살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

이 절차의 전반적인 목표는 Phagosomes를 포함하는 온전하고 농축된 박테리아를 분리하는 것입니다. 이 방법은 병원성 미생물이 숙주 세포에 침입할 때 식체 성숙 및 항원 처리의 변화와 같은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특수 장비 없이도 간단한 단계를 사용하여 식체를 포함하는 고품질 박테리아를 생산한다는 것입니다.

이 방법을 처음 접하는 개인은 방법론이 아닌 것과 비교하여 기술적으로 접근하기 쉽다는 것을 알게 될 것입니다. 우리는 세포 내 병원체가 Phagosomes를 유리하게 납치하는 메커니즘을 연구할 때 이 방법을 개발해야겠다는 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Saray Gutierrez입니다.

Salmonella Typhimurium 배양을 시작하려면 박테리아 루프를 사용하여 단일 박테리아 군집을 5ml의 뇌 심장 주입 육수에 접종합니다. 그런 다음 흔들면서 섭씨 37도의 인큐베이터에서 밤새 서스펜션을 배양합니다. 다음 날 이 박테리아 현탁액 1ml를 원뿔형 플라스크에 담긴 19mL BHI 육수에 옮깁니다.

흔들면서 섭씨 37도의 인큐베이터에서 다시 배양합니다. OD600이 1에 도달하면 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 배양물을 50ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5400 x G의 튜브를 15분 동안 원심분리합니다.

상등액을 제거한 후 박테리아 펠릿을 10ml 멸균 PBS에 다시 현탁시킵니다. 원심분리를 한 번 반복한 후 펠릿을 4.9밀리리터의 PBS에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 갓 준비한 비오틴 연결 용액 100마이크로리터를 박테리아 현탁액에 추가합니다.

이 현탁액을 5개의 1.5ml 튜브로 분할한 후 350rpm에서 2시간 동안 지속적으로 흔들면서 실온의 열 블록에서 배양합니다. 15, 000 x G에 10 분 동안 실내 온도에 관을 원심 분리한 후에, 상등액을 버리십시오. 두 번의 추가 원심분리 단계와 비오틴 연결 용액을 완전히 제거한 후, 이 비오틴 코딩 박테리아를 단일 1.5ml 튜브의 1ml 멸균 PBS에 다시 현탁시킵니다.

100마이크로리터의 스트렙타비딘 접합 마그네틱 비드 용액을 새 1.5ml 튜브에 넣고 마그네틱 랙에 5분 동안 놓습니다. 튜브에서 솔벤트를 제거한 후 마그네틱 랙에서 튜브를 제거합니다. 그런 다음 튜브에 남아 있는 비드를 1ml의 Biotin 코딩 박테리아 현탁액으로 다시 현탁시킵니다.

350rpm으로 흔들면서 실온에서 1시간 동안 열 블록에 튜브를 배양합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 놓습니다. 피펫을 사용하여 벽에 부착되지 않은 박테리아를 제거하고 코딩되지 않은 박테리아라고 표시된 새 튜브로 옮깁니다.

벽에 부착된 마그네틱 비드가 있는 튜브에는 Biotin Streptavidin으로 코딩된 박테리아가 포함되어 있습니다. 마그네틱 랙에서 Biotin Streptavidin 코드 박테리아가 있는 튜브를 제거하고 1ml 멸균 PBS에 다시 현탁합니다. 튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 올려놓은 후 PBS를 분리합니다.

마지막으로, 세척된 Biotin Streptavidin 코드화된 박테리아를 500마이크로리터의 멸균 PBS에 다시 현탁시키고 튜브를 코드화된 박테리아로 표시합니다. 감염 전날, 플레이트는 10%의 FBS가 보충된 RPMI의 6cm 접시에 담긴 BMDM을 완전히 분화했습니다. 다음 날에, 5 분 동안 4 섭씨 온도에서 15, 000 x G에서 코딩 된 박테리아 현탁액을 원심 분리하십시오.

상층액을 제거한 후 10% FBS가 보충된 RPMI 배지에 박테리아 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 세포를 감염시키기 위해 BMDM에서 배지를 제거하고 RPMI 배지에 5ml의 코딩된 박테리아 현탁액을 추가합니다. 식세포작용(Phagocytosis)을 동기화하려면 실온에서 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 식세포작용(Phagocytosis)을 시작하려면 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 접시에서 배지를 제거하고 RPMI에서 세포를 세 번 세척하여 내재화되지 않은 박테리아를 제거합니다. 겐타마이신 밀리리터당 50마이크로그램에 10% FBS를 함유한 RPMI 10밀리리터에서 비식세포화된 박테리아를 죽이는 것.

마지막으로, 감염된 BMDM을 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 원하는 시점까지 배양합니다. 먼저, 사용 직전에 DTT 및 Cytochalasin B를 첨가하고 제조업체에서 권장하는 Protease 및 Phosphatase Inhibitors를 추가하여 필요한 Phagosome Isolation Buffer A의 부피를 준비합니다. 원하는 시점에 감염된 세포에서 배지를 제거하고 실온으로 예열된 멸균 PBS로 세포를 세척합니다.

그런 다음 750마이크로리터의 Phagosome Isolation Buffer A를 접시에 넣고 얼음에서 20분 동안 배양합니다. 가끔 접시를 흔드는 것을 잊지 마십시오. 다음으로, 250마이크로리터의 Phagosome Isolation Buffer B를 추가한 다음 플레이트를 흔들어 버퍼가 표면을 완전히 덮도록 합니다.

고무 경찰관을 사용하여 세포를 부드럽게 긁어 접시에서 세포를 제거하고 미리 냉각된 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 1밀리리터 주사기를 사용하여 26게이지 바늘을 통해 세포 현탁액을 최소 15회 통과시킵니다. 그런 다음 셀 서스펜션을 마그네틱 랙에 5분 동안 놓습니다.

자기 구슬에 부착된 입자는 코드화된 S.Typhimurium을 포함하는 식체입니다. 그런 다음 나머지 세포 구성 요소를 포함하는 현탁액을 Cytosol로 표시된 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 랙에서 분리된 Phagosome이 들어 있는 튜브를 제거하고 1mL 멸균 PBS에 다시 현탁합니다.

튜브를 마그네틱 랙에 다시 5분 동안 놓은 다음 PBS를 제거합니다. PBS로 이 세척을 한 번 반복한 후 PBS를 제거하고 마지막으로 필요한 완충액에 Phagosomes가 포함된 S.Typhimurium을 다시 현탁합니다. 컨포칼 현미경으로 S.Typhimurium Biotinylation의 효과를 평가하기 위해 BMDM을 비오틴으로 표지된 mCherry S.Typhimurium에 감염시켰습니다.

Cy5-Streptavidin으로 고정 및 배양 후 Cy5-Streptavidin 형광 신호에 의해 성공적인 Biotinylation이 확인되었습니다. 이 신호는 비오틴화된 mCherry S.Typhimurium에서만 독점적으로 관찰된 반면, 비오틴화된 mCherry S.Typhimurium에서는 신호가 없었습니다. 분리된 Phagosomes의 Immunoblock 분석은 세포질 분획과 비교하여 Phagosomes에서 S.Typhimurium을 발현하는 mCherry의 상당한 농축을 보여주었습니다.

분리된 Phagosome에서 엔도솜 및 리소좀 마커를 사용한 면역블록 분석은 감염 후 30분이 지난 것에 비해 감염 후 4시간 후에 분리된 Phagosome에서 테스트된 마커가 풍부해지는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜이 황색포도상구균에 적용되었을 때, S.aureus를 발현하는 GFP의 성공적인 Biotinylation이 나타났습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 연구자가 감염을 위해 선택한 잠복 시간에 따라 약 1시간 30분 안에 완료할 수 있습니다.

Phagosomes를 포함하는 박테리아의 성공적인 분리를 보장하려면 완충액에 표시된 농도가 포함되어 있고 세포의 균일한 적용 범위를 보장하기 위해 플레이트가 흔들리고 있는지 확인하십시오. 또한 세포를 긁을 때와 바늘을 통해 세포 현탁액을 통과시킬 때 부드럽게 하십시오. 이 절차에 따라 단백질체학 또는 대사체학과 같은 다른 기술을 분리된 식체로 수행하여 관련된 병원성 인자에서 병원체로 인한 변화를 연구할 수 있습니다.