Name: 살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 학습하세요 대식세포에서 Salmonella typhimurium을 포함한 파고솜을 분리하는 방법을. 비오틴과 스트렙타비딘을 이용한 이 기술은 면역학 연구에 필수적인 도구입니다.

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로빈슨의 실험실에서 연구 Aging-Associated 질병, 쾰른 대학, 독일에서에서 세포질 긴장 응답에 쾰른 우수 클러스터에서 자금에 의해 지원 됩니다 (CECAD; 독일 연방의 우수 이니셔티브에서 DFG, 투자 및 정부 국가)와 도이치 가운데 (SFB 670), 쾰른 재산, 그리고 쾰른, 독일의 대학의 마리아 Pesch 재단에서 교부 금.

병원 성 미의 사용을 포함 하는 모든 단계 typhimurium BSL-2 또는 더 높은 생물 학적 보안 수준의 시설에서 실시 해야 합니다. 문화와 미의 코팅 골 수 유래 세포 (BMDMs)의 감염 뿐 아니라 Typhimurium, 오염을 방지 하기 위해 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다. 미의 격리 typhimurium-phagosomes를 포함 하는 어떤 BSL-2 실험실 벤치에 수행할 수 있습니다.
 대 식 세포로의 분화에 대 한 쥐에서 골의 추출에 동물 복지 기관 지침에 따라 수행 되었고 자연, 북쪽 라인 강 Westphalian 국가 기관에 의해 승인 환경 및 소비자 보호 [Landesamt 위한 Natur, Umwelt 및 Verbraucherschutz (LANUV) 노르 트 베스트 팔 렌; 파일 번호: 84-02.05.40.14.082와 84-02.04.2015.A443]와 쾰른 대학.
 1. Culturing S. typhimurium <li>Inoculate S. <ol> typhimurium (SL1344 스트레인) 세균성 루프를 사용 하 여 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 국물의 5 mL로 단일 세균성 식민지에서.</li>
	<li>떨고와 하룻밤 37 ° C에서 인큐베이터에서 세균성 정지를 품 어.</li>
	<li>다음 날, 세균 현 탁 액의 1 mL 원뿔 플라스 크에서 BHI 국물의 19 mL로 하 고 떨고와 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>모니터링 미 600에서 광학 밀도 (OD)를 측정 하 여 typhimurium 성장 nm (OD 600)는 분 광 광도 계. 측정 30 분 마다 약을 복용 해야</li>
	<li>때 세 600 1.0에 도달할 때, 인큐베이터 및 50 mL 튜브에 전송에서 세균 현 탁 액을 제거 합니다. 4에서 15 분 동안 5400 x g에서 박테리아를 원심 ° c.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 10 mL의 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에서 resuspend.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 5400 x g에서 원심 분리기</li>
	<li>는 상쾌한을 제거 하 고 살 균 PBS의 4.9 mL에 박테리아 resuspend.</li>
</ol> 2. S. typhimurium NHS-비오 틴/Streptavidin-활용 자석 구슬의 코팅 <ol><li>10 mg/mL의 추가 100 µ L biotin 연결 솔루션 (NHS-비오 틴 디 메 틸 sulfoxide, DMSO에에서 용 해) 갓 준비, 세균 현 탁 액 이전 단계에서 준비. 예를 들어 메 마른 DMSO의 0.5 mL에 NHS-비오 틴의 5 mg을 희석. 제대로 몇 번 위아래로 pipetting으로 믹스.</li>
	<li>5 1.5 mL 튜브에 믹스를 분할.</li>
	<li>350 rpm에서 일정 한 동요와 함께 실 온 (RT)는 thermoblock에에서 2 h에 대 한 품.</li>
	<li>튜브 RT에서 10 분 동안 15000 x g에서 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>살 균 PBS, RT에서 10 분 동안 15000 x g에서 원심 분리기의 1 mL에 resuspend 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>솔루션 연결 초과 biotin을 완전히 제거 하려면 단계 2.5 두 번 더 반복.</li>
	<li>마지막 세척 후 살 균 PBS의 1 mL에 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 10 mg/mL streptavidin 활용 자석 구슬 솔루션의 100 µ L를 전송 하 고 5 분에 대 한 자석 선반에 두고</li>
	<li>는 피 펫과 용 매를 제거, 자기 선반에서 streptavidin-활용 자석 구슬 솔루션 고 biotin 코팅 세균 현 탁 액 단계 2.7에서에서 준비의 1 mL와 함께 그것을 resuspend.</li>
	<li>350 rpm에서 일정 한 동요와 thermoblock에 RT에 1 시간에 대 한 품.</li>
	<li>솔루션에 자석 랙; 5 분 기다려 놓고 다음 벽에 고착 하지 않았다 박테리아는 피 펫으로 제거 (튜브로 계속 &#34; 비 코팅 박테리아 &#34;). 자석 접촉 튜브의 벽에 준수 하는 분수는 비오 틴/streptavidin 입히는 박테리아.</li>
	<li>자석 선반에서 레이블이 박테리아를 포함 하는 튜브를 제거 하 고 살 균 PBS의 1 mL에 resuspend.</li>
	<li>자석 선반에 그것을 다시 배치, 5 분 대기 고는 피 펫을 사용 하 여 PBS를 제거.</li>
	<li>는 streptavidin 활용 자석 구슬에 입힌 모든 박테리아를 제거 하 2.13, 2.14 단계 두 번 더 반복.</li>
	<li>마지막 세척 후 코팅-박테리아 살 균 PBS의 500 µ L에 resuspend 하 고로 튜브 라벨 &#34; 박테리아 코팅 &#34;.</li>
	<li>계산 콜로 니 형성 단위 (cfu) 둘 다의 &#34; 비 코팅 박테리아 &#34; 및 &#34; 박테리아 코팅 &#34; BHI 한 천 배지에서 직렬 희석 도금 솔루션. 대략 2 x 10 8 cfu/mL 코팅-박테리아의 1.0의 OD 600와 초기 세균 현 탁 액의 20 mL에서 얻을 수 있습니다. 코팅-박테리아 정지 대 식 세포를 감염 하는 다음 날에 사용 될 4 ° C에서 유지.</li>
</ol> 3. BDMDs의 감염 <ol><li>완전히 접시 때 박테리아 biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 코팅은 같은 날 6 cm 요리 접시 당 5 x 10 6 세포의 밀도에서 차별화 된 BMDMs 22.</li>
	<li>다음 날, 4에 5 분 동안 15000 x g 코팅-박테리아 정지 원심 ° c.</li>
	<li>는 상쾌한을 제거 하 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 매체에서 10 x 10 6 cfu/mL의 농도에서 resuspend.</li>
	<li>10, 감염 (MOI)의 다양성에 대 식 세포를 감염 하는 BMDMs에서 매체를 제거 하 고 코팅-박테리아 정지 준비의 5 mL을 추가. 최적의 나 모든 셀 또는 격리 된 phagosomes의 실험 목적에 대 한 평가 수 있습니다.</li>
	<li>먹어서 동기화 10 분 RT에서 품.</li>
	<li>품 먹어서 시작 30 분 5% CO 2 배양 기에서 37 ° C에서. 다른 세포 유형 다른 보육 시간 박테리아의 국제화를 위해 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>요리에서 박테리아를 포함 하는 매체를 제거 하 고 비 내 면 박테리아를 제거 하 RPMI 셀 세 번 세척.</li>
	<li>마지막으로 어떤 비 phagocytized 박테리아를 죽 일 10 %FBS 및 50 µ g/mL gentamycin 포함 된 RPMI의 10 mL을 추가.</li>
	<li>원하는 시간 까지는 5% CO 2와 37 ° C에서 감염 된 BMDMs를 품 어. 원하는 시간 포인트 박테리아 및 셀 형식 사용 및 분석의 목적에 따라 실험적으로 결정 되어야 합니다. 미에서 초기 phagosome endosome 퓨전 이벤트의 연구에 대 한 Typhimurium 감염 BMDMs 30 분 부 화는 것이 좋습니다. 나중에 이벤트의 분석을 위한 phagosomes 2 h 또는 외피의 4 h 후 추출할 수 있습니다. 미와 대 식 세포의 장기 배양 24 시간 넘어 Typhimurium 대 식 세포의 죽음에서 발생합니다. 확장 세포내 감염 전에 phagosome 추출 아마 비오 틴 분자의 저하로 이어질 수 있습니다. 그러나, 우리가 않았다 관찰 하지 코팅-박테리아에 biotin의 손실까지 24 h.</li>
</ol> 4. 미의 격리 typhimurium-Phagosomes 포함 된 <ol><li>준비 필요한 phagosome 볼륨 절연 버퍼는 (50 m m 파이프, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5mm EGTA) 1 m m, Cytochalasin B는 최종의 최종 농도를 dithiothreitol (DTT)을 추가 하 여 제조업체에서 권장 하는 대로 10 µ M, 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 농도. 
	참고: DTT와 Cytochalasin B에 추가 되어야 합니다 phagosome 절연 버퍼는 사용 전에 항상 즉시. Cytochalasin B 방해 세포 골격, 세포 막의 파열을 촉진.</li>
	<li>원하는 시간에 포인트, 감염 된 세포에서 매체를 제거 하 고 실시간에 따뜻하게 살 균 PBS로 세척</li>
	<li>Phagosom의 추가 750 µ Le 절연 접시 당 A를 버퍼링 하 고 얼음에 20 분을 품 어. 다른 휴대폰 번호를 사용할 경우 절연 버퍼 A의 볼륨 비례적으로 조정 되어야 합니다.</li>
	<li>추가 250 µ L phagosome 절연 버퍼 B (50 m m 파이프, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5mm EGTA, 220 mM 마 니 톨, 및 68 mM 자당). 버퍼는 접시의 전체 표면에 도달 되도록 접시 바위. 다른 휴대폰 번호를 사용할 경우 절연 버퍼 B 양의 비례적으로 조정 되어야 합니다.</li>
	<li>고무 경찰관을 사용 하 여 부드럽게 된다고 하 여 접시에서 셀을 제거 하 고 미리 냉장된 1.5 mL 튜브에 그들을 전송.</li>
	<li>세포 현 탁 액 26 G 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 적어도 15 번 (한 포부와 한 번으로는 셀 서 스 펜 션의 한 방출) 통과. 이것은 BMDMs의 cytosolic 콘텐츠 공개 충분 하다. 바늘을 통해 전달 수 모든 세포 유형에 대 한 최적화 해야 합니다.</li>
	<li>자석 선반에 세포 현 탁 액을 배치 하 고 5 분을 기다립니다. 자석에 부착 된 입자는 포함 하는 코팅-미 phagosomes Typhimurium입니다. 세포 구성 성분의 나머지를 포함 하는 정지.</li>
	<li>정지로 1.5 mL 튜브에 전송 &#34; cytosol &#34;.</li>
	<li>자석 선반에서 분리 된 phagosomes와 튜브를 제거 하 고 살 균 PBS의 1 mL에 그들을 resuspend.</li>
	<li>Phagosome 정지 자석 선반에, 5 분 대기 장소와 PBS를 제거.</li>
	<li>4.9-4.10 격리 미를 씻어 반복 단계 typhimurium-포함 하는 phagosomes.</li>
	<li>는 마지막으로 PBS를 제거 하 고 필요한 버퍼; 예를 들어 단백질 분석에 대 한 radioimmunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) 버퍼는 phagosomes resuspend. 단백질의 약 50-200 µ g 샘플 셀의 초기 금액 및 감염의 나에 따라,이 프로토콜에 따라 당 얻은 것입니다.</li>
</ol>

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</ol>

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미 의 격리에 대 한 새로운 방법 typhimurium-여기 설명 biotin와 streptavidin 활용 자석 구슬 박테리아를 코팅 하 여 phagosomes를 포함 하. 부드러운 파괴 후 세포 막의, 포함 하는 박테리아 phagosomes 추출할 수 있습니다 쉽게 자기 선반을 사용 하 여. 우리는 박테리아의 라벨 염증을 유발 하는 병원 체의 용량을 유지 하 고 호스트 세포의 phagocytic 속성을 변경 하지 않습니다 보여줍니다. 중요 한 것은,이 방법에 의해 얻은 phagosomes 풍성 하 게 박테리아와 endosome/리소좀에 마커 및 cytosolic 오염 없는.
이 방법은 자당 그라데이션 분리를 고용 하 고 전통적인 phagosome 격리 방법에 비해 몇 가지 장점을 제공 합니다. 그것은 시간이 걸리는 연구원 적은 시간에 더 많은 샘플을 처리 하 고 쉽게 단계 세척의 수를 증가 시켜 순수한 phagosome 샘플을 얻을 수 있도록 ...

대 식 세포는 검색 하 고, 아마, 어떤 이물질 침입 박테리아 등 미생물까지 apoptotic 세포에서 주변 조직에 저하 전문된 phagocytic 세포 순환 하 고 있다. 병원 체 특정 마커 미생물 (병원 체 관련 된 분자 패턴 또는 PAMPs 라고도 함)의 표면에 일반적으로 존재의 표면 수용 체-중재 인식, 시 세포에서 세포 막의 복잡 한 개편 시작 서라운드 및 병원 체1phagocytize 순서입니다.
몸부림치 병원 체 라고 phagosome 세포내 소포에서 대 식 세포에 의해 다음 포함 되어 있습니다. 일련의 융해 및 분열 이벤트 endosomes 리소좀 등 다른 소포를 통해 병원 체 포함 phagosome phagosomal 콘텐츠 제거에 필요한 단백질의 집합을 가져옵니다. 따라서,는 phagosome의 효소 구성 phagosome 성숙2로 알려진이 프로세스 과정에서 매우 변수입니다.
식 균 작용, 복잡 한 vacuolar ATPase (v-ATPase) phagosome 막 endosomes3융합에 의해 통합 됩니다 multimeric 직후 이 복잡 한 phagosome4의 루멘에 cytosol에서 펌프 양성자에 ATP를 사용합니다. 산성화는 phagosome의 다른 소포5 퓨전 이벤트와 pH-종속 degradative 효소6의 큰 숫자의 활성화를 위해 필수적 이다. 또 다른 multimeric 효소 복잡 한 phagosome 멤브레인에 신속 하 게 조립 하는 NADPH 산화 효소 (NOX) 복잡 한이입니다. NOX 복잡 한 반응성 산소 종 (선생님)을 phagosome 루멘으로 은닉 되 고 몸부림치 미생물7의 살인에 크게 기여를 생성 하기 위하여 NADPH 산화 한다.
성숙의 초기 단계 동안 phagosomes Rab5 등 각각8v ATPase V0 소 단위와 함께 초기 및 늦은 endosomes의 Rab7 일반적으로 마커를 제시. Phagosomes 늦은 endosomes와 리소좀의 융합 결과 cathepsin 프로 테아 제, lipases, β-galactosidase9등 가수분해 효소의 다양 한 phagocytized 병원 체의 노출. 루멘의 산성화는 또한이 효소의 활성화를 위해 필요 합니다. 예를 들어 활성 약식 생산 cathepsin D의 분열 pH 의존10입니다. 이 효소는 병원 체를 저하 하 고 병원 체 파생 짧은 펩 티 드의 macrophage 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 클래스 II 분자 T 세포는 적합 한 면역 반응11하에서 제공 하는 생산을 중재.
따라서 phagosome 성숙은 타고 난 면역 반응에 대 한 중요 하 고 링크 타고 난 및 적응형 면역 시스템의 팔. 그것은 전혀 놀라운 병원 체 phagosome 성숙의 위 설명 된 과정을 통해 세포에 의해 제거 극복 하는 전략을 진화 했다. 예를 들어 결핵균 , 레지오 넬 라 pneumophila 세포내 박테리아 방지 억제 v ATPase 어셈블리 및 필연적인 루멘 산성화12,13 phagosome 성숙 . 다른 박테리아, Listeria monocytogenes 등 Shigella flexneri cytosol14,15로 탈출 phagosome 막에서 기 공 형성 유도. 다른 한편, 살 모 넬 라 enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) 16의 복제 대 한 적당 한 위치에 그것을 변환 하는 공포에서 phagosome의 속성을 수정할 수 있다. 이 능력은 미 typhimurium phagosome 성숙의 병원 체 중재 간섭 공부에 매우 흥미로운 모델.
S. typhimurium 인간에서 위장염을 일으키는 facultative 세포내 박테리아 이다. Lamina propria, 미 의 침공 후 Typhimurium 박테리아 및 감지 신속 하 게는 대 식 세포에 의해 phagocytized 그리고 phagosomes17내 포함. 일부 보고서는 그 미 를 앞에서 설명한 typhimurium-포함 phagosomes 제시 endosomes와 리소좀18, 제조 업체 및 다른 연구 phagosome 리소좀 퓨전 S. 시 방해 발견 Typhimurium 감염19.
처음, phagosome 성숙 미 시 typhimurium 감염 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 조사 했다. 포함 하는 박테리아의 고립에 대 한 기술의 개발 phagosomes endosome와 리소좀 마커 점에서 phagosome 내용의 더 정확한 연구를 활성화. 날짜, 포함 하는 박테리아의 절연에 사용 되는 주요 방법 phagosomes 자당 단계 그라디언트18,20subcellular 분류입니다. 그러나,이 방법은 여러 원심 분리 단계를 phagosomes 기계적 손상 될 수 있습니다, phagosomal 구성 요소 (단백질, 지질)의 안정성에 영향을 미칠 수 있는 시간이 소요 됩니다 필요 합니다. 또한, 그것 요구는 ultracentrifuge의 사용: 모든 실험실에 대 한 액세스할 수 있는 특수 장비의 한 조각.
최근, 새로운 접근 포함 하는 박테리아의 고립에 적용 된 phagosomes, biotinylated lipopetide (Lipobiotin)와 나중 세균성 병원 체는 분류는 streptavidin 활용 자석 구슬21 사용 하 여 추출 . 우리는 streptavidin 활용 자석 구슬 이어서 세균성 표면 아민 함유 고분자 NHS-비오 틴의 라벨 다른 보완적인 방법을 제안 합니다. Phagosomes이 메서드에서 얻은 endosome와 리소좀 표식에 풍성 하 게 높은 고 분석 실험, omics 분석 단백질 분석에서의 광범위 한 범위에 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 ultracentrifuges 같은 전문된 장비를 필요 하지 않습니다. 또한, 원심 분리 단계를 제거 함으로써 phagosomes에 기계적 손상 및 고용 시간을 상당히 줄일 수 있습니다. 이 메서드는 phagosomes 포함 하는 다른 박테리아는 그람 양성 포도 상 구 균,이 원고에 포함 등의 절연에 대 한 쉽게 적응 될 수 있다. 요약 하자면, 미 의 격리에 대 한이 방법은 typhimurium-phagosomes를 포함 하는 단순 하 고, 비용 효율적인, 그리고 자당에 의해 클래식 격리 보다 소비 하는 시간이 적은 그라데이션-ultracentrifugation, 높은 렌더링 농축 박테리아 포함 된 phagosomes.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag Streptavidin</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Halt 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL 또는 DynaMag Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 분광 광도계</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>세균 루프(10&마이크로; l)</td> <td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344</td><td>Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>SA1011</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta-actin 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>anti-mCherry 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab5 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>anti-Rab7 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10764</td><td></td></tr><tr><td>anti-v-ATPase (V0) 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>anti-V-ATPase (V1) 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>anti-cathepsin D 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6486</td><td></td></tr><tr><td>anti-Tomm20 항체</td>Santa <td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-17764</td><td></td></tr><tr><td>anti-calnexin 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>사우스캐롤라이나-20357</td><td></td></tr></tbody></table>

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 phagosomes를 포함 하

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

살 모 넬 라 typhimurium 인간에서 위장염을 일으키는 facultative 세포내 박테리아 이다. Lamina propria S. 의 침공 후 typhimurium 박테리아 및 감지 신속 하 게는 대 식 세포에 의해 phagocytized 그리고 소포 저하 될 하기 위해 phagosomes로 알려진에 포함 된. 미 의 격리 typhimurium-포함 phagosomes 널리 사용 되었습니다 공부 어떻게 미 typhimurium 감염 세균 저하를 방지 하기 위해 phagosome 성숙의 과정을 변경 합니다. 고아 하 게, 포함 하는 박테리아의 격리 phagosomes 자당 기온 변화도 원심 분리에 의해 수행 되었습니다. 그러나,이 과정은 시간이 많이 걸리는, 이며 전문된 장비와 어느 정도의 손 재주. 여기에 설명 된은 미 의 격리에 대 한 간단 하 고 빠른 방법 typhimurium-자석 구슬 biotin streptavidin 활용 된 박테리아를 코팅 하 여 세포에서 phagosomes를 포함 하. Phagosomes이이 방법으로 얻은 분석 실험, 단백질, 대사 산물, 및 지질 분석 등의 광범위 한 범위에 대 한 격리 된 phagosomes의 사용을 허용 하는 선택의 어떤 버퍼에 중단 될 수 있습니다. 요약 하자면, 미 의 격리에 대 한이 방법은 typhimurium-phagosomes 포함 된 특정, 효율, 빠른, 최소 장비를 요구 이며 자당 기온 변화도-ultracentrifugation 격리의 고전적인 방법 보다 더 다양 한.

포함 하는 박테리아의 고립이이 프로토콜에 의해 phagosomes 필요한 첫 번째 단계는 박테리아의 biotinylation. 우리는 그러므로 미 의 효과 평가 BMDMs biotinylated 감염의 confocal 현미경 분석에 의해 typhimurium biotinylation mCherry-S. typhimurium Cy5 Streptavidin 표시입니다. 간단히, BMDMs mCherry-S와 함께이 프로토콜에서 설명 된 대로 감염 되었다. typhimurium 이전 biotinylated 하지 streptavidin 활용 자석 구슬 알을 품 지만. 37 ° C에서 30 분 부 화, 후 셀 따뜻한 PBS로 세척 되었고 실시간 고정 20 분 PBS 가진 광범위 한 세척에 의해 중단 됐다에 대 한 4% 포름알데히드로 고정. 셀은 다음 실시간 감염 BMDMs에서 5 분에...

여기 살 모 넬 라 typhimurium의 격리에 대 한 간단 하 고 빠른 방법 설명-비타민 b 복합체와 streptavidin 박테리아를 코팅 하 여 세포에서 phagosomes를 포함 하.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

이 절차의 전반적인 목표는 Phagosomes를 포함하는 온전하고 농축된 박테리아를 분리하는 것입니다. 이 방법은 병원성 미생물이 숙주 세포에 침입할 때 식체 성숙 및 항원 처리의 변화와 같은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특수 장비 없이도 간단한 단계를 사용하여 식체를 포함하는 고품질 박테리아를 생산한다는 것입니다.이 방법을 처음 접하는 개인은 방법론이 아닌 것과 비교하여 기술적으로 접근하기 쉽다는 것을 알게 될 것입니다. 우리는 세포 내 병원체가 Phagosomes를 유리하게 납치하는 메커니즘을 연구할 때 이 방법을 개발해야겠다는 아이디어를 처음 갖게 되었습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Saray Gutierrez입니다.Salmonella Typhimurium 배양을 시작하려면 박테리아 루프를 사용하여 단일 박테리아 군집을 5ml의 뇌 심장 주입 육수에 접종합니다. 그런 다음 흔들면서 섭씨 37도의 인큐베이터에서 밤새 서스펜션을 배양합니다. 다음 날 이 박테리아 현탁액 1ml를 원뿔형 플라스크에 담긴 19mL BHI 육수에 옮깁니다.흔들면서 섭씨 37도의 인큐베이터에서 다시 배양합니다. OD600이 1에 도달하면 인큐베이터에서 플라스크를 제거하고 배양물을 50ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5400 x G의 튜브를 15분 동안 원심분리합니다.상등액을 제거한 후 박테리아 펠릿을 10ml 멸균 PBS에 다시 현탁시킵니다. 원심분리를 한 번 반복한 후 펠릿을 4.9밀리리터의 PBS에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 갓 준비한 비오틴 연결 용액 100마이크로리터를 박테리아 현탁액에 추가합니다.이 현탁액을 5개의 1.5ml 튜브로 분할한 후 350rpm에서 2시간 동안 지속적으로 흔들면서 실온의 열 블록에서 배양합니다. 15, 000 x G에 10 분 동안 실내 온도에 관을 원심 분리한 후에, 상등액을 버리십시오. 두 번의 추가 원심분리 단계와 비오틴 연결 용액을 완전히 제거한 후, 이 비오틴 코딩 박테리아를 단일 1.5ml 튜브의 1ml 멸균 PBS에 다시 현탁시킵니다.100마이크로리터의 스트렙타비딘 접합 마그네틱 비드 용액을 새 1.5ml 튜브에 넣고 마그네틱 랙에 5분 동안 놓습니다. 튜브에서 솔벤트를 제거한 후 마그네틱 랙에서 튜브를 제거합니다. 그런 다음 튜브에 남아 있는 비드를 1ml의 Biotin 코딩

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Gutiérrez, S., et. al., 대식세포에서 살모넬라 티피무리움 함유 파고솜의 분리. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 실험 사용에 적합한 깨끗하고 대사 활성 박테리아 현탁액을 얻기 위해 살모넬라 티피무리움 의 배양 및 준비를 보여줍니다.

살모넬라 티피무리움 배양 준비

출처: 시갈, N. 외. 대식세포에서 세포 내 배양된 리스테리아 모노사이토제네스에서 RNA 정제.  J. Vis. 경험 (2016).이 영상은 감염된 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 내화된 병원성 박테리아를 분리하는 과정을 보여줍니다. 박테리아는 숙주 세포에 부착하도록 허용되고, 붙지 않은 박테리아는 씻겨 나갑니다. 내화된 후에는 내화되지 않은 박테리아를 제거하기 위해 항생제를 첨가합니다. 숙주 세포를 용해하여 원심분리한 후, 상원액을 여과하여 박테리아를 필터 페이퍼에 포집하고, 이를 급속 냉동하여 보관하여 추가 사용을 위해 사용합니다.

감염된 숙주 세포로부터 세포내 병원성 박테리아 분리

Source: Gutiérrez, S., et al., Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the magnetic isolation of phagosomes containing biotin–streptavidin bead–coated bacteria from infected macrophages. The protocol includes buffer treatments, cell disruption, magnetic separation, and washing to yield purified phagosomes for analysis.

Isolation of Phagosomes Containing Magnetic Bead-Tagged Bacteria from Infected Macrophages

Source: Fernández-Fernández, R., et. al. Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the use of exogenous LPS (Lipopolysaccharide) as a receptor mimic to inactivate lytic bacteriophages in Salmonella cultures. Through sequential incubation, centrifugation, and washing, phages are eliminated, resulting in a viable, phage-free bacterial suspension for downstream applications.

Inactivation of Bacteriophages Using Exogenous Lipopolysaccharide to Generate Phage-Free Salmonella Cultures

이 비디오는 차등 투과화를 사용하여 골수 유래 대식세포 내부의 세포질 및 액포 Salmonella typhimurium을 정량화하는 분석을 보여줍니다. 대식세포는 형광 단백질을 발현하는 살모넬라균(Salmonella)에 감염되어 있으며, 이 물질은 살모넬라균 함유 액포 또는 SCV라고 하는 특수 액포 구조 내부에 내재되어 있습니다. 박테리아의 하위 집합은 SCV를 탈출하여 세포질로 들어갑니다. 콜레스테롤이 풍부한 대식세포의 원형질막은 디지토닌(digitonin)을 사용하여 투과화되어 SCV는 손상되지 않습니다. 세포질 박테리아를 형광 표지 항체로 라벨링하면 액포 및 세포질 박테리아의 비율이 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 정량화됩니다.

감염된 1차 대식세포에서 세포질 및 진공 살모넬라균을 정량화하기 위한 분석

이 비디오는 유리 바닥 접시 표면에 부착된 IgG-opsonized 적혈구(RBC)의 대식세포 매개 식세포작용 중 식체(phagosome) 형성 및 폐쇄를 실시간으로 시각화하기 위한 고해상도 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경 기술을 보여줍니다. 대식세포는 적혈구 주위로 가성족(pseudopodia)을 확장하고 식체(phagosome) 내부를 삼켜 유리 표면에서 분리합니다.

TIRF 현미경 기반 식체 형성 및 폐쇄 시각화

체외 표현형 살모넬라 또는 다른 세균성 협회, 침윤 및 높은 처리량과 식세포에서 복제에 높은 처리량 분석이 개발되었다. 방법은 호스트 병원체 상호 작용에서의 침범 위해 살모넬라 유전자 녹아웃 돌연변이 균주를 평가하기 위해 사용 하였다.

표현형 높은 처리량 분석 살모넬라 엔테 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

여기서는 쥐 복막 대식세포를 분리하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 이 절차 다음에는 RNA 추출을 수행하여 Toll-like receptor 자극에 대한 유전자 발현 분석을 수행합니다.

쥐 복막 대 식세포의 분리는 수신자 같은 수용체 자극하면 유전자 발현 분석을 수행하기

우리는 차등 디지토닌 투과화를 사용하여 골수 유래 대식세포에서 세포질 및 액포 Salmonella typhimurium의 정량화를 설명합니다.

공포 성 대 세포질의 정량화<em&gt; 살모넬라</em&gt; 차동 투과성으로하여 기본 대 식세포에서

여기, 우리 향상 된 녹색 형광 단백질 표현 대장균을 사용 하 여 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해

지구상에서 어디에나 존재하며 다양한 박테리오파지는 박테리아 숙주 내에서 감염되고 복제되어 미생물 생태계에서 중요한 역할을 합니다. 그들의 중요성에도 불구하고, 그들의 존재는 산업 공정을 혼란에 빠뜨릴 수 있습니다. 우리는 살모넬라 배양에서 박테리오파지를 제거하기 위해 박테리아 지질다당류를 사용하는 방법을 개발했습니다.

감염된 살모넬라균 배양물에서 박테리오파지 제거

학습하세요 대식세포에서 Salmonella typhimurium을 포함한 파고솜을 분리하는 방법을. 비오틴과 스트렙타비딘을 이용한 이 기술은 면역학 연구에 필수적인 도구입니다.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

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