Neurodegeneration의 초파리 모델에서 성인 등반 동작을 분석 하기 위한 자동화 된 신속한 반복 부정적인 Geotaxis 분석 결과

이 자동화된 급속 반복 음성 지오택시 분석의 전반적인 목표는 신경 퇴행과 관련된 초파리 성인 등반 결손을 분석하는 것입니다. 이 방법은 신경 퇴행과 관련된 기관차 결손의 메커니즘과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 플라이 클라이밍 활동을 자동화되고 높은 증거 직업에서 분석할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 신경 퇴행성 질환이 종종 운동 능력의 점진적인 상실과 수명 단축 및 노화에 따른 신경 퇴행과 관련이 있기 때문에 신경 퇴행의 치료 및 진단으로 확장됩니다. 우리는 처음에 이 방법에 대한 아이디어를 가지고 있었습니다. 우리는 성체 초파리의 기관차 활동을 보다 정확한 방식으로 측정하고 싶었습니다.

파리 수집을 수행하려면 먼저 섭씨 25도, 습도 70%, 12시간 밝음, 12시간 어두운 주기에서 표준 파리 음식에 파리를 유지하는 것으로 시작합니다. 이산화탄소 마취 하에 UAS-Dicer2 DDC-GAL4 파리 처녀를 수집합니다. 처녀를 다음과 같은 유전자형을 가진 2 일 된 성인 수컷 파리로 교배하며 수컷 / 암컷 비율은 1 대 2입니다.

실험당 각 그룹별로 3개의 바이알에 새로 폐쇄된 수컷과 암컷을 별도로 수집하고, 표준 먹이와 함께 각 일반 파리 바이알에 10마리의 파리를 배치합니다. 그런 다음 바이알을 섭씨 25도로 설정합니다. 자동 RING 분석을 수행하려면 유전자형당 수집된 10마리의 남녀 공용 파리를 각 바이알로 옮깁니다.

그런 다음 나사로 바이알을 고정합니다. 각 실험 세트에 대해 서로 다른 유전자형을 함께 운반하는 대조 파리와 파리를 분석합니다. 기기 앞에 놓인 디지털 카메라를 켜고 파리가 적재되고 준비되면 녹화를 시작합니다.

카메라는 수평으로 배치해야 하며 카메라는 RING 장치에서 적절한 거리를 유지하여 모든 파리의 비교적 정확한 위치에서 위치를 캡처해야 합니다. 파리가 바이알에 정착할 때까지 1분 정도 기다린 후 스텝 드라이버를 제어하는 스텝 컨트롤러를 켭니다. 이것은 작은 전기 모터를 구동하여 부착 된 레버를 제어하여 2 초 동안 장치를 연속적으로 상승시키고 4 번 두드리도록합니다.

장치를 두드리면 파리가 벽을 오르기 시작합니다. 녹음이 계속 켜져 있는 상태에서 방금 설명한 대로 60초 간격으로 동기화를 반복하여 3-5회 연속 시도를 수행합니다. 5일, 15일, 25일, 35일 된 파리에 대해 실험을 반복합니다.

각 실험에 대해 각 그룹에 대해 최소 30마리의 파리 또는 3개의 바이알을 사용하여 최소 3개의 독립적인 실험을 수행합니다. 데이터를 분석하려면 녹화된 비디오를 컴퓨터로 가져옵니다. 각 평가판에 대해 탭한 후 6초 후에 동영상의 스냅샷을 찍습니다.

R-fly 감지 소프트웨어에서 파일 메뉴를 사용하여 스냅샷 이미지를 가져옵니다. 그런 다음 도구 모음의 기준선 아이콘을 사용하여 바이알의 위쪽 및 아래쪽 기준선을 정확하게 설정한 다음 커서를 사용하여 이미지의 위쪽 및 아래쪽 기준선을 표시합니다. Settings bar의 Flies in Rect 필드에 바이알당 파리 수를 입력하고 Tube Height 필드에 바이알 길이를 입력합니다.

개별 플라이 위치가 감지되고 각 바이알의 화면에 점으로 표시됩니다. 오른쪽 패널의 표에서 소프트웨어는 각 플라이의 등반 거리를 자동으로 결정하고 각 바이알에 있는 10마리의 플라이의 평균값을 표시합니다. 데이터를 평균 플러스 또는 마이너스 SEM으로 표시합니다.

Bonferroni 다중 비교 검정을 통한 일원 분산분석(One-way ANOVA)을 사용하여 유의성의 P-값을 계산합니다. 이 비디오에 제시된 자동 RING 분석을 사용하여 Dicer2 지정 파리를 분석한 결과, 수컷 파리와 암컷 파리 모두 6초 동안 연령에 따라 상승 거리가 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 도파민 또는 DA 뉴런의 보조 발현이 파리 운동 활동에 중요하다는 것을 시사합니다. 등반 능력은 DA 뉴런에서 auxGFP 오버 발현과 RNAi 표현형에서 구출된 DA 뉴런에서 auxR 및 auxGFP의 동시 발현에 영향을 받지 않는 것으로 보입니다.

일단 숙달되면 제대로 수행되면 2-3시간 동안 완료할 수 있습니다. 이러한 발전은 이제 신경과학 분야의 연구자들이 Drosophila melanogaster의 신경퇴행을 탐구하는 방법입니다. 전기 RING 장치로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하기 전에 각 확인을 단단히 고정하고 주의 깊게 확인해야 한다는 것을 잊지 마십시오.