합성 및 루 테 늄 기반 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물의 평가

합성 및 정제의 전반적인 목표는 시판되는 루테늄 360보다 10배 더 효과적인 미토콘드리아 칼슘 흡수 분석에 사용되는 루테늄 360 유사체를 비교적 쉽게 생산하는 것입니다. 이 방법은 미토콘드리아 칼슘 흡수의 순수한 억제제를 제공함으로써 미토콘드리아 칼슘 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최종 제품이 매우 강력하고 순수하다는 것입니다.

이 방법을 처음 접하는 사람들은 정화에 시간과 인내가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 프로듀서를 시연할 사람은 제 연구실의 대학원생인 Sarah Nathan입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 pentaammine chloro ruthenium dichloride의 합성으로 이 절차를 시작합니다.

200 밀리리터의 둥근 바닥 플라스크에 1 몰 수산화 암모늄 용액 50 밀리리터에 펜타민 클로로 루테늄 디클로라이드 100 밀리그램을 용해시킵니다. 플라스크를 유리 마개로 느슨하게 덮고 반응 혼합물을 섭씨 75도에서 6시간 동안 가열합니다. 밀봉된 용기를 가열하면 압력이 상승합니다.

과도한 압력을 방출할 수 있도록 유리 마개가 느슨한지 확인하십시오. 6 시간 후에 열에서 반응 혼합물을 제거하십시오. 그리고 실온에서 4일 동안 저어주면 짙은 녹색 용액이 나옵니다.

생성된 트랜스 디아쿠아 옥토 아민 mu-oxo diruthenium pentachloride를 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하려면 먼저 25ml 비커에 0.1몰 HCL 10ml에 5g의 메쉬 양이온 교환 수지를 현탁합니다. 이 슬러리를 50ml 용매 저장소가 부착된 10ml 컬럼에 로드합니다. 용리액이 무색이 될 때까지 약 20-30 밀리리터의 0.1 몰 HCL로 수지를 세척합니다.

다음으로, 이전에 분리된 녹색 반응 용액에 농축된 HCL을 첨가하여 PH를 2로 조정하면 용액 색상이 갈색으로 변합니다. 이 산성화된 용액을 수지 위에 부드럽게 피펫팅하여 양이온 교환 수지 컬럼에 로드합니다. 용리액을 완전히 배출하고 용액을 계속 로드합니다.

전체 솔루션이 추가될 때까지 이 프로세스를 반복합니다. 수지의 상단은 짙은 갈색 또는 검은 색입니다. 수지의 부피가 약간 감소합니다.

다음으로 수지 상단을 유리 구슬로 덮어 새로운 용액을 추가할 때 수지가 방해받는 것을 방지합니다. 20ml의 1몰 HCL로 컬럼을 용리합니다. 그런 다음 50ml의 증가된 HCL 농도가 1.5어금니로 컬럼을 용리합니다.

노란색 용액이 기둥에서 나오기 시작합니다. 다음으로 HCL 농도를 2몰로 높이고 150-200밀리리터로 용리를 계속합니다. 용리액은 매우 옅은 노란색으로 시작하여 밝은 노란색으로 바뀝니다.

컬럼에서 나오는 용리액이 다시 매우 창백해질 때까지 기다립니다. 이 단계에서는 인내심이 중요합니다. 용리액은 매우 창백해야 합니다.

HCL 농도를 2.5어금니로 더 높입니다. 용리액을 시험관에서 분획으로 수집합니다. 마지막으로 농도를 3 어금니 HCL로 증가시킵니다.

생성물은 컬럼에서 녹갈색 용액으로 용리됩니다. 적갈색 분획이 기둥에서 떨어지기 시작할 수도 있습니다. 이러한 분획은 루테늄 갈색 불순물이며 녹색-갈색 분획과 함께 풀링되어서는 안 됩니다.

UV-Vis 분광법으로 모든 분획을 테스트하려면 주어진 분획 100마이크로리터를 2밀리리터의 3몰 암모니아에 첨가합니다. 그런 다음 UV-Vis 분광법으로 혼합물을 분석합니다. 순수한 생성물을 함유한 분획은 360나노미터에서 큰 흡광도 대역을 가지며 600나노미터에서 덜 강렬한 흡광도를 갖습니다.

480나노미터에서의 흡광도는 루테늄 브라운을 나타내고 533나노미터에서의 흡광도는 루테늄 적색 불순물을 나타냅니다. 다른 불순물은 300 나노 미터 미만의 흡광도에서 볼 수 있습니다. 순수한 생성물을 함유 한 분획을 풀링하고 IR 분광법으로 고체 상태의 샘플을 분석하기 전에 회전 증발에 의해 용액을 건조로 증발시킵니다.

텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 형광 분광법(fluorescent spectroscopy)에 의한 미토콘드리아 칼슘 흡수 억제를 평가합니다. 정제된 트랜스 디아쿠아 옥토 아민 mu-oxo diruthenium pentachloride의 UV-Vis 스펙트럼은 각각 360나노미터와 600나노미터에서 주요 흡수와 미량 흡수를 특징으로 합니다. 반대로, 불순한 혼합물은 루테늄 적색 불순물로부터 533 나노미터, 출발 물질로부터 275 내지 300 나노미터에서 흡수 띠를 보인다.

적외선 분광법을 사용한 고체 상태 특성화는 아민에서 예상되는 스트레치를 가지고 있습니다. 루테늄뿐만 아니라 산소, 루테늄은 850 반센티미터로 늘어납니다. 칼슘에 민감한 형광 염료와 트랜스 디아쿠아 옥토 아민 뮤-옥소 디루테늄 펜타클로라이드로 처리된 투과증발화된 HeLa 세포는 미토콘드리아로의 칼슘 흡수를 억제합니다.

절차를 시도하는 동안 분획이 완전히 용리되도록 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 인내심은 순수한 제품을 낳을 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이 강력한 루테늄 360 아날로그를 합성, 정제 및 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

미토콘드리아 칼슘 수치는 생물 에너지학 및 세포 사멸 조절을 포함한 광범위한 세포 간 과정을 조절합니다. 이 방법으로 생산된 억제제는 다른 생물학적 과정을 매개하는 데 있어 미토콘드리아 칼슘 생물학의 역할을 이해하기 위한 연구에 적용될 수 있습니다. 농축된 산 및 염기로 작업하는 것은 부식성이 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 PPE 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.