Name: 내가 조직 공학에 대 한 마우스 Cochleae Decellularizing에 대 한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 배우세요 마우스 달팽이관의 탈세포화 및 탈석회화 방법을 통해 조직 공학용 스캐폴드를 제조하는 기술입니다. 이 방법은 세포와 세포외기질의 상호작용을 연구하여 감각 상피 형성 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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현재 프로젝트 개념 펀드의 캔자스의 대학 증거에 의해 투자 되었다. 우리는 cochleae 문화 지원에 대 한 인간의 탯, 그리고 데이비드 조 젠 슨은 취득에 우리 위한 KUMC (캔사스 시, KS)에서 간호 직원을 감사 하 고 싶습니다.

동물 안락사를 포함 하 여 모든 절차는 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 프로토콜 (ACUP #2014-2234) 캔자스의 대학 의료 센터 (KUMC)에 따라 실시 했다.
참고: HWJCs 동의 제공 하는 환자에 의해 기증 된 인간 탯 으로부터 격리 되었고 표본 캔자스의 대학 인간 주제 위원회 (구 IRB #15402)에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 사용 했다.
1. 측 뼈 수확과 달팽이 관 절연
<ol>
	<li>수술가 위, 날카로운 쌍 두개골과 첫 번째 자 궁 경부 척추 사이 절단 하 여 적절 하 게 안락사, 15 주 된 마우스를 목을 벨 다음 스프레이로 소독 (그림 1A) 70% 에탄올과 머리.</li>
	<li>(그림 1B-C, 파선) 수술가 위 같은 날카로운 쌍을 사용 하 여 중간에 화살 평면에서 두개골 이등분</li>
	<li>(그림 1D, 화살촉) 집게의 쌍을 사용 하 여 두개골에서 뇌 조직을 제거 합니다.</li>
	<li>청각의 존재 및 두개골 및 외관 (1 층 그림, 화살표)에서 외가도의 내부에 vestibular 신경 뿌리 (그림 1E-F, 화살촉) 통해 측 뼈를 식별 합니다. 측 뼈 두개골 (그림 1G)의 나머지에서 분리 두개골을 통해 조심 스럽게 잘라. 참고: 어떤 경우에, 그것 가능 할지도 모른다 섬세 하 게 절단 하지 않고도 측 뼈에서 두개골의 주변 뼈를.</li>
	<li>그래서 팁 달팽이 puncturing 위험 하지 않습니다 약 5 m m (그림 1 H), 외가도의 개통으로 미세 집게를 삽입 합니다. 부드럽게 깨 물집 (그림 1 H, 상단 빨간색 음영 처리 된 영역)의 뼈 그래서 그것 골절 (1I 그림, 빨간 점선 라인). 참고: 필요한 경우, 해 부 현미경 수 있습니다 원조이 과정에서 정확 하 게 배치 하 고 악기의 조작.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 여, 놀 리 려 멀리 측 뼈, 뼈 미로 달팽이 관 (그림 1J, 빨간 괄호)의 노출에서 물집의 나머지.</li>
	<li>페 트리 접시 측 뼈를 충분히 큰 장소 (예를 들어, 30 m m 이상)는 해 부 아래 시야 범위와 함께 충분 한 인산 염 버퍼링 염 분 (PBS) 측 뼈 (예를 들어, 0.5 ~ 1 mL)를 작성.</li>
	<li>향하도록 하는 달팽이 관의 타원형과 둥근 창문이 PBS에 제거 물집과 측 뼈를 잠수함. 참고: 달팽이 관에서 vestibular 시스템의 제거 필요는 없습니다,로 vestibular 시스템 역할 잘 조작 하 고 방향을 (1I 그림 및 그림 2B) 달팽이 관의 기능에 대 한 핸들.</li>
	<li>집게의 초 미세 쌍을 사용 하는 등골을 통과 stapedial 동맥을 제거 합니다.</li>
	<li>어디 동맥을 통과 하는 등골의 아치를 통해 초 미세 집게의 한 끝을 삽입 하 고 섬세 하 게 위쪽으로 등골을 리프트. Disarticulated 등골 타원형 창에서 리프트 해야 합니다.</li>
	<li>초 미세 집게의 한 팁을 사용 하 여 타원형 펑크 및 windows를 둥근.</li>
	<li>튜빙 28.5 게이지 주사기 가득 1 x PBS를 사용 하 여 (내부 직경 0.28 m m, 외경 0.61 m m) 타원형 창 튜브를 놓고, (그림 2A -B). 참고: 튜브의 오프닝 조작할 수 있습니다 정확 하 게 배치 되도록 돕는 초 미세 집게를 사용 하 여.<ol>
		<li>신선한 주사기와 튜브를 사용 하 여 각 달팽이 관에 대 한.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10% 항생제 antimycotic (방지) 및 10% 페니실린-스 (펜-strep) PBS에 5 분 이상 달팽이 관을 통해 제거 하는 perilymph의 2 개 mL perfuse 너무 빨리 너무 많은 압력으로 perfusing는 달팽이 관 내의 미세 구조 손상 것입니다. 참고: 수동으로 perfuse 달팽이 관을 통해 액체를 손으로 주사기 운전은 효과적 이다, 관류 펌프 대신으로 사용 될 수 있지만.<ol>
		<li>수동으로 perfusing, 자동 폐쇄 달팽이 관 (그림 2A) 안정 집게 관류 동안 측 뼈의 vestibular 부분을 파악,의 쌍을 사용 합니다. 참고: 필요 하지 않지만 이것은 두 손을 자유롭게 처리 계기; 다른 튜브를 배치할 수 있습니다 하는 동안 한 손으로 주사기 (그림 2A)를 구동할 수 있다 적절 하 게 (그림 2B).</li>
		<li>이 단계에서 앞으로, 공기에 불필요 하 게 달팽이 관을 노출 하지 않도록 주의. 유체 순환 차단 유체 공간으로 기포를 도입 하 고 달팽이 관 내의 미세 구조 손상 더 밖으로 건조.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>제거 하 고 미세 집게를 사용 하 여 하 모든 나머지 근육 조직과 뼈 파편을 삭제.</li>
	<li>필요한 경우, 최대 7 일간 항생제 솔루션 모든 48 h의 일정 변경에 대 한 10% 방지와 PBS에서 10% 펜 strep 솔루션에 4 ° C에서 고립 된 cochleae를 저장 합니다.</li>
</ol>
2. 인공 처리
<ol>
	<li>Decellularization
	<ol>
		<li>각 달팽이 관에 대 한 채우기 20 mL 유리 섬광 유리병으로 1% 나트륨 라우릴 황산 드 이온된 (DI) 수, 달팽이 관을 decellularize 하는 데 사용 되는에 (SDS) 솔루션.</li>
		<li>개통은 달팽이 관 통과를 위해 충분히 큰 되도록 면도날을 사용 하 여 플라스틱 7 mL 전송 피 펫의 끝을 잘라.</li>
		<li>전송 피 펫을 사용 하 여, 부드럽게 그릴 달팽이 관 피펫으로에 그래서 그것은 단지 몇 밀리미터에 의해 잘라 가장자리를 전달.</li>
		<li>1 %SDS 솔루션 가득 섬광 유리병에 달팽이 관을 추방.</li>
		<li>전송 피 펫을 사용 하 여 섬광 유리병에 달팽이 관을 통해 드 이온된 (DI) 수에서 1 %SDS 2 개 mL를 순환.</li>
		<li>회전으로 섬광 유리병을 놓고 실내 온도에서 72 h에 대 한 10 rpm 회전 섬광 유리병을 허용 합니다.<ol>
			<li>1 %SDS 솔루션 마다 24 h 72 h 동안 변경 합니다. 결코 공기에 달팽이 관을 노출 하는 SDS를 변경할 때 주의 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>디 물으로 30 분 각각에 대 한 세 번 달팽이 관을 세척.</li></ol></li></ol>SDS 요금; 사용 같은 섬광 유리병에는 세척을 수행 이 단계에서 달팽이 관은 decellularized입니다.
	
	
	<li>Decalcification
	<ol>
		<li>충분히 빠져들 달팽이 관을 계속 떠나 섬광 유리병에서 나머지 디 물을 제거 합니다.</li>
		<li>Decalcification를 하려면, 달팽이 관을 포함 하는 섬광 유리병에 디 물에 10 %ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (0.02 M)의 5 mL을 추가 합니다.</li>
		<li>전송 피 펫을 사용 하 여 섬광 유리병에 달팽이 관을 통해 디 물에 10 %EDTA 2 개 mL를 순환.</li>
		<li>회전에 다시 섬광 유리병을 놓고 실 온에서 72 h에 대 한 10 rpm 회전 섬광 유리병을 허용 합니다. 10 %EDTA 솔루션 마다 24 h 72 h 동안 변경 합니다. 달팽이 관은 공기에 노출 되지 않습니다 있도록 솔루션을 변경할 때 주의 합니다.</li>
		<li>2 h 각 1 x PBS;에 대 한 3 번 달팽이 린스 이 단계에서 달팽이 관은 석.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>스토리지
	<ol>
		<li>10% 방지, 10% 펜 strep 솔루션에 PBS에서 4 ° c.에 최대 72 h에 대 한 cochleae를 저장 참고: 긴 저장 기간 항생제 솔루션;의 일정 변경 가능 있을 수 있습니다. 그러나, 처리 된 cochleae의 확장된 저장이이 프로토콜에서 검증 되지 않았습니다.</li>
	</ol>
	</li>

3. 조달 및 hWJCs의 확장
<ol>
	<li>이전에 게시 프로토콜22에 따라 hWJCs를 격리 합니다. 간단히, 3 cm 섹션으로 탯 세그먼트.</li>
	<li>조심 스럽게 만들 메스로 절 개를 얕은 세로 각 탯 선분을 풀 튼의 젤리 탯의 노출에. 집게를 사용 하 여 혈관을 제거.</li>
	<li>조직 잠수함 탯 세그먼트 (예를 들어, 60 mm 페 트리 접시에에서 40 mL) 충분 한 PBS로 두 번 씻는 다. 가늘게 조직 세그먼트 메스를 말하다. 다이제스트 100 mm 페 트리 접시 소화 매체의 50 mL와 조직 (0.2 %2 형 콜라, 1% 페니실린-스, 낮은 혈당에서 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)).</li>
	<li>소화는 5% CO2, 37 ° C 배양 기에서 1 박 50 rpm에서 궤도 통에 중간에 티슈를 놓습니다. 다음 날, 소화 매체 2% 항생제-PBS에서 antimycotic에 1시 16분의 비율로 희석 하 고 실 온에서 500 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 (~ 27 ° C) 10 분 삭제 상쾌한에 대 한.</li>
	<li>Resuspend 펠 릿 중간 엽 줄기 세포 성장 매체 (MSCGM)에서 하 고 세포를 재결합. 조직 문화에 7 x 103 셀/c m2 의 조밀도에 접시 셀 T-75 플라스 크 취급. MSCGM에서 HWJCs 문화 한 통로 5 실험을 확장 합니다. 참고: HWJCs 수 수 하위 양식 큰 T-플라스 크로 (예를 들어, T-150, T-300) 실험에 대 한 hWJCs의 수확량 증가를 뿌리고 때.</li>
</ol>
4입니다. Decellularized Cochleae에 hWJCs의 주입
<ol>
	<li>Decellularized cochleae을 준비
	<ol>
		<li>무 균 기술을 사용 하 여, 3 시간 30 분 대 한 1 x PBS에 저장된 cochleae 세척.</li>
		<li>Cochleae 24-잘 접시의 별도 우물으로 전송 하 고 37 ° C의 1 mL를 추가 MSCGM를 미리 예 열.</li>
		<li>Cochleae는 5% CO2, 세포의 주입 하기 전에 1 h의 최소 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서에서 품 어.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>해리 hWJCs 및 resuspend
	<ol>
		<li>37 ° c 워시 hWJCs 전 두 번 1 x PBS를 따뜻하게합니다.</li>
		<li>37 ° c 충분 한 사전 예 열 셀 선박 표면에 0.5 %EDTA 트립 신.</li>
		<li>HWJCs는 5% CO2, 37 ° C 세포 문화 인큐베이터에서에서 최대 5 분을 품 어.<ol>
			<li>세포의 90%는 거꾸로 현미경 세포를 확인 하 여 세포 문화 표면에서 분리 된 확인 합니다. 참고: 때 문화 배 도청 부드럽게 이동 하는 셀 분리 했습니다. 셀 고정, 남아 있는 분리 하지 있다.</li>
			<li>부드럽게 연결 된 셀을 더 꺼내 려 플라스 크의 측면을 누릅니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>무 균 기술을 사용 하 여, 해당 볼륨 MSCGM의 Trypsin의 볼륨을 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 문화 선박에서 전송 hWJCs는 세포 분열을 사용.</li>
		<li>실 온에서 500 x g에서 centrifuging 여는 hWJCs 작은 (~ 27 ° C) 5 분.</li>
		<li>상쾌한, 발음 하 고 500, 000 셀/mL의 농도에서 MSCGM에 hWJCs를 resuspend.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cochleae perfuse
	<ol>
		<li>Cochleae 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 24-잘 접시에 전송 합니다.</li>
		<li>어떤 달팽이 관 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 각 달팽이 관에 MSCGM의 한 방울을 추가 합니다.</li>
		<li>섬세 하 게 타원형과 둥근 창문을 향하도록 하 초 미세 집게를 사용 하 여 달팽이 관을 방향을 정하십시오. 참고: 주의 극단적인 달팽이 관 손상 쉽게 각 달팽이 관을 직접 처리 하는 경우.</li>
		<li>살 균 28.5 게이지 인슐린 주사기를 사용 하 여 연결 된 튜빙, 0.2 mL resuspended hWJCs (100000 셀)를 그립니다.</li>
		<li>멸 균된 미세 집게를 사용 하 여 케이블의 튜빙을 타원형 창에 놓으십시오.</li>
		<li>섬세 하 게 그리고 천천히 perfuse 폴 리 에틸렌 튜브에 연결 28.5 게이지 인슐린 주사기를 사용 하 여 resuspended hWJCs의 0.2 mL와 달팽이 관 (외경: 0.61 m m, 내경: 0.28 m m) 약 5 분 이상.</li>
		<li>관류, 후 37 ° C의 0.8 mL를 추가할 필요는 잘 포함 하는 잘에서 1 mL 전체 볼륨을가지고 달팽이 관에 MSCGM를 미리 따뜻하게.</li>
		<li>각 달팽이 관, 신선한 주사기를 사용 하 고 각 시간을 튜브에 대 한 4.3.3-4.3.7 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>5% CO2, 37 ° C 세포 문화 인큐베이터, 끼얹는다 cochleae를 놓고 미디어 주 당 3 시간을 변경 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 달팽이 수확 및 보존
참고: Cochleae 그리고 경작 수 있습니다 최대 30 일 후 관류 시간 언제 든 지 수확.
<ol>
	<li>Cochleae를 유지 하려면 1 x PBS 락 플랫폼에 4 ° C에서 하룻밤에 4 %paraformaldehyde 수정 했다.</li>
	<li>고정, 후 5 분에 대 한 세 번 1 x PBS 가진 cochleae 세척.</li>
	<li>점차적으로 에탄올과 달팽이 관을 탈수 하 고 파라핀에 포함 하기 전에 지방 족 탄화수소 용 매로 취소 합니다.</li>
	<li>에 톰 및 마운트를 사용 하 여 10 µ m의 두께로 섹션 샘플 현미경 슬라이드 유리. 참고: 샘플 준비가 이제 조직학 immunohistochemical 처리 표준 프로토콜을 사용 하 여 또는.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

우리는 성공적으로 복잡 한 3 차원 조직 발판으로 달팽이 관의 사용을 허용 하는 decellularization 과정을 통해 달팽이 관에서 네이티브 인공 세포를 제거할 수 있습니다 시연 했다. 산 티 외. 15 decellularizing cochleae에 대 한 초기 방법을 개발 하 고 정확 하 게 빛 시트 현미경23의 도움으로 많은 인공 구조를 통해 볼륨 견적 했다. 이러한 초기 작업 조직 엔지니어링과 세포 문화 기술을 여기에 대 한 강력한 기반으로 재직 했습니다. Decellularized 달팽이 관 수 성공적으로 융합 세포, 그리고 그 시간의 연장된 기간에 대 한 교양. 다양 한 동물에서에서 cochleae 수 이론적으로 세포 유형의 다양 한 유사 하 게와 함께 활용할 수 있습니다. 이러한 조합을 허용 여기에 제시 된 수많은 가능한 실험적인 디자인, 감각 상피 개발14검사, 약물...

달팽이 관은 측 뼈에서 발견 하는 복잡 한 나선형 구조. 그것은 외부 뼈 미로 동심, 내부 membranous 미로1로 구성. Membranous 미로 3 유체 공간 구성: 스칼라 vestibuli, 스칼라 언론과 Scala tympani1. 스칼라 미디어 하우스 수많은 종류의 세포로 구성 되어, 감각 상피, 하지만 감각 머리 세포 (HC), 신경 충 동2음파 기계적 에너지 transduce는 특정 관심의. 음향 외상3,,45, 약6, 질병7,8, 및 노화9 노출 모두 HC 죽음 통해 장애인된 청각 기능 발생할 수 있습니다. 포유류에서 머리 세포 손실 부상10후 재생성 수 조류 HCs 달리 영구적 이다.
다양 한 현대 연구 노력 하고자 했다 손실된 HCs 복원 특정 실험적인 접근 다르지만. 감각 상피에 유전자 발현의 조작 및 몸 밖에 서 분화 하는 줄기 세포의 주입은 필드에서 지배적인 접근 인공 organoids로 줄기 세포를 분화 하는 유도 방법 있다 지만 시도11,,1213. 이 방법의 각각은 줄기 세포 나 줄기 세포; 사용 발달 큐에 직접 의존 그러나, 두 번째 공유 하 고 잠재적으로 중요 한 요소는 달팽이 관 자체의 ECM14,15.
ECM 뿐만 아니라 세포와 조직, 세포 접착, 확산, 생존, 및 마이그레이션에 대 한 서피스를 포함 하지만 또한 HCs와 나선형 ganglion15,16의 개발에 중요 한 역할에 대 한 물리적 지원 제공 ,17. 자연스럽 게 발생 ECM는 세포 표현 형 결정 및 세포 접착, 확산, 그리고 생존18가이드 수 유도 신호를 제공 합니다. 따라서, 교양된 hWJCs와 함께에서 decellularized 달팽이 관의 사용 ECM HC 재생의 역할을 탐구 하는 독특한 기회를 제공 합니다. HWJCs는 중간 엽 줄기 세포19처럼 인간의 탯에서 고립 된 쉽게 사용할 수, 비 논란이 셀 유형입니다. HWJCs는 neurosensory 세포 계보20,21아래로 차별 하는 능력을 보여주었다. 따라서, 현재 프로토콜 절연, decellularization, 및 cochleae 내가 조직 공학에 대 한 hWJCs와 C57BL 마우스 시체에서의 관류 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Allegra X-14R 원심분리기</td><td>Beckman-Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic Semi-Rigid Tubing</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler</td><td>Eppendorf</td><td>M1190-0002</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>정밀 과학 도구</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>정밀 과학 도구</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>초미세 집게</td><td>미세 과학 도구</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원뿔형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>U-100 인슐린 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td></td></tr><tr><td>섬광 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-73</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Rotator Fisher Scientific</td><td>88-861-049</td><td></td></tr><tr><td>트랜스퍼 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균제</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost PLUS 유리 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>전사 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>DAPI가 포함된 ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046341</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>중간엽 줄기세포 성장 배지</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-3232</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-75 배양 플라스크</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-150 배양 플라스크</td><td>MidSci</td><td>TP90151</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-300 배양 플라스크</td><td>MidSci</td><td>TP90301</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>니콘 기기</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>니콘 이클립스 Ts2R-FL 도립 현미경</td><td>니콘 기기</td><td>MFA51010</td><td></td></tr><tr><td>NuAire 클래스 II, 유형 A2 생물 안전 캐비닛</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>1% SDS 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143-100G</td><td></td></tr><tr><td>10% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

내가 조직 공학에 대 한 마우스 cochleae decellularizing에 대 한 프로토콜

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

포유류에서 청각 부족을 재생성 하는 기능을 촉진 하는 mechanosensory 세포는 청력 손실에 대 한 치료를 제한 했다. 현재 재생 의학 전략 이식 줄기 세포 또는 주변 청각 상실을 해결 하기 위해 손상 된 줄기 세포의 교체를 장려 하는 내가 지원 세포의 유전자 조작에 집중 했다. 그러나, 기질 (ECM) 유도 하 고 세포의 기능 유지에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 그리고 잘 조사 하지. 인공 와우를 사용 하 여 성체 줄기 세포를 성장 하는 발판으로 ECM 어떻게 구성 및 extracellular 환경 아키텍처 셀에 에이즈 청력 기능을 유지 하는 독특한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 우리는 분리 하 고 건설 기계 성인 줄기 세포 끼얹는다 수락으로 사용 하는 마우스에서 cochleae를 decellularizing 하는 방법을 제시. 현재 프로토콜에서 cochleae 안락사 쥐, decellularized, 그리고 석 으로부터 격리 됩니다. 그 후, 탯 줄에서 고립 된 인간의 튼 젤리 셀 (hWJCs) 각 달팽이 관에 끼얹는다 신중 하 게 했다. cochleae 생물 반응 기, 사용 하 고 셀 분석에 대 한 처리를 진행 하기 전에 30 일 동안 배양 되었다. Decellularized cochleae 식별 extracellular 구조를 유지 하지만 DNA의 현저한 조각 또는 셀의 존재를 공개 하지 않았다. 셀 달팽이 관에 끼얹는다 인테리어와 달팽이 관의 외관의 대부분을 침공 하 고 30 일의 기간 동안 사고 없이 성장 했다. 따라서, 현재 방법 어떻게 인공 ECM에 영향을 미치는 세포 발달 및 행동 연구를 사용할 수 있습니다.

여기에 제시 하는 방법을 사용 하 여, cochleae의 성공적인 decellularization 4'를 통해 DNA의 유무를 검사 하 여 평가 했다 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 얼룩. Cochleae는 DNA 이었다 decellularized 달팽이 관 내에서 확인 되지 않는 경우 완전히 decellularized로 간주 됐다. Decellularization 또는 decalcification을 받을 하지 않았다 이전 실험에서 네이티브 달팽이 관 구조와 전통적으로 C57BL 마우스 달팽이 관에 있는 세포를 설명 하기 위해 긍정적인 제어로 사용 되었다. 어떤 hWJCs를 주입 하지 않은, decellularized-석된 달팽이 관, 부정적인 컨트롤으로 사용 되었다. 아니 정량 DAPI 스테인드 세포 핵 조직 단면도 (그림 3)의 어떤 지역에서 관찰 되었다. 두 개의 cochleae de...

이 프로토콜의 목표 decellularize 알려줍니다 마우스 cochleae 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 공중 발판으로 이용 하는 효과적인 방법 설명 하는 것입니다.

내가 조직 공학에 대 한 마우스 Cochleae Decellularizing에 대 한 프로토콜

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

이 절차의 전반적인 목표는 내이 조직 공학 응용 분야에 골격을 사용하기 위해 마우스 달팽이관을 탈세포화하고 석회질을 제거하는 효과적인 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 3D 달팽이관 및 세포외 기질의 다양한 구성 요소가 줄기세포 분화에 어떤 영향을 미치는지와 같은 청각 및 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자가 세포가 달팽이관의 세포 외 기질과 직접 상호 작용하여 감각 상피를 형성하는 방법을 연구할 수 있다는 것입니다.이 방법의 시각적 시연은 측두골 격리 및 세포 증식 장치가 텍스트 설명만으로는 올바르게 시각화하기 어려울 수 있으므로 매우 중요합니다. 이 절차를 시작하려면 날카로운 수술용 가위를 사용하여 시상면의 두개골을 이등분합니다. 다음으로 두개골에서 뇌 조직을 제거합니다.그런 다음 두개골 내부와 외이도 외부에 있는 청각 및 전정 신경근의 존재를 통해 측두골을 식별합니다. 두개골을 조심스럽게 잘라 두개골의 나머지 부분과 측두골을 분리하십시오. 그런 다음 가는 집게를 외이도 입구에 약 5mm 정도 삽입하여 끝이 달팽이관에 구멍을 뚫을 위험이 없도록 합니다.올가미뼈를 부드럽게 부러뜨려 골절시킨다. 가는 집게를 사용하여 측두골에서 볼라의 나머지 부분을 들어 올려 달팽이관의 뼈 미로를 드러냅니다. 그런 다음 달팽이관의 타원형 및 둥근 창이 위를 향하도록 PBS에 측두골을 담그십시오.매우 미세한 집게를 사용하여 등골을 통과하는 등골 동맥을 제거합니다. 그런 다음 동맥이 통과하는 등골 아치를 통해 초미세 집게의 한쪽 끝을 삽입하고 등골을 섬세하게 위로 들어 올립니다. 그런 다음 타원형과 둥근 창문에 구멍을 뚫습니다.그런 다음 PBS로 채워진 28.5 게이지 주사기에 연결된 튜브를 타원형 창 위에 놓습니다. 10% 항생제-산소진균과 10% 페니실린-스트렙토마이신을 PBS에 2mm씩 5분 동안 주입하여 주림프를 제거합니다. 그런 다음 남아 있는 근육 조직과 뼈 조각을 제거하고 버립니다.탈세포화의 경우, 전사 피펫을 사용하여 달팽이관을 피펫 안으로 부드럽게 당겨 달팽이관이 절단된 가장자리를 몇 밀리미터 정도 통과하도록 합니다. 다음으로, 달팽이관을 1%SDS 용액이 채워진 섬광 바이알로 배출합니다. 전사 피펫을 사용하여 섬광 바이알의 달팽이관을 통해 탈이온수에 1%SDS 2ml를 순환시킵니다.섬광 바이알을 회전자에 넣고 실온에서 10시간 동안 72RPM으로 회전시킵니다. 72시간 동안 24시간마다 1%SDS 새 용액으로 교체하고 용액 교체 중에 달팽이관이 공기에 노출되지 않도록 주의하십시오. 그 후, 같은 섬광 바이알에 DI 워터로 각각 30분씩 달팽이관을 세 번 씻습니다.이 단계에서 달팽이관은 탈세포화되어야 합니다. 석회질 제거를 위해 섬광 바이알에서 남아 있는 DI 물을 달팽이관이 물에 잠길 수 있을 만큼만 남겨둡니다. 석회질 제거를 시작하려면 달팽이관이 들어 있는 섬광 바이알에 10%EDTA 및 DI 워터 5ml를 추가합니다.전사 피펫을 사용하여 섬광 바이알의 달팽이관을 통해 탈이온수에 2ml의 10%EDTA를 순환시킵니다. 섬광 바이알을 로테이터에 다시 놓고 섬광 바이알을 실온에서 10시간 동안 72RPM으로 회전시킵니다. 72시간 동안 24시간마다 10%EDTA 솔루션을 변경합니다.용액을 변경할 때 달팽이관이 공기에 노출되지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 PBS로 달팽이관을 2시간씩 세 번 헹굽니다. 이 단계에서 달팽이관은 석회질을 제거해야 합니다.세포를 주입하기 전에 탈cellurized 및 석회화된 달팽이관을 5% 이산화탄소, 섭씨 37도의 세포 배양 incubator에서 최소 1시간 동안 배양하는 것으로 시작합니다. 달팽이관을 풍성하게 만들려면 다음으로 달팽이관이 건조해지는 것을 방지하기 위해 각 달팽이관에 MSCGM 한 방울을 떨어뜨립니다. 전사 피펫을 사용하여 새 24웰 플레이트로 옮깁니다.초미세 집게를 사용하여 달팽이관의 방향을 섬세하게 조정하여 타원형 창과 둥근 창이 위를 향하도록 합니다. 그런 다음 튜브가 연결된 멸균 28.5 게이지 인슐린 주사기를 사용하여 다시 부유된 Human Wharton의 젤리 세포 0.2ml를 추출합니다. 그런 다음 멸균된 미세한 집게를 사용하여 타원형 창 위에 튜브를 배치합니다.5분에 걸쳐 0.2ml의 휴먼 와튼(Human Wharton) 젤리 세포를 다시 부유시켜 달팽이관에 섬세하고 천천히 주입합니다. 이 풍성한 단계가 중요합니다. 달팽이관을 통한 체액의 성공적인 공급은 이 프로토콜의 결과에 큰 영향을 미칩니다.충분히 섭취한 후 달팽이관이 들어 있는 웰에 섭씨 37도의 예열 MSCGM 0.8ml를 첨가하여 총 부피를 1ml로 만듭니다. 각 달팽이관에 대해 절차를 반복합니다. 매번 새 주사기와 튜브를 사용합니다.팽창된 달팽이관을 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에 넣고 일주일에 세 번 배지를 교체합니다. 여기에 표시된 것은 주입된 세포가 없는 마우스 달팽이관의 성공적인 탈세포화 및 석회화입니다. 전반적으로 달팽이관 해부학적 구조에는 얼룩이 남지 않은 빈 공간이 보존되어 있습니다.다음은 달팽이관 골격에서 Human Wharton's jelly cell을 성공적으로 배양한 대표적인 결과입니다. 달팽이관 전체와 바깥쪽 뼈 표면에서 풍부한 dappy staining이 관찰됩니다. 개별 전환을 자세히 살펴보면 탈세포화 및 석회질 제거 후에도 미세한 달팽이관 구조가 보존되고 주입된 세포가 천연 달팽이관 세포 외 기질에 부착되어 있거나 상호 작용한다는 것을 알 수 있습니다.후속 세포 배양에서의 탈세포화도 H&E 염색을 사용하여 조사했습니다. 탈세포화된 달팽이관은 천연 달팽이관의 세포를 전혀 포함하지 않았지만 세포 외 기질이 남아 있기 때문에 코르티 기관의 해부학적 구조의 대부분을 유지하고 있습니다. 배양된 세포에 주입된 것은 피질 기관을 통해 관찰될 수 있으며, 탈세포화된 세포 외 기질과 상호 작용합니다.일단 숙달되면, 달팽이관이 이미 준비되고 필요한 도구가 적절하게 배치된 경우 탈세포화된 달팽이관으로 세포가 풍부해지는 데 약 10-15분이 소요될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 달팽이관은 깨지기 쉬우므로 주의해서 다루는 것이 중요합니다. 달팽이관에 공기가 유입되는 것을 피하는 것도 중요한데, 이는 달팽이관이 풍성하게 나오는 동안 기포가 체액의 흐름을 차단하기 때문입니다.이 일반적인 절차는 다른 종의 달팽이관에 적용할 수 있으며 다양한 세포 유형도 주입할 수 있습니다. 구체적인 탈세포화 및 석회질 제거 시간은 다를 수 있지만 기본 개념은 동일하게 유지됩니다. 미네소타 대학의 피터 산티(Peter Santi) 박사는 처음에 이 프로토콜에 맞게 수정한 탈세포화 기술을 개발했습니다.우리는 달팽이관 골격에서 우리의 기술과 세포 배양을 다른 조직 엔지니어가 사용할 수 있기를 희망합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 배양 실험에 사용하기 위해 세포를 주입하기 전에 측두골을 성공적으로 분리, 탈세포화 및 석회화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

우리는 배아 쥐 내이에서 달팽이관 이식의 격리 및 배양을 설명하는 방법을 제시합니다.  또한 구형파 전기천공법을 통해 달팽이관 이식으로 유전자를 전달하는 방법을 보여줍니다. 유전자 전달 기술과 결합된 체외 이식 배양을 통해 연구자들은 발달 중 유전자 발현 변경의 영향을 연구할 수 있습니다.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

동물 모델의 달팽이관에 이독성 물질을 도입하는 다양한 방법이 있습니다. 제시된 것은 이독성 물질을 둥근 창 틈새에 전달하기 위한 수술 프로토콜입니다. 이 절차는 신뢰할 수 있고, 표적화된 달팽이관 내 병변을 생성하며, 마이크로아키텍처에 대한 기계적 손상을 방지합니다. 달팽이관 자가 수리/재생에 대한 검사가 가능합니다.

인공 와우 세포 변성을 유도하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 기술 : Ototoxic 에이전트 배달을 위해 마우스 라운드 창 접근

일차 섬모는 다양한 신호 경로에 영향을 미칩니다. 포유류 달팽이관은 평면 세포 극성(PCP) 신호 전달을 검사하는 데 이상적입니다. 섬모 기능 장애는 달팽이관 성장, 세포 패터닝 및 유모 세포 방향, PCP 판독에 영향을 미칩니다. 우리의 목표는 표현형 분석, 면역조직화학 및 주사 전자 현미경을 통해 마우스 달팽이관의 PCP 신호 전달을 분석하는 것입니다.

Ciliopathy 마우스 돌연변이 달팽이관의 평면 셀 극성 표현형의 평가

내이로의 국소 약물 전달을 위한 두 가지 미세수술 접근법이 여기에 설명되어 있으며 청력 매개변수, 달팽이관 세포 구조 및 염증 마커 발현에 미치는 영향 측면에서 비교됩니다.

마우스 내부 귀를 대상으로 약물 전달 방법의 비교 연구 : Bullostomy 대 Transtympanic 주입

본 문서는 성인 마우스 달팽이관에서 면역 조직 화학을 위한 10 mm 둥근 커버 전표에 달팽이관 상피의 조각을 부착하기 위하여 세포 및 조직 접착제의 decalcification 및 사용을 요구하는 변형된 달팽이관 표면 준비 방법을 제시합니다.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

여기서, 우리는 기능성 메카노트랜스덕션 채널을 가진 청각 모발 세포에서 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱젠의 섭취를 시각화하는 방법을 제시한다. 또한, 3-10 kDa의 덱스 트랜스는 모발의 내분비증과 코르티 장기의 지지 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

라이브 및 기능성 뮤린 달팽이관 모발 세포의 덱젠 라벨링 및 섭취량

본 연구에서는, 우리는 코르티의 기관을 포함하는 달팽이관 상피와 전 생체 배양에 의해 손상된 조직을 향해 이동하는 세포를 관찰하는 공초점 현미경을 사용하여 실시간 이미징 방법을 제시한다.

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

현재 프로토콜은 이전 프로토콜을 업데이트하고 고품질 인공와우 배양을 위한 비교적 간단한 접근 방식을 통합합니다. 이를 통해 살아있는 세포와 고정된 세포에서 신뢰할 수 있는 데이터 수집과 고해상도 이미징을 제공합니다. 이 프로토콜은 내이 세포를 연구하는 지속적인 추세를 지원합니다.

체외 모델로서의 전체 신생아 인공와우 이식

여기에서, 우리는 마우스에서 일차 달팽이관 유모 세포를 분리하고 배양하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 처음에는 Corti의 장기를 현미경으로 신생아(3-5일령) 쥐 달팽이관에서 절개했습니다. 이어서, 세포를 효소에 의해 단일세포 현탁액으로 절단하고, 배양에서 며칠 후에 면역형광을 이용하여 확인하였다.

신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

생쥐 내이 조직의 초보 사용자를 위한 이 프로토콜은 단면 면역 염색을 위한 다양한 발달 단계에서 생쥐 내이를 처리하는 단계를 포괄적으로 자세히 설명합니다.

냉동 절제 및 면역 염색 마우스 내이 조직: 배아에서 성체 단계까지

배우세요 마우스 달팽이관의 탈세포화 및 탈석회화 방법을 통해 조직 공학용 스캐폴드를 제조하는 기술입니다. 이 방법은 세포와 세포외기질의 상호작용을 연구하여 감각 상피 형성 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

내가 조직 공학에 대 한 마우스 Cochleae Decellularizing에 대 한 프로토콜

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