생체 외에서 Osteoclastogenesis에 자연 우라늄의 영향을 분석 하기 위한 방법

이 절차의 전반적인 목표는 자연 우라늄 노출이 파골세포의 생존력, 분화 및 기능에 미치는 영향을 조사하는 것입니다. 이 방법은 우라늄 노출이 뼈의 생리학 및 신진대사에 미치는 영향에 대한 환경 독성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 우라늄 발신자를 선별하기 위한 흥미로운 새로운 도구를 제공한다는 것입니다.

RAW 264.7 세포 배양이 85-90% 포화도에 도달하면 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포 배양 플라스크 바닥에서 세포를 기계적으로 들어 올리고 세포를 멸균 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포 용액을 몇 번 피펫팅하여 덩어리를 분해하고 생성된 단일 세포 현탁액을 계수합니다. L-글루타민과 5%의 소 태아 혈청을 보충한 알파 변형 최소 필수 배지에서 밀리리터당 10-4 세포 농도로 세포를 1배 희석하고 24웰 세포 배양 플레이트에 웰당 1밀리리터의 세포를 추가하여 섭씨 37도에서 6시간 배양합니다.

파골세포 분화 및 재흡수 분석의 재현성을 위한 중요한 매개변수는 세포 파종 밀도입니다. 세포를 도금하기 전에 세포 계수, 세포 현탁액 준비 및 균질성에 특히 주의하십시오. 소변 염 용액을 준비하려면 멸균 세포 배양 테스트를 거친 7.5% 중탄산나트륨 수용액에서 시작하여 먼저 100밀리몰의 중탄산염을 준비하고 얼음 위의 물에 냉각한 다음 100밀리몰 소변기 아세테이트 용액 1부피를 얼음처럼 차가운 중탄산염 용액 9부피에 부드럽게 흔들어 한 방울씩 추가합니다.

용액이 실온에서 평형을 이루도록 합니다. 3시간 후, 원하는 소변기 작업 농도에 도달할 때까지 RANKL 밀리리터당 50나노그램을 포함하는 분화 배지에 적절한 부피의 소변기 용액을 한 방울 한 방울 희석하고 실온에서 다시 3시간 동안 평형을 이룹니다. 소변기 소금을 희석할 때마다 긴 배양 단계는 용액 내 소변기 복합체의 안정화에 필수적입니다.

두 번째 평형 기간이 끝나면 각 웰의 배지를 1ml의 소변기 처리 배지 또는 적절한 조절 배지로 부드럽게 교체하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 다핵 파골세포는 배양 3일에서 4일 사이에 나타나야 합니다. 새로 분화된 파골세포의 크기와 형태를 평가하려면 제조업체의 지침에 따라 타르타르산염 내성 산 인산가수분해효소로 세포를 염색하고 세포핵을 구별하기에 충분한 해상도로 각 웰의 전체 표면을 이미지

모든 웰의 이미지가 생성되면 오픈 소스 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 한 웰의 이미지를 열고 배율 단위를 확인합니다. 그런 다음 팝업 창에서 전역 상자를 선택하여 이후의 모든 이미지에 새 배율 단위를 적용합니다. Analyze(분석) 메뉴에서 Set Measurements(측정 설정)를 선택하고 Area(영역) 및 Display(레이블) 상자를 선택합니다.

다른 모든 상자의 선택을 취소합니다. 분석 메뉴에서 도구를 연 다음 관심 영역 관리자를 열고 기본 ImageJ 창에서 직사각형 선택 도구를 선택합니다. 약 1, 000x-1, 000마이크로미터의 관심 영역을 간략하게 설명하고 추가 버튼을 클릭하여 선택 항목을 관심 영역 관리자에 추가합니다.

그런 다음 More(추가), Save(저장)를 클릭하여 지역을 저장합니다. 분석할 5개 영역 중 하나의 복사본을 만들려면 관심 영역 관리자에서 관심 영역을 선택하고 선택한 영역 내부를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 영역을 복제합니다. Show All 및 Labels 상자를 선택하고 polygon selection 도구를 선택하여 복제된 관심 영역에 있는 파골세포 중 하나의 윤곽을 수동으로 윤곽을 그립니다.

이 개요를 Region of Interest Manager에 추가하려면 Region of Interest Manager 창에서 Add를 클릭합니다. 모든 파골세포가 추가되면 모든 윤곽선을 선택하고 측정을 클릭하여 해당 표면을 측정합니다. 그런 다음 결과 창에 나타나는 측정값을 스프레드시트로 전송합니다.

소변기 처리된 파골세포의 기능을 평가하기 위해, 분화 배지를 추가하기 하루 전에 방금 시연한 바와 같이 85-90% 융합 세포 배양의 RAW 세포를 성장 배지의 24웰 골 분석 플레이트에 플레이트화합니다. 다음날, 방금 시연된 것처럼 상등액을 분화 소변기가 포함된 배지로 부드럽게 교체하고 RAW 세포가 파골세포로 분화하도록 합니다. 파골형성 5일째에 소변기가 포함된 배지를 10% 표백제 용액으로 교체하여 뼈 모방 표면에서 세포를 제거합니다.

실온에서 5분 후 우물을 탈이온수로 두 번 씻고 자연 건조시킵니다. 다음으로, 각 웰의 재흡수되지 않은 부분의 칼슘 염을 1 % Alizarin Red S 나트륨 염 용액으로 염색합니다. 10-15초 후에 알리자린 용액을 제거하고 물로 웰을 3-4회 부드럽게 씻습니다.

알리자린 염색 웰의 RGB 이미지를 회색조 8비트 형식으로 변환하려면 이미지 메뉴에서 유형 및 8비트를 선택합니다. 그런 다음 타원형 선택 도구를 사용하여 방금 설명한 것처럼 흡수를 위해 분석할 우물의 전체 표면을 간략하게 설명하고 관심 영역을 저장합니다. 임계값을 쉽게 선택하려면 편집(Edit) 및 외부 지우기(Clear Outside)를 선택하여 정의된 관심 영역 밖에 있는 모든 피쳐를 지웁니다.

방금 설명한 대로 관심 영역을 복제하고 이미지 메뉴에서 Adjust Threshold를 선택하고 슬라이드 바를 조정하여 적절한 임계값을 선택합니다. 모든 재흡수 영역은 임계값 위에 있어야 하고 흰색으로 표시되어야 하며, 모든 재흡수되지 않은 영역은 임계값 미만이어야 하며 빨간색으로 표시되어야 합니다. 임계값 선택을 완료하려면 임계값 창에서 적용을 클릭하고 최종 이진 이미지를 원하는 적절한 형식으로 저장합니다.

관심 영역 내에서 수행할 측정을 정의하려면 Analyze(분석) 메뉴에서 Set Measurements(측정 설정)를 선택하고 Area(영역), Area Fraction(면적 분수) 및 Limit to Threshold(임계값 제한) 상자를 선택하고 다른 모든 상자는 선택 취소합니다. 그런 다음 결과 창 내에서 직접 흡수된 영역의 비율을 얻으려면 편집 메뉴에서 반전을 선택하고 최종 이진 이미지에서 주요 관심 영역이 선택되었는지 확인하고 흡수된 영역 비율을 측정하여 복제된 이진 이미지를 반전합니다. 우라늄에 대한 반응으로 새롭게 분화된 파골세포의 수와 크기의 변화는 전체 우물의 합성 이미지뿐만 아니라 선택된 관심 영역의 확대 사진에서도 쉽게 볼 수 있습니다.

서로 다른 배양 조건에서 성장한 파골세포의 크기는 각 영역 내의 모든 파골세포를 간략하게 설명하고 윤곽이 그려진 각 세포의 면적을 측정하여 설명한 것처럼 분석할 수 있습니다. 파골세포 흡수 활성에 대한 우라늄의 영향을 조사하기 위해 RAW 264.7 세포를 골 모방 표면판에서 도금하고 분화합니다. 분석이 끝나면 파골세포를 제거하고 재흡수되지 않은 영역을 염색하고 시연된 대로 이미지화합니다.

그런 다음 이미지는 8비트 그레이스케일로 변환되고 임계값이 설정되어 재흡수 영역의 계산을 용이하게 합니다. 이 절차는 다른 중금속이 파골형성에 미치는 영향에 대한 연구에도 적용될 수 있습니다.