Name: 감염 성병 제조 및 방지를 위한 Griffithsin 수정 섬유 장비의 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 배우세요 Griffithsin을 이용한 PLGA 전기방사 섬유의 표면 개질 방법을 통해 HIV-1 감염을 예방하는 약물 전달 시스템을 개발하는 기술입니다. 이 기법은 다양한 바이러스 감염 치료에 활용될 수 있습니다.

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우리는이 연구 자금에 대 한 우수성에 대 한 유태인 유산 기금에 감사입니다. 우리 닥터 스튜어트 윌리엄스 II 전기 시스템의 사용을 아낌없이 제공 감사. 우리는 또한 Griffithsin를 제공에 대 한 박사 케네스 팔 머 감사 합니다. 우리는 또한 박사 노부유키 마토 바와 그의 연구소 GRFT ELISA에서 작동 하는 훈련에 대 한 감사 합니다.

1. 준비 및 제조 Electrospun 섬유 발판의 주의: 화학 증기 두건 .에 용 매 또는 폴리머 솔루션으로 모든 작업을 수행 해야 프로토콜을 시작 하기 전에 각 시 약의 물질 안전 데이터 시트를 참조.
<li><ol>Electrospin 3 mL 15 %w / w PLGA 폴리머 솔루션에 무게의 50: 50 폴 리 (유산 공동 glycolic 산) 720 mg (PLGA; 0.55 0.75 dL/g, 31-57 kDa) 10 mL 섬광 유리병에. 솔루션의 볼륨은 현재 연구에 사용 되는 일반적인 일괄 처리 크기에 따라. 
	참고: 폴리머 질량 주어진된 양의 용 매를 추가 하는 폴리머를 분해 하는 데 사용 하는 용 매에의 밀도 확인 하 여 계산 되어야 합니다. 용 매 Hexafluoro-2-프로 판 올 (HFIP)의 조밀도 1.59 g/mL 이다. 따라서, 용 매, 무게 4.8 g (3.0 x 1.59 g/mL)는 3.0 mL HFIP 필요의 볼륨에 따라. 15 %w / w HFIP PLGA의 일부분, 720 mg PLGA 3.0 mL HFIP (0.15 x 4800 mg = 720 mg)에 추가 되어야 합니다. %W / v, 보다는 오히려 %w / w 폴리머/솔루션을 사용 하 여의 장점은이 마지막 해결책의 정의 무게를 제공 합니다. 이 정의 된 무게 1.3 단계 용 매 증발의 경우 더 정확한 용 매 대체 가능.</li>
	<li>추가 3.0 mL HFIP 유리 섬광 유리병 (에서 단계 1.1) PLGA를 포함 하는 혈 청 학적인 유리 피 펫을 사용 하 여. 플라스틱 필름, 유리병 커버 다음 측정 하 고 기록 유리병 미사</li>
	<li>는 폴리머의 완전 한 해체를 위해 37 ° C에서 하룻밤 폴리머 정지 품 어. 어떤 용 매 증발, 유리병 질량 감소 추가 HFIP 유리병 단계 1.2에서에서 원래 질량에 도달할 때까지.</li>
	<li>인큐베이션, 후 준비 전기 장치 ( 그림 2 A). 모든 규모의 맨 드릴을 사용할 수 있습니다, 비록 여기 회전 25 mm 외부 직경 스테인리스 굴대는 수집기로 사용 되었다. 
	참고: 큰 맨 드릴 직경 전기 솔루션의 동일한 볼륨을 주어 섬유 두께 줄일 것 이다.</li>
	<li>폴리머 솔루션 3 mL 주사기로 발음.</li>
	<li>무딘 18 게이지, ½ 인치 바늘 팁 주사기를 연결 하 고 바늘 팁에서 빈 headspace 제거 초과 솔루션 (일반적으로 0.25 mL) 분배.</li>
	<li>주사기 주사기 펌프에 놓고 2.0 mL/h. 악기 유량 설정 
	참고:이 유량은 이전 기반 최적화이 대 한 폴리머 점도.</li>
	<li>폴리머 솔루션 +27의 전압을 사용 하 여 주사기 바늘과 electrospin에는 전원 연결 kV. 바늘 및 수집기 사이의 거리는 대략 25 cm ( 그림 2 B)로 설정 되어야 합니다. 
	주의: 전기 프로세스 용 매 증기를 만듭니다. 증기 두건 또는 밀폐 장치 ( 그림 2)를 사용 하 여 유해한 증기 .을 제거</li>
	<li>전체 솔루션 electrospun 일단 전원 끄고 완전히 용 매를 증발 하는 추가 30 분에 대 한 회전 심 봉 수.</li>
	<li>차례 회전 심 봉 수집기와 곡 괭에서 섬유를 잘라 면도날을 사용 하 여. 블레이드를 사용 하 여 곡 괭에서 섬유를 부드럽게 껍질.</li>
	<li>레이블이 페 트리 접시에 electrospun PLGA 섬유를 수집 하 고 잔여 용 매를 제거 하는 desiccatorovernight에.</li>
</ol> 2. GRFT 섬유의 표면 수정 <ol><li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 2-(N-morpholino)의 준비 솔루션 ethanesulfonic 산 (MES 버퍼). 8 g NaCl, KCl 0.2 g, 1.44 g Na 2 HPO 4 및 0.24 g KH 2 포 4 초순 물 1 L에 용 해 하 여 PBS를 준비 합니다. 마찬가지로, 19.52 g MES (무료 산, MW 195.2) 분해 및 29.22 g MES 버퍼 준비 초순 물 1 L에 NaCl. 각 솔루션의 최종 pH는 7.2-7.5 5.0-6.0, 각각, pH 미터를 사용 하 여 확인 하십시오.</li>
	<li>EDC (2 mM) 및 보 건국 (5mm)의 개별 작업 솔루션 준비.
	<ol><li>EDC와 보 건국 냉장고에서 제거 하 고 무게 전에 실내 온도에 equilibrate 수.</li>
		<li>1.5 mL microcentrifuge 관으로 EDC의 4 밀리 그램 무게.</li>
		<li>다른 microcentrifuge 관으로 NHS의 6 밀리 그램 무게.</li>
		<li>추가 1 mL MES 버퍼 각 튜브입니다. 소용돌이 시 약을 보장 하기 위해 적극적으로 모두 튜브 완전히 해산.</li>
	</ol></li> <li>Hydroxylamine 솔루션 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 70 밀리 그램 무게에 의해 준비.</li>
	<li>20 mL PBS hydroxylamine와 추가 해산 소용돌이.</li>
	<li>15 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 PLGA 섬유의 적절 한 금액을 질량. 일반적으로, 섬유의 75 mg는 각 반응 일괄 처리에 사용 됩니다.</li>
	<li>15 mL 튜브에 MES 버퍼의 8 mL을 추가.</li>
	<li>추가 1 mL 각 관에 앞서 준비 EDC와 보 건국 솔루션의. 솔루션의 최종 볼륨 10 mL 이어야 한다. EDC와 보 건국의 최종 농도 0.4 mg/mL 및 0.6 mg/mL, 각각 이어야 한다.</li>
	<li>가까이 플라스틱 필름 및 실내 온도 ( 그림 3 B)에서 15 분 동안 부드럽게 반전에 솔루션을 수 있도록 회전에 15 mL 튜브를 봉인. 이 단계는 GRFT 단백질 ( 그림 3 A)와 공유 수정 있도록 폴리머에 carboxyl 그룹 활성화.</li>
	<li>활성화, 후 신중 하 게 튜브에 β-mercaptoethanol의 14 µ L을 추가 하 여 반응을 끄다. 완전 한 혼합 되도록 여러 번 튜브를 반전. 
	주의: β-mercaptoethanol은 매우 독성 및 화학 증기 두건에서 사용 해야 합니다.</li>
	<li>는 상쾌한 삭제 하 고 10 mL PBS, 모든 나머지 β-mercaptoethanol을 제거 하려면 두 번, PLGA 섬유 린스.</li>
	<li>Rinsing 후, 튜브를 GRFT 재고 솔루션의 적절 한 금액을 추가. 예를 들어 5 nmol GRFT/mg 섬유는 섬유의 밀리 그램 당 (10 mg/mL 재고)에서 GRFT 재고 솔루션의 6.35 µ L를 요구할 것입니다. 따라서 75 mg 섬유 샘플 476.25 µ L 10 mg/mL GRFT 재고 솔루션의 필요. 
	참고: GRFT 섬유 0.05, 0.5, 및 mg 섬유 당 5 nmol GRFT의 이론적인 선적으로 조작 했다.</li>
	<li>닫고 철저 하 게 혼합 되도록 튜브 반전 추가 8 mL를 최종 볼륨을가지고 충분 한 PBS.</li>
	<li>튜브 플라스틱 필름으로 밀봉 하 고 장소는 터에 다시,이 시간 2 h.</li>
	<li>부 화 후 2 h, 15ml 원심 관으로 hydroxylamine 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 여 반응을 끄다. 제조업체 지침 당 냉각 반응 동안 hydroxylamine의 최종 농도 0.7 mg/mL 이어야 한다.</li>
	<li>는 솔루션을 잘 혼합 하 고는 상쾌한 삭제. 어떤 결합형된 GRFT를 제거 하려면 10 mL 초순 물으로 두 번 표면 수정 PLGA 섬유 린스.</li>
	<li>전송 섬유 페 트리 접시 및 장소는 desiccator 내부 섬유 완전히 건조 될 때까지. 저장을 위한 4 ° C를 페 트리 접시를 전송.</li>
</ol> 3. SEM GRFT 표면 특성 수정 섬유 <ol><li>장소는 SEM에 탄소 이중 면 테이프의 스트립 견본 마운트. 영구 마커를 사용 하 여 샘플 식별 정보 견본 마운트 하단의 레이블.</li>
	<li>한 표면 수정 섬유에서 3 샘플 고 별도 표본 마운트에 그들을 배치. 각 샘플의 두께 약 0.5 m m.</li>
	<li>스퍼터 코트 골드 플레이트에서 전자 유도 입자 증 착을 사용 하 여 샘플. 스퍼터 90 코트 s, 2.4 k v. 
	참고: 스퍼터 코트 시간 전압 및 암페어 수를 포함 하 여 장비 매개 변수에 따라 다를 수 있습니다.</li>
	<li>8 샘플 이미지 5, 1, 000에서까지 확대와 함께 kV X. 000</li>
</ol> 4. GRFT 표면 수정 섬유에서 추출 <ol><li>1.5 mL microcentrifuge 튜브로 3 중에서 섬유의 2 밀리 그램을 대량.</li>
	<li>튜브, 다음 소용돌이를 1 mL 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 추가 하 고 완전히 섬유 분해를 실 온에서 1 분 동안 품 어.</li>
	<li>인큐베이션, 후 희석의 10 µ L 약 수 트리 스-EDTA (테) 버퍼에 4.2, 적어도 100 단계에서 DMSO 섬유 솔루션 (pH = 8.0).</li>
	<li>ELISA와 특성화 로드까지-20 ° C에서 샘플을 저장할.</li>
</ol> 5. 섬유에서 탈 착 GRFT 측정 <ol><li>GRFT 발표의 양을 평가 또는 섬유 표면 수정 및 microcentrifuge 관에서 5-10 밀리 그램의 무게는 섬유에서 desorbed. 각 관에서 섬유 대량 기록.</li>
	<li>생리 적인 환경을 모방 하는 적절 한 솔루션의 1 mL을 추가 (예, PBS, 테 버퍼, 시뮬레이션된 질 액체 (SVF), 등) 각 샘플.</li>
	<li>200 rpm, 37 회전 통에 1 시간에 대 한 샘플을 품 어 ° c.</li>
	<li>후 부 화, 제거 약 1 mL 유리병, 약 수에서 desorbed GRFT 클러스터에 포함 된 테 버퍼 튜브. 단백질 정량화까지-20 ° C에서 저장소.</li>
	<li>새로운 microcentrifuge 튜브 샘플 전송, microcentrifuge 관 내의 섬유에 신선한 버퍼 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 다음 시간 포인트까지 품 어.</li>
	<li>릴리스를 측정 하는 데 사용 하는 전형적인 시간 포인트 포함: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h, 및 1 wk. 무시할 수 탈 착 4 헤 후 이러한 연구에서 관찰 되었다</li>
</ol> 6. GRFT 추출 및 ELISA 통해 탈 착의 정량화 HA의 0.1 mL <ol><li>코트 96-잘 ELISA 플레이트 (10 µ g/mL) 잘 당 앞에서 설명한 51. 플라스틱 필름 격판덮개 및 4 ° C ( 그림 4)에서 밤새 품 어.</li>
	<li>코팅 버퍼를 제거 하 고 각 우물에 버퍼 (2-3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에 0.05% 폴 20와 함께)를 차단 하는 0.3 mL를 추가 합니다. 실내 온도에 적어도 2 시간에 대 한 접시를 품 어.</li>
	<li>, 부 화 후 3 번 0.1% 폴 20 (PBS-P)와 1 x PBS 가진 접시를 씻어. Rinsing 후, 각 우물에 부정적인 컨트롤 샘플, 표준, 또는 PBS의 0.1 mL를 분배. 다시 실 온에서 1 h에 대 한 접시를 품 어.</li>
	<li>린스는 접시 3 번 다시 PBS. Rinsing 후, 각 음에 1 차적인 항 체 (염소 안티 GRFT 원으로)의 0.1 mL를 추가 하 고 실내 온도에 적어도 1 시간에 품 어. 일반적으로 1 차적인 항 체 솔루션 1:10,000 PBS에 의해 희석 이다.</li>
	<li>잠복기 1 차적인 항 체 린스 샘플 판 다시 3 회 PBS.와 후 이차 항 체의 0.1 mL를 추가 (양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)-활용 된 토끼 반대로 염소 IgG) 각을 잘 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 이차 항 체 솔루션 1:10,000 PBS에 의해 희석 이다.</li>
	<li>세척 접시 3 번. 각 우물에 0.1 mL TMB 2 과산화 효소 기질을 추가 합니다. 모니터 색상 개발 (약 2 분), 다음 추가 0.1 mL H 2 이렇게 4 (1 N) 반응 해소. 450에 접시를 읽고 플레이트 리더에 nm.</li>
	<li>배경 OD 값 (웰 스 PBS를 수신만 하는), 평균 및 실험적인 그룹에서 이것을 빼기.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

그들의 다공성 구조와 큰 표면 영역, EFs 헬스케어, 치료 배달 차량으로 봉사를 포함 하는 중 하나는 다양 한 응용 프로그램을 발견 했다. 약물 및 다른 활성 에이전트 통합할 수 있습니다 EFs에서 가변 배달 동안 생물 의약품 및 화학 ligands 셀-특정 대상52 또는 바이오 센 싱53섬유 표면에 활용 될 수 있습니다. 여기 GRFT의 제조 표면-수정 PLGA EFs, HIV 감염을 방지 하기 위해 배달 비 계 설명. GRFT-EFs 다른 섬유 생산 방법49,53상대적인 낮은 비용과 높은 생산 비율의 혜택을 제공, 전기에 의해 합성 되었다.
프로토콜의 중요 한 단계 EFs의 형성은 비판적으로 특히 솔루션 또는 용 매 점도<sup class="xref"...

국 소 전달 플랫폼으로 EFs 사용 하 여 성병을 줄일 가능성이 있다. 현재, 36 백만 이상의 사람들이 HIV에 보고 2015 혼자1,2의 이상 2 백만 새로운 케이스와 함께 살고 있다. 또한, 포진 심 플렉스 바이러스 2 (HSV-2) 감염의 영향을 수백 전세계 사람들의 수백만 입력 하 고 2-5 배3HIV의 수집을 향상을 보여줘 왔다. 이 관계 HSV-2 감염 및 HIV 취득으로 인해 여러 성병에 대 한 동시 보호를 제공 하는 새로운 활성 에이전트 개발에 상당한 관심이입니다. 또한, 이러한 항 바이러스 대리인의 납품을 개선 하기 위해 새로운 차량의 개발 추가 보호 및 치료 효능을 향상 시키기 위해 잠재력을 제공 합니다. 이 목표를 향해 EFs V-1와 h s V-2 감염의 보급을 줄이기 위해 새로운 배달 플랫폼으로 조사 되어 있다.
지난 2 년 동안 EFs는 약물 전달 및 조직 공학4의 분야에서 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다. 종종, 생체 고분자는 쉽게 치료 응용 프로그램을 변환할 선택 됩니다. 고분자 EFs를 조작 하 선택 된 폴리머는 유기 용 제 또는 수성 솔루션에 폴리머 hydrophobicity5의 정도 따라 녹입니다. 관심의 활성 에이전트 다음 전기 과정 이전 또는 수성 솔루션에 추가 됩니다. 폴리머 솔루션 다음 주사기로 발음 이며 천천히 전류 따라 나옵니다. 이 프로세스는 일반적으로 폴리머 섬유 시트 또는 원통형 macrostructures (그림 1)와 마이크로-나노 규모6에서 배열 하는 섬유 직경에에서 발생 합니다. 가장 치료 응용 프로그램에 대 한 활성 에이전트 전기 과정에서 섬유 안에 통합 되 고 확산 및 후속 섬유 저하를 통해 섬유에서 해제 됩니다. 속도 저하 또는 자료의 다른 유형의 폴리머를 사용 하 여 변경 될 수 있습니다 또는 폴리머 혼합7을 독특한 화학 및 물리적 특성 부여 하 고 거의 모든의 캡슐화를 추진 하 고 원하는 릴리스 프로필을 설정 하 복합. 따라서, EFs는 작은 분자 약물 및 단백질, 펩 티 드, oligonucleotides, 및 성장 요인6,,89를 포함 하 여 생물 학적 에이전트의 배달에 도움이 입증 했습니다.
STI 예방 분야에서 EFs 최근 사용 된 통합 하 고 지속 또는 유도할 수 있는-릴리스 항 바이러스 대리인10,,1112,13,14의 제공 ,15,,1617,,1819. 초기 연구 중 하나에서 전화 응답 섬유 에이즈-111에 대 한 보호의 온-디맨드 방법으로 활성 에이전트 (FRT) 여성 재생산 지역 내 환경 변화에 대응을 출시 개발 되었다. 이후, 다른 연구 조사 폴리머 혼합 폴 리 에틸렌 산화물 (PEO)와 폴 리-L-젖 산 (PLLA), 에이즈-1 예방 및 피임 생체 외 에 대 한 항 바이러스 및 피임 제의 가변 평가의 구성 12. 추가 연구는 다음을 제공 하는 EFs의 타당성 증명: 작은 분자 antivirals14, 강한 릴리스 및 유연한 기계적 특성20, 3 차원 배달 아키텍처21 연장 , 정자 침투12, 그리고 다른 배달 기술13와 병합 하는 능력의 저해. 마지막으로, 이전 작업 일반적인 co-infective 바이러스, HSV-2와 에이즈-114에 대 한 항 바이러스 제의 지속적인 배달에 대 한 고분자 섬유를 평가 했다. 이 연구에서는 폴리머 섬유 1 달까지 동안 그들의 구조를 유지 하 고 바이러스 항목에 대 한 물리적 방 벽을 제공 하 여 항 바이러스 배달 보완 활동을 제공. 이러한 결과에서 둘 다 물리적 및 화학적 방해 바이러스 감염에 EFs를 사용할 수 있습니다 관찰 되었다.
가변 자료 속성을 고분자 EFs microbicide 배달에 대 한 매력적인 전달 플랫폼, EFs 표면 수정 건설 기계7을 다른 응용 프로그램에서 개발 되었습니다. 종종 역할 건설 기계 세포 재생22, 개선 하 고 조직 공학23,24에 그들의 유틸리티를 강화 하는 세포 외 기질 (ECM)의 형태를 모방 하기 위해 eFs 사용 되었습니다. 섬유 고분자 폴 리-ε-caprolactone (PCL) 등으로 구성 되었으며 PLLA 성장 인자와 단백질 표면 수정 후 전기를 얻으며 ECM 같은 속성 증가 세포 접착 및 확산25 를 포함 하 여 , 26. 항균 성 표면 수정 EFs 특정 병원 성 박테리아27,28의 성장을 방지 하기 위해 평가 또한. 이 다양성 및 생물 학적 효과 유도 하는 능력, EF 기술 다양 한 기계 멀티 기능을 제공 하는 분야에서 확장 하 고 있습니다. 그러나, 그들의 유틸리티 애플 리 케이 션의 다양성에도 불구 하 고 표면 수정 섬유 최근에 microbicide 필드29탐험 되었습니다 있다.
방지 하 고 성병 치료 배달 신기술 개발 병행, 새로운 생물학적 치료제 개발 되었습니다. 가장 유망한 microbicide 후보자 중 하나 접착제 항 바이러스 lectin, GRFT30입니다. 원래 빨강 조류의 종에서 파생 된, GRFT는 설명 했다 HIV, HSV-2, SARS의 강력한 억제제로 활동 뿐만 아니라 C 형 간염 바이러스31,32,,3334, 35 , 36. 사실, 생물학 기반의 억제제 중 GRFT는 가장 강력한 반대로 HIV 활동 하면서 안정성과 질에서 문화 미디어 존재 활동 연락처30, 시 거의 즉시 V-1를 비활성화 최대 10 일37미생물. 더 최근에, 0.1 %GRFT 젤 자 HSV-2 도전, 그것은 HSV-2와 에이즈-132 에 대 한 보호의 첫 번째 줄에 대 한 유망한 후보 만들기에 대 한 마우스를 보호 하기 위해 표시 했다, 38. 에이즈에 대 한 GRFT 물리적 항목38,,3940,41 방지 하기 위해 바이러스 성 봉투 표면에 gp120 또는 터미널만 노 오 스 N 연결 glycan 잔류물을 바인딩 하 여 감염을 억제 하는 특히, ,42. 이 억제는 매우 강력한 IC50s 3 ng/mL43접근. HIV 감염을 억제 하는 것 이외에 연구는 또한 보여주었다 GRFT 바이러스32의 세포-세포 확산을 억제 하 여 감염 HSV-2에 대 한 보호. 모든 경우에, GRFT 변성에 높은 저항을 시연, 바이러스 성 입자에 접착제를 되도록 표시 되었습니다. 마지막으로, GRFT 만들고 그것은 실현 가능성이 EFs와 함께 공동 관리에 도움이 테 (TFV) 및44의 다른 antivirals 조합으로 시너지 활동을 시연 하고있다. GRFT의 강력한 속성은 우수한 생물학 기반의 항 바이러스 후보자, 있는 배달 EF 기술로 향상 될 수 있도록 합니다.
GRFT의 접착제 및 타고 난 항 바이러스 속성의이 지식을 활용 하 여, 고분자 섬유 비 계 설계 되었습니다, 이러한 속성을 제공 하는 바이러스 항목 저해29의 첫 번째 계층을 통합 하. Cervicovaginal 점액 mucoadhesive mucin 상호 작용을 통해 주로 바이러스 전송 방해 하는 방법에 영감을 찾기, 우리 가정 했다 그를 발판으로 EFs를 사용 하 여 covalently GRFT의 높은 밀도와 표면 수정 GRFT 표면에 활용 된 것 수 고 entrypoint45,,4647에서 바이러스를 비활성화. 여기 EFs는 플랫폼을 제공 하는 단백질 기반, 바이러스 성 접착제 비활성화 장벽 고정 발판으로 개발 되었다. 우리를 만드는 새로운 바이러스 "함정." 생체, 대, 고 내구성 폴리머 플랫폼 GRFT의 적 정량 항 바이러스 특성을 결합 하고자
이러한 목표를 달성 하기 위해 PLGA의 구성 하는 섬유 electrospun, 그리고 EDC-보 건국 화학 GRFT와 EF 표면 그 후 수정 하는 데 사용 되었다. PLGA 전기48, 생체 적합성 및 비용 효율성에에서 그것의 광범위 한 사용 모델 폴리머 역임 했습니다. 또한, 표면 개 질 EFs의 큰 표면 영역을 이용 하 고 캡슐화 섬유 유틸리티49를 극대화 하기 위해 결합 될 수 있는 유용한 대안을 제공 합니다. 전통적인 캡슐화 방법 어디 GRFT의 일부만 사용할 수 (그리고는 FRT만 뚜렷이 제시), 달리 표면 수정 수 있습니다 가능 치료의 전체 기간 동안 최대 bioactivity를 유지 하는 GRFT 또한, 전통적인 전기 방법으로 단백질 같은 친수성 화합물의 낮은 캡슐화 효율성 및 단백질 활동50의 손실 될 수 있습니다. 따라서, GRFT 표면 수정 섬유 STI 감염에 대 한 보호 기능을 향상 하거나 전기와 함께 사용할 수 있는 유망한 대체 배달 방법을 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA) 50:50</td><td>Lactel</td><td>B6013-2P</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>147541000</tr><tr><td>블런트 디스펜싱 바늘 18g X 1/2</td><td>Brico 의료 용품</td><td>BN1815</td><td></td></tr><tr><td>BD 3mL 주사기 Luer-lok 팁</td><td>VWR</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>파라필름 (플라스틱 필름)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3671&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마 알드리치</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마 알드리치</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마 알드리치</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 단염기</td>성 <td>시그마 알드리치</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>하이드록시숙신이미드 (NHS)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염(EDC)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Fisher</td><td>BP176</td><td></td></tr><tr><td>Griffithsin (GRFT)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>맞춤 제작, 제품 번호 없음</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Milipore</td><td>317275</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트 (Polysorbate, Tween 20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris EDTA 버퍼</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>플랫-바텀 이뮤노 비멸균 96-웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>3355</td><td></td></tr><tr><td>인플루엔자 헤마글루티닌 (HA)</td><td>켄터키 바이오프로세싱</td><td>NA</td><td>맞춤형, 제품 번호 없음</td></tr><tr><td>Goat Anti-GRFT (1차 항체)</td><td>Kentucky Bioprocessing</td><td>NA</td><td>맞춤형, 제품 번호 없음</td></tr><tr><td>토끼 안티 염소 IgG-HRP (2차 항체)</td><td>Santa Cruz</td><td>2056</td><td></td></tr><tr><td>Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate</td><td>KPL</td><td>52-00-00</td><td></td></tr></tbody></table>

감염 성병 제조 및 방지를 위한 griffithsin 수정 섬유 장비의 특성

Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections

Electrospun 섬유 (EFs) 널리 다양 한 치료 애플 리 케이 션;에 사용 되었습니다. 그러나, 그들은 단지 최근에 적용 되었을으로 방지 하 고 치료 성적으로 기술 전송 감염 (STIs). 또한, 많은 EF 기술 biofunctionality를 얻으며 표면을 활용 하 여 상대적인 활성 에이전트를 캡슐화에 초점. 여기 조작 및 poly(lactic-co-glycolic) 산 (PLGA) electrospun 섬유, 강력한 항 바이러스 lectin Griffithsin (GRFT)와 표면 수정 하는 방법을 설명 합니다. PLGA는 약물 전달의 뛰어난 화학 및 생체 특성 때문에 널리 사용 된는 FDA 승인 중합체 이다. GRFT 자연, 강력한, 및 안전 lectin 인간 면역 결핍 바이러스 1 (hiv-1) 형을 포함 하는 수많은 바이러스에 대 한 광범위 한 활동을 소유 하는. 결합 될 때, GRFT 수정 섬유 체 외에에이즈-1의 강력한 비활성화를 증명 하고있다. 이 원고에서는 조작 하 고 GRFT 수정 EFs를 특성화 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, PLGA 섬유 비 계를 만들 electrospun입니다. 섬유는 이후에 표면 수정 1을 사용 하 여 GRFT-에틸-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 및 N-hydroxysuccinimide (NHS) 화학. 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 크기와 표면 수정 공식의 형태를 평가 하기 위해 사용 되었다. 또한, gp120 또는 조류 (하)-기반된 ELISA, 활용 된 GRFT GRFT 섬유 표면에서 탈 착의 양을 계량 하 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 섬유를 서로 다른 단백질의 다양 한 표면 수정 조작 하 더 광범위 하 게 적용할 수 있습니다.

섬유 형태 바이러스에 대 한 보호를 제공 하는 표면 수정 EFs의 기능에 상당한 효과가 있다. 전기는 편리 하 고 간단한 절차, 최적화 되지 않은 폴리머 제형 불규칙 한 섬유 형태 (그림 5B-C) 발생할 수 있습니다. 파란색 또는 비정 질 매트 같은 형태학의 대형 귀착되는 전기 조건에서 변경 종종 용 폴리머 호환성, 낮은 폴리머 점도, 흐름 속도, 또는 다른 전기 조건에 의해 발생 합니다. 섬유 구조에 결과 유사 약물 통합 섬유 또는 불일치 활용 효능, 물리적 또는 화학적으로 바이러스 침투를 방해 하는 섬유 수 변경에 대 한 다른 릴리스 프로필에 발생할 수 있습니다. 설명된 전기 조건을 사용 하 여 날조 PLGA EFs 1.5와 2.8 µ m (그림 6) 사이 배열 하는 직경 고유 섬유 형태학 발생 한다. 섬유 형태 및 직경을 확인 ...

이 원고 조작 하 고 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 감염에 대 한 강력한 접착제 및 항 바이러스 활동을 보여 주는 Griffithsin 수정 폴 리 유산 공동 glycolic acid () electrospun 섬유를 특성화 하는 절차를 설명 합니다. 생체 외에서. 합성 하는 데 사용 하는 방법 표면 수정, 결과 형태, 활용, 특성 및 표면 수정 섬유에서 Griffithsin의 탈 착에 설명 되어 있습니다.

감염 성병 제조 및 방지를 위한 Griffithsin 수정 섬유 장비의 특성

Electrospun fibers (EFs) have been widely used in a variety of therapeutic applications; however, they have only recently been applied as a technology to ...

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 양의 항바이러스 단백질인 Griffithsin을 사용하여 폴리락트산, 코글리콜산, 전기방사 섬유를 제작하고 표면 변형하는 것입니다. 이 방법은 HIV-1과 같은 성병 바이러스 감염을 예방할 수 있는 새로운 전달 매체를 공식화하고 특성화하는 방법과 같은 약물 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 Griffithsin의 항바이러스 활성이 섬유 표면의 고도로 국소화된 Griffithsin에 대한 고정 골격으로 고분자 전기 방사 섬유를 사용하여 극대화된다는 것입니다.이 기술의 의미는 다양한 감염 유형에 대한 Griffithsin의 강력한 예방 및 치료 잠재력 때문에 다른 바이러스 및 박테리아 감염 치료로 확장됩니다. 이 방법은 HIV-1 감염 예방에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, Griffithsin이 효능을 입증한 다른 바이러스 또는 박테리아 감염과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 720mg의 50/50 PLGA를 10ml 섬광 사악병에 넣으십시오.혈청학적 유리 피펫을 사용하여 3.0ml의 HFIP를 첨가합니다. 사악한 것을 플라스틱 필름으로 덮으십시오. 그런 다음 사악한 덩어리를 측정하고 기록합니다.폴리머 현탁액을 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하여 폴리머의 완전한 용해를 보장합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 전기 방사 장치를 준비합니다. 3밀리리터 주사기를 사용하여 폴리머 용액을 흡입합니다.그런 다음 뭉툭한 18게이지 0.5인치 바늘 끝을 주사기에 연결합니다. 바늘의 빈 머리 공간을 제거하기 위해 여분의 용액을 분배하십시오. 주사기를 주사기 펌프에 놓고 기기 유량을 시간당 2.0밀리리터로 설정합니다.주사기 바늘에 전원을 연결합니다. 양의 27 킬로 볼트의 전압을 사용하여 폴리머 용액을 전기 스핀합니다. 전체 용액을 전기적으로 회전시킨 후 전원을 끕니다.맨드릴이 추가로 30분 동안 회전하여 용매를 완전히 증발시키도록 합니다. 그런 다음 회전하는 맨드릴 수집기를 끕니다. 면도날을 사용하여 맨드릴에서 섬유를 부드럽게 벗겨냅니다.전기로 방사된 PLGA 섬유를 라벨이 붙은 페트리 접시에 모읍니다. 접시를 밤새 건조제에 넣어 잔류 용매를 제거하십시오. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PBS 및 MES 솔루션을 준비합니다.그런 다음 냉동실에서 EDC와 NHS를 꺼냅니다. 실온과 평형을 이루도록 그대로 두십시오. 그런 다음 EDC 4mg을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.NHS 6mg의 무게를 다른 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 각 튜브에 1ml의 MES 버퍼를 추가합니다. 시약이 완전히 용해되도록 두 튜브를 격렬하게 소용돌이치십시오.그런 다음 70mg의 하이드록실아민을 50ml 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다. PBS 20밀리리터를 넣고 소용돌이치십시오. 적당량의 PLGA 광섬유를 15ml 원추형 원심분리기 튜브에 대량으로 넣습니다.광섬유에 8ml의 MES 버퍼를 추가합니다. 다음으로, EDC 및 NHS 솔루션 1ml를 추가합니다. 플라스틱 필름을 사용하여 15ml 원추형 원심분리기 튜브를 밀봉합니다.튜브를 회전자에 올려 실온에서 15분 동안 용액을 부드럽게 뒤집습니다. 그런 다음 14마이크로리터의 베타-메르캅토에탄올을 첨가하여 반응을 소멸시킵니다. 완전한 혼합을 위해 튜브를 여러 번 뒤집습니다.상층액을 버리고 세탁할 때마다 10ml의 PBS를 사용하여 PLGA 섬유를 두 번 헹굽니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 튜브에 적절한 양의 GRFT 스톡 용액을 추가합니다. 그런 다음 최종 부피가 8밀리리터가 되도록 충분한 PBS를 추가합니다.철저한 혼합을 위해 튜브를 닫고 뒤집으십시오. 플라스틱 필름으로 튜브를 밀봉하십시오. 튜브를 회전자에 올려 놓고 2시간 동안 용액을 부드럽게 뒤집습니다.그 후, 제조된 히드록실아민 용액 2ml를 첨가하고 30초 동안 볼텍싱하여 반응을 소멸시킵니다. 상등액을 버리십시오. 표면 변형 PLGA 섬유를 10 밀리리터의 초순수를 사용하여 두 번 헹구고 각 세척마다 와류를 헹굽니다.다음으로, 세척된 섬유를 페트리 접시에 옮깁니다. 섬유가 완전히 마를 때까지 페트리 접시를 데시케이터 내부에 놓습니다. 그런 다음 페트리 접시를 섭씨 4도에서 보관하십시오.먼저 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브 3개를 준비합니다. 각각 2mg의 섬유질을 덩어리로 만듭니다. 그런 다음 각 튜브에 1ml의 DMSO를 추가합니다.섬유를 완전히 녹이기 위해 실온에서 1분 동안 와류를 치십시오. 그 후, 10 마이크로 리터 분취액을 TE 완충액에 100 배 이상 희석합니다. Eliza로 특성화를 로드할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.5-10mg의 표면 변형 섬유의 무게를 측정하여 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 배치된 섬유 질량을 기록합니다. 다음으로, 각 샘플의 생리학적 환경을 모방한 용액 1ml를 추가합니다.200 RPM 및 37°C의 회전 셰이커에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 그 후, 탈착된 GRFT를 포함하는 용액을 약 1ml씩 제거하고 클러스터 튜브로 분취합니다. 단백질 정량화를 수행할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.그런 다음 샘플을 새 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 1ml의 신선한 완충 용액을 추가하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 다음 시점까지 배양합니다. 이 연구에서는 PLGA 전기 방사 섬유를 제조하기 위한 조건을 조사합니다.블랭크, 0.05 나노몰, 0.5 나노몰 및 5 나노몰 GRFT 섬유의 SEM 분석은 GRFT 변형이 섬유 형태에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 모든 구조물은 약 1.9미크론의 유사한 평균 직경을 갖는 것으로 보이며, 이는 배치 전반에 걸쳐 수정된 제조 공정의 일관성을 보여줍니다. 그런 다음 전기 방사 섬유에 접합된 GRFT의 양이 결정됩니다.5 나노몰 변형에는 373 나노그램의 GRFT가 포함되어 있는 반면, 0.5 및 0.05 변형에는 각각 165 및 42가 포함되어 있습니다. 이는 더 높은 이론적 표면 변형 밀도로 접합된 섬유가 섬유에 더 많은 GRFT가 접합된다는 것을 보여줍니다. 그러나 결과 conjugation efficiency에서 역 상관 관계를 볼 수 있습니다.다음으로, 섬유에 공유 접합된 GRFT의 양을 평가합니다. 처음 4시간 이내에 5나노몰, 0.5나노몰 및 0.05나노몰 이론적 변형 농도에서 각각 5나노몰, 0.5나노몰 및 0.05나노몰 이론적 변형 농도에서 전기방사 섬유 밀리그램당 113나노그램, 25나노그램 및 10나노그램의 GRFT가 검출됩니다. 4시간 후, 세 가지 제형 모두에 대한 방출 용리액에서 무시할 수 있는 GRFT가 검출됩니다.이 데이터는 대부분의 GRFT가 전기 방사 섬유에 공유 결합되어 있고 표면 흡수 GRFT가 처음 4시간 이내에 방출됨을 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 약 4일 안에 완료할 수 있습니다. 고분자 섬유 골격을 전기 방사하는 것은 고분자 용액을 준비하고 전기 방사하는 데 2일이 걸립니다.반면, 표면 개질, 후속 건조 및 섬유 특성화에는 최소 이틀이 더 필요했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 최적의 변형을 보장하기 위해 시약의 적절한 비율을 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 적절한 섬유 형태를 보장하기 위해 electospinning 매개변수가 올바른지 확인하는 것도 중요합니다.개발 후, 이 기술은 약물 전달 분야의 연구자들이 섬유 내에 항바이러스제를 캡슐화할 뿐만 아니라 섬유 표면을 통해 활성 제제를 결합할 수 있는 능력을 가진 전기 방사 섬유를 제작할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 고분자 섬유를 전기방사하는 방법, 항바이러스 단백질인 Griffithsin으로 섬유의 표면 변형을 수행하는 방법, 섬유에 접합된 Griffithsin의 질적 변형을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. HFIP, 베타-메르캅토에탄올, EDC 및 NHS와 같은 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.이 절차를 수행하는 동안 PPE의 적절한 적용 및 화학 흄 후드 사용과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

조직 공학 및 세포 배양을위한 폴리머를 electrospinning의 과정은이 문서에서 해결되었습니다. 특히 photopatterning 멀티 고분자 electrospinning의 추가 처리 능력과 photoreactive macromers의 electrospinning이 설명되어 있습니다.

조직 공학 및 세포 배양을위한 섬유 고분자의 공사장 공중 발판을 Electrospinning

Electrospun의 공사장 공중 발판은 조직 공학 응용 프로그램을위한 포스트 프로덕션을 처리할 수 있습니다. 여기 불임 (무균 생산 또는 멸균 포스트 생산)을 달성하기 위해하고 적절한 biomechanical 속성을 달성위한 두꺼운 공사장 공중 발판을 (멀티 layering이 열을 사용하거나 증기가 풀림으로) 제작을 위해, 복잡한 공사장 공중 발판을 (연속 회전으로) 회전하는 방법을 설명합니다.

조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

거미 실크 옷의 뛰어난 기계적 및 생화 학적 특성에도 불구하고,이 재료는 종래의 방법으로 대량 수확 할 수 없습니다. 여기 차세대 biomaterials 같은 거미 실크의 생산과 사용을 공부 수사관을위한 중요한 과정입니다 인공 거미 실크 섬유를 스핀하는 효율적인 전략을 설명합니다.

실험실 규모의 합성 거미의 실크 생산

생체의 pH 응답 졸 - 겔 나노 센서는 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA) 전기 방사 지지체에 혼입 될 수있다. 생성 된 자기보고 지지체는 지지체에 세포를 배양하는 동안 미세 환경 조건 인 시츄 모니터링에 사용될 수있다. 3D 셀룰러 구조는 실험을 방해하지 않고 실시간으로 모니터링 할 수있는 이는 유익하다.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

이 프로토콜은 전기 방사와 마이크로 스피어를 결합하여 뉴런을 지시하는 조직 공학 골격을 개발합니다. 신경 성장 인자는 PLGA 미세구 내에 캡슐화되어 히알루론산(HA) 섬유 골격으로 전기 방사되었습니다.  단백질 생체 활성은 기본 병아리 Dorsal Root Ganglia를 골격에 파종하고 4-6일 동안 배양하여 테스트했습니다.

섬유 공사장 공중 발판으로 마이크로 스피어를 해제 전기 방사의 성장 인자

여기서 우리는 섬유의 계조 조직과 전기 방사 나노 섬유 지지체를 제작하고 세포 형태 / 방향을 조절하는 응용 프로그램을 탐구하는 프로토콜을 제시한다. 나노 섬유 지지체의 물리 화학적 특성에 관한 그라디언트는 생물 의학 분야에서 다양한 응용 프로그램을 제공합니다.

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미세 회전 및 재생성된 실크 fibroin monofilament의 미세 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

미세 드라이 회전 및 재생성된 실크 Fibroin 섬유의 특성

본원은 CAR-T 세포 치료를 위한 T 세포를 포함하는 T 세포의 유전공학에 사용하기 위한 효율적인 바이러스 유전자 전달을 매개하는 건식 거대다공성 알기네이트 스캐폴드를 생성하기 위한 프로토콜이다. 스캐폴드는 활성화된 1차 T 세포를 &gt;85% 형질도입으로 형질도입하는 것으로 나타났다.

T 세포의 바이러스 형질도입을 위한 건식 거대다공성 알긴산 스캐폴드의 제조 및 사용

플라스틱 멤브레인이 있는 조직 배양 삽입물은 세포 배양 실험실에서 세포층과 장벽 조직 모델을 확립하기 위한 투과성 지지체로서 황금 표준입니다. 여기에서, 우리는 플라스틱 멤브레인을 재조합 기능화된 거미줄 단백질로부터 만들어진 생물학적으로 더 관련성이 높은 멤브레인으로 대체하는 간단한 방법을 제시한다.

맞춤형 조직 배양 인서트에 재조합 기능성 거미줄로 만든 Nanofibrillar 기저막 모방

배우세요 Griffithsin을 이용한 PLGA 전기방사 섬유의 표면 개질 방법을 통해 HIV-1 감염을 예방하는 약물 전달 시스템을 개발하는 기술입니다. 이 기법은 다양한 바이러스 감염 치료에 활용될 수 있습니다.

감염 성병 제조 및 방지를 위한 Griffithsin 수정 섬유 장비의 특성

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