양의 웜을 새 플레이트로 빠르게 옮기려면 주걱을 사용하여 선택한 웜이 들어있는 NGM 한천 조각을 자릅니다.그런 다음 절단된 조각을 제거하고 새 플레이트의 OP50 패치 가장자리에 앞면이 아래로 향하게 놓습니다. 웜을 개별적으로 옮기려면 웜 픽의 와이어가 빨갛게 될 때까지 화염을 피운 다음 화염에서 제거하고 몇 초 동안 식히십시오. 픽의 와이어를 사용하여 새 플레이트에서 자란 OP50 배양 패치를 부드럽게 긁어내어 픽의 와이어를 덮습니다.와이어 끝을 덮고 있는 점성 배양은 벌레가 구덩이 끝에 달라붙게 만듭니다. 따라서 스와이프 동작을 사용하여 선택한 웜을 부드럽게 집습니다. 선택한 지렁이를 모으면 한천을 가로질러 배양물을 부드럽게 문질러 새 접시에 놓습니다.그런 다음 와이어를 화염에 넣어 픽에 남아 있는 배양물을 제거합니다. 약 20마리의 성체 동물을 골라거나 덩어리로 만들어 50마이크로리터의 대장균 균주 OP50이 들어 있는 접시에 놓습니다. 하루에서 이틀 후에 난자를 모으려면 10ml의 M9 완충액으로 플레이트를 가득 채웁니다.그런 다음 유리 혈청 피펫을 사용하여 한천 플레이트의 내용물을 휘젓고 부드럽게 교반하여 OP50에 달라붙은 성인 동물 또는 알을 방출합니다. 알과 성충이 들어 있는 모든 액체를 모으십시오. M9 및 OP50 용액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다.튜브를 2, 100 x g에서 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿을 방해하지 않고 약 9ml의 상층액을 흡입합니다. 다음으로, 멸균수 2ml, 표백제 1ml, 0.25몰 수산화나트륨 1ml를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.성체 동물의 약 70%가 용해된 것처럼 보일 때까지 반전으로 부드럽게 혼합합니다. 일반적으로 난자는 껍질 때문에 이 짧은 표백제 처리 중에 손상되지 않은 상태로 유지됩니다. 이 단계에서는 표백제에 대한 노출량을 제한하는 것이 중요합니다.표백제에 장기간 노출되면 난자가 파괴됩니다. 계란 준비에 실패하면 표백제 노출 기간을 제한하거나 용액을 희석하십시오. 원뿔형 튜브를 990 x g에서 2분 동안 원심분리합니다.펠릿을 방해하지 않고 상층액을 흡입하십시오. 그런 다음 펠릿을 10ml의 M9 버퍼에 재현탁시킵니다. 다시 회전하고 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 제거한 후 200마이크로리터의 M9 버퍼를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.3-5밀리리터의 YPD를 멸균 시험관에 분주하고 멸균 루프를 사용하여 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 단일 콜로니를 접종합니다. 튜브를 섭씨 30도의 회전 드럼에 약 16-18시간 동안 놓습니다. 1.5 밀리리터 마이크로분리관 하나에는 C.albicans를 포함하고, 다른 하나는 OP50을 포함하도록 라벨을 붙인 다음 각 빈 튜브의 무게를 기록합니다.하룻밤 사이에 배양된 C.albicans 배양 500마이크로리터를 C.Albicans라고 표시된 튜브로 옮깁니다. 그리고 1500 마이크로 리터의 OP50 배양을 OP50이라고 표시된 튜브에 넣습니다. 튜브를 16, 100 x g에서 10분 동안 원심분리한 다음 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 흡입합니다.500마이크로리터의 멸균수를 사용하여 각 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 16, 100 x g에서 튜브를 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 흡입하십시오.그런 다음 마이크로분리 튜브의 최종 중량을 기록합니다. 최종 중량에서 마이크로분리관의 초기 중량을 빼서 각 펠릿의 중량을 결정합니다. 멸균수를 사용하여 C.albicans 펠릿을 밀리리터당 10mg으로, OP50 펠릿을 밀리리터당 20밀리그램으로 재현탁합니다.그런 다음 10 마이크로 리터의 50 밀리리터 당 스트렙토 마이신 용액, 2.5 마이크로 리터의 OP50 배양액, 0.5 마이크로 리터의 C.Albicans 배양 용액 및 7 마이크로 리터의 멸균 수를 결합하여 마스터 감염 믹스를 만듭니다.대조판의 경우, C.albicans 배양량을 멸균수로 대체하여 마스터 믹스를 만듭니다. 그런 다음 마이크로피펫을 사용하여 20마이크로리터의 감염 혼합물 또는 OP50 제어 용액을 NGM 플레이트의 중앙에 시딩합니다. 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 계란을 준비한 후 해부 범위 아래에 있는 계란을 세십시오.그리고 M9를 사용하여 마이크로리터당 약 5-6개의 건강한 계란 농도가 달성될 때까지 계란 용액을 희석합니다. 피펫을 사용하여 약 30개의 계란이 들어 있는 20마이크로리터 샘플을 박테리아 배양물과 플레이트 측면 사이의 준비된 NGM 플레이트에 분배합니다. 플레이트를 섭씨 20도에서 48시간 동안 배양합니다.그런 다음 해부 현미경으로 각 판에 있는 살아있는 성충과 죽은 성충의 수를 세십시오.알루미늄 와이어로 머리를 두드리거나 접시를 두드려도 반응하지 않으면 동물의 죽음을 고려하십시오. 또한 Dar가 있는 벌레의 수를 세고 해부 현미경의 스테이지에 있는 플레이트를 빠르게 두드려 동물이 Dar를 가지고 있는지 확인합니다.Dar가 없는 동물은 즉시 뒤로 이동하지만, Dar가 있는 동물은 방향을 바꾸기 위해 반복해서 탭해야 하거나 전혀 탭하지 않습니다. 격일로 남아 있는 성충을 골라서 새로운 감염 또는 대조판으로 옮깁니다. 이 시점에서 필요한 경우 매일 살아있는 벌레, 죽은 벌레 및 사라진 벌레의 수를 추적하여 생존 분석을 수행합니다.최소한 이틀에 한 번씩 지렁이를 옮기는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 이 분석에서 점수가 매겨지는 성충이 자손에서 혼동되지 않도록 할 수 있습니다. 예쁜꼬마선충은 6일 동안 C.albicans에 노출되어 감염 징후, 질병 진행 및 사망 징후를 관찰했습니다.Dar 표현형은 생존 분석의 4일째에 가장 잘 보이며, 감염되지 않은 동물에서는 볼 수 없는 돌출된 항문 영역이 관찰됩니다. C.albicans에 감염된 기생충은 외음부 부위도 부종을 보이는 것으로 알려져 있습니다. 두 경우 모두 이 단계에 도달한 후에는 감염을 제거할 수 없습니다.장 내강에서 C.Albicans의 집락화를 시각화하기 위해, 벌레는 RFP로 태그가 지정된 야생형 C.albicans를 먹여 집락 부위가 붉은색으로 형광을 발하게 했습니다. C.albicans는 분석 3일째까지 장 내강에 군집합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 감염된 기생충은 감염되지 않은 대조군에서 관찰된 것보다 더 심한 장 팽창을 보였습니다.이 실험에서는 악성 C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1 이중 돌연변이에 의한 감염에서 살아남는 기생충의 능력을 테스트했습니다. 이중 돌연변이에 감염된 벌레는 대조군보다 통계적으로 유의하게 오래 산다. 이 두 유전자가 C.Elegans에 대한 C.albicans의 독성에 필요하다고 제안합니다.일단 숙달되면이 기술의 각 부분은 지렁이의 수명 동안 매일 1-2 시간 안에 완료 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 감염원을 사용하고 있을 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 적절한 생물 안전 예방 조치를 취해야 합니다.살아있는 숙주의 맥락에서 미생물 상호 작용을 연구하기 위해 추가 미생물 제제를 도입하는 것과 같이 이 기본 절차를 약간 수정할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 감염병 분야의 연구자들이 미생물 독성, 숙주 선천성 면역 반응 메커니즘 및 새로운 항균제의 발견을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 예쁜꼬마선충을 유지 및 조작하고 유기체를 사용하여 분자 수준에서 숙주 미생물 상호 작용을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.미생물 병원균 및 아지드화나트륨과 같은 화학 시약을 다루는 것은 위험할 수 있으므로 PPE 및 폐기물 처리 방법과 같은 적절한 안전 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

야생 Caenorhabditis 선충은 많은 미생물과 연관됩니다, 종종 창 자 루멘에서 또는 창 자를 감염. 이 프로토콜은 도어 큐티클의 저항을 활용하여 내장을 식민지화하는 헤아릴 수없는 미생물을 풍부하게하는 방법을 자세히 설명합니다.

장내 미생물군유전체 박테리아를 위해 농축하는 야생 케노르하비티스 선충제의 선택적 세척

microsporidian 기생충 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 웜이 동일한 병원균에 매우 저항력이있는 자손을 생산할 수있게합니다. 이것은 유전 된 면역의 예이며, 잘 이해되지 않는 후성 유전 적 현상입니다. 본 프로토콜은 유전적으로 견인성 웜 모델에서 유전된 면역의 연구를 기술한다.

Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection에서 유전 된 면역 연구

세포 외 박테리아와 오르세 바이러스 및 미세 포자충 (곰팡이)과 같은 세포 내 병원체를 포함한 장내 미생물은 종종 야생 Caenorhabditis 선충류와 관련이 있습니다. 이 기사에서는 C. elegans 선충류에 서식하는 미생물을 검출 및 정량화하고 실험실에서 통제 된 감염 후 병원체 부하를 측정하기위한 프로토콜을 제시합니다.

RNA 형광 제자리 혼성화(FISH)를 통해 Caenorhabditis elegans 장에서 미생물 집락화 및 감염을 시각화합니다.

이 프로토콜은 외부 박테리아를 제거하기 위해 감기 마비 및 표면 표백에 이어 박테리아 식민지화 된 Caenorhabditis elegans의 96-well 파괴를 설명합니다. 생성 된 현탁액은 한천 플레이트에 도금되어 많은 수의 개별 웜에서 박테리아 부하의 정확하고 중간 처리량 정량화를 허용합니다.

단일 웜 데이터를 사용하여 예쁜꼬마선충-박테리아 상호작용의 이질성 정량화

Caenorhabditis elegans 는 생물학의 주요 모델 종 중 하나이지만 거의 모든 연구는 자연적으로 관련된 미생물이없는 상태에서 수행됩니다. 여기에 설명 된 방법은 미래의 기능적 C. elegans 연구의 기초로서 관련 미생물의 다양성에 대한 이해를 향상시키는 데 도움이 될 것입니다.

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

퇴비 소우주는 자연에서 발견되는 미생물 다양성을 실험실로 가져와 Caenorhabditis elegans의 미생물 군집 연구를 용이하게합니다. 여기에는 소우주 실험을 설정하기위한 프로토콜이 제공되며, 실험은 환경 미생물 다양성과 벌레 장내 미생물 구성 간의 관계를 탐구하기 위해 환경 미생물 다양성을 조절하는 능력을 보여줍니다.

Caenorhabditis elegans의 마이크로바이옴 연구를 위한 미생물적으로 다양하고 자연과 유사한 환경으로서의 소우주를 퇴비화

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 은 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 유도하는 분자 결정 요인을 조사할 수 있는 강력한 모델입니다. 우리는 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 생리학의 주요 측면과 함께 장내 마이크로바이옴 집락화의 단일 동물 수준을 프로파일링하는 고처리량 파이프라인을 제시합니다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 장내 마이크로바이옴의 정량화 및 분석을 위한 유동 지렁이 측정법의 적용

여기에서는 ImageJ와 같은 이미지 분석 소프트웨어에서 후속 사용을 위해 광시야 현미경 이미지에서 개별 웜의 자동 분할을 위해 개발한 딥 러닝 시스템인 SegElegans를 효과적으로 활용하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 온라인과 오프라인 모두에서 시스템을 사용할 수 있는 방법을 제공합니다.

SegElegans를 사용한 C. elegans 형광 이미지의 자동 분석

유전자 Ustilago이 maydis 검댕 곰팡이 조작에 우리는 강력한 유전자 교체 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 감염 표현형을 조사하기 위해 삭제 돌연변이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 형광 표지 단백질을 코딩하는 서열을 추가하여, 예를 들어, 임의의 방법으로 유전자를 수정하도록 확장 될 수있다.

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

배우세요 선충 Caenorhabditis elegans를 이용한 진균 감염 관찰 방법으로 병원성 독성 인자와 숙주 면역 반응을 연구합니다. 이 실험은 감염성 질환 메커니즘 규명과 신약 개발에 활용됩니다.

선 충 꼬마 선 충-모델을 다양 한 비보에 호스트-미생물 상호작용 연구

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