Neurodegeneration의 초파리 모델에서 성인 등반 동작을 분석 하기 위한 자동화 된 신속한 반복 부정적인 Geotaxis 분석 결과
2017년 9월 12일
이 단계별 프로토콜 파리의 수백을 접대 하 고 전기 모터에 의해 그들의 행동을 동기화 하는 자동화 된 멀티 실린더 시스템을 사용 하 여 초파리 부정적인 geotaxis 동작을 분석 합니다. 동기화 시 디지털 기록 및 자체 디자인된 RflyDetection 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된 비행 부정적인 geotaxis 동작 분석입니다.
이 자동화된 급속 반복 부정적 지오택시스 분석의 전반적인 목표는 신경퇴행과 관련된 Drosophila 성충 등반 결손을 분석하는 것입니다. 이 방법은 신경과학 분야의 주요 질문에 답할 수 있는 도움을 줄 수 있습니다. 예를 들어, 신경퇴행과 관련된 운동 결손의 메커니즘 같은 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 파리의 등반 활동을 자동화되고 높은 정확도로 분석할 수 있다는 것입니다.
이 기술의 의미는 신경퇴행의 치료 및 진단에까지 확장됩니다. 왜냐하면 신경퇴행성 질환은 빈번하게 움직임 능력의 점진적 상실과 삶의 기간 감소 및 나이에 따른 신경퇴행과 관련이 있기 때문입니다. 우리는 이 방법에 대한 아이디어를 처음 가지게 되었습니다. 우리는 Drosophila 성충의 운동 활동을 더 정확하게 측정하고 싶었습니다.
파리 수집을 위해, 25도 섭씨, 70% 습도 및 12시간 빛, 12시간 어둠 주기에서 표준 파리 사료로 파리를 유지하는 것으로 시작합니다. 탄소 산화 마취 하에 UAS-Dicer2 DDC-GAL4 파리 처녀를 수집합니다. 처녀를 2일 된 성충 수컷 파리와 교배시키고, 남성/여성 비율은 1:2로 합니다.
각 실험 그룹마다 새로 부화한 수컷과 암컷을 각각 3개의 비알에 분리하여 수집합니다. 각 일반 파리 비알에 10마리의 파리를 표준 사료와 함께 넣습니다. 그런 다음 비알을 25도 섭씨로 설정합니다. 자동화된 RING 분석을 수행하기 위해 각 유전자형당 10마리의 수집된 남녀 파리를 각 비알에 옮깁니다.
그런 다음 나사로 비알을 고정합니다. 각 실험 세트에 대해 대조군 파리와 다른 유전자형을 가진 파리를 함께 분석합니다. 장치 앞에 배치된 디지털 카메라를 켜고 파리가 로드되어 준비되면 녹화를 시작합니다.
카메라는 수평으로 배치해야 하며, 카메라는 RING 장치에서 적절한 거리에 배치되어 모든 파리의 위치를 비교적 정확한 위치에서 캡처해야 합니다. 파리가 비알에 정착하도록 1분 동안 기다린 후, 스텝 드라이버를 제어하는 스텝 컨트롤러를 켭니다. 이는 소형 전기 모터를 제어하여 부착된 레버를 연속적으로 올리고 2초 동안 장치를 4회 두드리게 합니다.
장치를 두드린 후, 파리가 벽을 오르기 시작하는 것을 확인할 수 있습니다. 녹화가 계속 진행되는 동안, 방금 시연된 동기화를 반복하여 60초 간격으로 3~5회의 연속 시도를 반복합니다. 5, 15, 25 및 35일 된 파리에 대해 실험을 반복합니다.
각 실험 그룹에 대해 각 실험에 대해 적어도 3개의 독립적인 실험을 수행하고, 최소 30마리의 수집된 파리 또는 3개의 비알을 사용합니다. 데이터를 분석하기 위해, 녹화된 비디오를 컴퓨터에 가져옵니다. 각 시도에 대해 두드림 후 6초에 비디오의 스냅샷을 찍습니다.
R-fly 탐지 소프트웨어에서, 파일 메뉴를 사용하여 스냅샷 이미지를 가져옵니다. 다음으로, 도구 모음의 기준선 아이콘을 사용하여 비알의 상단 및 하단 기준선을 정확하게 설정한 다음, 커서를 사용하여 이미지의 상단 및 하단 기준선을 표시합니다. 설정 막대에서, 비알 내 파리 수 필드에 비알당 파리 수를 입력하고, 튜브 높이 필드에 비알 길이를 입력합니다.
개별 파리 위치는 각 비알에 대해 화면에서 점으로 감지되고 표시됩니다. 오른쪽 패널의 표에는 소프트웨어가 각 파리에 대한 등반 거리를 자동으로 결정하고, 각 비알의 10마리 파리의 평균 값을 표시합니다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시합니다.
의미 있는 P값은 일원 분산 분석과 Bonferroni 다중 비교 검정을 사용하여 계산합니다. 이 비디오에 제시된 자동화된 RING 분석을 사용하여 Dicer2 지정
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개요
본 프로토콜은 신경퇴행과 관련된 성체 초파리의 등반 능력 저하에 초점을 맞추어, 초파리의 음성 지성(negative geotaxis) 행동을 분석하는 자동화된 방법을 상세히 설명합니다. 이 기술은 다중 실린더 시스템을 활용하여 초파리의 움직임을 동기화하고 기록함으로써 운동 능력 결핍에 대한 통찰을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 행동 분석
- 신경퇴행
배경
- 초파리는 신경퇴행성 질환 연구를 위한 모델 생물로 활용됩니다.
- 음성 지성 반응 행동은 초파리의 운동 능력을 측정하는 지표입니다.
- 신경퇴행은 흔히 점진적인 운동 능력 상실과 수명 단축으로 이어집니다.
- 자동화 시스템은 행동 분석의 정확도를 높여줍니다.
연구 목적
- 신경퇴행과 관련된 초파리의 등반 능력 저하를 분석합니다.
- 운동 능력 저하의 기저 메커니즘을 탐구합니다.
- 초파리 운동 활동의 측정 정확도를 향상시킵니다.
사용된 방법
- 초파리의 동기화된 이동을 위한 자동화된 다실린더 시스템.
- 음성 지성 운동(negative geotaxis) 행동의 디지털 기록.
- 자체 설계한 RflyDetection 소프트웨어를 이용한 분석.
- 고처리량 데이터 수집을 위한 신속한 반복 분석.
주요 결과
- 정확한 분석을 위한 초파리 움직임의 성공적인 동기화.
- 신경퇴행과 연관된 등반 능력 저하의 확인.
- 자동화된 분석의 효율성 및 신뢰성 입증.
- 신경퇴행성 질환의 치료 및 진단에 대한 잠재적 시사점.
결론
- 이 자동화된 분석법은 Drosophila의 운동 행동을 연구하기 위한 견고한 방법을 제공합니다.
- 이를 통해 얻은 통찰은 신경퇴행성 질환의 치료적 접근 방식에 정보를 제공할 수 있습니다.
- 이 기술은 운동 능력과 신경퇴행성 상태 사이의 관계에 대한 이해를 높여줍니다.
자주 묻는 질문
산업 관련 요약
이 자동화된 고처리량 분석법은 신경퇴행성 질환의 Drosophila 모델에서 운동 능력 결핍을 빠르게 정량화할 수 있게 하여, 객관적이고 재현 가능한 행동 분석 결과를 제공함으로써 초기 단계의 타겟 검증을 지원합니다. 이 방법은 여러 유전자형과 연령 그룹에 걸쳐 수백 마리의 초파리를 동시에 분석할 수 있게 하여 전임상 스크리닝의 예측 신뢰도를 높이며, 화합물 또는 유전적 수정 인자의 효율적인 평가를 용이하게 합니다. 이러한 분석법을 발견 워크플로우에 통합하면 표준화되고 확장 가능한 표현형 분석을 통해 신경퇴행성 타겟의 기전적 리스크를 줄이는 데 도움이 됩니다.
바이오제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 유전 모델에서 신경 퇴행과 관련된 연령 의존적 등반 능력 저하를 정량화함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 뉴런의 무결성을 나타내는 대리 지표로서 운동 능력을 고처리량으로 측정하여 기능적 타겟 검증을 지원합니다.
- 예측적 가치: 유의미한 운동 장애를 보이는 유전형을 식별함으로써 포트폴리오 분류를 지원하는 정량적 행동 데이터를 생성합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 신경퇴행성 질환 중심의 스크리닝 캠페인에서 분석법 검증에 적합한 표준화되고 재현 가능한 음성 지성 운동(negative geotaxis) 지표를 생성합니다.
- 운용적 가치: 자동 비디오 캡처 및 RflyDetection 소프트웨어 분석을 통해 유전적 또는 약리학적 수정 인자의 신속한 스크리닝을 가능하게 합니다.
- 확장성: 1회 실행당 수백 마리 파리의 데이터를 처리함으로써 수동 분석 대비 처리량을 높이고 변동성을 줄입니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구 관련성: 신경퇴행성 질환의 임상적 운동 장애와 유사한 운동 표현형을 평가할 수 있는 질환 관련 시스템을 제공합니다.
- 전임상 연속성: 파리의 연령별(5, 15, 25, 35일) 종단적 평가를 지원하여 점진적인 신경퇴행을 모델링합니다.
- 기전적 위험 제거: 표적 특이성 및 경로 관여를 검증하기 위한 유전자 구조 실험(예: auxR/auxGFP 공동 발현)의 평가를 가능하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 분석법은 타겟 검증부터 리드 화합물 발굴에 이르는 발견 연속체(discovery continuum)에 부합하며, 신경퇴행 모델에서 유전자 조작과 표현형 결과 사이를 잇는 정량적 행동 종말점을 제공합니다.
- 발견 생물학: 반복적인 음성 굴지성 측정을 통해 유전자 발현(예: 도파민성 뉴런의 aux)을 운동 기능과 연결함으로써 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 실험 조건 전반에 걸쳐 신뢰할 수 있는 비교가 가능한 분석 준비 완료된 표준화된 결과값(6초 동안의 등반 거리)을 제공합니다.
- 분석: 그룹 간 비교 및 유의성 검정을 지원하기 위해 통계적 엄밀성(일원 분산 분석, Bonferroni 교정)을 갖춘 평균 ± SEM 데이터를 생성합니다.
- 중개 연구: 행동 판독값을 신경퇴행성 메커니즘과 연결하여, 전임상 모델에서 바이오마커와 일치하는 표현형 평가를 지원합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 유전자형, 연령 및 처리 그룹에 걸쳐 종단적 행동 스크리닝을 수행할 수 있는 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 정량화 가능한 고해상도 행동 표현형 분석을 통해 기전적 모호성을 줄임으로써 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운용적 가치: 자동화된 동기화, 디지털 기록 및 소프트웨어 기반 분석을 통해 재현성과 표준화를 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 대규모 표본에 대한 운동 능력 결핍의 신속한 평가를 가능하게 하여 go/no-go 결정 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 견고한 연령 의존적 표현형 진행 데이터를 기반으로 타겟의 위험 조정 우선순위 설정을 용이하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- Drosophila 취급, 유전적 교배 유지 및 행동 분석 설정에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 자동 RING 장치, 스텝 컨트롤러, 디지털 카메라 및 호환 조명을 포함한 전문 기기에 의존합니다.
- 비디오 가져오기, 스냅샷 추출 및 RflyDetection 소프트웨어 작동을 위한 컴퓨팅 인프라가 필요합니다.
- 환경 조건(25°C, 70% 습도, 12시간 명/암 주기)의 표준화와 바이알 준비 프로토콜이 포함됩니다.
- 전기 부품으로 인한 안전 고려 사항이 포함되며, 장치는 작동 전 고정 및 검증되어야 합니다.
