감염 성병 제조 및 방지를 위한 Griffithsin 수정 섬유 장비의 특성

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 양의 항바이러스 단백질인 Griffithsin을 사용하여 폴리락트산, 코글리콜산, 전기방사 섬유를 제작하고 표면 변형하는 것입니다. 이 방법은 HIV-1과 같은 성병 바이러스 감염을 예방할 수 있는 새로운 전달 매체를 공식화하고 특성화하는 방법과 같은 약물 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Griffithsin의 항바이러스 활성이 섬유 표면의 고도로 국소화된 Griffithsin에 대한 고정 골격으로 고분자 전기 방사 섬유를 사용하여 극대화된다는 것입니다.

이 기술의 의미는 다양한 감염 유형에 대한 Griffithsin의 강력한 예방 및 치료 잠재력 때문에 다른 바이러스 및 박테리아 감염 치료로 확장됩니다. 이 방법은 HIV-1 감염 예방에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, Griffithsin이 효능을 입증한 다른 바이러스 또는 박테리아 감염과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 720mg의 50/50 PLGA를 10ml 섬광 사악병에 넣으십시오.

혈청학적 유리 피펫을 사용하여 3.0ml의 HFIP를 첨가합니다. 사악한 것을 플라스틱 필름으로 덮으십시오. 그런 다음 사악한 덩어리를 측정하고 기록합니다.

폴리머 현탁액을 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하여 폴리머의 완전한 용해를 보장합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전기 방사 장치를 준비합니다. 3밀리리터 주사기를 사용하여 폴리머 용액을 흡입합니다.

그런 다음 뭉툭한 18게이지 0.5인치 바늘 끝을 주사기에 연결합니다. 바늘의 빈 머리 공간을 제거하기 위해 여분의 용액을 분배하십시오. 주사기를 주사기 펌프에 놓고 기기 유량을 시간당 2.0밀리리터로 설정합니다.

주사기 바늘에 전원을 연결합니다. 양의 27 킬로 볼트의 전압을 사용하여 폴리머 용액을 전기 스핀합니다. 전체 용액을 전기적으로 회전시킨 후 전원을 끕니다.

맨드릴이 추가로 30분 동안 회전하여 용매를 완전히 증발시키도록 합니다. 그런 다음 회전하는 맨드릴 수집기를 끕니다. 면도날을 사용하여 맨드릴에서 섬유를 부드럽게 벗겨냅니다.

전기로 방사된 PLGA 섬유를 라벨이 붙은 페트리 접시에 모읍니다. 접시를 밤새 건조제에 넣어 잔류 용매를 제거하십시오. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PBS 및 MES 솔루션을 준비합니다.

그런 다음 냉동실에서 EDC와 NHS를 꺼냅니다. 실온과 평형을 이루도록 그대로 두십시오. 그런 다음 EDC 4mg을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.

NHS 6mg의 무게를 다른 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 각 튜브에 1ml의 MES 버퍼를 추가합니다. 시약이 완전히 용해되도록 두 튜브를 격렬하게 소용돌

그런 다음 70mg의 하이드록실아민을 50ml 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다. PBS 20밀리리터를 넣고 소용돌이치십시오. 적당량의 PLGA 광섬유를 15ml 원추형 원심분리기 튜브에 대량으로 넣습니다.

광섬유에 8ml의 MES 버퍼를 추가합니다. 다음으로, EDC 및 NHS 솔루션 1ml를 추가합니다. 플라스틱 필름을 사용하여 15ml 원추형 원심분리기 튜브를 밀봉합니다.

튜브를 회전자에 올려 실온에서 15분 동안 용액을 부드럽게 뒤집습니다. 그런 다음 14마이크로리터의 베타-메르캅토에탄올을 첨가하여 반응을 소멸시킵니다. 완전한 혼합을 위해 튜브를 여러 번 뒤집습니다.

상층액을 버리고 세탁할 때마다 10ml의 PBS를 사용하여 PLGA 섬유를 두 번 헹굽니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 튜브에 적절한 양의 GRFT 스톡 용액을 추가합니다. 그런 다음 최종 부피가 8밀리리터가 되도록 충분한 PBS를 추가합니다.

철저한 혼합을 위해 튜브를 닫고 뒤집으십시오. 플라스틱 필름으로 튜브를 밀봉하십시오. 튜브를 회전자에 올려 놓고 2시간 동안 용액을 부드럽게 뒤집습니다.

그 후, 제조된 히드록실아민 용액 2ml를 첨가하고 30초 동안 볼텍싱하여 반응을 소멸시킵니다. 상등액을 버리십시오. 표면 변형 PLGA 섬유를 10 밀리리터의 초순수를 사용하여 두 번 헹구고 각 세척마다 와류를 헹굽니다.

다음으로, 세척된 섬유를 페트리 접시에 옮깁니다. 섬유가 완전히 마를 때까지 페트리 접시를 데시케이터 내부에 놓습니다. 그런 다음 페트리 접시를 섭씨 4도에서 보관하십시오.

먼저 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브 3개를 준비합니다. 각각 2mg의 섬유질을 덩어리로 만듭니다. 그런 다음 각 튜브에 1ml의 DMSO를 추가합니다.

섬유를 완전히 녹이기 위해 실온에서 1분 동안 와류를 치십시오. 그 후, 10 마이크로 리터 분취액을 TE 완충액에 100 배 이상 희석합니다. Eliza로 특성화를 로드할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

5-10mg의 표면 변형 섬유의 무게를 측정하여 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 배치된 섬유 질량을 기록합니다. 다음으로, 각 샘플의 생리학적 환경을 모방한 용액 1ml를 추가합니다.

200 RPM 및 37°C의 회전 셰이커에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 그 후, 탈착된 GRFT를 포함하는 용액을 약 1ml씩 제거하고 클러스터 튜브로 분취합니다. 단백질 정량화를 수행할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

그런 다음 샘플을 새 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 1ml의 신선한 완충 용액을 추가하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다음 시점까지 배양합니다. 이 연구에서는 PLGA 전기 방사 섬유를 제조하기 위한 조건을 조사합니다.

블랭크, 0.05 나노몰, 0.5 나노몰 및 5 나노몰 GRFT 섬유의 SEM 분석은 GRFT 변형이 섬유 형태에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 모든 구조물은 약 1.9미크론의 유사한 평균 직경을 갖는 것으로 보이며, 이는 배치 전반에 걸쳐 수정된 제조 공정의 일관성을 보여줍니다. 그런 다음 전기 방사 섬유에 접합된 GRFT의 양이 결정됩니다.

5 나노몰 변형에는 373 나노그램의 GRFT가 포함되어 있는 반면, 0.5 및 0.05 변형에는 각각 165 및 42가 포함되어 있습니다. 이는 더 높은 이론적 표면 변형 밀도로 접합된 섬유가 섬유에 더 많은 GRFT가 접합된다는 것을 보여줍니다. 그러나 결과 conjugation efficiency에서 역 상관 관계를 볼 수 있습니다.

다음으로, 섬유에 공유 접합된 GRFT의 양을 평가합니다. 처음 4시간 이내에 5나노몰, 0.5나노몰 및 0.05나노몰 이론적 변형 농도에서 각각 5나노몰, 0.5나노몰 및 0.05나노몰 이론적 변형 농도에서 전기방사 섬유 밀리그램당 113나노그램, 25나노그램 및 10나노그램의 GRFT가 검출됩니다. 4시간 후, 세 가지 제형 모두에 대한 방출 용리액에서 무시할 수 있는 GRFT가 검출됩니다.

이 데이터는 대부분의 GRFT가 전기 방사 섬유에 공유 결합되어 있고 표면 흡수 GRFT가 처음 4시간 이내에 방출됨을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 약 4일 안에 완료할 수 있습니다. 고분자 섬유 골격을 전기 방사하는 것은 고분자 용액을 준비하고 전기 방사하는 데 2일이 걸립니다.

반면, 표면 개질, 후속 건조 및 섬유 특성화에는 최소 이틀이 더 필요했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 최적의 변형을 보장하기 위해 시약의 적절한 비율을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 적절한 섬유 형태를 보장하기 위해 electospinning 매개변수가 올바른지 확인하는 것도 중요합니다.

개발 후, 이 기술은 약물 전달 분야의 연구자들이 섬유 내에 항바이러스제를 캡슐화할 뿐만 아니라 섬유 표면을 통해 활성 제제를 결합할 수 있는 능력을 가진 전기 방사 섬유를 제작할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 고분자 섬유를 전기방사하는 방법, 항바이러스 단백질인 Griffithsin으로 섬유의 표면 변형을 수행하는 방법, 섬유에 접합된 Griffithsin의 질적 변형을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. HFIP, 베타-메르캅토에탄올, EDC 및 NHS와 같은 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

이 절차를 수행하는 동안 PPE의 적절한 적용 및 화학 흄 후드 사용과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.