Name: 생체 외에서 Osteoclastogenesis에 자연 우라늄의 영향을 분석 하기 위한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 배우세요 생체 외에서 자연 우라늄이 파골세포 생존율, 분화 및 기능에 미치는 영향을 분석하는 방법을. RAW 264.7 세포 배양을 활용한 이 기술은 환경 독성학 분야에서 뼈 대사에 대한 우라늄 노출의 영향을 연구하는 새로운 도구를 제공합니다.

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저자 Chantal Cros 도움이 기술 지원에 대해 감사 하 고 싶습니다. 이 연구는에서 교부 금에 의해 투자 되었다는 "Commissariat à l'Energie Atomique 외 보조 에너지 대안" (URANOs-프로그램 횡단 de Toxicologie du CEA와 CPRR CEA-AREVA), ANR에서 (우라늄의 독성: biomineralization의 다단계 접근 뼈, ANR-16-CE34-0003에서에서 처리). 이 작품 또한 좋은 소피아 앙 티 폴리스는 CNRS의 대학에 의해 지원 되었다.

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<li>Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uranium+in+the+tissues+of+an+occupationally+exposed+individual%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Phys%22%5BJournal%5D)">Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual.</a> Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).</li>
<li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+effects+of+uranium+in+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Renal effects of uranium in drinking water.</a> Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).</li>
<li>Leggett, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basis+for+the+ICRP%27s+age-specific+biokinetic+model+for+uranium%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Phys%22%5BJournal%5D)">Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium.</a> Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).</li>
<li>Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+as+target+organ+for+metals%3A+the+case+of+f-elements%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Bone as target organ for metals: the case of f-elements.</a> Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).</li>
<li>Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+action+associated+with+uranium+induced+adverse+effects+in+bone+function+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development.</a> Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).</li>
<li>Ikeda, K., Takeshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+osteoclast+differentiation+and+function+in+skeletal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis.</a> J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).</li>
<li>Teiltelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoclast+and+its+unique+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The osteoclast and its unique cytoskeleton.</a> Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).</li>
<li>Nesbitt, S. A., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+matrix+collagens+through+bone-resorbing+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts.</a> Science. 276 (5310), 266-269 (1997).</li>
<li>Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+osteoclast+bone+resorption+products+by+transcytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis.</a> Science. 276 (5310), 270-273 (1997).</li>
<li>Pierrefite-Carle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+natural+uranium+on+the+UMR-106+osteoblastic+cell+line%3A+impairment+of+the+autophagic+process+as+an+underlying+mechanism+of+uranium+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity.</a> Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).</li>
<li>Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uranium+inhibits+bone+formation+in+physiologic+alveolar+bone+modeling+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Res%22%5BJournal%5D)">Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling.</a> Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).</li>
<li>Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ethane-1-+hydroxy-1%2C1-bisphosphonate+%28EHBP%29+on+endochondral+ossification+lesions+induced+by+a+lethal+oral+dose+of+uranyl+nitrate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate.</a> Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).</li>
<li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+as+a+possible+target+of+chemical+toxicity+of+natural+uranium+in+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water.</a> Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).</li>
<li>Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL-mediated+osteoclast+formation+from+murine+RAW+264.7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells.</a> Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).</li>
<li>Beranger, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+poly%28ADP-Ribose%29+polymerase-1+and+JunD%2FFra2+accounts+for+RANKL-induced+Tcirg1+gene+expression+during+osteoclastogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).</li>
<li>Mirto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+uranium%28VI%29+speciation+for+the+evaluation+of+in+vitro+uranium+cytotoxicity+on+LLC-PK1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Exp.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells.</a> Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).</li>
<li>Carrière, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+uranium+speciation+on+normal+rat+kidney+%28NRK-52E%29+proximal+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity.</a> Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).</li>
<li>Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+accumulation+and+distribution+of+uranium+and+lead+in+osteoblastic+cells+as+a+function+of+their+speciation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation.</a> Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).</li>
<li>Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+and+phenotypic+effects+of+uranium+and+lead+on+osteoblastic+cells+are+highly+dependent+on+metal+speciation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation.</a> Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).</li>
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<li>Motiur Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation-coupled+osteoclast+differentiation+by+RANKL%3A+Cell+density+as+a+determinant+of+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation.</a> Bone. 81, 392-399 (2015).</li>
</ol>

저자 공개할 게 없다

우리가 알기로 이것이 처음으로 뼈 세포를 resorbing에 자연 우라늄의 효과 연구를 목표로 자세한 절차 설명 하. 이 방법은 뼈 생리학에 우라늄 영향의 더 나은 이해를 달성 하는 데 유용 되며 우라늄 chelators의 심사에 대 한 흥미로운 새로운 도구를 제공할 수 있습니다. 또한, 우리는 여기에 설명 된 프로토콜 osteoclatogenesis에 다른 중 금속의 영향을 연구에 적용 될 수 믿습니다.
그것은 알려져 그 uranyl는 문화 미디어18,19,,2021에 무기 및 유기 구성 요소와 complexed. 이러한 complexations speciation 우라늄의 그리고,이 방법으로, 그것의 세포 독성 영향. 이러한 이유로, 프로토콜에 중요...

우라늄은 자연 발생 방사능 요소 토양, 공기 및 물;에 따라서, 동물과 인간은 그들의 규정식에 있는 자연 우라늄에 노출 됩니다. 자연 소스 뿐만 아니라 우라늄 어떤 환경에서 그것의 풍부를 증가 anthropogenic 활동에서 유래. 우라늄 화학 및 방사능 위험 포즈. 그러나, (이 동위 원소 혼합물 포함 99.27 238U, 0.72 235U, 그리고 0.006 234U) 자연 우라늄 낮은 특정 활동 (25.103 Bq.g-1)가 있기 때문에 건강에 미치는 영향에 기인의 화학 독성입니다.
무엇이 든 해당 항목 경로 (흡입, 섭취, 또는 피부 노출), 대부분 우라늄의 배설물 제거는 시체를 입력 하 고 단지 작은 부분에 도달 하면 조직의 순환. 혈액에서 우라늄의 약 67%에 신장에 의해 필터링 되 고 24 h1내 소변에서 시체를 나뭇잎. 나머지는 주로 신장과 뼈, 우라늄의 독성2,,34의 두 가지 주요 표적 기관에 입금 됩니다. 여러 연구 탐험 실시 되어 골격 우라늄 장기 보존2,,34,,56의 주 사이트 발견 되었습니다, 때문에 골 생리학7에 우라늄의 효과.
뼈는 일생에 걸쳐 지속적으로 리 모델링 광물 화 된 조직 이다. 뼈는 복잡 한 프로세스 전문된 셀 형식에 따라 달라 집니다 이며 대부분의 두 단계로 구성 됩니다: osteoclasts 하 여 기존의 오래 된 매트릭스의 재흡수 osteoblasts 드 노 보 뼈 구조에 의해 옵니다. Osteoclasts 있습니다 큰 多 어디 그들은8뼈를 연결 하는 재흡수 사이트로 마이그레이션하는 조 혈 근원의 전조 세포의 융해에서 유래. 그들의 첨부 파일은 그들의 골격9의 광범위 한 개편으로 동시에 발생합니다. 이 개편은 셀과로 osteoclast secretes 양성자, hydroxyapatite, 및의 저하에 관련 된 프로 테아의 해체로 이어지는 뼈 표면 사이 격리 된 구획의 설립을 위한 필요는 유기 매트릭스입니다. 결과 저하 제품 endocytosed, 뼈 표면에 반대 막 영역에 셀을 통해 수송 되며, 분 비, transcytosis10,11을 불리는 과정.
Vivo에서 그리고 생체 외에서 학문에서 결과 우라늄 뼈 형성 억제와 osteoblasts7,12의 활동을 변경 나타냅니다. 대조적으로, 뼈 재흡수 및 osteoclasts에 우라늄의 효과 제대로 탐험 되었습니다 있다. 여러 vivo에서 연구 쥐 또는 쥐13,14uranyl 질 산의 관리 후 뼈 재흡수의 향상을 보고 있다. 또한, 역학 조사는 식 수를 통해 우라늄 섭취의 증가 경향이 남자15뼈 재흡수 표시자의 혈 청 수준에 있는 증가와 관련 된 제안 했다. 함께 찍은, 이러한 결과 우라늄, 뼈에 축적 되어 뼈 재흡수를 홍보할 수 있는 결론으로 이끌어 냈다. 그러나, 우라늄의이 잠재적인 효과에 관련 된 세포 메커니즘 미결 문제 남아 있다. 이러한 이유로, 우리는 뼈 세포 resorbing의 동작에 우라늄의 영향을 검사 하기로 결정 했다.
여기, 우리는 우리가 설정한 프로토콜 설명 하 특성화 고와 osteoclasts 차별화 및 resorptive 활동 사전 osteoclasts 생존에 자연 우라늄의 효과 계량. 여기에 설명 된 실험 RAW 264.7 murine 변형 된 macrophage 셀 라인,는 쉽게 osteoclasts 때 4 ~ 5 일에 대 한 cytokine RANKL의 존재 양식으로 분화 할 수 있다 하 고 고전적인 연구에 사용 되는 할 osteoclast 차별화 및 기능16. 개발 절차는 신뢰할 수 있는, 높은 재현성 결과는 완전히 기본 osteoclasts에 적용. 모든 이러한 이유로, 우리는이 방법론은 뼈에 우라늄 독성에 관련 된 분자 메커니즘을 더 잘 이해 해 줘 유용 믿습니다. 또한, 우리는이 이렇게 새로운 우라늄 킬레이트 화 대리인 확인을 위한 검사 도구로 적응 될 수 있다고 생각 합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>EMEM 페놀 레드</td><td>Lonza</td><td>12-668E</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양용 물</td><td>Lonza</td><td>BE17-724F</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; L-글루타민 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 용액 0.4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 소 태아 혈청</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>7.5% 중탄산나트륨 수용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Lekocyte(TRAP) 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>티아 졸릴 블루 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분말</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>M5655</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>알리자린 레드 S 나트륨 염, 1 % w / v aq. sol.</td><td>Alfa Aeros</td><td>42746</td><td></td></tr><tr><td>Osteoassay 골 흡수 플레이트, 24웰 플레이트</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>플라스크 75cm2</td><td>Falcon</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 원추형 튜브 50ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>셀 스크레이퍼 30cm</td><td>TPP</td><td>90003</td><td></td></tr></tbody></table>년

생체 외에서 osteoclastogenesis에 자연 우라늄의 영향을 분석 하기 위한 방법

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

우라늄은 뼈 생리학 방해을 보여줘 왔다 그리고 그것은 잘이 금속 뼈에 축적 되어 설립. 그러나, 작은 뼈 세포의 행동에 자연 우라늄의 효과 대 한 알려져 있다. 특히, osteoclasts 뼈 매트릭스의 재흡수에 대 한 책임 셀에 우라늄의 충격은 문서화 되어 있지. 이 문제를 조사, 우리 osteoclast 선구자의 모델로 자연 우라늄의 원본과 murine RAW 264.7 세포 라인으로 uranyl 아세테이트를 사용 하 여 새 프로토콜을 설립 했다. 여기, 우리가 상세한 osteoclast 선구자에 우라늄 세포 독성을 테스트 하 고는 osteoclastogenesis에 그리고 성숙한 osteoclasts의 resorbing 기능에 미치는 영향을 평가 하는 데 필요한 모든 분석 실험. 우리가 개발한 조건, 특히 uranyl 포함 된 문화 미디어의 준비와 RAW 264.7 시드 셀 안정적이 고 높은 생식 결과를 얻을 수 있습니다. 또한, 우리 osteoclasts의 크기 또는 resorbed 매트릭스의 비율 등 다양 한 매개 변수 분석을 촉진 하기 위하여 소프트웨어 도구의 사용을 최적화 했습니다.

주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소 얼룩 3 개 이상의 핵 데 큰 보라색 셀 osteoclasts 시각화 사용 되었다. RANKL의 경작 된 RAW 264.7 세포에서 얻은 osteoclasts의 대표 이미지 그리고 uranyl 이온 그림 1에 나와 있습니다. Osteoclasts 우라늄에 대 한 응답에서의 수와 크기에 변화 전체 우물의 합성 이미지와 확대 사진을 쉽게 볼 수 있습니다.
Osteoclasts의 크기 ImageJ 소프트웨어 (그림 2)를 사용 하 여 분석 했다. 이 목적에 대 한 트랩 osteoclasts 스테인드의 전체 잘 이미지 사용 되 고 동일한 지역에 각 문화 조건의 각 잘 대우 되었다 (그림 2...

우라늄은 골 대사에 영향을 미칠으로 알려져 있다. 여기, 선물이 생존, 분화, 및 osteoclasts 뼈 재흡수를 담당 하 고 세포의 기능에 자연 우라늄 노출의 효과 조사 하기 위한 프로토콜.

생체 외에서 Osteoclastogenesis에 자연 우라늄의 영향을 분석 하기 위한 방법

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

이 절차의 전반적인 목표는 자연 우라늄 노출이 파골세포의 생존력, 분화 및 기능에 미치는 영향을 조사하는 것입니다. 이 방법은 우라늄 노출이 뼈의 생리학 및 신진대사에 미치는 영향에 대한 환경 독성 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 우라늄 발신자를 선별하기 위한 흥미로운 새로운 도구를 제공한다는 것입니다.RAW 264.7 세포 배양이 85-90% 포화도에 도달하면 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포 배양 플라스크 바닥에서 세포를 기계적으로 들어 올리고 세포를 멸균 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포 용액을 몇 번 피펫팅하여 덩어리를 분해하고 생성된 단일 세포 현탁액을 계수합니다. L-글루타민과 5%의 소 태아 혈청을 보충한 알파 변형 최소 필수 배지에서 밀리리터당 10-4 세포 농도로 세포를 1배 희석하고 24웰 세포 배양 플레이트에 웰당 1밀리리터의 세포를 추가하여 섭씨 37도에서 6시간 배양합니다.파골세포 분화 및 재흡수 분석의 재현성을 위한 중요한 매개변수는 세포 파종 밀도입니다. 세포를 도금하기 전에 세포 계수, 세포 현탁액 준비 및 균질성에 특히 주의하십시오. 소변 염 용액을 준비하려면 멸균 세포 배양 테스트를 거친 7.5% 중탄산나트륨 수용액에서 시작하여 먼저 100밀리몰의 중탄산염을 준비하고 얼음 위의 물에 냉각한 다음 100밀리몰 소변기 아세테이트 용액 1부피를 얼음처럼 차가운 중탄산염 용액 9부피에 부드럽게 흔들어 한 방울씩 추가합니다.용액이 실온에서 평형을 이루도록 합니다. 3시간 후, 원하는 소변기 작업 농도에 도달할 때까지 RANKL 밀리리터당 50나노그램을 포함하는 분화 배지에 적절한 부피의 소변기 용액을 한 방울 한 방울 희석하고 실온에서 다시 3시간 동안 평형을 이룹니다. 소변기 소금을 희석할 때마다 긴 배양 단계는 용액 내 소변기 복합체의 안정화에 필수적입니다.두 번째 평형 기간이 끝나면 각 웰의 배지를 1ml의 소변기 처리 배지 또는 적절한 조절 배지로 부드럽게 교체하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 다핵 파골세포는 배양 3일에서 4일 사이에 나타나야 합니다. 새로 분화된 파골세포의 크기와 형태를 평가하려면 제조업체의 지침에 따라 타르타르산염 내성 산 인산가수분해효소로 세포를 염색하고 세포핵을 구별하기에 충분한 해상도로 각 웰의 전체 표면을 이미지화합니다.모든 웰의 이미지가 생성되면 오픈 소스 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 한 웰의 이미지를 열고 배율 단위를 확인합니다. 그런 다음 팝업 창에서 전역 상자를 선택하여 이후의 모든 이미지에 새 배율 단위를 적용합니다. Analyze(분석) 메뉴에서 Set Measurements(측정 설정)를 선택하고 Area(영역) 및 Display(레이블) 상자를 선택합니다.다른 모든 상자의 선택을 취소합니다. 분석 메뉴에서 도구를 연 다음 관심 영역 관리자를 열고 기본 ImageJ 창에서 직사각형 선택 도구를 선택합니다. 약 1, 000x-1, 000마이크로미터의 관심 영역을 간략하게 설명하고 추가 버튼을 클릭하여 선택 항목을 관심 영역 관리자에 추가합니다.그런 다음 More(추가), Save(저장)를 클릭하여 지역을 저장합니다. 분석할 5개 영역 중 하나의 복사본을 만들려면 관심 영역 관리자에서 관심 영역을 선택하고 선택한 영역 내부를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 영역을 복제합니다. Show All 및 Labels 상자를 선택하고 polygon selection 도구를 선택하여 복제된 관심 영역에 있는 파골세포 중 하나의 윤곽을 수동으로 윤곽을 그립니다.이 개요를 Region of Interest Manager에 추가하려면 Region of Interest Manager 창에서 Add를 클릭합니다. 모든 파골세포가 추가되면 모든 윤곽선을 선택하고 측정을 클릭하여 해당 표면을 측정합니다. 그런 다음 결과 창에 나타나는 측정값을 스프레드시트로 전송합니다.소변기 처리된 파골세포의 기능을 평가하기 위해, 분화 배지를 추가하기 하루 전에 방금 시연한 바와 같이 85-90% 융합 세포 배양의 RAW 세포를 성장 배지의 24웰 골 분석 플레이트에 플레이트화합니다. 다음날, 방금 시연된 것처럼 상등액을 분화 소변기가 포함된 배지로 부드럽게 교체하고 RAW 세포가 파골세포로 분화하도록 합니다. 파골형성 5일째에 소변기가 포함된 배지를 10% 표백제 용액으로 교체하여 뼈 모방 표면에서 세포를 제거합니다.실온에서 5분 후 우물을 탈이온수로 두 번 씻고 자연 건조시킵니다. 다음으로, 각 웰의 재흡수되지 않은 부분의 칼슘 염을 1 % Alizarin Red S 나트륨 염 용액으로 염색합니다. 10-15초 후에 알리자린 용액을 제거하고 물로 웰을 3-4회 부드럽게 씻습니다.알리자린 염색 웰의 RGB 이미지를 회색조 8비트 형식으로 변환하려면 이미지 메뉴에서 유형 및 8비트를 선택합니다. 그런 다음 타원형 선택 도구를 사용하여 방금 설명한 것처럼 흡수를 위해 분석할 우물의 전체 표면을 간략하게 설명하고 관심 영역을 저장합니다. 임계값을 쉽게 선택하려면 편집(Edit) 및 외부 지우기(Clear Outside)를 선택하여 정의된 관심 영역 밖에 있는 모든 피쳐를 지웁니다.방금 설명한 대로 관심 영역을 복제하고 이미지 메뉴에서 Adjust Threshold를 선택하고 슬라이드 바를 조정하여 적절한 임계값을 선택합니다. 모든 재흡수 영역은 임계값 위에 있어야 하고 흰색으로 표시되어야 하며, 모든 재흡수되지 않은 영역은 임계값 미만이어야 하며 빨간색으로 표시되어야 합니다. 임계값 선택을 완료하려면 임계값 창에서 적용을 클릭하고 최종 이진 이미지를 원하는 적절한 형식으로 저장합니다.관심 영역 내에서 수행할 측정을 정의하려면 Analyze(분석) 메뉴에서 Set Measurements(측정 설정)를 선택하고 Area(영역), Area Fraction(면적 분수) 및 Limit to Threshold(임계값 제한) 상자를 선택하고 다른 모든 상자는 선택 취소합니다. 그런 다음 결과 창 내에서 직접 흡수된 영역의 비율을 얻으려면 편집 메뉴에서 반전을 선택하고 최종 이진 이미지에서 주요 관심 영역이 선택되었는지 확인하고 흡수된 영역 비율을 측정하여 복제된 이진 이미지를 반전합니다. 우라늄에 대한 반응으로 새롭게 분화된 파골세포의 수와 크기의 변화는 전체 우물의 합성 이미지뿐만 아니라 선택된 관심 영역의 확대 사진에서도 쉽게 볼 수 있습니다.서로 다른 배양 조건에서 성장한 파골세포의 크기는 각 영역 내의 모든 파골세포를 간략하게 설명하고 윤곽이 그려진 각 세포의 면적을 측정하여 설명한 것처럼 분석할 수 있습니다. 파골세포 흡수 활성에 대한 우라늄의 영향을 조사하기 위해 RAW 264.7 세포를 골 모방 표면판에서 도금하고 분화합니다. 분석이 끝나면 파골세포를 제거하고 재흡수되지 않은 영역을 염색하고 시연된 대로 이미지화합니다.그런 다음 이미지는 8비트 그레이스케일로 변환되고 임계값이 설정되어 재흡수 영역의 계산을 용이하게 합니다. 이 절차는 다른 중금속이 파골형성에 미치는 영향에 대한 연구에도 적용될 수 있습니다.

methods-for-analyzing-impacts-natural-uranium-on-vitro

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에서는 파골세포 전구세포의 파골세포 형성 과정인 파골세포 형성에 대한 다양한 항-c-fms 항체 농도의 효과를 보여줍니다.

생쥐 골수 세포의 골수 형성에 대한 Anti C-fms 항체의 효과시험관 내

파골 세포는 신체의 주요 뼈 재 흡수 세포이다. 많은 수의 파골 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 파골 세포 생물학의 이해에 상당한 발전을 가져왔다. 이 프로토콜에서는 배양 및 in vitro에서 파골 세포 활성을 정량화, 단리하는 방법을 설명한다.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

생산 블리드 워터 (PBW)는 산화 구리 나노 입자 (CuO-NPs)로 처리되고 배양 된 인간 세포에서 세포 독성을 평가했다. 이 프로토콜의 목표는 CuO-NP 처리로 인한 독성의 변화를 평가하는 세포 배양 형식으로 네이티브 환경 샘플을 통합하는 것이 었습니다.

우라늄에서 구리 산화물 나노 입자에 의한 미량 원소의 제거<em&gt; 현장에서</em&gt; 복구 블리드 물과 세포 생존에 미치는 영향

선물이 두 인간의 뼈 세포 선으로 발표 하는 소포에 미네랄의 상태를 비교 하는 프로토콜: hFOB 1.19와 Saos-2. 그들의 강화 프로 파일에 의해 알리자린 레드-S (아칸소-S) 얼룩, 자외선 (UV) 빛 시각화, 전송 전자 현미경 (TEM) 이미징 및 에너지 흩어진 엑스레이 microanalysis (EDX)을 분석 했다.

미네랄 hFOB 1.19에 의해 생산 및 Saos-2 세포를 사용 하 여 전송 전자 현미경 에너지 흩어진 엑스레이 Microanalysis와 분석

파 골 세포는 조 혈 간세포의 대 식 세포 혈통에서 유래한 조직 특유의 대 식 세포 폴 리 에틸렌 이다. 이 프로토콜은 기존의 방법에서 발견 되는 사고의 위험을 줄이면서 많은 양의 파 골 세포를 얻을 수 있도록 골 수 셀을 분리 하는 방법을 설명 합니다.

쥐 골 골에서의 파 골 세포 전 구체의 분리, 정제 및 분화

이 프로토콜 포함 murine 긴 뼈와 골 절연, 골 수 세포를 생성 하 고 osteoclasts 대 식 세포 콜로 니 계수 (M-CSF) 및 핵 요인 Kappa B ligand (RANKL)의 수용 체 활성을 자극을 사용 하 여 생산의 해 부 또는 종양 괴 사 요인 알파 (TNF-α) 그리고 안티-c-fms 항 체, M-CSF 수용 체에 의해 그들의 체포.

Osteoclast 형성과 생체 외에서 Osteoclast 선구자의 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과

이 프로토콜은 방사성 표지 된 아미노산 섭취 분석을 제시하며, 이는 일차 세포 또는 분리 된 뼈에서 아미노산 소비를 평가하는 데 유용합니다.

배양된 뼈 세포와 분리된 뼈축의 아미노산 소비 평가

실시간 세포 대사 플럭스 분석은 pH 및 산소 센서를 사용하여 미토콘드리아 및 글리콜 아데노신 삼인산염 생산에 해당하는 산소 소모율 및 세포외 산성화 속도를 측정합니다. 원고는 조골 세포의 에너지 상태와 세포 생물 에너지 상태의 특성화 및 해석을 이해하는 방법을 설명합니다.

실시간 세포 대사 플럭스 분석기를 사용하여 조골세포 생물에너지 모니터링

여기에서, 우리는 인산칼슘 코팅 세포 배양 플레이트를 이용한 재흡수 구덩이 분석을 위한 간단하고 효과적인 분석 절차를 제시한다.

시험관 내에서 파골세포 재흡수를 시각화하고 정량화하는 간단한 구덩이 분석 프로토콜

여기에서는 중추신경계 수초화의 시험관 모델을 통해 희소돌기아교세포에서 희소돌기아교세포의 역할을 구체적으로 조사하기 위해 희소돌기아교세포 전구세포를 바이러스로 조작하여 관심 단백질을 과발현할 수 있는 유연하고 전략적인 기반을 제공하는 프로토콜을 제시합니다.

생산 및 선택적으로 형질 도입 기본 희소 돌기 아교 세포 전구체 세포에 렌티 바이러스의 사용을위한 체외 수초 분석

배우세요 생체 외에서 자연 우라늄이 파골세포 생존율, 분화 및 기능에 미치는 영향을 분석하는 방법을. RAW 264.7 세포 배양을 활용한 이 기술은 환경 독성학 분야에서 뼈 대사에 대한 우라늄 노출의 영향을 연구하는 새로운 도구를 제공합니다.

생체 외에서 Osteoclastogenesis에 자연 우라늄의 영향을 분석 하기 위한 방법

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