Name: 세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 배우세요 전체 마우스 유방샘 절단 및 고정을 통한 세포 외 기질 단백질과 선 형태 분석 방법. 이 기법은 종양 생물학 및 발달 생물학 연구에서 조직 구조와 단백질 발현을 정량화하는 데 활용됩니다.

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저자 동물 검 시와 선 격리 지원에 대 한 4 월 간 계 및 박사 로저 Broderson를 각각 인정 하 고 싶습니다. 이 작품에 대 한 자금 지원 Osteopathic 약의 필라델피아 대학 센터에서 만성 장애의 노화 한다.

동물 과목이이 프로토콜에 관련 된 절차 검토 되었고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 Osteopathic 약의 필라델피아 대학의 승인 그리고 모든 기술에서 엄격한 실시 했다 윤리적 지침.
 1. 샘플 조달 및 처리 <ol><li>선택 적절 한 동물 주제와 CO 2 챔버로 장소. 이 실험에 대 한 사용 8 10 주 오래 된 여성 미 b 6. Cg-Cav1tmMIs/J와 C57BI/6J.</li>
	<li>가스 흐름 30-40%로 설정. 일단 동물 가시 의식이 약 2 분 후, 추가 5 분에 대 한 전체 압력 가스 밸브를 열고 
	참고: CO 2 배달 중지 후 10 분 동안 (예: 가슴의 움직임) 호흡의 눈에 보이는 징후를 관찰 하 여 동물의 죽음을 확인 합니다. 동물 아직 살아있다, CO 2 챔버에 다시 삽입할 수 있습니다. 자 궁 경관 탈 구도 사용 될 수 있지만 그것은 권장 하지 않습니다 혈액 해 부 결과와 방해 하는 유 방 땀 샘 주위 누적 될 수 있습니다.</li>
	<li>희생, 부정사 자리에 시체를 고정 하 고 70% 에탄올과 포화.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 치 골 바로 위에 펠트를 꼬 집 고 작은 수술가 위 닉. 가 위, 회전 이동 복 부 정중 선 따라 펠트 꼬리를 잘라 두개골.</li>
	<li>큰가 위 또는 한 hemostat, 퉁 명 스럽게 해 부 피하 근 막 양측, 하지 복 펑크에 주의 사용 하 여. 절 개의 원심 양쪽에 가로 여백을 따라 컷.</li>
	<li>핀에 펠트 플랩 열고 다시 70% 에탄올 스프레이. 
	참고: 비록 70% 에탄올의 사용 허용 더 나은 시각적 구분 선와 주변 피하 조직,이 솔루션의 사용으로 인해 조직의 건조 하지 않도록 주의 해야 합니다. 건조 하지 않도록, 선 하지 4 분을 초과 하는 시간 프레임에서 제거 합니다. 70% 에탄올을 대신, 탐정 또한 조직의 건조를 피하기 위해 1 x PBS 같은 일반적인 격리 버퍼 대체할 수 있습니다.</li>
	<li>유선 및 관련된 피부 지방 진 피에서 무료 절단 가죽 플랩의 안쪽을 따라 #4 메스 블레이드 슬라이드 찾기 관심, 유 방 땀 샘. 
	참고: 외과 마이크로 loupes x 3.5 땀 샘의 쉽게 시각화에 도움이 있습니다.</li>
	<li>즉시 24-48 헤에 대 한 10% 중립 버퍼링된 말린의 10:1 솔루션-조직 볼륨을 포함 하는 원뿔 관에 새로 절연된 선 잠수함 
	참고: 연구의 의도 따라 많은 다른 fixatives 사용할 수 있습니다 paraformaldehyde, 게놈 연구, 그리고 버퍼를 보존 하는 상용 RNA에 대 한 에탄올 등.</li>
	<li>는 파라핀 포함을 위한 기관 프로토콜에 따라, 포함, 처리에 대 한 공급 업체에 샘플을 제출 하 고 슬라이스/슬라이드 장착. 5 µ m에서 조직 섹션. 
	참고: 초과 지방 주변 동맥 때문 보십시오 제거 조직의 단면을 얼룩이 지기 전에 100-200 µ m.</li>
</ol> 2. 조직 얼룩 <ol><li>Immunohistochemistry <ol><li>장소 슬라이드 열 블록에 얼룩이 질에 녹기 파라핀 1 h 58 ˚C 설정. 
		주의: 파라핀 왁 스를 녹는 슬라이드 해제 실행할 수 있습니다. 밀접 하 게 모니터링 하거나 결선 왁 스를 잡으려고 슬라이드 아래 닦아. 
		참고:이 단계는 중요 하지 않습니다 하 고 건너뛸 수 있습니다. 결과 예상 대로 되지, 하는 경우 결과 향상 시킬 수 있습니다이 단계를 다시 추가.</li>
		<li>품 슬라이드는 슬라이드에 포함 된 100% 자일 렌 30 분 보장 완전 한 침수에 대 한 항아리. 한번 반복. 
		참고:이 시점에서, 검사 수행 되어야 한다 직물 단면도 지방 조직 및 파라핀 되도록. 이면 추가 지방 조직 또는 왁 스 분명 크 실 렌에 슬라이드를 다시 침수 한다. 주의 사용 하 여이 조직의 수 축을 일으킬 수로 자일 렌을 추가 노출을 최소화.</li>
		<li>10 분에 대 한 100% 에탄올을 포함 하는 슬라이드 항아리에 리하이드레이션 조직 반복 한 번.</li>
		<li>이동 슬라이드 10 분에 대 한 95% 에탄올을 포함 하는 슬라이드 항아리를 반복 한 번.</li>
		<li>슬라이드는 슬라이드 항아리 포함 75% 에탄올 5 분에 대 한 이동</li>
		<li>슬라이드는 슬라이드 항아리 포함 50% 에탄올 5 분에 대 한 이동</li>
		<li>10 m m 나트륨 구 연산 염 해결책 (pH 6.0) 핫 플레이트 또는 전자 레인지에 끓인 고 Coplin 항아리에 붓는 다. 
		주의: 신중 하 게 난방 솔루션을 모니터링 하 고 종 기 피하기 위하여 처리. 컨테이너는 매우 뜨거운 것입니다. 보호를 사용 하 여 화상을 피하기.</li>
		<li>천천히 Coplin에 장소 슬라이드 항아리, 완전 한 침수를 보장 하 고 10 분 검색 epitopes 100 ° C에서 품 어. 제거 하 고 신중 하 게 슬라이드 건조.</li>
		<li>소수 표시와 함께 조직 주위에 방 벽을 그립니다. 충분 한 내 생 효소 차단 추가 (과산화 수소와 나트륨 아 지 드, 사용할 수 있는 상업적으로) 티슈 커버 하 고 10 분에 대 한 품 어</li>
		<li>Submerge 슬라이드 1 x 인산 염 버퍼 10 분에 대 한 식 염 수 (PBS)</li>
		<li>티슈 커버 및 실내 온도 습도 챔버에 1 시간에 대 한 품 어 1 x PBS에 충분 한 나 귀 10% 혈 청 추가. 
		참고: 실험 수 수 일시 중지 여기 하룻밤에 4 ° C에서 습도 챔버 슬라이드를 저장 하 여. 당나귀 혈 청 최적의 착 결과를 발견 했다, 탐정 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 염소 혈 청 등 최적의 결과 결정 하기 위해 혈 청 말 다른 세라를 테스트 하실 수 있습니다. BSA를 사용 하는 경우 탐정이이 신선한 사용 하기 전에 준비 해야 한다.</li>
		<li>는 슬라이드에서 과잉 차단기를 가만히 따르다 고 추가 제대로 희석된 주 항 체 1% 혈 청에서 직접 조직 솔루션에 덮여 균등 하 게 보장 하는 슬라이드. 실내 온도 습도 챔버에 30 분 동안 품 어. 
		참고:이 단계 수 없습니다 계속 오래 시간 기간에 대 한 4에 저장 하는 습 한 챔버와 ° C. 확인이이 단계에서 적절 한 부정적인 컨트롤 (예: 없는 기본 항 체, 항 원 네거티브 조직, 등 알려진와 슬라이드) 슬라이드를 포함 해야 합니다.</li>
		<li>신중 하 게 약 1 mL의 diH 2 O 조직에 흐르는 슬라이드를 세척 하 고 5 분에 대 한 1 x PBS의 1 변화에 품 어</li>
		<li>초과 PBS를 가만히 따르다와 조직 및 습도 챔버에 30 분 동안 품 어 충분 한 양 고추냉이 과산화 효소 레이블을 추가. 
		참고:이 단계에서 탐정 형광 붙일 활용된 2 차 항 체를 사용 하 여 얼룩을 진행 하실 수 있습니다. 적절 하 게 설명 하는 다음 단계를 수정 해야이 바란다면,.</li>
		<li>신중 하 게 약 1 mL의 diH 2 O 조직에 흐르는 슬라이드를 세척 하 고 5 분에 대 한 1 x PBS의 1 변화에 품 어</li>
		<li>Chromogen 솔루션 제조 업체 제안된 비율에 따라 플러스 diaminobenzidine (DAB)을 확인 하 고 소용돌이 의해 혼합. 
		참고: 많은 기성 품 장비는이 프로토콜에 사용 되는 것 이외에도 상용.</li>
		<li>Decant 초과 슬라이드에서 버퍼링 하 고 조직에 직접 chromogen 얼룩의 2-3 방울 (10-50 µ L)를 추가 하 고 습 실에서 5 분 동안 품 어. 신중 하 게 조직에 흐르는 약 1 mL diH 2 O 슬라이드를 세척. 
		주의: DAB chromogen 매우 독성이 있다. 유해 폐기물에 떨어져 피부와 수집 흐름 얼룩의 직접 접촉을 방지.</li>
	</ol></li> <li>Hematoxylin 및 오신 (H &#38; E) <ol><li>해리스 되며 1-2 분에 대 한 수돗물에서 부드럽게 2-2.5 분 린스 슬라이드에서 슬라이드를 잠수함 chromogen 부 화 후 최종 린스 다음 
		참고: 조직에 물을 직접 제트를 피하기 위해 주의.</li>
		<li>Submerge 차별화 솔루션 (0.25 mL의 70% 에탄올 100ml에 염 산의)에서 2-3 s에 대 한 슬라이드. 약 1-2 분에 대 한 수돗물에서 부드럽게 슬라이드 린스</li>
		<li>30에 대 한 95% 에탄올에 60 미 린스 슬라이드 슬라이드 블루 에이전트 (4.5 mg 탄산 칼슘 100 mL 수돗물, pH 9.4 조정) 잠수함 s.</li>
		<li>Submerge 슬라이드 알코올 오신 2-3 분에 대 한 Y</li>
		<li>조직 2 변화 1 분에 대 한 95% 에탄올의 탈수.</li>
		<li>1 분에 100% 에탄올의 변경 1에서 Dehydrate 조직</li>
		<li>신중 하 게 보풀 지우기와 슬라이드 건조. 적용 1 방울 (약 100-200 µ L)의 합성, 비 수, 수 지 기반 미디어를 슬라이드 및 coverslip 적용 장착. 
		참고: 다른 착 방법, 선출 하는 경우 다른 설치 미디어 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 탐정 선택 형광 활용 된 이차 항 체, 수성 산 더 이상적인 것.</li>
		<li>하룻밤 실 온에서 설정 하려면 슬라이드 허용.</li>
	</ol></li> <li>Picrosirius 레드 (PSR) 얼룩 <ol><li>스테인드 될 immunohistochemistry 프로토콜 6 단계 (50% 에탄올 담가) 따라 하는 슬라이드를 선택 합니다.</li>
		<li>PSR Submerge 슬라이드 1 헤에 대 한 얼룩</li>
		<li>0.5% 초 산에 대 한 1-2, 얼룩을 차별화 하는 데 두 번 슬라이드 잠수함.</li>
		<li>조직 2 변화 1 분에 대 한 95% 에탄올의 탈수.</li>
		<li>1 분에 100% 에탄올의 변경 1에서 Dehydrate 조직</li>
		<li>짧게에 대 한에 대 한 100% 크 실 렌에 잠수 하 여 슬라이드를 취소 3-4 미</li>
		<li>신중 하 게 보풀 지우기와 슬라이드 건조. 적용 1 방울 (약 100-200 µ L)의 합성, 비 수, 수 지 기반 미디어를 슬라이드 및 coverslip 적용 장착.</li>
	</ol></li></ol> 3. 샘플 분석 α-SMA를 위한 <ol><li>Ductal 분석 <ol><li>선택 슬라이드 스테인드. 카메라 마운트 목적으로 가벼운 현미경을 사용 하 여 20 배 확대에서 대표 이미지 수집.</li>
		<li>사용 ImageJ (NIH), 구별 및 각 이미지에 관. 이러한 수동으로 열거 될 수 있다 또는 하나 개별 덕트 숫자 점수를 할당할 수 있습니다. 숫자 점수를 할당 하려면 ImageJ 열고 플러그인을 선택 합니다. 다음 분석을 선택 하 고 드롭 다운 메뉴에서에서 셀 카운터를 선택 합니다. 초기화를 클릭 합니다 다음 덕트를 표시 하려면 1을 강조 표시 합니다. 완료 되 면, ductal 카운트를 볼 결과 선택. 
		참고: ductal 및 하지 혈관 구조 확인 주의.</li>
		<li>에 &#39; 설정 측정 &#39; 옵션, 확인 &#39; 경계 &#39;와 &#39; 지역 &#34;.</li>
		<li>Myoepithelial 구획 (α-SMA 얼룩에 의해 원조 하는 시정)에서 각 덕트 주위 선을 그리는 자유형 다각형 도구를 사용 하 여. 선택 &#39; 측정 &#39; 경계와 영역 기록.</li>
		<li>다시 루멘의 내부에 ductal 상피의 꼭대기 측면을 따라 선을 그립니다 자유형 다각형 도구를 사용 하 여. 선택 &#39; 측정 &#39; 경계와 영역 기록.</li>
		<li>Ductal 상피의 둘레를 얻기 위하여 myoepithelial 구획의 경계에서 luminal 구획의 둘레를 뺍니다. Ductal 상피의 영역을 얻기 위해 myoepithelial 구획의 지역에서 luminal 구획의 영역을 뺍니다.</li>
	</ol></li> <li>Immunohistochemistry 분석 <ol><li>ImageJ 등 피지 스위트 분석 소프트웨어에 명시 이미지를 업로드. 
		참고:이 프로토콜 분석 ImageJ IHC 도구 상자 플러그인을 사용 하 여 얼룩에 대 한 단계를 간략하게 설명.</li>
		<li>는 플러그인 메뉴에서 IHC 도구 상자를 엽니다. 에 &#34; 선택 모델 &#34; 열립니다, 적절 한 얼룩을 선택 하는 콤보 상자 (즉, H-DAB, PSR, 등). 선택은 &#34; 색상 &#34; 얼룩을 옵션. 이 결과 창이 열립니다. 
		참고:이 메서드는 관심사의 단백질 extracellular 또는 cytosolic 공간에 있는 또는 원형질 막에 바인딩된 경우 적절 한. 관심사의 단백질 핵 이면 선택 &#34; 핵 &#34; 긍정적으로 얼룩진된 핵에 대 한 이미지를 분석 하는 플러그인을 묻는 메시지가 표시 됩니다.</li>
		<li>를 사용 하 여 색상 선택기 슬라이드 배경 포함 또는 과도 한 얼룩 제외 없이 얼룩의 적절 한 절연. 
		참고: 자동 모드 얼룩을 감지할 수 없거나 허용 이미지 귀착되 지 않는다, 그릴 사각형 관심 영역 (ROI)는 확인 된 이상 스테인드 영역. IHC 도구 상자 창에서 선택 &#34; 기차 &#34; 적절 한 대상에 플러그인 직접.</li>
		<li>16 비트 이미지를 변환합니다. 이동 이미지 &#8594; 유형 &#8594; 16 비트.</li>
		<li>임계값 이미지입니다. 이동 이미지 &#8594; 조정 &#8594; 임계값을 자동.</li>
		<li>길이 할당 이미지에서 눈금 막대 바로 위에 선 ROI를 그려서 이미지 측정 비율을 설정 합니다. 눈금 막대를 설정 하려면로 이동 분석 &#8594; 비율 설정. 길이 (예: 120 픽셀 당 50 µ m)의 원하는 단위 당 픽셀 수를 입력.</li>
		<li>결과 영역을 측정 하 고 회색 값을 의미. 이동 분석 &#8594; 설정 측정 클릭 하 여 측정을 수집 분석 &#8594; 측정.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

신문에서 우리 그대로 마우스 유 방 땀 샘: ECM 표현과 ductal 형태학의 다운스트림 조직학 분석을 분리 하는 기법을 설명 했습니다. Ductal 형태학의 분석, 관련이 방법론 ductal 아키텍처 기반으로 얼룩진된 조직학 섹션의 신속한 조사를 수 있습니다. Ductal 분석의 다른 방법 염료 ductal 트리의 시각화 수 있도록 기술적으로 도전적이 고 많은 시간이 소요 될 수 있는 방법의 주사에 의존 합니다.
유방암, ECM 비정상적인 수를 보고 되었습니다. 1 , 2 , 6 , 9 특히 ECM의 풍부 그리고/또한 cross-linking 패턴의 변화 보고 된 종양 진행, 전이 및 치료 저항3,...

유방암 조직 섬유 증1,2,,34의 상당한 정도 의해 특징입니다. ECM,이 아닌 휴대 엔터티 모든 조직에서 다양 한 각도에서 발견 하며 주로 원 및 원 비 collagens, 엘라 스 틴, 그리고 다양 한 신호 분자는 뿐만 아니라 glycoproteins의 복잡 한 채널의 구성 이 매트릭스에서 격리. 항상성 조건에서 증 착 및 ECM의 긴밀 하 게 제어 됩니다. 5 유 방 tumorigenesis, 동안 ECM 증 착 및 저하의 균형은 중단 됩니다. 이와 같이, 유 방 종양 collagens, fibronectin 다른 tenascin C 등 풍부한 ECM 단백질 표현 하 보고 되었습니다. 6 매트릭스 가교의 증가 패턴 뿐만 아니라이 단백질의 비정상적인 식 유 방 종양 진행, 전이 및 치료 저항1,3, 를 홍보 하기 위해 문서화 되었습니다 4,7,,89.
ECM 구성과 ductal 형태 평가, 그대로 유 방 땀 샘의 격리 수행 되었다. 여기, 우리 caveolin-1에 대 한 결핍 여성 미 마우스를 사용는 적극적인에 연결 되어있다는 완전 한 막 단백질 종양 서명10,,1112, 유 방 및 여성 미 b 6를 제어 쥐입니다. 조직학 처리 하 고 이러한 직물의 얼룩이 ductal 형태학의 특성화와 함께 여러 가지 ECM 단백질의 id 허용.
전반적으로, 전체, 그대로 유 방 땀 샘의 조직 전체 형태학 또는 세포 변화 발생 하는 외 인 성 또는 내 인 성 요인에 대 한 응답에서을 조사 기회 연구자를 제공 합니다. 기술의 단점 ductal 나무의 복잡 한 형태학의 더 완전 한 그림을 얻을 것 이다 3D 관점 반대로 2 차원 (2D) 조직 단면도의 분석에 연결 되어 있습니다. 유 방 동맥에서 세포-세포와 세포-ECM 상호 작용의 복잡성을 감안할 때, 전체, 그대로 샘의 격리는 ductal 형태 및 단백질 표현의 다양 한 지역에서는 murine 유를 효율적으로 분석 하기 위한 유리한 선입니다.

<table><tbody><tr><td>광학 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>현미경 카메라</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>Olympus</td><td>cellSens 엔트리 소프트웨어</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R 수술용 마이크로 루페</td><td>로즈 마이크로 솔루션</td><td></td><td>연구원 선호에 따른 확대</td></tr><tr><td>Mayo 가위</td>, <td>Medline</td><td>DYND04035</td><td></td></tr>, <tr><td>염색 랙</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>121</td><td></td></tr>, <tr><td>염색 접시</td>, <td>Fisher Scientific</td>, <td>112</td><td></td></tr>, <tr><td>Coplin Jars,</td><td>Fisher Scientific</td>, <td>19-4</td><td></td></tr>, <tr><td>유리 커버 슬립,</td><td>Fisher Scientific</td>, <td>12-550-15</td>, <td>조직에 적합한 크기</td></tr><tr><td>, IHC, EnVision+ 키트(HRP, 마우스, DAB+)</td><td>Dako</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius 레드 키트</td><td>Abcam</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y, 알코올 시</td><td>그마-알드리치</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>해리스 헤마톡실린</td><td>시그마-알드리치</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 혈청</td><td>EMD 밀리포어</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>시그마-알드리치</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>자일렌, 시약 등급</td><td>시그마-알드리치</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>에탄올,</td><td>분자 생물학에 적합한</td>200프루프 <td>시그마-알드리치</td><td>792780</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수,</td><td>1x Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td>나트륨 <td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>탄산칼슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>영구 마운팅 매체</td><td>Dako</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt의 마운팅 매체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin 항체</td><td>Abcam</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>Tenascin-C 항체</td><td>Abcam</td><td>AB108930</td><td></td></tr><tr><td>알파 평활근 Actin 항체</td><td>Abcam</td><td>AB124964</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision Dual Link System HRP</td><td>Dako</td><td>K4065</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

이 절차의 목표는 ECM 표현과 ductal 아키텍처 평가 #4 복 유 방 동맥 여성 미 쥐에서 수확 했다. 여기, 피부 아래 작은 주머니 메이 요가 위, 수 있도록 기본 복 막에서 피하 조직 내 분 비의 분리를 사용 하 여 만들었습니다. 땀 샘의 시각화 3.5의 사용에 의해 주 었 했다 x-R 수술 마이크로 loupes. 펠트 반전 했다 그리고 고정 다시 그대로 유 방 지방 패드의 허용 식별. #4 복 부 동맥의 각각 퉁 명 스럽게 옆으로 피하 층과 동맥 사이 메스 블레이드를 슬라이딩 하 여 해 부 했다. 수확 후 즉시 분 비 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 후속 조직 처리에 배치 했다. 전체 체의 절단은 주로 제외 ductal 상피 세포 및 다른 microenvironmental 세포 인구 부분 생 검에 놓친 수 간의 중요 한 조직 차원의 상호 작용의 위험을 제거 하기 때문에 유리 하다. 방법론의 1 결점은 동맥 내의 개별 위치로 ductal morphogenesis 고 단백질 식의 분석을 제한 하는 고정된 조직에서 직렬 섹션의 사용. 이와 같이, 3 차원 (3D) ductal 건축과 단백질 식에 변경 쉽게 얻을 수 아니다. 전반적으로, 기술 발달 ductal morphogenesis 또는 유 방 암 등 하류 조사에 대 한 전체 그대로 murine 유 방 땀 샘을 요구 하는 연구에 적용 됩니다.

여성 쥐 유 방 땀 샘의 5 쌍 있다. 특히, 자 궁 경부 분 비 (#1), 흉부 동맥 (#2 및 #3), 한 쌍의 복 부 동맥 (#4), 그리고 사 타 구니 동맥 (#5) (그림 1A)의 1 쌍의 두 쌍의 한 쌍이입니다. 여기, 우리는 그들은 쉽게 식별 #4 분 비 고립. 일부 경우에 # 4와 #5 분 비 했다 격리 함께 둘 사이의 구분이 어려웠다. 그대로 #4 복 부를 격리 하기 위해 유 방 땀 샘, 펠트는 고정 되었고 신중 하 게 화살표 (그림 1B)에 표시 된 #4 땀 샘의 위치를 드러내는 기본 복 막에서 분리. #4 샘 excised 신중 하 게 되었고 어떤 잔여 피하 또는 근육 직물의 존재에 대 한 검사. 이들은 우리의 고립 된 샘 (그림 1...

여기, 우리는 전체, 그대로 마우스의 격리에 대 한 프로토콜 세포 외 기질 (ECM) 식과 ductal 형태를 조사 하는 유 방 땀 샘을 제시. 마우스 #4 복 부 동맥은 8 10 주 오래 된 여성 미 쥐, 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정, 단면화 및 immunohistochemistry ECM 단백질에 대 한 사용 하 여 스테인드에서 추출 되었다.

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

이 전체 유선(whole mammary gland) 채취 기술의 전반적인 목표는 생체 외 온전한 분비선에서 유방 조직의 조직학적 표현을 쉽게 분석할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 종양에서 기질 조직이 어떻게 리모델링되는지 또는 비정상적인 유전자 또는 단백질 발현이 유관 구조를 어떻게 변화시키는지와 같은 종양 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자들이 건강하고 병든 쥐의 전체 유선에서 단백질 발현과 관 구조를 특성화하고 정량화할 수 있다는 것입니다.이 기술을 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Chris Thompson입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 8주에서 10주 된 암컷 무늬 쥐를 희생한 후 사체를 누운 자세로 고정하고 70% 에탄올을 사용하여 포화시킵니다. 집게를 사용하여 치골 바로 위의 가죽을 꼬집고 작은 수술용 가위로 긁습니다.그런 다음 가위를 돌려 복부 정중선을 따라 가죽을 자르고 꼬리를 두개골로 이동합니다. 더 큰 가위나 지혈기를 사용하여 복막에 구멍을 뚫지 않도록 주의하면서 피하 근막을 양측으로 둔탁하게 절개합니다. 절개 부위의 양쪽 말단 끝에서 수평 가장자리를 따라 자릅니다.다음으로, 펠트 플랩을 핀으로 열고 조직에 PBS를 뿌려 촉촉하게 유지합니다. 그런 다음 관심 있는 유선의 위치를 파악하고 펠트 플랩 내부를 따라 메스 날을 밀어 유선과 관련 피하 지방을 진피에서 제거합니다. 서혜부에서 복부를 분리하기 전에 땀샘을 가능한 한 뚜렷하게 식별하도록 주의하십시오.새로 분리된 분비샘을 약 6밀리리터의 10:1 용액을 들어 있는 원뿔형 튜브에 조직 부피 10% 중성 완충 포르말린에 즉시 담그고 24-48시간 동안 배양합니다. 슬라이드에서 파라핀을 녹이고 텍스트 프로토콜에 따라 슬라이스를 다시 수화한 후 10밀리몰의 구연산나트륨 용액을 핫 플레이트나 전자레인지에서 끓여서 용액을 Coplin 항아리에 붓습니다. 슬라이드를 Coplin 용기에 천천히 넣고 완전히 잠기고 섭씨 100도에서 10분 동안 슬라이드를 배양하여 항원결정기를 회수합니다.그런 다음 슬라이드를 제거하고 조심스럽게 말리십시오. 다음으로, 소수성 마커로 조직 주위에 장벽을 그립니다. 건조되면 PBS로 슬라이드를 1-2초 동안 헹굽니다.그런 다음 조직을 덮을 만큼 충분한 내인성 효소 차단제를 추가하고 슬라이드를 10분 동안 배양합니다. 슬라이드를 1X PBS에 10분 동안 담급니다

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 방법은 생쥐에서 유선 개발 및 기능을 해부하다하고 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 우유 방출은 옥시토신 기반 myoepithelial 세포 수축 분석을 사용하여 평가하는 동안 Excised 내유 분비가 전체 마운트를 사용하여 개발의 정도에 대한 평가입니다.

마우스 모델에서 유선 개발 및 기능 평가

시간 경과 영상은 특정 행동 매개 변수 독특한 유전 적 병변 사이에 상관 관계가 있는지 확인하기 위해 유방암 위험 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 기본 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 평가하는 데 사용됩니다.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

이 문서에서 설명하는 간접 면역 형광 프로토콜 탐지 및 마우스 유방 동맥에서 단백질의 현지화 할 수 있습니다. 완전한 방법은 유선 샘플을 제조 형광 현미경에 의해 이미지, 조직 절편을 면역 조직 화학 법을 수행하고, 이미지를 재구성하기 위해 주어진다.

마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

이 프로토콜은 non-adherent / mesenchymal 유방 상피 세포에서 세포 외 소포 (EVs) / 엑소 좀을 정화, 정량화 및 특성화하고 유선 형성능을 내유성 상피 세포로 전달하는 방법을 설명합니다. 줄기 모양의 유방 상피 세포로부터 유래 된 EVs / 엑소 좀은이 세포 특성을 EVs / 엑소 좀을 섭취하는 세포로 전달할 수있다.

extracellular vesicles / exosomes를 통한 유방 기초 상피 세포와 유방 Luminal 세포 사이 유선 형성 능력의 이전

설치류의 유선 선생 발달은 일반적으로 기술적 평가를 사용하거나 기본적인 신체적 속성을 측정하여 평가되었습니다. 분지 밀도는 객관적으로 정량화하기 어려운 유방 발달의 지표입니다. 이 프로토콜은 유선의 분기 특성의 정량 평가를위한 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다.

Sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화

우리는 성공적으로 슬라이드를 전체 마운트로 고정시킨 유방 조직을 조직 병리학 적 평가를 위해 성공적으로 제거, 가공, 절단 및 착색하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 생식 및 발달 테스트 지침 연구에서 유선 전체 마운트의 수집 및 평가를 촉진 할 수 있습니다.

병변 식별을위한 유선 절개 전체 장착

유방 동맥은 외부 근상피 및 내부 발광 상피 세포를 포함하는 이중 층 구조입니다. 제시된 것은 차동 트립시니화를 이용하여 오르가노이드를 준비하는 프로토콜이다. 이 효율적인 방법은 연구원이 별도로 유선 양식 및 기능에 있는 그들의 역할에 관하여 질문을 탐구하기 위하여 이 2개의 세포 모형을 조작하는 것을 허용합니다.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

여기에 설명된 생체내 영상화 방법은 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 콜라겐 초고조파 생성 및 내인성 형광을 이용하여 표지되지 않은 종양 미세환경을 종양, 기질 및 혈관 구획으로 비침습적으로 분절하여 4D 생체내 영상의 심층 분석을 한다.

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

본 프로토콜은 레이저 스캐닝 컨포칼 및 다광자 현미경에 의한 수유 마우스 유선의 생체 내 이미징을 위한 손쉬운 기술을 설명합니다.

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland(유선의 생체 내 세포내 현미경)

이 프로토콜은 차등 원심분리를 통해 원발성 정상 및 종양 유방 조직에서 상피 오가노이드를 생성하는 접근 방식에 대해 논의합니다. 또한 3차원 배양 및 포매된 오가노이드의 면역형광 이미징에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

계대증 없이 정상 및 종양 유방 조직에서 마우스 및 인간 상피 오가노이드 생성 및 이미징

이 프로토콜은 마우스 유선에서 유전자 노크아웃 및 활성화 연구를 병행할 수 있는  확장 가능한 관내 CRISPR 스크리닝 접근법을 설명합니다.

마우스 유선에서 유전자 결색 및 활성화의 병행 생체 내 스크리닝

배우세요 전체 마우스 유방샘 절단 및 고정을 통한 세포 외 기질 단백질과 선 형태 분석 방법. 이 기법은 종양 생물학 및 발달 생물학 연구에서 조직 구조와 단백질 발현을 정량화하는 데 활용됩니다.

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

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