Name: NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 학습하세요 CAEBV 환자에서 소량의 말초혈액과 저용량 IL-2를 사용하여 NK 및 T 세포주를 효율적으로 확립하는 간단한 방법을. 이 기술은 면역세포 증식 메커니즘 연구에 중요합니다.

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이 작품에서 중국의 국립 과학 재단 (전략적 생물 자원 기술 지원 시스템의 중국 과학 아카데미 (CZBZX-1, ZSSB-004) (KFZD-남서-205), 과학의 중국 아카데미 키 프로젝트 및 교부 금에 의해 지원 되었다 81401640) 자연 과학 기금 (14ZR1434800)을 상해 하 고.

이 연구는 연구소의 유전학 그리고 개발 생물학, 과학의 중국 아카데미의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 프로토콜 인간의 복지에 대 한 제도적 지침을 따릅니다.
참고: 워크플로 회로도 대 한 그림 1 을 참조 하십시오.
1입니다. CAEBV 환자에서 PBMC의 격리
<ol><li>그라데이션 (예를 들어, Ficoll-패)에 의해 CAEBV 환자의 전체 혈액의 2 mL에서 기본 PBMC 정화 제조업체의 지침에 따라 원심 분리. 또는, 해빙 RPMI 1640 매체 액체 질소에서 PBMC를 cryopreserved.</li>
	<li>18 µ L 세포 현 탁 액에 2 µ L trypan 블루의 (0.4%)를 추가, 얼룩 셀, 셀 카운터 접시에 정지를 전송 및 세포의 농도 자동된 셀 카운터 생존 능력을 측정 3 분 기다려야 합니다.</li>
	<li>2-3 × 106 셀/mL 20% 인간의 혈 청 (56 ° C에서 비활성화 열), 2 m L-글루타민, m을 포함 하는 완전 한 RPMI 1640 문화 매체와 보충의 조밀도에 세포 현 탁 액을 준비 하 고 항생제 (100 µ g/mL 스, 100 U/mL 페니실린). 씨 24-잘 세포 배양 배지로 잘 당 PBMC 서 스 펜 션의 1 mL.</li>
	<li>잘 당 150 U rhIL-2를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 배양 배지를 배치</li>
	<li>하루에 2, 현미경 (200 배 확대); 세포 형태 관찰 셀은 밝고 라운드 때 좋은 상태에 있습니다.</li>
</ol>2. 확장 셀의 가능한 셀 번호 매기기
<ol><li>(200 배 확대), 현미경으로 세포 형태를 관찰 하 고 매체를 변경 하기 전에 셀 번호 매기기에 의해 세포 성장 상태를 모니터링: 18 µ L 세포 현 탁 액을 trypan 블루 (0.4%)의 2 µ L을 추가 하 고 세포의 농도 계산 (1.2 참조 그림 2).</li>
	<li>24-잘 접시에 매체의 500 µ L를 무시 하 고 500 µ L 신선한 완전 한 문화 매체를 추가 합니다. 잘 당 150U rhIL-2를 추가 합니다.</li>
	<li>중간 단계 2.2에서 일주일에 두 번 변경 합니다.</li>
	<li>세포 성장 곡선 (그림 3)를 그립니다.</li>
	<li>실행 가능한 세포의 농도 5 × 106/mL을 초과 하면 1-2 × 106 셀/mL에 각 잘의 농도에 새로운 우물으로 셀을 나눕니다. 이 프로세스는 2-4 주 걸립니다.</li>
</ol>3. 세포 형질 Cytometry에 의해
<ol><li>세포는 확장 하는 때, 결정 셀 라인의 고기를 1 × 106 세포를 수집 합니다. 실 온에서 5 분 동안 240 x g 에서 세포를 원심 (NK/T 세포는 튜브의 밑에 침전 것 이다).</li>
	<li>상쾌한, 7 mL PBS를 추가 하 여 강수량을 세척. 실 온에서 240 x g 에 5 분 동안 원심 분리기. 한 번 반복 합니다.</li>
	<li>각 튜브를 200 µ L 인간의 혈 청을 추가 하 고 잘 섞어 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>실 온에서 5 분 동안 240 x g에서 셀 원심 상쾌한 삭제 하 고 다시 1 × 106/mL 찬 PBSA (PBS+0.2%BSA)에서 세포를 일시 중지. 2 × 105 셀을 포함 하는 각 관 5 튜브로 셀을 나눕니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 240 x g에서 원심 분리기 세포 상쾌한 삭제 하 고 다시 PBSA 버퍼 또는 PBSA 10 µ L PE (또는 PE-Cy7)를 포함 하는 셀을 일시 중지와 10 µ L FITC 표시 그림 4에 의해 나타나는 것과 같이 얼음 T 나 NK 세포의 세포 수용 체를 얼룩에 항 체. 셀 PBSA 버퍼 중단 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	<li>어둠 속에서 얼음에 20-30 분에 대 한 항 체와 세포를 품 어.</li>
	<li>씻어 감기 PBSA 두 번 셀, 다시 셀 300 µ L 중단 차가운 PBSA.</li>
	<li>와 교류 cytometer 세포 표현 형 분석.<ol>
<li>Flow Cytometer 조건 "워크시트 만들기"에 설정 합니다. 측면 살포 (SSC) 대 앞으로 분산형 (FSC)를 표시 하는 도트 음모와 실험 서식 파일을 설정 합니다.</li>
		<li>FSC 그리고 SSC 전압 최적화 isotype 제어 튜브를 로드 하 고 관심의 세포 인구를 방해 하지 않고 파편을 제거 하기 위해 FSC 임계값 값 최적화. FSC, SSC, FITC, PE PE Cy7를 제외한 모든 매개 변수를 삭제 합니다.</li>
		<li>각 2 색 분석 그룹에 isotype 제어 및 단일 긍정적인 컨트롤을 사용 하 여 보정을 수행 합니다.</li>
		<li>샘플을 로드 HLA-DR VS CD19, CD56 VS CD16, CD4 VS CD8, CD3 VS CD16 점 세포의 다른 인구를 보여주는 플롯 이다. 참고: PBMC 보상 제외/isotype 제어 및 단일 긍정적인 컨트롤을 사용 하 여 수행할 수 사용 되었다. 교류 cytometer와 2 색 면역 형광 표면 마커 표현 분석을 정기적으로 사용 되었다. 다음 항 체가 포함 되어 있습니다: 안티-HLA-DR, 안티-CD4, 안티-CD16 fluorescein isothiocyanate (FITC), 안티-CD8, 안티 CD56 활용, CD3 phycoerythrin (PE)와 활용 및 안티-CD19 PE Cy7와 활용.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 확장 및 Cryopreservation NK/T 세포의
<ol><li>세포 표현 형 분석을 완료 하는 때 매체를 변경 합니다. 신중 하 게는 상쾌한의 절반을 제거 하 고 접시의 바닥에 세포를 만지지 마십시오. 포함 된 셀 판 300 U/mL rhIL-2 신선한 문화 매체의 동일한 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>매체의 절반을 변경 셀까지 (2.2)로 3 일 마다 클러스터 현미경 (그림 2) 명확 하 게 볼 수 있습니다. 일반적으로이 프로세스는 2-3 주 걸립니다.</li>
	<li>같은 혈통의 다른 우물을 혼합 후 24-잘 접시에서 T25 문화 플라스 크 셀을 전송. 문화 매체의 볼륨 두 매체의 볼륨까지 노란색으로 10-15 mL을 확장 합니다. RhIL-150 U/mL의 농도와 2를 추가 합니다.</li>
	<li>성장, 2-3 주 후 냉동 하기 전에 중간 24 h를 변경 하면 셀 질량 육안으로 관찰 될 수 있다. 셀 카운터로 세포 농도 측정 합니다.</li>
	<li>240 x g에 5 분 동안 세포 현 탁 액을 원심 하 고 다시 5-10 배 90% 태아 둔감 한 혈 청 및 10 %dimethylsulfoxide (DMSO)를 포함 하는 냉동 재고 솔루션 106 셀/mL의 조밀도에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. -80 ° C에 분 당 1 ° C의 속도로 십시오 그리고 그 후 액체 질소에 직접 전송.</li>
</ol>

<ol><li>Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus infection.</a> N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).</li>
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<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+natural+killer-cell+clones+with+variable+proliferative+capacity+in+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).</li>
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<li>Tsuchiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+human+natural+killer-cell+line+%28NK-YS%29+established+from+natural+killer+cell+lymphoma%2Fleukemia+associated+with+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).</li>
<li>Tsuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-infected+natural+killer+%28NK%29+cell+proliferation+in+patients+with+severe+mosquito+allergy%3B+establishment+of+an+IL-2-dependent+NK-like+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line.</a> Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+cytological+and+cytogenetic+features+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-positive+natural+killer+%28NK%29+cells+and+cell+lines+derived+from+patients+with+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas%2C+chronic+active+EBV+infection+and+hydroa+vacciniforme-like+eruptions%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions.</a> Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).</li>
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<li>Imadome, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+xenograft+models+reveal+a+critical+role+of+CD4%2B+T+cells+in+the+proliferation+of+EBV-infected+T+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).</li>
<li>Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine+requirement+for+the+generation+of+natural+killer+cells+from+CD34%2B+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).</li>
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</ol>

D.Z., X.Z., 및 X.C.에 NK/T 세포 선 및 연구에서 설립 셀 라인을 설정 하기 위한이 방법의 잠재적인 사용을 포함 하는 특허 출원의 공동 발명가. D.Z., X.Z., 및 X.C.는이 작품에서 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 나머지 작가 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 프로토콜에서 CAEBV 환자의 전체 혈액에서 NK/T 세포 라인을 설립 하는 새로운 기술 개발 되었습니다. 기존의 방법에 비해,이 방법의 주요 장점은 그것의 단순 하 고 작은 양의 혈액의 그것의 필요 조건 그것은 세포 생존 능력의 좋은 조건과 높은 성공률을 전시 하는 동안. 게다가, NK/T 세포 라인 셀 형식 결정으로 사전에 감염 latently EBV 소비 더 많은 혈액과 경작 하기 전에 시간을 확인 하지 않고 PBMC를 경작 하 여 설정할 수 있습니다. 또는 셀 라인 분석 될 수 있다 하 고 세포의 다른 고기 셀 라인 설립 후 cytometry로 순화 될 수 있다. 게다가, 메서드 rhIL 2의 낮은 복용량을 사용 하 고 지류 셀 필요. 이 방법으로 우리 8 CAEBV 환자에서 7 셀 라인을 개발 하 고 한 달 이내에 그들을 cryopreserved. 하나는 셀 라인으로 개발 되지 않았습니다 중요 한 확산 없이 5 개월 이상 살아 유지 될 수 있다 그리고이 뒤에 이유 필요 추가 탐사.
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엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 유비 쿼터 스 이며 감염 B 셀 뿐만 아니라 T 및 자연적인 살인자 (NK) 세포 EBV 관련 된 NK/T lymphoproliferative 질병 (LPD) 및 림프 종/백혈병, EBV 관련 hemophagocytic 등의 수는 lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme와 같은 림프 종, extranodal NK/T-세포 림프 종, 비 강 유형 및 호전적인 NK 세포 백혈병1,2,3. 이러한 가운데는 심각한 만성 활성 EBV (SCAEBV) 질병, 사고, 동남 아시아에서 주로 그리고 있는 지금 LPD EBV 감염 T 나 NK 세포4,,56, 의 클론 확장으로 인 한 것으로 간주 됩니다. 7, 하지만 명백한 면역 결핍 없이 전염 성 mononucleosis (IM)에 존재-처럼 높은 EBV DNA로 서 지속적으로 또는 recurrently, 발열, hepatosplenomegaly, lymphadenopathy, 및 간 기능 장애 등 증상에 로드는 말 초 혈액8,9. CAEBV 가진 환자는 빈약한 예 지10,11및 그것의 병 인 그리고는 EBV의 역할은 분명 하다. 따라서, EBV 관련 된 NK/T lymphoproliferative 질병에서 파생 된 라인 세포 및 림프 종 백혈병의 발생률이 높은와 NK 또는 T 세포 확산 및 그것의 관계를 유도 EBV의 메커니즘을 명확히 셀 모델로 매우 도움이 또는 림프 종입니다.
날짜 하려면, 여러 셀 라인 다른 기법12,13,14,,1516함께 설립 되었습니다. 인간 NK 세포 선, NK-YS, NK 세포 림프 종/백혈병, 피더로 그리고 rhIL-2 mL15당 20U의 농도에서 존재 마우스 stromal 세포 라인 공동 경작에 의해 설립 되었다. KAI3 다른 NK 세포 선 심각한 모기 알레르기를 가진 환자 또는 헌 lymphoblastoid 셀 라인 (LCL), SCAEBV에서 설립 되었다 B 세포 EBV, 피더 세포와 100U/mL16rhIL-2의 추가 변형. SNK6와 SNT8는 rhIL-2 (700U/mL)12의 높은 복용량을 추가 하 여 비 강 NK/T 세포 림프 종 환자 들의 종양 조직에서 파생 되었다. 유사한 기술, SNK-1 셀 CAEBV 환자, PBMC에서 T 세포를 제거 하 고 rhIL-213,17700U/mL을 추가 하 여 양식에서 했다. SNT13와 SNT15는 CD4 + 및 CD8 + 세포18제거 하 여 설립 되었다. 지금까지, EBV-NK/T LPD 환자에서 다른 T 세포와 NK 세포 선이 방법19모두 개발 되었다.
위에서 언급 한 기존 방법의 단점 때문에 병원에서 매우 도전적인는 일리노이-2로 10 mL 전 혈의 활용 또는 NK/T 세포의 정화의 높은 복용량의 요구 피더 세포의 고용 포함 어떤 종류의 세포는 EBV latently 확인의 필요성 문화 시작 하기 전에 감염. CAEBV 아시아 아이 들에서 주로 발생 10 mL 혈액 모든 지역에서 얻기 쉽지 않다. 이 연구에서 우리는 피더 세포 없이 rhIL2의 낮은 복용량과 전체 혈액의 2 mL의 볼륨을 사용 하 여 CAEBV 환자에서 PBMC를 경작 NK / T 세포 라인을 구축 하 고 성공률을 새로운 간단한 방법을 개발. 이 방법의 결과 그것의 높은 효율성과 시간 절약을 입증 했다.

<table><tbody><tr><td>Hu HLA-DR, FITC</td><td>BD</td><td></td>, <td>560944 FACS용 항체</td></tr>, <tr><td>Hu CD4, FITC</td><td>BD</td>, <td>555346</td><td>FACS용 항체</td></tr><tr><td>, Hu/NHP CD8 PE</td>, <td>BD</td><td>557086</td><td>FACS용 항체</td></tr><tr><td>, Hu CD3 PE</td>, <td>BD</td><td>555340</td>, <td>FACS용</td></tr> 항체, <tr><td>Hu CD16, FITC 3G8</td>, <td>BD</td>, <td>555406</td><td>FACS용</td></tr> 항체, <tr><td>Hu/NHP, CD56, PE, MY31</td><td>BD</td><td>556647</td><td>FACS</td></tr><tr><td>hu/CD19 PE-Cy7</td><td>BD</td>용 항체 <td></td><td>560728 FACS</td></tr><tr><td>human IL-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>human serum</td><td>MRC</td><td>CCC118-125</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Techcomp</td><td>CT6T</td><td>원심분리</td></tr><tr><td>현미경</td><td>OLYMPUS CKX53</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>자동 세포 계수기</td><td>Countstar</td><td>IC 1000</td><td>세포 계수용</td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 클러스터</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>폴리스티렌 플레이트</td></tr><tr><td>25cm2 세포 배양 플라스크</td><td>둥지</td><td>707001</td><td>폴리스티렌</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>세포 매체</td></tr><tr><td>구성 요소 RPMI 매체 1640</td><td>수명</td><td>22400089</td><td>세포 배지</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Amresco</td><td>374</td><td>세포 배지 구성 요소</td></tr><tr><td>100 x 스트렙토마이신 페니실린 용액 BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>세포 배지</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td> 림프구 DMSO Sigma D2650의 <td>체외 분리용</td></tr> 세포 <tr><td></td><td></td><td></td><td>동결</td></tr><tr><td>용유세포분석기</td><td>BD</td><td>BD FACSAria II</td><td></td></tr><tr><td>소프트 웨어</td><td>BD</td><td>BD FACSDiva 소프트 웨어</td><td>FACS 분석</td></tr></tbody></table>

nk과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 t 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

다양 한 방법 설명 림프 종 또는 lymphoproliferative 증후군 환자에서 NK/T 세포 라인을 설립 되었습니다. 이러한 방법을 피더 셀, 순화 NK / T 세포, 혈액 10 mL로 또는 일리노이-2 높은 복용량 사용. 이 연구는 재조합 인간 일리노이-2 (rhIL-2)의 추가 함께 주변을 경작 하 여 NK, T 세포 라인 혈액 단 세포 (PBMC)를 설정 하는 강력 하 고 간단한 전략으로 새로운 메서드를 제공 하 고 전체 혈액의 2 mL 만큼 약간 사용 합니다. 셀 2 주에 신속 하 게 증식 수 고 3 개월 이상 유지 됩니다. 이 방법으로 7 NK 또는 T 세포 라인 높은 성공율으로 설립 되었습니다. 이 메서드는 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 더 많은 경우의 CAEBV 또는 NK/T 세포 림프 종에서 셀 라인 구축에 적용.

후에 3 일 셀 라인의 설립 동안 문화, 다형성 세포 나타납니다 (그림 2)를 시작 합니다. 7 일 후 세포 수와 세포의 생존 능력 (그림 3) 높은 속도로 증가 신속 하 게, 성장. 셀의 작은 클러스터 셀 농도 3-6 × 106을 초과할 수 있습니다 때, 성장 하는 10-14 일 후 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이 기간에 문화 접시 2 개 또는 3 개의 우물에 사단에 의해 세포를 확장 한다. 약 한 달 후, 한 번 셀 숫자에 도달 3-5 × 107, 개수는 보존을 위한 충분히 높은.
또 다른 중요 한 문제 셀 성공적으로 경작 되는 때에 고기를 결정 하는. 우리의 결과 셀 좋은 조건에서 3 개월 이상 성장 T (L19...

높은 효율, 적은 양의 주변 혈액 그리고 일리노이-2의 낮은 복용량 CAEBV 환자에서 NK, T 세포 클론을 얻기 위한 간단한 방법을 개발 되었다.

NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

이 절차의 전반적인 목표는 CAEBV 환자로부터 NK 또는 T 세포주를 얻는 것이며, 이는 이 치명적인 질병에 대한 연구에서 큰 의미가 있습니다. 이 방법은 세포 증식에 대한 원시 VBV 연구, NK/T 세포 증식을 방해하는 억제제 스크리닝 등 CAEBV의 메커니즘에 대한 연구를 위한 NK 또는 T 세포주를 얻는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 CAEBV 환자로부터 NK 또는 T 세포주를 확립하기 위해 소량의 말초 혈액과 저용량의 철분 2만 있으면 되는 매우 간단하고 효율적이라는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 배양 2주 중 첫 번째 주에서 세포 생존이 불확실하기 때문에 어려움을 겪을 수 있으며 이 방법은 초기 배양의 세포 증식을 결정하는 방법을 보여줍니다. 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸을 때, 우리는 인간 혈청 아이언 2가 최대 2주 동안 PBMC를 포함할 수 있다는 것을 발견했습니다. 우리는 이 방법의 시연이 세포의 모양과 증식의 원인을 보여주기 때문에 중요하다는 것을 보여주었습니다.그리고 세포의 확장 및 Y-bar 세포 번호 매기기가 절차를 시작하려면 구배 원심분리로 CAEBV 환자의 전혈 2밀리리터에서 1차 PBMC를 정제합니다. 또는 RPMI-1640 배지를 사용하여 액체 질소에서 극저온 보존 PBMC를 해동합니다. 다음으로, 18마이크로리터의 세포 현탁액에 0.4%트리판 블루 2마이크로리터를 첨가하여 세포를 3분 동안 염색한 다음 현탁액을 세포 카운터 플레이트로 옮기고 자동화된 세포 계수기로 세포 농도와 생존율을 측정합니다.20%의 인간 혈청, 2밀리몰 L-글루타민 및 항생제를 함유한 완전한 RPMI-1640 배양 배지를 보충하고 1밀리리터당 10-6번째 세포의 2-3배 밀도로 세포 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 웰당 1ml의 PBMC 현탁액을 24웰 세포 배양 플레이트에 파종합니다. 다음으로, 각 웰에 rhIL-2 밀리리터당 150단위를 추가합니다.배양 플레이트를 섭씨 5도의 37% 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 둘째 날에는 200배 배율로 현미경으로 세포 형태를 관찰합니다. 세포는 밝고 동그랗을 때 좋은 상태를 유지합니다.이 단계에서 18마이크로리터의 세포 현탁액에 0.4%트리판 블루 2마이크로리터를 첨가하고 세포의 농도를 계산합니다. 다음으로, 세포 형태를 관찰하고 배지를 변경하기 전에 세포에 번호를 매겨 세포 성장 상태를 모니터링합니다. 세포 형태와 상태를 모니터링하는 것이 중요합니다.세포의 생존 여부는 배양 초기 단계의 다형성 세포와 세포의 상태에 의해 판단할 수 있습니다. 그 후, 24-웰 플레이트의 각 웰에서 500마이크로리터의 배지를 제거하고 500마이크로리터의 새로운 완전 배양 배지를 추가합니다. 그런 다음 각 웰에 rhIL-2 밀리리터당 150단위를 추가합니다.일주일에 두 번 매체를 교체하십시오. 세포 성장 곡선을 플로팅합니다. 생존 가능한 세포 농도가 밀리리터당 10-6번째 세포의 5배를 초과하면 각 웰에서 10-6번째 세포의 농도로 세포를 새로운 웰로 나눕니다.이 과정은 2주에서 4주 정도 걸립니다. 세포가 확장되면 10-6번째 세포를 1배로 수집하여 세포주의 표현형을 결정합니다. 실온에서 5분 동안 240배 g으로 원심분리하여 NKNT 세포를 침전시킵니다.그 후, 상등액을 버리고 PBS 7 밀리리터를 첨가하여 침전물을 씻으십시오. 실온에서 240시간 g으로 5분 동안 원심분리합니다. 절차를 한 번 더 반복한 다음 각 튜브에 200마이크로리터의 인간 혈청을 넣고 잘 섞어 실온에서 10분 동안 배양하고 실온에서 5분 동안 240배 g으로 세포를 원심분리합니다.상등액을 버리고 차가운 PBSA로 밀리리터당 10-6번째 세포를 한 번에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 각각 10-5 개의 세포를 2 배로 포함하는 5 개의 튜브로 나눕니다. 그 후, 섭씨 4도에서 5분 동안 240배 g으로 세포를 원심분리한 후 상층액을 버리고 10마이크로리터의 PE와 10마이크로리터의 FITC 표지 항체를 함유한 PBSA 완충액 또는 PBSA로 세포를 다시 현탁시켜 얼음 위의 T 또는 NK 세포의 세포 수용체를 염색합니다.PBSA 버퍼로 현탁된 셀은 음성 대조군으로 사용됩니다. 다음으로, 어두운 곳에서 얼음 위에서 20-30분 동안 항체로 세포를 배양합니다. 저온 PBSA로 세포를 두 번 세척하고 유세포 분석기로 분석하기 전에 300마이크로리터의 저온 PBSA로 세포를 다시 현탁시킵니다.세포 표현형 분석이 완료되면 상층액의 절반을 조심스럽게 제거하고 플레이트 하단의 세포를 만지지 마십시오. rhIL-2를 함유한 동일한 부피의 신선한 배양 배지를 밀리리터당 300 단위로 플레이트에 첨가한 다음 현미경으로 세포 클러스터가 명확하게 보일 때까지 배지의 절반을 3일마다 교체합니다. 그 후, 동일한 계통의 다른 웰을 혼합한 후 24웰 플레이트의 세포를 T-25 배양 플라스크로 옮깁니다.배지의 부피가 10-15 밀리리터로 팽창 할 때까지 노란색으로 변할 때 배양 배지의 부피를 두 배로 늘립니다. 그런 다음 밀리리터당 150단위 농도의 rhIL-2를 첨가합니다. 2-3주 성장 후 동결 24시간 전에 배지를 변경하면 육안으로 세포 덩어리를 관찰할 수 있습니다.세포 계수기로 세포 농도를 측정합니다. 그런 다음, 세포 현탁액을 240배 g으로 5분 동안 원심분리하고 90%의 소 태아 혈청과 10%의 DMSO를 함유한 냉동 원액을 사용하여 5-10배 10-6번째 세포의 밀도로 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 분당 섭씨 1도에서 섭씨 영하 80도의 속도로 동결한 다음 액체 질소로 직접 이동합니다.세포주를 확립하는 동안 3일 동안 배양한 후 다형성 세포가 나타나기 시작합니다. 7일이 지나면 세포의 수와 생존율이 모두 높은 비율로 증가함에 따라 세포가 빠르게 성장합니다. 작은 세포 클러스터는 10-14일 후에 세포 농도가 10-6배의 3배를 초과할 때 명확하게 볼 수 있습니다.이 기간 동안 세포는 배양 플레이트의 2개 또는 3개의 웰로 분할하여 확장되어야 합니다. 약 한 달 후, 세포 수가 10에서 7분의 1에 3에서 5가 되면, 그 수는 보존할 수 있을 만큼 충분히 높은 수치가 된다. 또 다른 중요한 문제는 세포를 성공적으로 배양한 후 표현형을 결정하는 것입니다.본 연구의 결과는 T 세포와 NK 세포를 상기한 방법으로 배양할 수 있으며, 세포가 양호한 상태로 3개월 이상 성장함에 따라 이 기술로 세포주를 확립할 수 있음을 나타냅니다. 이 방법, 이 기술은 훨씬 더 많이 수행할 수 있습니다. 제대로 수행하는 것은 쉽습니다.이 절차를 시도하는 동안 PBMC의 가변성을 유지해야 한다는 점을 기억해야 합니다. 이 절차의 경우, MTT-assay kit 8과 같은 두 방법 중 하나를 수행하여 양자 면역 요법에 사용될 수 있는 NK 또는 T 세포주의 독성과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 각 개발 후, 이 기술은 CAEBV 분야의 연구자들이 세포 모델 시스템에서 수술 질환과 관련된 EBV 관련 NK/T의 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.이 동영상을 시청한 후에는 이 프로토콜에 따라 NK 및 T 세포주를 확장하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 병원체와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 경우 항상 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

의 생성에 대한 신속, 간단하고 비용 효율적인 프로토콜 기증자 파생 CMV, EBV 감염 또는 교수실을 개발하는 위험 allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 수신자에게 주입을위한 multivirus 특정 CTLs (rCTL을). 이 제조 과정은 GMP 준수하고 전문 센터 이외 T - 세포 immunotherapy의 광범위한 구현을 보장한다.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

우리는 엡스타인 - 바 바이러스를 사용하여 변형 B 세포 라인을 생성하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 감염 후 삼일 빠르면 변환을 받다 운명 B 세포를 식별할 수있는 소설 분석을 설명합니다.

엡스타인 - 바 바이러스 성장 변화 Lymphoblastoid 전지 라인 구축

여기가 첫 번째 좋은 생산 관행 (GMP)을 준수하는 탯줄 혈액, 주로 나이브 T 세포의 소스에서 바이러스 특정 세포 독성 T 림프구 (CTL)를 생산 방법을 설명합니다.

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Kaposi 육 종 (KS) 종양 바이러스 인간 herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV) 감염에 의해 유도 된 종양 이다. 여기에 설명 된 내 피 세포 문화 모델은 공부는 KSHV 호스트 셀 변환 메커니즘 적합 합니다.

공부 하는 Kaposi 육 종 Herpesvirus에 의해 세포 변환에 대 한 생체 외에서 모델

B-LCLS을 설정하기위한 간단한 적혈구 용해 방법은 소량의 혈액을 필요로하고 동결 보존 개시로부터 시간을 절약 불멸화 높은 효율로 발전되었다.

B 임파 세포 라인의 설립에 대한 간단한 적혈구 용해 방법

여기서 엡스타인 바 바이러스에서 내인적으로 발현된 RYR1 돌연변이의 기능적 효과를 연구하는 데 사용되는 방법은 인간 B-림프구및 근육 생검 유래 위성 세포가 심투로 분화되어 설명된다.

내인성 표현 인간의 RYR1 변종의 기능적 특성화

여기에서는 말초혈액자연살해(PBNK), 간 조직으로부터 NK세포, 말초혈액단핵세포(PBMC) 또는 제대혈(CB)에서 유래한 키메라 항원 수용체(CAR)-NK세포를 확장시키는 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 확장된 NK 세포의 최적화된 순도 외에도 221-mIL-21 영양세포를 사용하는 NK 및 CAR-NK 세포의 확장을 보여줍니다.

멤브레인 결합-IL-21-변형 B 세포주를 이용한 자연살해(NK) 및 CAR-NK 세포 확장 방법

면역자기 비드와 형광 활성화 세포 분류를 결합하여 말초 혈액 단핵 세포(단핵구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포)의 정의된 면역 세포 하위 집단을 분리하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여 자기 및 형광 표지 된 세포를 정제하고 분석 할 수 있습니다.

감염성 단핵구증이 있는 어린이의 말초 혈액 샘플에서 면역 세포 하위 집단 분리

이 프로토콜은 phorbol 12-myristate 13-아세테이트로 바이러스 용해 주기를 유도할 때 인간 P3HR1 세포주에서 Epstein-Barr 바이러스 입자의 분리를 허용합니다. 이어서 바이러스 제제에서 DNA를 추출하고 실시간 PCR을 수행하여 바이러스 입자 농도를 정량화합니다.

P3HR1 세포주에서 엡스타인-바 바이러스의 분리 및 정량화

학습하세요 CAEBV 환자에서 소량의 말초혈액과 저용량 IL-2를 사용하여 NK 및 T 세포주를 효율적으로 확립하는 간단한 방법을. 이 기술은 면역세포 증식 메커니즘 연구에 중요합니다.

NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

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