Name: 희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: 학습하세요 인간 혈액에서 B 림프구를 분리하여 희귀 항원 결합 B 세포를 격리하고 완전한 인간 단일 클론 항체를 생성하는 방법을. 이 기술은 면역요법을 위한 정밀한 항원 표적화에 필수적입니다.

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우리는 전문가 기술 지원을 위한 Cytometry 시설 "CytoCell" (SFR 건강, Biogenouest, 낭트) 감사합니다. 우리는 그들의 기술 지원에 대 한 또한 모든 직원을의 재조합 단백질 생산 (P2R) 및 영향 플랫폼 (INSERM 1232, SFR 건강, Biogenouest, 낭트)의 감사합니다. 우리에 대 한 건설적인 의견 원고 에마뉘엘 Scotet 및 리처드 Breathnach 감사합니다. 이 작품 «Investissements d'Avenir» 프랑스 정부 프로그램, 여는 프랑스 국가 연구 기관 (ANR) (ANR-10-IBHU-005) 관리에 의해 자금 IHU Cesti 프로젝트에 의해 재정적으로 지원 되었다. IHU-Cesti 프로젝트도 낭트 메트로 지구의 드 라 루아르에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 미래의 프로그램 ANR-11-LABX-0016-01의 투자를 통해 국립 연구 기관에서 지 원하는 LabEX IGO 프로그램의 맥락에서 실현 했다.

모든 인간 주변 혈액 샘플은 로컬 윤리 위원회 (Etablissement 프랑스어 뒤 상, EFS, 낭트, 프로시저 PLER 국세청-2016-08)에 따라 동의 후 익명 성인 기증자 로부터 얻은 했다.
1. 인간 주변 혈액 단 세포의 고립
참고: 시작 물자 수 총 인간 주변 혈액 또는 cytapheresis 샘플. 샘플 8 h 이상 해서는 안 되 고 응고 (예를들면, 헤 파 린)와 보충.
<ol><li>2 볼륨 (인간 주변 혈액) 혈액 또는 5 볼륨 (cytapheresis 샘플) RPMI (로스웰 파크 기념 연구소) 매체의 희석.</li>
	<li>신중 하 게 35 mL 50 mL 원뿔 튜브에 그라데이션 중간 밀도의 15 mL에 희석된 세포 현 탁 액의 레이어. 모든 희석된 혈액을 배포 하는 데 필요한 만큼 많은 튜브를 확인 합니다. 브레이크에서 실내 온도 진동 물통 회전자에 25 분 1,290 x g에서 원심.</li>
	<li>조심 스럽게 밀도 그라데이션 매체와 플라즈마 레이어 간의 인터페이스에 단 세포 층을 발음 하 고 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송.</li>
	<li>튜브 RPMI 매체, 믹스를 실 온에서 10 분 동안 1,290 x g에서 원심. 조심 스럽게 제거는 상쾌한.</li>
	<li>20 ml RPMI 매체와는 혈소판을 제거 하는 10 분 x g 200에서 원심 분리기의 셀 펠 릿을 resuspend. 조심 스럽게 제거는 상쾌한. 일단이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>10%와 RPMI 매체에 셀 펠 릿 resuspend 태아 둔감 한 혈 청 (FBS). 참고: tetramer 라벨을 직접 진행 하거나 하룻밤 107 셀/mL의 농도에서 4 ° C에서 세포를 유지 합니다.</li>
</ol>2. Ag 특정 B 세포의 자기 농축 tetramer 관련
<ol><li>Ag-tetramers 중 PE 추가 하 여 준비 또는 APC 라는 프리미엄 학년 streptavidin 또는 BV421 표시 된 streptavidin biotinylated 항 원 단위체를 1: 4의 어 금 니 비율에서. 실 온에서 한 약 수 매 10 분을 추가 세 가지 별도 부분에 streptavidin 켤레의 적절 한 금액을 추가 합니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 세포 (3 x 10까지8 튜브 당) 고 5 분 동안 460 x g에서 원심. 참고: 다음 프로토콜 1 개의 관입니다.</li>
	<li>2%와 PBS (인산 염 버퍼)의 200 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend FBS. PE, APC 및 BV421 활용 된 tetramers, 10 µ g/mL의 최종 농도를 각각 추가 합니다. 잘 혼합 하 고 실 온에서 30 분 동안 품 어.</li>
	<li>PBS를 사용 하 여 0.5 %BSA (소 혈 청 알 부 민)과 EDTA (Ethylenediaminetetraacetic 산) 얼음 처럼 차가운 셀 분리 버퍼 (SB) 준비 2 m m.</li>
	<li>5 분 동안 460 x g에서 원심 분리에 의해 하고있다 펠 릿 세포의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>안티-APC 자기 microbeads의 안티-PE와 50 µ L의 얼음 처럼 차가운 하고있다 추가 50 µ L의 500 µ L 셀 resuspend</li>
	<li>잘 혼합 하 고 4 ° c.에 20 분 동안 품 어</li>
	<li>2.5 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>제거는 상쾌한 신중 하 게 andresuspend 얼음 차가운 SB에서 2 x 108 셀/mL의 농도에서 세포 펠 릿.</li>
	<li>SB의 3 mL와 자석에 큰 자석 열 equilibrate</li>
	<li>Equilibrated 칼럼의 상단에 2.9에서 세포 현 탁 액을 전송 하 고 완전히 방전 있습니다. 중요 한 단계: 열의 응집을 방지 하려면 70 µ m 나일론 메쉬를 통해 세포를 전달 합니다.</li>
	<li>얼음 차가운 SB의 3 mL와 셀에 포함 된 튜브를 헹 구 고 (여과, 린스 70 µ m 나일론 메쉬)의 경우 열에 직접 버퍼 전송.</li>
	<li>버퍼는 완전히 열에 물기를 때 열을 얼음 차가운 SB의 또 다른 3 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>또 다른 3 mL 세척을 위한 2.13 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 수집 관을 통해 자석과 장소에서 열을 제거 합니다.</li>
	<li>열의 맨 위에 얼음 차가운 SB의 5 mL을 추가 하 고 즉시 플런저를 사용 하 여 열에서 셀을 플러시. 일단이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 460 x g에서 수집 된 세포 (농축된 관련 tetramer 포지티브 셀 분수) centrifuge 고 추가 항 체 얼룩이 계속 합니다. 참고: 수영장 셀에서에서 수집 모든 튜브, 적절 한 경우.</li>
</ol>3. 자세-특정 인간 B 세포와 세포 분류의 얼룩
<ol><li>C d 3에 대 한 반대로 인간 항 체의 칵테일 셀 펠 릿 resuspend (마지막 희석: 1시 20분), CD19 (1:20), CD14 (1:50), CD16 (1:50), 및 7AAD (1:1000) 2%와 PBS의 100 µ L의 최종 볼륨에서 FBS. 4 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>셀, 5 분, 460 x g에서 원심 분리기에 PBS의 10 mL를 추가 하 고 제거는 상쾌한. 일단이 단계를 반복 합니다. PBS, 70 µ m 나일론 메쉬에 필터의 200 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>100 µ m-노즐 및 20 psi의 압력 셀 정렬 cytometer에 단일 세포 수준에서 특정 B 세포 1000 이벤트/s9를 초과 하지 않고 정렬로 이동 합니다. 참고: 사용 되는 제어 전략 그림 1. 에 표시 됩니다. 셀에 CD14 문이 먼저 했다-CD16-7AAD- 셀 제외 monocytes, NK, 죽은 세포 ( 그림 1에 표시 되지 않음). 다음 CD19+ B 셀 더블 스테인드 셀에 게이팅 하기 전에 PE와 송출 관련 Ag-tetramers에 의해 선정 됐다. 비 특정 B 세포 게이팅 BV421 부정적인 세포 (없는 Ag tetramer 여 흠 없는)에 의해 제외 되었습니다.</li>
	<li>8-스트립 PCR 튜브 10 µ L 1 x PBS의 RNAse 억제제의 10 단위 이전 가득 및 96 microtubes에 대 한 선반에 배치로 단일 B 세포를 수집 합니다. 즉시-80 ° c.에 PCR 튜브를 고정 참고: cytometer 악기에 선택 정렬 마스크는 마스크 수율: 0, 순도 마스크: 32, 그리고 위상 마스크: 0. 필요한 경우 단일 셀 보증금 96 또는 384 잘 PCR 접시에 조정 될 수 있었다. 단일 B 세포는 최대한 빨리 동결 해야 합니다 하 고 필요한 경우에 몇 주 동안-80 ° C에 남아 수 있습니다.</li>
</ol>4. 단일 셀 RT-PCR
<ol><li>직접 건조 욕조에 5 분 동안 70 ° C에서 PCR 스트립에서 냉동된 샘플을가 열 하 여 세포를 lyse.</li>
	<li>얼음 1 mM dNTP, 25 µ g/mL oligod(T) 뇌관, 5 µ M 임의의 hexamers, RNAse 억제제의 20 단위 및 역전사의 400 단위를 포함 하는 마스터 믹스 버퍼 x 2의 튜브 당 10 µ L을 추가 하 여 전송 (RT)를 진행 하는 스트립을 전송 합니다. 참고: 셀 녹고, 후 RT 수행 되어야 합니다 신속 하 게 RNA 강 직을 피하기 위해.</li>
	<li>교배, 50 ° C에서 1 시간에 대 한 품 어 그리고 반응을 중지를 3 분 동안 95 ° C에 외피와 마무리를 임의의 hexamers 수 있도록 5 분 동안 25 ° C에서 품 어.</li>
	<li>각 인코딩 변수 무거운 (vH)와 카파 (vLκ) 또는 람다 경 쇄 (vLλ) 지역에 대 한 중첩 된 PCR 증폭의 2 라운드 진행. 참고: 또는, RT 샘플-20 ° C에서 냉동 고 1 주일 동안 보관.<ol>
<li>PCR의 첫 번째 라운드에 대 한 추가 1.5 m m MgCl2, 0.25 m m dNTPs, DNA 중 합 효소의 2.5 단위 및 200를 포함 하는 40 µ L 최종 볼륨에 대 한 cDNA의 3 µ L 외부 뇌관 (뇌관 시퀀스 그림 2 및 테이블의 자료 를 참조)의 nM. 참고: 외부 뇌관 혼합의 구성입니다. 무거운 사슬 확대를 위한: 4 뇌관 (5' LVH 믹스) 전달 및 2 반전 뇌관 (3' CµCγ 믹스). 빛 카파 체인 확대를 위한 3는 앞으로 프라이 머 (5' LV | 혼합) 1 반전 뇌관 (3' Cκ543-566). 빛 람다 체인 확대, 7 전달 뇌관 (5' LVl 믹스) 및 1 반전 뇌관 (3' Cl). 참고: 뇌관은 모든 무 겁 고 가벼운 체인 가족 유전자5의 확대를 위한 경 운 기 외. 에 의해 디자인 되었다.</li>
		<li>자전거 다음과 적용: 4 분, 94 ° C 30의 40 주기 다음 94 ° C, 30에서 s s 58 ° C VH와 VLκ (VLλ에 대 한 60 ° C), 및 55에서 최종 신장으로 72 ° C에 7 분 동안 72 ° C에 단계.</li>
		<li>두 번째 라운드 PCR에 대 한 사용 하 여 첫 번째 증폭 제품의 3 µ L 40의 최종 볼륨에 대 한 1.5 m m MgCl2, 0.25 m m dNTPs, DNA 중 합 효소의 2.5 단위 그리고 200 µ L 식으로 복제에 대 한 금지 효소 사이트를 포함 하는 내부 뇌관의 nM (뇌관 시퀀스 그림 2 및 테이블의 자료 를 참조)는 벡터 참고: 내부 뇌관 혼합의 구성입니다. 무거운 사슬 확대를 위한: 9 앞으로 프라이 머 (5' AgeIVH 믹스)와 3 반전 뇌관 (3' SalIJH 믹스). 빛 카파 체인 확대를 위한 9 뇌관 전달 (5' AgeIV | 믹스) 3 반전 뇌관 (3' BsiWIJκ 믹스). 빛 람다 체인 증폭 6 뇌관 (5' AgeIVl 믹스) 전달 및 1 반전 뇌관 (3' XhoICl). 참고: 뇌관 경 운 기 외., 모든5의 무 겁 고 가벼운 체인 가족 유전자 증폭에 의해 설계 되었습니다.</li>
		<li>자전거 다음과 적용: 4 분, 94 ° C 30의 40 주기 다음 s 94 ° C, 30에서 VH와 LCκ (LCλ에 대 한 60 ° C), 및 45 58 ° C에서 s s 최종 신장으로 72 ° C에서 7 분 동안 72 ° C에 단계.</li>
	</ol>
</li>
	<li>VH, vLκ 및 vLλ (500 bp 제품 가변 무거운 체인 인코딩 세그먼트에 대 한) 및 세그먼트를 인코딩 변수 빛 체인 350 bp 제품 1.5 %agarose 젤에 PCR 제품의 마이그레이션 5 μ에 의해 긍정적인 우물을 식별 합니다.</li>
	<li>외 막 PCR 제품의 정화에 대 한 설계를 사용 하 여 양수 우물에서 남은 나머지 35 µ L PCR 제품을 정화.</li>
	<li>H2o.의 60 µ L PCR 제품을 elute</li>
</ol>5. 식 복제
<ol><li>
삽입을 준비 참고: 소화 60 µ L 각 순화 된 PCR의 적절 한 제한 효소 버퍼를 포함 하는 100 µ L의 최종 볼륨에서 제품.<ol>
<li>VH PCR 제품, 사리의 50 단위와 AgeI의 50 대를 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어</li>
		<li>VLλ PCR 제품, XhoI의 50 단위와 AgeI의 50 대를 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어</li>
		<li>VLκ PCR 제품을 위한 AgeI의 50 단위를 추가 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어 96 PCR 멤브레인을 사용 하 여 다이제스트를 정화 BsiWI 제한 효소 버퍼의 100 µ L의 최종 볼륨에서 60 µ L eluate H2o. 다이제스트의 60 µ L 함께 elute, BsiWI, 50 단위를 추가 하 고 1 h 55 ° c.에 품 어</li>
		<li>15 분 동안 80 ° C에가 열 하 여 효소 비활성화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
표현 하는 벡터의 준비 참고: vH PCR 제품 지속적인 무거운 체인 IgG1 Cγ1를 포함 하는 식 벡터 (HCγ1)에 복제 됩니다. vLκ PCR 제품 상수 빛 체인 Cκ를 포함 하는 식 벡터 (LCκ)에 복제 됩니다. vLλ PCR 제품 상수 빛 체인 Cλ를 포함 하는 식 벡터 (LCλ)에 복제 됩니다.<ol>
<li>다음 소화를 수행.<ol>
<li>믹스 1 µ g 식의 HCγ1 AgeI의 10 단위와 사리 endonucleases, 제조업체에서 권장 하는 제한 버퍼의 20 µ L의 총 볼륨에서의 10 단위 벡터 그리고 1 h 37 ° c.에 품 어</li>
			<li>제한 버퍼의 20 µ L의 전체 볼륨에 AgeI 제한 효소의 10 단위 식 벡터 LCκ의 믹스 1 µ g는 제조업체에서 권장 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어 BsiWI 제한 효소의 10 단위를 추가 하 고 1 시간 55 ° c.에 대 한 품 어</li>
			<li>AgeI의 10 단위 및 XhoI endonucleases 제한 버퍼의 20 µ L의 총 볼륨에서의 10 단위 식 벡터 LCλ의 믹스 1 µ g는 제조업체에서 권장 하 고 37 ° C에서 1 시간에 대 한 품 어</li>
		</ol>
</li>
		<li>10 분 제한 효소 비활성화 65 ° C에서 각 소화 혼합물이 열.</li>
		<li>2 µ L로 소화 PCR 제품의 5 µ L의 결 찰을 수행 (100 ng) 4 ° c.에서 하룻밤 배양 하 여 T4 DNA 리가의 1 단위와 DNA 리가 버퍼 x 1의 20 µ L의 총 볼륨의 해당 선형화 식 벡터의 참고: 또는, 결 찰 3 h 4 ° c.에 대 한 수행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
복제
	<ol>
<li>수 제 electrocompetent TOP10 대장균 (섹션 1.8.4-1.8.8 분자 생물학에 있는 현재 프로토콜)의 45 µ L로 20 µ L 결 찰 혼합물의 Electroporate 1 µ L. 즉시 2 X YT 매체의 500 µ L을 추가 하 고 변형 확산 박테리아 YT 암 피 실린 판 x 2에 30 분 동안 37 ° C에서 물 욕조에 품 어. 37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>각 변환에 대 한 8 개의 식민지 PCR에 의해 화면.<ol>
<li>얼음에 다음과 같이 반응 프리 믹스를 설정: PCR 버퍼, MgCl2 (25 m m)의 12 µ L, (에서 각각의 주식 포함 10 mM) dNTPs의 4 µ L, 앞으로 뇌관 (주식 10 µ M) 벡터 시퀀스 (뇌관 Ab vec 감지) 하 교배 시키기의 10 µ L x 5의 45 µ L 그리고 지속적인 무거운 또는 가벼운 체인 지역 타겟팅 역방향 뇌관 (주식 10 µ M)의 10 µ L (뇌관 시퀀스에 대 한 재료의 표 참조). H2o. 200 µ L의 최종 볼륨을 구성 하 DNA 중 합 효소 효소 (5 U / µ L)의 4 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>얼음에 8 스트립 PCR 튜브 당 반응 프리 믹스의 25 µ L를 배포 합니다.</li>
			<li>메 마른이 쑤 시 게를 사용 하 여 개별 식민지를 데리 러. 복제 판을 구성 하 여 PCR 반응 관에 그것을 찍어 2 x TY 암 피 실린 접시에 이쑤시개 행진</li>
			<li>다음 자전거 조건 심사 PCR을 수행: 10 분, 94 ° C 30의 25 주기 다음 s 94 ° C, 30에서 55 ° c, s 및 50 72 ° c.에 s</li>
			<li>1.5 %agarose 젤에 PCR 제품의 마이그레이션 5 µ L에 의해 긍정적인 박테리아를 식별 합니다. 참고: 긍정적 식민지에 게 PCR 제품 약 850 무거운 체인 벡터 및 600 bp bp 빛 체인 벡터에 대 한.</li>
		</ol>
</li>
		<li>복제 판에서 4 개의 긍정적인 식민지 파운드 매체의 2 mL에 접종 하 고 하룻밤 200 rpm에서 떨고와 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>제조 업체에 의해 표시 된 대로 플라스 미드 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 액체 문화에서 추출 합니다.</li>
		<li>생어 변수 도메인의 정확한 삽입 확인 Ab vec 감지 뇌관 플라스 미드의 연속. 참고: 올바른 삽입 (HC 및 해당 LC 인코딩) 플라스 미드는 분 비에 대 한 293A 셀으로 cotransfected 이다. 작은 규모 생산 mAbs의 특이성은 ELISA에 의해 분석 됩니다. 다음, 대규모 생산은 해당 하는 경우 수행 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6입니다. mAbs의 생산
<ol><li>
특이성 검사에 대 한 작은 규모의 생산
	<ol>
<li>200 µ L의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 보충에 전날 transfection, 씨앗 15000 인간 미 발달 신장 293A (293A HEK) 세포 당 96 잘 접시에 잘 FBS. 37 ° c.에는 CO2 (5% CO2) 인큐베이터에서 밤새 품 어</li>
		<li>DMEM 매체 10% 포함 된 293A 셀 cotransfect FBS transfection 시 약으로 선형 polyethylenimine 파생을 사용 하 여. 참고: triplicates에 있는 transfection를 수행 합니다. 다음 프로토콜 플랫 바닥 96 잘 접시의 한 잘 이다.<ol>
<li>150 mM NaCl의 10 µ L에 0.5 µ L DNA transfection 시 약의 희석. 150 mM NaCl의 10 µ L로 0.125 µ g의 vH와 vL 표현 벡터의 0.125 µ g을 희석. 와 동 각 희석 10 s.</li>
			<li>10 µ L 희석 DNA transfection 시 약 10 µ L DNA 솔루션에 추가 합니다. 소용돌이 15 s와 실 온에서 15 분 동안 품 어. 293A 셀에 drop-wise 20 µ L 믹스를 추가 하 고 부드럽게 접시 소용돌이 의해 혼합.</li>
		</ol>
</li>
		<li>혈 청 무료 매체에서 5 일 동안 transfection 및 문화 셀 후 중간 16 h를 교체 합니다. 주: 혈 청 자유로운 매체를 사용 하 여 혈 청 Igs 항 체 생산된 오염 방지.</li>
		<li>5 분 동안 460 x g에서 원심 분리 하 여 세포와 파편을 제거 합니다.</li>
		<li>다중 채널 피 펫과 포부에 의해 supernatants 수확 하 고 V-하단 96 잘 접시에 그들을 전송.</li>
		<li>외 투 관련 Ag 재구성된 ELISA/ELISPOT 코팅의 당 100 µ L에 4 ° C에서 하룻밤 96-잘 ELISA 격판덮개에 2 µ g/mL의 최종 농도에 1 x를 버퍼링 합니다. 9에서 예제를 참조 하십시오.</li>
		<li>37 ° C에서 2 시간에 대 한 10% FBS DMEM 매체와 웰 스 블록</li>
		<li>6.1.5, 단계에서 transfected 293A 셀의 supernatants의 50 µ L을 추가 하 고 실시간에 2 h에 대 한 품 어</li>
		<li>양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 효소 1 µ g/mL에서 IgG Ab 활용 하는 반 인간의 100 µ L을 추가 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 50 µ L 비 기판 (TMB), 추가 하 고 20 분 동안 품 어.</li>
		<li>450에서 광학 밀도 읽기는 분 광 광도 계에 nm. 참고: 특정 mAbs ELISA 분석 결과 의해 밝혀 더 큰 규모에서 생성 될 수 있다 고 순화 단백질에 인간 IgG에 대 한 선호도 제시 하는 열.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
대규모 생산 및 특정 mAbs의 정화
	<ol>
<li>전날 transfection, 씨앗 6 x 106 인간 미 발달 신장 293A (293A HEK) 25 mL DMEM 10% 보충을 포함 하는 175 cm2 플라스 크에 세포 FBS. 37 ° c.에는 CO2 (5% CO2) 인큐베이터에서 밤새 품 어 참고: 셀 70% 합칠 때 페 이어야 한다.</li>
		<li>DMEM 매체 10% 포함 된 293A 셀 cotransfect FBS transfection 시 약으로 선형 polyethylenimine 파생을 사용 하 여.<ol>
<li>150 mM NaCl의 450 µ L로 DNA transfection 시 약의 50 µ L를 희석. 150 mM NaCl의 500 µ L에 10 µ g의 vH와 vL 표현 벡터 10 µ g을 희석. 10 소용돌이 s 각 희석.</li>
			<li>DNA 솔루션을 희석된 DNA transfection 시 약을 추가 합니다. 소용돌이 15 s와 실 온에서 15 분 동안 품 어. 셀, drop-wise 1 mL 믹스를 추가 하 고 부드럽게 플라스 크를 소용돌이 의해 혼합.</li>
		</ol>
</li>
		<li>혈 청 무료 매체에서 5 일 동안 transfection 및 문화 셀 후 중간 16 h를 교체 합니다.</li>
		<li>25 mL 피 펫으로 발음 하 여 매체를 수확.</li>
		<li>5 분 동안 460 x g에서 원심 분리 하 여 세포와 파편을 제거 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템에 단백질 코팅 1 mL 열을 사용 하 여 항 체 정화<ol>
<li>단백질 sepharose 열 20 m m 인산 버퍼 (pH 7) equilibrate</li>
			<li>6.2.5 1.22 µ m 필터 다음 0.45 μ m 필터를 사용 하 여에서 세포 배양 매체를 필터링 합니다.</li>
			<li>열에 필터링 된 매체를 로드 하십시오.</li>
			<li>20 m m 인산 버퍼 (pH 7)로 세척 하 고 0.1 M 구 연산 염 버퍼 (pH 3.5)와 함께 elute.</li>
			<li>280에서 광학 밀도 읽고 nm 흡수 분 광 광도 계에 그리고 즉시 중화 1 M Tris 버퍼 (pH 9) 단백질을 포함 하는 분수.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3.5 K 분자량 PBS 버퍼 (pH 7.4)에 대 한 차단으로 카세트에 4 ° C에서 하룻밤 순화 Ab dialyze</li>
		<li>0.2 µ m 여과 및 제어 순으로 제조 업체에 의해 표시 된 크기 배제 크로마토그래피에 의해 소독.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+therapeutics%3A+history+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody therapeutics: history and future.</a> Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).</li>
<li>Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+inhibitors+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment.</a> Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).</li>
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저자는 공개 없다.

제안 된 프로토콜 Ag 특정 B 세포는 혈액 순환에서 직접 인간의 mAbs의 세대에 대 한 강력한 방법입니다. 그것은 세 가지 중요 한 측면을 결합 한다: (i) tetramer 관련 자기 농축, 심지어 드문 Ag 바인딩 B 세포;의 비보 전 격리 수 있는의 사용 (ii)을 사용 하 여 3 Ag tetramers (2 개의 관련 것 들 그리고 한 없는 하나) 이라는 세 가지 다른 형광으로, cytometry, 여 BCR 특정 원하는 Ag;에 대 한 표현 B 셀만 제어 전략 (iii) 해당 재조합의 재건 mAb cDNAs RT-PCR에 의해 단일 세포 수준 및 인간 세포에서 cDNAs의 표현.
이전 연구는 mAbs는 격리 된 B 세포6,7,8에서 정렬 및 후속 생산 전에 인간 B 세포를 하나 또는 두...

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Marie-Claire Devilder1,2,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,&#160;Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1 
1Centre R&#233;gional de Recherche en Canc&#233;rologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Universit&#233; de Nantes 
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,3,&#160;Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2&#160; 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Universit&#233; d&#39;Angers, Universit&#233; de Nantes 
2LabEx IGO, &#34;Immunotherapy, Graft, Oncology&#34; 
3CHU, Nantes, France

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Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

여기 설명 하는 방법을 완벽 하 게 인간 단일 클론 항 체의 (mAbs) 원하는 항 원 (Ag)에 대 한 신속 하 고 다양 한 생산 수 있습니다. mAbs는 많은 기초 연구 응용 프로그램 체 외 및 생체 내에서필수 도구: flow cytometry, 조직학, 서 럽 고 차단 실험 예. 또한, mAbs는 사용 되 고 더 의학에서 자가 면역 질환, 암, 치료 하 고 이식 거부1제어 하. 예를 들어 안티-CTLA-4 및 안티-PD-1 (또는 반대로 PD L1) mAbs 최근 암 치료2검사점 면역 억제제로 사용 되었다.
첫 번째 mAbs 면역 글로불린 (Ig)에 의해 제작-면역된 쥐 또는 쥐의 비장 세포에서 얻은 hybridomas 은닉. 그러나, murine 또는 쥐 mAbs에 대 한 강한 면역 반응을 그들의 신속한 통관 및 과민 반응3의 가능한 유도 인 간에 있는 그들의 치료 사용을 지장을 초래할 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 mAbs의 동물성 단백질 시퀀스 부분적으로 소위 공상 마우스 인간 또는 인간 답게 된 항 체를 생성 하 인간 그들에 의해 대체 되었습니다. 그러나,이 전략 부분적 으로만 immunogenicity, 실질적으로 비용 및 시간-생산의 규모를 증가 하는 동안 감소. 인간의 mAbs 인간 B 세포에서 직접 생성 하는 고이 대 한 몇 가지 전략을 사용할 수 있습니다. 그들 중 하나 살 균 소 또는 효 모 디스플레이의 사용 이다. 이 무거운 무작위 인간의 Ig의 조합 도서관에서 변수 도메인 표시과 빛 연결에 페이지 또는 효 모, 그리고 관심의 특정 항 원을 사용 하 여 선택 단계를 수행. 이 전략의 주요 단점은 무 겁 고 가벼운 사슬은 무작위로 연결 된, 생성 된 항 체의 다양성에 아주 큰 증가에 지도입니다. 얻은 항 체 특정 Ag에 대 한 자연 면역 반응에서 발생 하는 것을 그에 해당 하는 있지 않습니다. 또한, 인간 단백질 폴딩과 포스트 번역 상 수정은 체계적으로 복제 않을 원핵생물 또는 효 모에도. 두 번째 인간 mAb 생산 방법은 엡 스타인-바 바이러스 감염이 나 안티 apoptotic 요인 BCL-6 및 BCL XL4의 식에 의해 자연 인간 B 세포 immortalization입니다. 그러나,이 메서드는 메모리 B 세포에만 적용 이며 효율적인, 수많은 mAb 생성 불멸 하 게 B 세포의 몇 가지 (해당 되는 경우) mAb 클론 원하는 항 원 특이성을 식별 하는 검사를 요구 하지 않습니다. 방법은 이렇게 비용과 시간이 소요입니다.
최근 새로운 프로토콜에서 고립 된 단 하나 B 세포5인간의 mAbs의 생산에 대 한 설명 하고있다. 그것에 최적화 된 단일 셀 반전 전사-연쇄 반응 (RT-PCR) 증폭의 두 무거운-및 빛-체인 인코딩 단일 정렬 된 B 세포에서 세그먼트에 대 한 의존 합니다. 이것 완전히 인간의 mAb의 재건 되므로 진 핵 식 시스템에 복제 하 고 이러한 세그먼트의 표현에 의해 선행 된다. 이 프로토콜은 예방 접종된 기증자에서 B 세포에서 시작 하 고 성공적으로 사용 되었습니다. 셀 B 세포는 원하는 자세에 대 한 감독의 더 높은 주파수를 가져오고 따라서6심사에 필요한 시간을 제한 하는 예방 접종 후 몇 주를 수확 했다. 다른 완전히 인간 mAbs 또한 HIV+ (인간 면역 결핍 바이러스)에 감염 된 환자7 과 흑색 종 환자8에서 제작 되었습니다. 이러한 발전에도 불구 하 고 아직도 그들의 메모리 표현 형 또는 주파수의 독립적인 Ag 특정 B 세포의 분리를 가능 하 게 사용할 수 없는 절차가입니다.
절차 설명 여기 뒤에 높은 수율 및 낮은 심사 시간 완전 인간 항 원 특정 mAbs의 생산 그들의 BCR 특이성에 따라 인간의 순환 B 세포의 효율적인 비보 전 절연 리드. 메서드를 사용 하면 메모리 B 세포 또는 항 체 은닉 B 세포는 면역 반응 후 유도에 제한 되지 않습니다 하지만 인간의 순진한 B 셀 레 퍼 토리에도 적용 될 수 있습니다. 그것은 매우 낮은 주파수에 Ag 특정 B 세포에서 시작 작동 효율성의 좋은 표시 이다. 방법의 원리는 다음과 같습니다: 주변 혈액 단 세포 (PBMC)는 관심사의 항 원을 제시 하는 2 개의 tetramers 물, 각각 다른 형광 색소 (예를 들어, Phycoerythrin (PE) 및 Allophycocyanin (APC))와 함께 표시 그리고 세 번째 형광 색소 (예를 들어, 화려한 바이올렛 421 (BV421))와 밀접 하 게 관련 된 항 원 제시 3 tetramer 활용. 항 원 바인딩 셀에 대 한 풍부 하 셀은 다음 인 큐베이 팅 구슬 안티-PE 코팅 및 안티-APC Abs, 셀 분리 열에 정렬. APC PE+ + 셀 분수 선택, mAbs PBMC 셀 종류 B 세포의 식별을 허용에 대 한 특정의 다양 한 스테인드 그리고 복종 flow cytometry 셀 정렬 합니다. B 세포는 PE+ +, 화려한 바이올렛-, 그러나 APC 격리 됩니다. 이 단계는 카운터 B 세포 또는 항 원 tetramerized에 바인딩되지 않습니다 그러나 PE 또는 APC (이 셀 것 PE+ - APC 또는 PE- APC+) 또는 사용 (이 tetramers의 비 항 원 부분에 바인딩 할 셀을 선택 셀 BV421 될 것입니다+). 이 단계에서 B 세포 높은 관심의 피토 프에 대 한 특정 카운터 선택 또한 (이 셀 BV421 됩니다+). 따라서,이 메서드는 매우 구체적인 B 세포 B 세포 수용 체 (BCRs) 두 매우 밀접 하 게 관련 된 항 원 사이 차별 있게 표현 정화 수 있습니다. 튜브에 수집 되는 단일 특정 B 세포 그들의 PCR 증폭 Ig cDNAs (보완 deoxyribonucleic 산) 복제 하 고 IgG mAbs 분 비로 인간 세포 선으로 표현.
개념의 증거로 서이 연구는 펩 티 드 제시한 중요 한 조직 적합성 복잡 한 클래스 나 인식 인간의 mAbs의 효율적인 생성에 설명 합니다 (MHC-나) 분자가 펩 티이 드와 같은에 로드 된 다른 펩 티 드 사이 차별 수 있습니다 MHC-나 대립 유전자. 이 자세의 복잡성 수준을 중요 하지만이 방법을 사용 하면 (i) Ag 관련 mAbs;의 고수익 복구 (2) 두 개의 구조적으로 가까운 Ags 사이 차별 있게 mAbs의 생산. 이 방법은 프로토콜 수정 없이 예방 접종 또는 감염 된 환자에 게 확장 될 수 있습니다 그리고 또한 이미 성공적으로 인간 답게 쥐 시스템9에서 구현 되었습니다. 따라서,이 연구는 기초 연구에 immunotherapy 사용할 수 있는 완전 인간 mAbs를 생성 하는 다양 하 고 효율적인 접근 방식을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>HEK 293A 세포주</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco by life technologies</td><td>21969-035</td><td>(+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine</td></tr><tr><td>RPMI medium1640 (1X)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>PAA</td><td>K45-001</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td>100X Conc</td></tr><tr><td>PBS-Phosphate 완충 식염수(10X) pH 7,4</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 0,5M pH=8</td><td>Invitrogen by Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum (FBS)</td><td>Dominique Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll - 림프구 분리 중간 EuroBio</td><td></td><td>CMSMSL01-01</td><td>밀도 1,0777+/-0,001</td></tr><tr><td>스트렙타비딘 R-피코에리트린 접합체</td><td>Life Technologies</td><td>S21388</td><td>프리미온 등급 1mg/ml에는 5mM 아지드화 나트륨</td></tr><tr><td>스트렙타비딘, 알로피코시아닌 접합체</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>S32362</td><td>1mg/ml 2mM 아지드 프리미엄 등급</td></tr><tr><td>브릴리언트 바이올렛 421 스트렙타비딘</td><td>Biolegend</td><td>405225</td><td>conc : 0,5mg/ml</td></tr><tr><td>Anti-PE 공액 자성 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-APC 공액 자성 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACs 또는 QuadroMACS separotor</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302/130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD3 BV510 BD horizon</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>563109</td><td>사용 희석 1:20</td></tr><tr><td>CD19 FITC</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>345788</td><td>사용 희석 1:20</td></tr><tr><td>CD14 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>561116</td><td>사용 희석 1:50</td></tr><tr><td>CD16 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>338440</td><td>중고 희석 1:50</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>51-68981E (559925)</td><td>Used dilution 1:1000</td></tr><tr><td>FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-strip PCR tubes</td><td>Axygen</td><td>321-10-061</td><td></td></tr><tr><td>Racks for 96 microtubes</td><td>Dominique Dutscher</td><td>45476</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant)</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>10777-019</td><td>수량:5000U (40U/ul)</td></tr><tr><td>Distilled Water Dnase/Rnase Free</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Oligod(T)18 mRNA Primer</td><td>New England BioLabs</td><td>S1316S</td><td>5.0 A260unit</td></tr><tr><td>Random hexamers</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>N8080127</td>량 <td>: 50uM, 5nmoles</td></tr><tr><td>Superscript III Reverse transcriptase</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>18080-044</td><td>수량 : 10000U (200U/ul)</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA polymerase</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set, 분자 생물학 등급</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td>4*100umol</td></tr><tr><td>5LVH1</td><td>Eurofins</td><td>ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG</td><td>PCR의 첫 번째 라운드 - 중쇄 증폭 - 외부 프라이머 - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH3</td><td>Eurofins</td><td>AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG</td><td>PCR 1차 - 중쇄 증폭 - 외부 프라이머 - 포워드 프머</td></tr><tr><td>5LVL4_6</td><td>유로핀</td><td>CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG</td><td>PCR 1차 라운드 - 중쇄 증폭 - 외부 프라이머 - 포워드 Prmers</td></tr><tr><td>5LVH5</td><td>Eurofins</td><td>CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG</td><td>PCR 1차 - 중쇄 증폭 - 외부 프라이머 - 포워드 Prmers</td></tr><tr><td>3HuIgG_const_anti</td><td>Eurofins</td><td>TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT</td><td>PCR 1차 - 중쇄 증폭 - 외부 프라이머 - 인간 Ig- 박테리아 PCR 스크리닝을 위한 역 프라이머</td></tr><tr><td>3CuCH1</td><td>Eurofins</td><td>GGGAATTCTCACA GGAGACGA</td><td>PCR 1차 - 중쇄 증폭 - 외부 프라이머 - 인간 Ig</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_5_7</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC 위한 역방향 프라이머 GAGGTGCAGCTGGTGCAG</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄의 증폭 - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5AgeIVH3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 헤비 체인의 증폭 - 내부 프라이머 - 유로</td></tr><tr><td>핀</td><td>5AgeIVH3_23</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄의 증폭 - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5AgeIVH4</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄의 증폭 - 내부 프라이머 - 유로</td></tr><tr><td></td><td>핀5AgeIVH4_34</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄 증폭 - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_18</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄의 증폭 - 내부 프라이머 -</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_24</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄 증폭 - 내부 프라이머 -</td></tr><tr><td></td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT 5AgeIVH3__9_30_33 포워드 프라이머 GAAGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄의 증폭 - 내부 프라이머 -</td></tr><tr><td>5AgeIVH6_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 헤비 체인의 증폭 - 내부 프라이머 -</td></tr><tr><td></td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG 3SalIJH1_2_4_5 포</td><td>워드 프라이머PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄의 증폭 - 내부 프라이머 - 역방향 프라이머</td></tr><tr><td>3SalIJH3</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄 증폭 - 내부 프라이머 - 역방향 프라이머</td></tr><tr><td>3SalIJH6</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 중쇄 증폭 - 내부 프라이머 - 역방향 프라이머</td></tr><tr><td>5' LVk1_2</td><td>Eurofins</td><td>ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG</td><td>PCR 1차 - 경쇄 증폭 k - 외부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'LVk3</td><td>Eurofins</td><td>CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG</td><td>PCR 1차 - 경쇄 증폭 k - 외부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'LVk4</td><td>유로핀</td><td>ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG</td><td>PCR의 첫 번째 라운드 - 경쇄 증폭 k - 외부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>3'Ck543_566</td><td>Eurofins</td><td>GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA</td><td>PCR의 첫 번째 라운드 - 경쇄 증폭 k - 외부 프라이머 - 역 프라이머- 박테리아 PCR 스크리닝</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1_9_1&ndash; 13</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT</td><td>PCR 2차 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 -포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1D_43_1_8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC</td><td>PCR 2차 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 -포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2</td><td>유로핀</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC</td><td>PCR 2차 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2_28_2_30</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC</td><td>PCR 2차 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_11_3D_11</td><td>유로핀</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC</td><td>PCR 2차 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_15_3D_15</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC</td><td>PCR 2차 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_20_3D_20</td><td>유로핀</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTGTTGACGCAGTCT</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 경쇄의 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeVk4_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk1_2_4</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 라이트 체인 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk3</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 경쇄 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk5</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 라이트 체인 증폭 k - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'LVl1</td><td>유로핀</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG</td><td>PCR의 첫 번째 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 - 앞으로 프라이머</td></tr><tr><td>5'LVl2</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG</td><td>PCR의 첫 번째 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 - 앞으로 프라이머</td></tr><tr><td>5'LVl3</td><td>Eurofins</td><td>GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG</td><td>PCR의 첫 번째 라운드 - 가벼운 체인 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 - 앞으로 프라이머</td></tr><tr><td>5'LVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG</td><td>PCR 첫 번째 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 -앞으로 프라이머</td></tr><tr><td>5'LVl6</td><td>Eurofins</td><td>GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG</td><td>PCR의 첫 번째 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 -앞으로 프라이머</td></tr><tr><td>5'LVl7</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG</td><td>PCR 첫 번째 라운드 - 라이트 체인 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5LVl8</td><td>Eurofins</td><td>GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG</td><td>PCR의 첫 번째 라운드 - 라이트 체인 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>3'Cl</td><td>Eurofins</td><td>CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG</td><td>PCR의 첫 번째 라운드 - 라이트 체인 &lambda의 증폭; - 외부 프라이머 - 앞으로 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeIVl1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG</td><td>PCR 두 번째 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 내부 프라이머 -앞으로 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeIVl2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG</td><td>두 번째 PCR 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 내부 프라이머 -앞으로 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeIVl3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG</td><td>PCR 두 번째 라운드 - 가벼운 사슬 &lambda의 증폭; - 내부 프라이머 -포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeIVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA</td><td>두 번째 PCR 라운드 - 라이트 체인 &lambda의 증폭; - 내부 프라이머 -포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeIVl6</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG</td><td>PCR 두 번째 라운드 - 경쇄 &lambda의 증폭; - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>5'AgeIVl8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 라이트 체인 &lambda의 증폭; - 내부 프라이머 - 포워드 프라이머</td></tr><tr><td>3'XhoICl</td><td>Eurofins</td><td>CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG</td><td>PCR의 두 번째 라운드 - 경쇄 및 람다의 증폭; - 내부 프라이머 - 역 프라이머 - 박테리아 PCR 스크리닝</td></tr><tr><td>Ab-vec-sense</td><td>Eurofins</td><td>GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC</td><td>박테리아 PCR 스크리닝</td></tr><tr><td>QA Agarose-TM, 분자 생물학 등급</td><td>MP Bio</td><td>AGAH0500</td><td></td></tr><tr><td>NucleoFast 96 PCR 플레이트</td><td>Macherey Nagel</td><td>743.100.100</td><td></td></tr><tr><td>효소 연령 I HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3552L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzyme SalI HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3138L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>효소 Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>효소 BSIWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553L</td><td>10000U/ml</td></tr><tr><td>HCg1 (Genbank 등록 번호 FJ475055)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCk (Genbank 등록 번호 FJ475056 )</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCl (Genbank 가입 번호 번호 FJ517647)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>15224.017</td><td>100U (1U/ul)</td></tr><tr><td>2X YT 매체</td><td>시그마 알드리치</td><td>Y1003-500ML</td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>시그마 알드리치</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>LB (루리아 베르타니) 육수 (레녹스)</td><td>시그마 알드리치</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레오스핀 플라스미드 DNA, RNA 및 단백질 정제</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.250</td><td></td></tr><tr><td>Jet PEI DNA 형질주입 시약</td><td>PolyPlus</td><td>101-40</td><td></td></tr><tr><td>평평한 바닥96웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96웰 플레이트</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>055142</td><td></td></tr><tr><td>Nunc easy 175 cm2 플라스크</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>12-562-000</td><td></td></tr><tr><td>ELISA/ELISPOT 코팅 완충액</td><td>eBiosciences</td><td>00-0044-59</td><td></td></tr><tr><td>Nunc maxisorp 평평한 바닥 96 웰 ELISA 플레이트</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>44-2404-21</td><td>고단백질 결합</td></tr><tr><td>항-인간 IgG Ab 양고추냉이 과산화효소(HRP)에 접합</td>BD <td>Pharmingen / BD Biosciences</td><td>55788</td><td></td></tr><tr><td>TMB 기질</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S0677</td><td></td></tr><tr><td>1 mL-HiTrap 단백질 A HP 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0402-01</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>18190026</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17517501</td><td></td></tr><tr><td>NGC Quest 10 Plus 크로마토그래피 시스템</td><td>BioRad</td><td>7880003</td><td></td></tr></tbody></table>

희귀 한 항 원 특정 b 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

단일 클론 항 체 (mAbs)는 모두 근본적인 연구와 의학에 유용한 강력한 도구입니다. 그들의 높은 특이성 항 체 매우 관련된 구조 (예를 들면, 정상적인 단백질 및 그 돌연변이 버전) 사이 구별 하는 경우 필수 되지 않습니다. 같은 구별 mAbs 생성의 현재 방법은 비용과 시간이 소요 여러 Ab 생산 하는 B 세포의 광범위 한 검사를 포함 한다. 우리 제안 여기 신속 하 고 비용 효과적인 방법의 구별, 세대에 대 한 완전히 인간의 mAbs B 림프 톨을 순환 하는 인간의 혈액에서 시작 합니다. 이 전략의 독창성은 쉽게 사용할 수 있는 주변 혈액 단 세포 (PBMC)를 사용 하 여 다른 모든 셀의 카운터 선택과 결합 하는 특정 항 원 바인딩 B 세포의 선택 때문 이다. 일단 특정 B 세포 격리, 해당 mAb 코딩 하는 cDNA (보완 deoxyribonucleic acid) 시퀀스는 얻은 단일 셀 반전 전사-연쇄 반응 (RT-PCR) 기술을 사용 하 여 이후 인간의 표현 셀입니다. 1 달 만큼 적게, 내 자연스럽 게 B 셀 레 퍼 토리에 의해 감지 하는 거의 모든 원하는 항 원에 대하여 지시 하는 매우 구별 인간의 mAbs의 밀리 그램을 생산 가능 하다.

이 프로젝트 선물 Pp65495 펩 티 드를 인식 인간의 mAbs의 세대 건강 한 기증자에서 PBMC에서 출발 (Pp65, 인간의 세포에서) 제시한 중요 한 조직 적합성 복잡 한 클래스 나 (MHC-나) 분자 HLA-A * 0201 ( HLA-A2). 이러한 mAbs이 복잡 하 고 다른 펩 티 드 같은 MHC에 적재를 대표 하는 단지 사이 차별 수-내가 분자.
PBMC는 HLA A2/Pp65 PE, HLA-A2/Pp65-APC와 HLA A2/MelA2 BV421 tetramers 위의 프로토콜에 설명 된 대로 얼룩이 있었다. Immunomagnetic PE 및 APC tetramer 포지티브 셀의 셀 농축, 후 eluted 셀 추가 mAbs와 얼룩이 있었다. 교류 cytometry 셀 정렬에서 자석으로 풍부한 셀 처음 가능한 CD14에 문이 했...

인간의 혈액에서 회람 하는 드문 B 세포에서 시작 인간 항 체의 항 원에 대 한 특정의 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 자연 항 체의 생성은 효율적이 고 신속한, 그리고 얻은 항 체 매우 관련된 항 원 사이 차별 수 있습니다.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

이 절차의 전반적인 목표는 혈액을 순환하는 인간 B 림프구에서 시작하여 원하는 항원에 대항하는 완전 인간 단클론 항체를 생산하는 것입니다. 이 프로토콜은 관련성이 높은 항원을 구별할 수 있는 단클론 항체를 생성할 수 있습니다. 면역 요법과 같은 일부 응용 분야의 경우 항원의 정확한 표적화가 필수적일 수 있습니다.이 기술의 장점은 건강한 기증자 또는 면역된 기증자의 혈액에서 시작하여 이를 수행할 수 있으며 희귀한 항원 결합 B 세포도 분리할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 인간 샘플에서 시작하여 설명되지만 사전 면역이 가능한 동물에도 적용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 절차가 실제로 구별된 B 림프구에 대한 매우 복잡한 다중 분석 게이팅 전략에 따라 진행되기 때문에 매우 중요합니다.절차는 Melinda가 수행합니다. 우리 연구실의 보조 엔지니어입니다. 첫 번째 피펫은 50 밀리리터 원추형 튜브에서 15 밀리리터의 밀도 구배에 35 밀리리터의 희석된 세포 현탁액을 주입합니다.그런 다음 브레이크를 끈 상태에서 원뿔형 튜브를 스윙 버킷 로터에 넣고 실온에서 25분 동안 1290배 중력으로 원심분리기를 합니다. 다음으로, 밀도 구배 매질과 플라즈마 층의 계면에서 단핵 세포층을 조심스럽게 흡인하고 새로운 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 15ml 원뿔형 튜브에 세포 현탁액을 추가하고 중력의 460배에서 5분 동안 원심분리합니다.그런 다음 펠릿을 200마이크로리터의 인산염 완충 식염수에 2% 소 태아 혈청으로 재현탁합니다. 복합 사량체를 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도에 추가합니다. 잘 섞은 다음 빛으로부터 보호되는 Laminar flow hood에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.그런 다음 10ml의 얼음 저온 세포 분리 완충액을 세포 현탁액에 추가합니다. 460배 중력에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 얻어진 세포 펠릿에 500마이크로리터의 얼음 저온 세포 분리 완충액과 50마이크로리터의 두 가지 변형의 마그네틱 마이크로비드를 첨가하고 세포 현탁액을 20분 동안 배양합니다.다음으로, 세포 펠렛을 얼음 저온 세포 분리 완충액에 재현탁합니다. 평형을 이룬 컬럼 상단의 세포 현탁액을 조심스럽게 옮기고 완전히 배수시킵니다. 그런 다음 3ml의 세포 분리 완충액으로 튜브를 헹구고 완충액을 컬럼으로 옮깁니다.컬럼을 세 번 헹군 후 자석에서 컬럼을 제거하고 25ml 원추형 수집 튜브에 놓습니다. 컬럼 상단에 5ml의 얼음 냉간 분리 버퍼를 추가한 후 플런저를 사용하여 컬럼에서 세포를 빠르게 플러시합니다. 세포 펠릿을 항인간 항체 칵테일과 7AAD로 총 100마이크로리터의 인산염 완충 식염수와 2% 소 태아 혈청으로 재현탁합니다.그런 다음 섭씨 4도에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, cell sorter cytometer를 사용하여 초당 1,000개의 이벤트를 초과하지 않는 단일 세포 수준에서 특정 B cell을 분류합니다. 그런 다음 분류된 단일 B 세포를 10마이크로리터의 1X 인산염 완충 식염수와 10단위의 RNAse 억제제로 미리 채워진 8-스트립 PCR 튜브에 수집하고 96개의 마이크로튜브를 위한 랙에 놓습니다.튜브를 섭씨 영하 80도에서 빠르게 얼립니다. 냉동 샘플을 섭씨 70도로 유지되는 건조 수조에서 5분 동안 가열하여 세포를 용해합니다. 그런 다음 스트립을 얼음 위에 놓고 역전사 마스터 믹스를 구성하기 시작합니다.역전사 마스터 믹스가 준비되면 프로그램은 thermocycler에 지시합니다. 역전사가 끝나면 중첩된 PCR을 수행하여 면역글로불린 유전자를 증폭합니다. 1.5% 아가로스 겔에서 가변 중쇄 및 코딩 세그먼트에 대한 500 염기쌍 PCR 산물과 가변 경쇄 인코딩 세그먼트에 대한 350 염기쌍 PCR 산물의 이동을 시각화하여 양성 클론을 식별합니다.1마이크로리터의 클로닝 산물을 45마이크로리터의 전기 기능이 있는 TOP10 E.coli 세포에 첨가합니다. 전기천공염. 그런 다음 500마이크로리터의 2X YT 배지를 세포에 빠르게 첨가하고 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 배양합니다. 변형된 박테리아를 2X YT 암피실린 플레이트에 퍼뜨립니다.그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다. 다음으로, 반응 프리믹스를 설정하고 얼음에 보관된 8-스트립 PCR 튜브당 25마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 멸균 이쑤시개를 사용하여 집락을 선택하고 2X YT 암피실린 플레이트에 집락을 줄무늬로 만듭니다.그런 다음 이쑤시개를 PCR 반응 튜브에 담그십시오. 1.5% 아가로스 겔에서 중쇄 벡터에 대한 850 염기쌍 PCR 산물과 경쇄 벡터에 대한 600 염기쌍 PCR 산물의 이동을 시각화하여 양성 클론을 식별합니다. LB 배지 2밀리리터에 4개의 양성 콜로니를 접종합니다.섭씨 37도에서 분당 200회 회전하면서 하룻밤 동안 접종물을 배양합니다. 씨 15, 000의 인간적인 배아 신장 세포는 Dulbecco의 변경한 독수리 매체의 200 마이크로리터에 있는 편평한 바닥 96 좋은 판의 각 우물에 있는 10%fetal 둔감한 혈청으로 보충했다 transfection 전에 하루. 그런 다음 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 밤새 접시를 배양합니다.선형 폴리에틸렌이민 유도체 형질주입 시약을 사용하여 세포를 Cotransfection합니다. 0.5마이크로리터의 DNA 트랜스펙션 시약을 10마이크로리터의 150밀리몰의 염화나트륨으로 희석합니다. 다음으로, 150 밀리몰 염화나트륨 10 마이크로 리터에서 벡터를 발현하는 각 가변 중쇄 및 경쇄의 0.125 마이크로 그램을 희석합니다.모든 희석액을 각각 10초 동안 소용돌이칩니다. 그런 다음 이전에 희석한 DNA transfection 시약을 10마이크로리터의 DNA 용액과 혼합합니다. DNA transfection 혼합물을 15초 동안 빠르게 와류로 가열하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.DNA transfection 혼합물을 세포에 적하 방향으로 첨가한 다음 플레이트를 부드럽게 소용돌이칩니다. 형질주입 16시간 후에 배지를 교체하고 섭씨 37도의 무혈청 배지에서 5일 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 상층액을 흡인하고 v-bottom 96 웰 플레이트로 옮깁니다.각 웰을 96웰 ELISA 플레이트에 관련 항원과 함께 섭씨 4도의 온도에서 100마이크로리터의 최종 농도로 100마이크로리터의 최종 농도로 코팅합니다. 다음으로, 50마이크로리터의 형질주입된 세포 상등액을 96웰 ELISA 플레이트의 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 양 고추 냉이 과산화 효소에 접합 된 항 인간 면역 글로불린 G 항체 100 마이크로 리터를 밀리리터 당 1 마이크로 그램 농도로 추가하고 1 시간 동안 실온에서 웰을 배양합니다.마지막으로 50마이크로리터의 발색 기질을 웰에 추가하고 20분 더 배양합니다. 배양이 끝나면 분광 광도계에서 450 나노 미터의 광학 밀도를 읽습니다. 특정 B 세포를 분리하기 위해 수용체를 발현하는 B 세포를 HLA-A2/Pp65 복합체와 구별하는 게이팅 전략을 사용했습니다.초기에 세포는 CD19 양성, CD3 음성 개폐식이었습니다. 마지막으로, 세포를 HLA-A2/Pp65PE 및 HLA-A2/Pp65APC로 염색하되 HLA-A2/MelABV421 사량체는 염색하지 않고 매우 특이적인 B 세포를 얻기 위해 게이트를 처리했습니다. 이 게이팅 전략을 사용하면 선택적 B 세포를 분리할 수 있으며, 이는 HLA-A2/Pp65 및 기타 관련 HLA-A2 펩타이드 복합체를 구별할 수 있습니다.다음으로, HLA-A2/Pp65 테트라머에 대한 PC1.02 항체의 존재를 연구하기 위해 ELISA 분석을 수행했습니다. 얻어진 막대 플롯에서 y축은 최적 밀도 판독값에 해당하고 x축은 HLA-A2 펩타이드에 해당합니다. 분석에서 단클론 항체가 펩타이드 및 주요 조직 적합성 복합체 의존적 방식으로 HLA-A2/Pp65 사량체와 결합하는 것을 보여줍니다.다음으로, 표면 플라스민 레지던스를 사용하여 PC1.02 항체의 결합 친화도를 연구했습니다. 그런 다음 HLA-A2/Pp65 특이적 B 세포를 분석하기 위한 표 형식의 데이터를 얻었습니다. 비특이적 B 세포의 배제 전략의 영향, 면역글로불린 유전자 증폭의 수율 및 HLA-A2/Pp65 특이적 B 세포로부터의 단클론 항체 생산이 나타났습니다.일단 숙달되면 인간 혈액에서 항원 특이적 B 세포를 분리하는 것부터 단클론 항체 생산에 이르기까지 다양한 기술을 한 달 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 중단하지 않고 B 세포 분류에서 RT-PCR로 바로 진행해야 한다는 점을 기억하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 중쇄 및 경쇄 유전자를 가진 플라스미드 벡터를 도입하여 포유류 세포에서 항체를 생성하는 방법을 보여줍니다. 이 벡터는 폴리에틸렌과 상호 작용하고 폴리플렉스를 형성하여 세포에 들어갑니다. 나중에, 그들은 개별 단백질로 번역되어 완전한 항체로 조립되어 세포 외 배지로 분비됩니다.

포유류 세포 배양에서 재조합 단클론 항체 생성

이 비디오는 항원 특이적 B 세포에서 단클론 항체를 생성하는 기술을 보여줍니다. 분리된 항원 특이적 B 세포에서 복제된 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 진핵생물 발현 벡터는 폴리플렉스를 사용하여 포유류 세포에 도입됩니다. 일단 세포 내부로 들어가면 이러한 벡터는 번역을 거치고, 그 결과로 생성된 중쇄 및 경쇄 펩타이드는 항체로 조립되어 세포에서 분비됩니다.

항원 특이적 B 세포에서 단클론 항체를 생성하는 기술

이 논문은 정의된 동종항원에 특이적으로 반응하는 인간 T 세포 클론의 생성 및 증식 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다양한 펩타이드-MHC 리간드에 특이적인 인간 T 세포를 클로닝하는 데 적용할 수 있습니다.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

인간 단클론 항체의 합성은 자가 항체 매개 면역 반응의 병태생리학적 메커니즘을 밝히는 것을 목표로 하는 연구의 첫 번째 단계입니다. 당사는 B 세포 분리, 항체 클로닝 및 체외 합성을 포함하여 혈액 분류 B 세포에서 재조합 인간 면역글로불린 G(IgG) 단클론 항체를 생성하는 프로토콜을 개발했습니다.

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

인간의 말초 혈액은 일반적으로 체액성 면역 반응의 평가에 사용됩니다. 여기에서는 말초 혈액에서 인간 B 세포를 분리하고, 배양에서 인간 B 세포를 항체(Ab) 분비 B 세포(ASC)로 분화하고, ELISpot 분석을 통해 총 IgM- 및 IgG-ASC를 열거하는 방법에 대해 설명합니다.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

하이브리도마 기술을 기반으로 한 단클론 항체 생성을 위해 최적화된 프로토콜이 제시됩니다. 마우스는 면역접합체로 면역되었습니다. 비장 세포는 PEG와 전기 충격에 의해 불멸의 골수종 세포와 융합되었습니다. 항체 생산 하이브리도마 세포는 HAT 및 항원 특이적 ELISA 스크리닝에 의해 선택되었습니다.

하이 브리 도마 기술에 의해 쥐 단일 클론 항체의 생성

기능 및 표현형 분석 항원 반응성 B 세포를 검출하고 풍부 자성 나노 입자를 이용한 간단하면서도 효과적인 방법을 설명한다.

표현형 및 기능 분석에 대한 검색 및 희귀의 농축 항원 특이 적 B 세포

이 문서는 준비와 다양 한 immunoassays에 사용 하기 위해 천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 평가 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 절차는 면역을, 세포 융합, 간접 경쟁 ELISA, 긍정적인 복제품와 단일 클로 널 hybridoma 준비를 포함 한다. MALDI – TOF-MS와 ELISA 분석을 사용 하 여 항 체 특성에 대 한 사양도 제공 됩니다.

천연 제품에 대 한 단일 클론 항 체의 생성

인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 개별 항원 특이적 항체를 식별하고 회수하는 BSelex 방법은 유세포 측정과 단일 세포 PCR 및 복제를 결합합니다.

농축 된 인간 기억 B 세포 집단에서 원하는 특이성을 가진 항체의 선택 및 회복을위한 단세포 스크리닝 방법

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

학습하세요 인간 혈액에서 B 림프구를 분리하여 희귀 항원 결합 B 세포를 격리하고 완전한 인간 단일 클론 항체를 생성하는 방법을. 이 기술은 면역요법을 위한 정밀한 항원 표적화에 필수적입니다.

희귀 한 항 원 특정 B 세포 혈액 순환에서 구별 인간 단일 클론 항 체의 생성

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