NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

이 절차의 전반적인 목표는 CAEBV 환자로부터 NK 또는 T 세포주를 얻는 것이며, 이는 이 치명적인 질병에 대한 연구에서 큰 의미가 있습니다. 이 방법은 세포 증식에 대한 원시 VBV 연구, NK/T 세포 증식을 방해하는 억제제 스크리닝 등 CAEBV의 메커니즘에 대한 연구를 위한 NK 또는 T 세포주를 얻는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 CAEBV 환자로부터 NK 또는 T 세포주를 확립하기 위해 소량의 말초 혈액과 저용량의 철분 2만 있으면 되는 매우 간단하고 효율적이라는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 배양 2주 중 첫 번째 주에서 세포 생존이 불확실하기 때문에 어려움을 겪을 수 있으며 이 방법은 초기 배양의 세포 증식을 결정하는 방법을 보여줍니다. 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸을 때, 우리는 인간 혈청 아이언 2가 최대 2주 동안 PBMC를 포함할 수 있다는 것을 발견했습니다. 우리는 이 방법의 시연이 세포의 모양과 증식의 원인을 보여주기 때문에 중요하다는 것을 보여주었습니다.

그리고 세포의 확장 및 Y-bar 세포 번호 매기기가 절차를 시작하려면 구배 원심분리로 CAEBV 환자의 전혈 2밀리리터에서 1차 PBMC를 정제합니다. 또는 RPMI-1640 배지를 사용하여 액체 질소에서 극저온 보존 PBMC를 해동합니다. 다음으로, 18마이크로리터의 세포 현탁액에 0.4%트리판 블루 2마이크로리터를 첨가하여 세포를 3분 동안 염색한 다음 현탁액을 세포 카운터 플레이트로 옮기고 자동화된 세포 계수기로 세포 농도와 생존율을 측정합니다.

20%의 인간 혈청, 2밀리몰 L-글루타민 및 항생제를 함유한 완전한 RPMI-1640 배양 배지를 보충하고 1밀리리터당 10-6번째 세포의 2-3배 밀도로 세포 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 웰당 1ml의 PBMC 현탁액을 24웰 세포 배양 플레이트에 파종합니다. 다음으로, 각 웰에 rhIL-2 밀리리터당 150단위를 추가합니다.

배양 플레이트를 섭씨 5도의 37% 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 둘째 날에는 200배 배율로 현미경으로 세포 형태를 관찰합니다. 세포는 밝고 동그랗을 때 좋은 상태를 유지합니다.

이 단계에서 18마이크로리터의 세포 현탁액에 0.4%트리판 블루 2마이크로리터를 첨가하고 세포의 농도를 계산합니다. 다음으로, 세포 형태를 관찰하고 배지를 변경하기 전에 세포에 번호를 매겨 세포 성장 상태를 모니터링합니다. 세포 형태와 상태를 모니터링하는 것이 중요합니다.

세포의 생존 여부는 배양 초기 단계의 다형성 세포와 세포의 상태에 의해 판단할 수 있습니다. 그 후, 24-웰 플레이트의 각 웰에서 500마이크로리터의 배지를 제거하고 500마이크로리터의 새로운 완전 배양 배지를 추가합니다. 그런 다음 각 웰에 rhIL-2 밀리리터당 150단위를 추가합니다.

일주일에 두 번 매체를 교체하십시오. 세포 성장 곡선을 플로팅합니다. 생존 가능한 세포 농도가 밀리리터당 10-6번째 세포의 5배를 초과하면 각 웰에서 10-6번째 세포의 농도로 세포를 새로운 웰로 나눕니다.

이 과정은 2주에서 4주 정도 걸립니다. 세포가 확장되면 10-6번째 세포를 1배로 수집하여 세포주의 표현형을 결정합니다. 실온에서 5분 동안 240배 g으로 원심분리하여 NKNT 세포를 침전시킵니다.

그 후, 상등액을 버리고 PBS 7 밀리리터를 첨가하여 침전물을 씻으십시오. 실온에서 240시간 g으로 5분 동안 원심분리합니다. 절차를 한 번 더 반복한 다음 각 튜브에 200마이크로리터의 인간 혈청을 넣고 잘 섞어 실온에서 10분 동안 배양하고 실온에서 5분 동안 240배 g으로 세포를 원심분리합니다.

상등액을 버리고 차가운 PBSA로 밀리리터당 10-6번째 세포를 한 번에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 각각 10-5 개의 세포를 2 배로 포함하는 5 개의 튜브로 나눕니다. 그 후, 섭씨 4도에서 5분 동안 240배 g으로 세포를 원심분리한 후 상층액을 버리고 10마이크로리터의 PE와 10마이크로리터의 FITC 표지 항체를 함유한 PBSA 완충액 또는 PBSA로 세포를 다시 현탁시켜 얼음 위의 T 또는 NK 세포의 세포 수용체를 염색합니다.

PBSA 버퍼로 현탁된 셀은 음성 대조군으로 사용됩니다. 다음으로, 어두운 곳에서 얼음 위에서 20-30분 동안 항체로 세포를 배양합니다. 저온 PBSA로 세포를 두 번 세척하고 유세포 분석기로 분석하기 전에 300마이크로리터의 저온 PBSA로 세포를 다시 현탁시킵니다.

세포 표현형 분석이 완료되면 상층액의 절반을 조심스럽게 제거하고 플레이트 하단의 세포를 만지지 마십시오. rhIL-2를 함유한 동일한 부피의 신선한 배양 배지를 밀리리터당 300 단위로 플레이트에 첨가한 다음 현미경으로 세포 클러스터가 명확하게 보일 때까지 배지의 절반을 3일마다 교체합니다. 그 후, 동일한 계통의 다른 웰을 혼합한 후 24웰 플레이트의 세포를 T-25 배양 플라스크로 옮깁니다.

배지의 부피가 10-15 밀리리터로 팽창 할 때까지 노란색으로 변할 때 배양 배지의 부피를 두 배로 늘립니다. 그런 다음 밀리리터당 150단위 농도의 rhIL-2를 첨가합니다. 2-3주 성장 후 동결 24시간 전에 배지를 변경하면 육안으로 세포 덩어리를 관찰할 수 있습니다.

세포 계수기로 세포 농도를 측정합니다. 그런 다음, 세포 현탁액을 240배 g으로 5분 동안 원심분리하고 90%의 소 태아 혈청과 10%의 DMSO를 함유한 냉동 원액을 사용하여 5-10배 10-6번째 세포의 밀도로 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 분당 섭씨 1도에서 섭씨 영하 80도의 속도로 동결한 다음 액체 질소로 직접 이동합니다.

세포주를 확립하는 동안 3일 동안 배양한 후 다형성 세포가 나타나기 시작합니다. 7일이 지나면 세포의 수와 생존율이 모두 높은 비율로 증가함에 따라 세포가 빠르게 성장합니다. 작은 세포 클러스터는 10-14일 후에 세포 농도가 10-6배의 3배를 초과할 때 명확하게 볼 수 있습니다.

이 기간 동안 세포는 배양 플레이트의 2개 또는 3개의 웰로 분할하여 확장되어야 합니다. 약 한 달 후, 세포 수가 10에서 7분의 1에 3에서 5가 되면, 그 수는 보존할 수 있을 만큼 충분히 높은 수치가 된다. 또 다른 중요한 문제는 세포를 성공적으로 배양한 후 표현형을 결정하는 것입니다.

본 연구의 결과는 T 세포와 NK 세포를 상기한 방법으로 배양할 수 있으며, 세포가 양호한 상태로 3개월 이상 성장함에 따라 이 기술로 세포주를 확립할 수 있음을 나타냅니다. 이 방법, 이 기술은 훨씬 더 많이 수행할 수 있습니다. 제대로 수행하는 것은 쉽습니다.

이 절차를 시도하는 동안 PBMC의 가변성을 유지해야 한다는 점을 기억해야 합니다. 이 절차의 경우, MTT-assay kit 8과 같은 두 방법 중 하나를 수행하여 양자 면역 요법에 사용될 수 있는 NK 또는 T 세포주의 독성과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 각 개발 후, 이 기술은 CAEBV 분야의 연구자들이 세포 모델 시스템에서 수술 질환과 관련된 EBV 관련 NK/T의 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다.

이 동영상을 시청한 후에는 이 프로토콜에 따라 NK 및 T 세포주를 확장하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 병원체와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 경우 항상 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.