Name: 혈 청 및 혈장 복사 번호 검출 실시간 PCR를 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 학습하세요 혈청 및 혈장 DNA에서 실시간 PCR을 이용한 유전자 복사 수 변이 검출 방법을 통해 전립선암 약물 내성 예측 마커를 식별하는 기술입니다. 이 기법은 빠르고 민감하여 임상 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리 데이터 분석에서 지원에 대 한 키 아 라 Molinari와 필리포 Martignano 감사합니다.

복사 번호 분석을 위한 실시간 PCR을 수행 하기 위해 혈 청 또는 혈장 샘플에서 DNA의 격리 프로토콜에 의하여 이루어져 있다. DNA 추출, DNA 수량 제어 (분 광 광도 계)와 특정 대상에 대 한 실시간 PCR 수행 했다. 그림 1, 절차 및 타임 라인의 요약 보고 합니다.
프로토콜은 IRST 인간의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1. 혈 청 수집 및 처리
<ol>
	<li>약 5 mL의 전 혈 혈 청을 얻기 위해 응고 제 없이 혈 청 튜브에 수집 합니다. 처리까지 4 ° C에서 혈액 튜브를 유지 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기 튜브</li>
	<li>조심 스럽게 2 mL 튜브에 혈 청을 전송 합니다.</li>
	<li>수집 관을 무시 하 고 즉시-80 ° C에서 상쾌한 사용까지 동결.</li>
</ol>
2. 플라즈마 수집 및 처리
<ol>
	<li>플라즈마를 EDTA와 플라즈마 튜브에서 약 10 mL 전 혈을 수집 합니다. 튜브를 완전히 작성 하 고 8 시간 그것을 반전. 처리까지 4 ° C에서 혈액 튜브를 유지 합니다.</li>
	<li>튜브는 원심 분리기에 없는 브레이크 설정 실 온에서 15 분 동안 1800 x g에서 원심</li>
	<li>조심 스럽게 2 mL 튜브에는 플라즈마의 위쪽 부분을 전송 합니다. 화이트 셀 레이어 위에 상쾌한의 적어도 1 mL을 떠나는 전송을 반복 합니다. 참고: 셀 또는 셀 파편 오염 위험 감소는 상쾌한의 위쪽 부분을 전송.</li>
	<li>수집 관을 무시 하 고 즉시-80 ° C에서 상쾌한 사용까지 동결.</li>
</ol>
3. DNA 분리 혈 청 또는 혈장에서
주: 혈 청 또는 플라스마에서 DNA의 분리 수행 되어야 한다 상업 프로토콜 다음 단계에서 수정을 사용 하 여.
<ol>
	<li>(0.5에서 2 mL에 포함 되는) 하는 한 약 수 혈 청 또는 플라스마 실 온에서 녹여</li>
	<li>소용돌이 샘플을 혼합 하 고 명확한 1.5 mL 튜브에 혈 청 또는 혈장 0.5 mL를 전송. -80 ° c.에 재료의 나머지를 고정</li>
	<li>샘플에 직접 가수분해 k (20 mg/mL)의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>샘플에 0.5 mL의 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 pipetting으로 잘 혼합.</li>
	<li>튜브를 닫고 열 블록에 15 분 동안 56 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>제조업체의 지침에 표시 된 대로 표시 된 양의 100% 에탄올 워시 버퍼 1과 2에 추가 합니다.</li>
	<li>실내 온도에 다시 샘플을 가져올 하 고 절대 에탄올의 0.5 mL을 추가 pipetting으로 잘 혼합.</li>
	<li>3.7 분리 및 6000 x g에서 원심 분리기는 1 분 동안에 단계에서 얻은 혼합물의 650 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>통해 흐름을 포함 하는 튜브를 삭제 하 고 새로운 깨끗 한 컬렉션 튜브에 열을 놓습니다. 3.8 및 3.9 단계 한 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>습윤 열과 1 분 동안 6000 x g에서 원심 분리기의 테두리 없이 워시 버퍼 1, 500 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>통해 흐름을 포함 하는 튜브를 삭제 하 고 새로운 깨끗 한 컬렉션 튜브로 교체.</li>
	<li>습윤 십 분 (20000 x g) 최고 속도로 원심 분리기의 테두리 없이 워시 버퍼 2, 500 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>통해 흐름을 포함 하는 튜브를 삭제 하 고 새로운 깨끗 한 컬렉션 튜브로 교체.</li>
	<li>최고 속도로 (20000 x g) 어떤 잔여 세척 버퍼를 제거 하려면 3 분 원심.</li>
	<li>장소는 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 열. 차입 버퍼의 150 µ L을 추가 하 고 해당 버퍼 늦으면 열 수 있도록 7 분을 기다립니다.</li>
	<li>1 분 동안 8000 x g에서 원심.</li>
	<li>DNA의 최대 복구를 보장 하기 위해 1 분 동안 다시 같은 열과 (20000 x g) 최고 속도로 원심 분리기에 단계의 3.16 elute 플라스틱</li>
</ol>
4. DNA 정량화 및 희석
<ol>
	<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA의 정량화를 수행 합니다. 샘플의 2 µ L를 사용 하 여 제조 업체의 지시 당 벤치 정상 분 광 광도 계에. 참고: 경우 DNA 수량 실시간 PCR를 계속 충분 하지 않습니다 (적어도 120 ng), 새로운 DNA 분리 과정을 수행.</li>
	<li>마지막 볼륨 (약 50 µ L) 모든 실시간 PCR를 위한 충분 한 2.5 ng / µ L를 혈 청 또는 플라스마에서 DNA를 희석.</li>
</ol>
5. 실시간 PCR
<ol>
	<li>Thaw 복사 번호 분석 실험, 참조 유전자 분석 결과, 희석 DNA 샘플 및 교정기 얼음에 풀링된. 실 온에서 4 ° c.에 저장 된 마스터 믹스 equilibrate</li>
	<li>각 샘플의 풀링된 교정기 3 복제에 대 한 대상 분석 결과의 참조 유전자 분석 결과, 1 µ L, 믹스 마스터의 10 µ L의 1 µ L의 혼합을 준비 합니다. 혼합 부정적인 제어 (물) 및 2 추가 샘플을 준비 합니다.</li>
	<li>96 잘 접시, 각 우물에 혼합의 aliquot 12 µ L에서. 피 펫 또는 스핀 튜브 하지 않습니다.</li>
	<li>각 DNA 샘플의 각 음에 풀링된 교정기 8 µ L (2.5 ng / µ L의 농도)를 추가 합니다. 피 펫 또는 스핀 튜브 하지 않습니다. 각 잘에 대 한 팁을 변경 합니다. 참고: 30 DNA 샘플 96 잘 접시를 사용 하 여 각 실시간 실험에 대 한 처리 수: 30 x 3 샘플 + 1 x 3 교정기 풀링된 + 부정 제어 = 94.</li>
	<li>짧게 1000 x g에서 접시를 회전 합니다.</li>
	<li>다음 프로토콜을 사용 하 여 접시를 실행: 15 95 ° C에서 40 주기를 10 분 동안 95 ° C에 단계 개최 s, 그리고 1 분 동안 60 ° C.</li>
</ol>
6. 데이터 분석 및 해석
<ol>
	<li>증폭 플롯 결과 아래에 "옵션" 섹션에서 첫 번째 대상 유전자 분석에 대 한 0.2에서 Ct 임계값을 설정 합니다. 각 대상 또는 참조 유전자에 대 한 집합을 반복 합니다. .Txt 확장명에 실시간 PCR 파일을 내보내려면, 도구 모음에 "내보내기"를 누릅니다. 플래그 "결과"만 선택 → 내보낼 데이터 선택 파일 형식으로는 확장명.txt → 언론 "수출 시작" → 가까이 내보내기 도구.</li>
	<li>분석 소프트웨어를 열고 가져올 파일.txt (도구 모음 → 가져오기).</li>
	<li>분석 하 고 도구 모음 (재생 기호)에 의해 분석 설정을 선택 파일 이름을 선택 합니다.</li>
	<li>보정 샘플 및 대상 ( AR 유전자에 대 한 복사예를 들어, 1)의 사본의 알려진된 수를 지정 합니다. 보도 자료 "적용 됩니다."</li>
	<li>각 샘플에 대 한 다른 우물에 비해 다른 델타 Ct (ΔCt) 한 음을 생략 합니다.</li>
	<li>실험 (언론 플레이 기호) 분석</li>
	<li>바 작 또는 테이블 복사본 수로 결과 평가 합니다. 참고: 결과 테이블 자신감, Z-점수, 및 결과 해석에 대 한 도움이 될 수 있는 분석 복제 같은 여러 매개 변수를 포함 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+as+a+diagnostic+marker+for+cancer%3A+current+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Onco+Targets+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights.</a> Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).</li>
<li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+as+a+liquid+biopsy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer.</a> Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).</li>
<li>Murtaza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+analysis+of+acquired+resistance+to+cancer+therapy+by+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA.</a> Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).</li>
<li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+detection+of+genome-wide+somatic+copy+number+alterations+by+liquid+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).</li>
<li>Diaz, L. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).</li>
<li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li>
<li>Romanel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+AR+and+abiraterone-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer.</a> Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).</li>
<li>Conteduca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptor+gene+status+in+plasma+DNA+associates+with+worse+outcome+on+enzalutamide+or+abiraterone+for+castration-resistant+prostate+cancer%3A+a+multi-institution+correlative+biomarker+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study.</a> Ann Oncol. , (2017).</li>
<li>Attard, G., Antonarakis, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer%3A+AR+aberrations+and+resistance+to+abiraterone+or+enzalutamide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide.</a> Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).</li>
<li>Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+genomic+DNA+in+plasma+and+serum+samples%3A+higher+concentrations+of+genomic+DNA+found+in+serum+than+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma.</a> Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).</li>
<li>Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+preanalytical+factors+on+the+molecular+size+of+cell-free+DNA+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.</a> Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

AR 혈 청 및 혈장 샘플에서 CN 분석 거세 저항 전립선 암 (CRPC) 환자의 계층에 대 한 새로운, 비-침략 적 접근 방식을 나타냅니다. 그것은 최근 증명 되었습니다 아칸소 CN CRPC 환자 화학 요법7,8,,910전후 abiraterone와 enzalutamide, 치료 결과 예측 수 있다.
우리의 접근 방법의 주요 장점은 DNA 분리 과정, 한 실시간 PCR 분석 및 쉬운 데이터 해석의 구성 된 프로토콜을 수행 하기 위해 매우 간단한는입니다. 또한, 테스트 수 있습니다 신속 하 게 수행된에 1 작업 일, 그리고 절차는 비싼 (각 샘플에 대 한 $20 USD 약). 우리는이 방법은 높은 재현성을 맞춰 디지털 PC...

순환 하는 혈액에서 세포 무료 DNA (cfDNA) 암 진단, 예 후, 모니터링 및 치료 저항1,2의 예측에 대 한 생체의 최적의 원본 증명 되었습니다. 많은 연구 DNA 변경 (돌연변이, 복사 번호 유사 조직에 epigenetic 수정)와 해당 플라즈마 샘플1, 순환 종양 DNA (ctDNA)는 확인 그 사이 좋은 색인 기본 및 전이성 종양 조직 변경3에 대 한 유익한. CtDNA의 가능성은 따라서 게놈 재배열 및 특정 oncogenes4, 잠재적으로 전이성 클론와 subclonal 셀 식별에 복사 번호 유사 (CNVs)의 재건에 대 한 수 있습니다. CtDNA 임상 암 치료 모니터링으로 특정 돌연변이 관련 특정 표적으로 한 치료5,6, CNVs 항구에 특히 유용한 것으로 표시 되었습니다. 그것은 또한 조직 생 검에 대 한 필요를 극복 하 고 결과 비-침략 적 방식으로 특정 암 치료 기간 동안 서로 다른 시간에 얻을 수 있습니다.
전립선 암, 순환 셀 무료 안 드로 겐 사이의 중요 한 상관 관계에 관해서는 수용 체 (아칸소) CNVs 및 치료 응답 abiraterone와 enzalutamide로 표시 되었습니다, 나타내는 AR 유전자 복사 번호 (CN) cfDNA에 있을 수 있습니다는 치료 저항7,,89,10,11예측 가능한 유망 바이오 마커. CtDNA에 특정 유전자의 CNVs 다른 감도, 비용 및 속도으로 다른 접근을 사용 하 여 평가할 수 있다 (예. 실시간, 디지털 PCR, 및 다음 세대 시퀀싱).
여기는 실시간 PCR 기술, 혈 청 및 혈장 샘플7,8cfDNA에 아칸소 CN을 평가 하기 위한 이중 분석에 따라 간단 하 고 빠른 방법에 설명 합니다. 전립선 암 (RNaseP, 일반 복사 번호 상태에 있는 것으로 알려져 내부 표준 기준 유전자로 intron 5 아칸소 (Xq12)의 다른 두 유전자 내에서 두 개의 다른 게놈 지역에 설계 된 두 개의 다른 PCR 분석 실험을 고려 14q11;에 전1, 1에 위치한 p 34). 우리는 정밀도 결과의 감도 증가 한 실행 하는 것이 아니라 두 기준 유전자 선택. 60의 DNA 양을 ng 각 분석 결과 조합 (결합 된 분석 결과 대 한 아칸소-assay_1 + RNaseP와 아칸소-assay_2+ AGO1)에 대 한 증폭 되었다. 건강 한 남성에서 3 개의 혈 청 또는 플라스마 DNA 샘플 풀링 되었고는 교정기로 사용. 우리 고려의 차단 &#62; 아칸소 이득에 대 한 1.5와 &#60; 삭제 0.5. 이 방법의 주요 장점 중 하나입니다 그것은 유연 하 고는 다른 유전자 또한 평가 될 수 있다, 변화 하는 표준 내부 기준 유전자 종양 유형 및 특성에 근거 하 여.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer 혈청 튜브</td><td>Becton Dickinson</td><td>367814</td><td>혈청 용 전혈관</td></tr><tr><td>BD Vacutainer EDTA 튜브</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>혈장 용 전혈관</td></tr><tr><td>에탄올 절대</td><td>VWR</td><td></td><td>사용자는 다른 회사도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>TaqMan 사본 번호 분석</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4400291</td><td>FAM-dye를 사용한 사전 설계 및 검증된 분석. 다음과 같은 분석을 사용했습니다: AR_assay1: hs04107225 및 AR_assay2: hs04511283</td></tr><tr><td>TaqMan 복제 수 분석(수정됨)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4467084</td><td>VIC 염료로 변형된 사전 설계 분석: AGO1: Hs02320401_cn</td></tr><tr><td>TaqMan 복제 수 참조 분석, 인간, RNase P</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4403326</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR 마스터 믹스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4326708</td><td>Real Time PCR을 위한 마스터 믹스</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>DNA 추출 키트</td></tr><tr><td>MicroAmp 96-Well Plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>N8010560 realt time PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 분광광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>-</td>사용자는 DNA 7500 Fast Real-Time PCR 시스템을 <td>정량화하기 위해 다른 분광광도계 방법도 사용할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td></td><td>Applied Biosystem</td><td>-</td>사용자는 복제 수 분석을 위해 다른 실시간 기기인 CopyCaller Software<td>를 사용할 수도 있습니다</td></tr>. <tr><td></td><td>Applied Biosystem-Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

혈 청 및 혈장 복사 번호 검출 실시간 pcr를 사용 하 여

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

혈 청 및 혈장 세포 무료 DNA (cfDNA)은 암 진단, 예 후, 모니터링 및 치료 저항의 예측에 대 한 생체의 유익한 정보, 비-침략 적 원본으로 표시 되었습니다. 전이성 거세 저항 전립선 암 (mCRPC)에서 자주 이벤트는 안 드로 겐 수용 체 (AR) 유전자 사본 번호 (CN) 얻을 가설에서 출발, 잠재적인 예측 biomarker로 cfDNA에서이 이벤트를 분석을 제안 한다.
우리가 2 다른 실시간 PCR 분석 실험 및 2 참조 유전자 (RNaseP 및 전1)를 사용 하 여 cfDNA에 아칸소 CN 평가. DNA 양의 60 ng 각 분석 결과 조합에 대해 사용 되었다. AR CN 이득 디지털 PCR를 사용 하 여 보다 정확한 방법으로 확인 됐다. CN 변형 분석 이미 치료 저항 mCRPC의 설정에서의 예측을 위한 유익 입증 되었습니다 하지만 그것은 도움이 될 수 있습니다 또한 다른 환자의 설정에서 다른 목적을 위해. CfDNA에 CN 분석에는 여러 이점이 있다: 그것은 비 침략 적, 신속 하 고 쉽게 수행 하 고 혈 청 또는 플라스마 소재의 작은 볼륨에서 시작.

총 cfDNA 농도 모든 샘플 분석, 6.12 ng / µ L의 중간값을 보여주는 분 광 광도 법으로 정량 (범위: 2.00-23.71 ng / µ L) 혈 청 샘플 및 3.21 ng / µ L의 중간값 (범위: 2.31-8.49 ng / µ L) 플라즈마 샘플. 우리는 실시간 PCR 실험에 의해 총 115 샘플의 분석.
테스트 감도 복사 번호 분석에 대 한 보정 샘플으로도 사용 되는 건강 한 기증자 로부터 아칸소, 그리고 DNA에 대 한 높은 또는 낮은 이득이 환자에서 혈 청 혼합된 DNA를 사용 하 여 평가 했다. 그림 2에 표시, 아칸소 CN은 충분히 아칸소 이득 건강 한 기증자 DNA 유전자 이득 감지 (그림 2</st...

이 원고는 실시간 PCR 방법을 사용 하 여 혈 청 또는 플라스마 DNA에서 복사 번호 유사 분석을 설명 합니다. 이 방법은 거세 저항 전립선 암 환자에서 약물 저항의 예측에 적합 하지만 그것은 또한 다른 질병에 대 한 정보 수 있습니다.

혈 청 및 혈장 복사 번호 검출 실시간 PCR를 사용 하 여

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

이 방법의 전반적인 목표는 혈청 또는 혈장 샘플에서 유전자 복제 수 변이를 검출하는 것입니다. 이 방법은 포자 감소를 예측하거나 모니터링하는 데 유용한 마커 감지와 같은 진행성 전립선암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 쉽고 빠르게 수행할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 안드로겐 수용체 유전자 복제 수 변이가 빈번한 사건이기 때문에 진행성 전립선암 치료로 확장됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 cell-free DNA의 농도와 품질이 예상보다 낮은 경우가 많기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 혈청 수집을 위해, 1, 000 g.The 상등액에 15 분 동안 표본을 원심 분리해서 4 섭씨 온도에 유지된 항응고제 없는 전혈 그리고 혈청의 5 밀리리터 표본에서 일은, 000 g.The 혈청입니다. 2밀리리터 튜브에 넣고 펠릿을 버리십시오. 혈청이 즉시 처리되지 않는 한 샘플을 80도에서 동결하십시오.

serum-and-plasma-copy-number-detection-using-real-time-pcr

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

여기에서는 T-세포 수용체 절제원(TREC)과 K-삭제 재조합 절제원(KREC)을 동시에 정량화하는 방법을 설명합니다. TREC/KREC 분석은 흉선 및 골수 배출량의 마커로 사용할 수 있습니다.

T 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (TRECs)와 K-삭제 재조합 절제술 원 (KRECs) 실시간 PCR에 의한

순환 마이크로 RNA는 최근 각종 암 및 기타 질환에 대한 유망한 새로운 바이오 마커로 등장했다. 이 문서의 목적은 세 가지 다른 프로브 기반의 실시간 PCR 플랫폼 및 정량화 및 마이크로 RNA 순환의 풍요 로움을 결정하는 데 사용할 수있는 방법을 논의하는 것입니다.

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

염료 기반 화학 및 액적 디지털 PCR 기술을 사용한 cell-free microRNA 정량화를 위한 민감하고 정확한 방법에 대해 설명합니다.

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

이 보고서 또는 사전 증폭 없이 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 miRNA의 절대 레벨을 측정 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 플라즈마 miRNAs의 수량의 더 나은 이해를 제공 하 고 다른 연구 나 실험실에서 해당 데이터의 질적 평가 허용 한다.

Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화

원고는 칩 기반 디지털 PCR 분석 결과를 신선한 냉동 정상에 드문 CDH1 사본 이체 (CDH1a) 및 위 암 환자에서 얻은 종양 조직 검출을 설명 합니다.

칩 기반 디지털 PCR에 의해 신선한 냉동 위 암 조직에서 CDH1 드문 사본 이체의 탐지

여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

여기에서, 우리는 환자 생물학적 유체 (biofluids)에 존재하는 순환 DNA에 있는 종양 체세포 돌연변이를 검출하는 프로토콜을 제시합니다. 우리의 액적 디지털 중합효소 연쇄 반응 (dPCR) 기지를 둔 방법은 종양 돌연변이 allelic 주파수 (MAF)의 정량화를 가능하게 하고, 종양 반응의 진단 그리고 시간적 감시에 최소침습 적인 보충을 촉진하.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

여기에서는 단일 세포에서 절대 미토콘드리아(mt)DNA 복제 수와 mtDNA 결실 이형질 수준을 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

디지털 액적 중합효소 연쇄반응을 이용한 단세포 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 이형질 측정

이 원고 ctDNA, 응급실이에서 낮은 주파수의 돌연변이 검출 하는 기술을 설명 합니다. 이 메서드는 두 방향 오류 수정, 특별 한 배경 필터 및 효율적인 분자 신안의 독특한 사용에 의해 분화 된다.

다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 CtDNA에서 희소 한 변이의 탐지

이 프로토콜 주변 혈액 및 혈 청/플라즈마 다운스트림 분석 단일 염기 다형성 (SNP) 평가 및 ELISA 분석 결과 등을 저장 하는 간단 하 고 유용한 방법을 설명 합니다.

샘플 저장소 암 바이오 마커의 평가를 위한 유용한 툴으로 말린 혈액 및 혈 청 관광 명소

학습하세요 혈청 및 혈장 DNA에서 실시간 PCR을 이용한 유전자 복사 수 변이 검출 방법을 통해 전립선암 약물 내성 예측 마커를 식별하는 기술입니다. 이 기법은 빠르고 민감하여 임상 연구에 활용됩니다.

혈 청 및 혈장 복사 번호 검출 실시간 PCR를 사용 하 여

더 많은 동영상 탐색