Name: 합성 및 루 테 늄 기반 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 배우세요 루테늄 기반 미토콘드리아 칼슘 흡수 억제제의 합성 및 정제 방법을. 이 기법은 상용 제품보다 10배 강력한 효능을 제공하여 미토콘드리아 생물학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 코넬 대학에 의해 지원 되었다. 이 작품은 코넬 센터의 시설에 대 한 재료 연구 공유, NSF MRSEC 프로그램 (그랜트 DMR-1120296)을 통해 지원 되는 사용 했다. S.R.N.는 NSF 대학원 연구 장학금 (그랜트 DGE-1650441) / 닥터 데이브 Holowka를 통해 칼슘 실험 지원을 인정합니다. 모든 의견, 결과, 결론 또는 권고가이 자료에서 표현은 저자 (들)의 고 반드시 국립 과학 재단의 의견을 반영 하지 않습니다.

참고: 농축된 산 및 기초가이 합성에 사용 됩니다. 모든 적절 한 안전 관행을 사용 하 여 엔지니어링 컨트롤 (증기 두건) 및 안전 안경, 장갑, 랩 코트, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발 등 개인 보호 장비 (PPE)의 사용을 포함 한 반응을 수행할 때.
 1.의 준비 [(오 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (오 2)] Cl 5 [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl의 <ol><li>합성 2 12 <ol>RuCl 3 · n H 2 O의 <li>분해 1.00 g (40% 무게에 의해 Ru, 4.1 mmol) H 2 o. 쿨 얼음 목욕에서 0 ° C에 어두운 갈색 솔루션의 5 ml에서. Dropwise 방식에서 80% 히드라 진 하이드 레이트 솔루션의 11 mL (0.23 mol)를 추가 합니다. 초기 반응 갈색 솔루션의 결과로 진화 가스와 활발 한 것입니다. 16 h;에 대 한 실 온에서 저 결과 솔루션을 보자 최종 솔루션은 어두운 무엇이 될 
		주의: 히드라 진은 심하게 독성과 발암 성. 또한, 무수이 시 약이 폭발 합니다. 항상 그렇듯이, 처리할 때 적절 한 보호구 및 연기 후드를 사용 합니다. 이러한 솔루션 건조에 집중 하지 마십시오.</li>
		<li>가 솔루션 2로 pH를 조정에 집중 된 HCl의 약 5-10 mL을 추가. 이 시점에서, 솔루션 것입니다 노란색 갈색 색상에서.</li>
		<li>1-2 시간 교 반 하면서 105 ° C에서이 솔루션을 열. 노란 고체 솔루션에서 침전 한다. 더 이상 침전 가시 형태, 열에서 제거.</li>
		<li>하도록을 실내 온도에 냉각 후 0 ° C 얼음 욕조에 10 분 수집 진공 여과 및 세척 5 mL로 하 여 노란색 고체에 대 한 반응 혼합물의 에탄올과 에테르 diethyl.</li>
		<li>완전히 15-25 mL의 뜨거운 물에 원유 제품을 분해. 얼음 목욕에서 그것을 배치 하 여 집중 HCl 솔루션 필터 플라스 크에 10 mL을 진정. 창백한 노란색 순수한 고체의 강 수를 유도 하기 위해 냉장된 HCl 솔루션으로 노란색 솔루션을 필터링 합니다. 이 침전을 필터링 하 고 각 0.5 M HCl, 에탄올 및 에테르 5 mL로 씻어.</li>
		<li>특성과 복합 사용 하 여 적외선의 분광학 3226 c m -1, 1604 cm -1, 1297 cm -1, 801 c m -1에서 기지개 주파수 식별에 의해 순도 확인 합니다. 2069 cm -1에 일반적인 작은 불순 [Ru (NH 3) 5 N 2] Cl 3에 할당 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>[(오 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (오 2)] Cl 5의 합성 <ol><li>100mg (0.34 mmol)을 녹 [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 50 ml의 1 M NH 4 200 mL 무거운 벽 라운드 바닥 압력 용기에 오. 느슨하게 캡 스 토퍼와 플라스 크 6 h. 제거 열에서 75 ° C에서 반응 혼합물이 열 하 고 어두운 녹색 솔루션을 4 일 동안 실내 온도에 저 어. 
		주의! 압력 형성에 밀폐 용기 결과 난방. 적절 한 압력 안전 유리를 사용 하 여 있는지 확인 합니다. 이 반응에 대 한 선박을 씰링의 목적은 가스 NH 3의 손실을 최소화 하기 위해입니다. 따라서, 느슨하게 초과 압력의 릴리스에 대 한 수 있도록 스 토퍼를 배치.</li>
	</ol></li> <li>양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정화 <ol><li>25 mL 비 커에 5 g 양이온 교환 수 지를 일시 중단 (예: Dowex 50WX2 200-400 메쉬 (H + 형식) 10 ml 0.1 M HCl.</li>
		<li>50 mL 용 저수지와 부착 (직경 10 m m, 높이 15 cm) 10 mL 열에이 슬러리를 로드 합니다. eluate 무색이 될 때까지 약 20-30 mL의 0.1 M HCl로 수 지를 세척.</li>
		<li>단계 1.2.1에서에서 고립 된 녹색 반응 솔루션을 반환 합니다. 이 솔루션에 추가 2, 어느 시점에서 솔루션 색상이 갈색으로 변경 pH 조정에 집중 된 HCl.</li>
		<li>부드럽게 수 지 위에 pipetting 단계 1.3.2에서에서 준비한 양이온 교환 수 지 열이 acidified 솔루션을 로드 합니다. 완전히 배수, 및 솔루션을 로드 계속 eluate 하자. 이 프로세스를 반복 하 여 전체 솔루션 추가 되었습니다. 수 지의 상단은 어두운 갈색/검은색 될 것입니다. 수 지에에서 약간 줄어듭니다.</li>
		<li>사용 수 지의 상단을 충당 하기 위해 유리 구슬. 이 새로운 솔루션은 추가 될 때 방해 되 고에서 수 지를 방지 합니다.</li>
		<li>20 mL의 1 M HCl와 열을 elute.</li>
		<li>Elute 1.5 m HCl 농도 증가 된 열 (&#8776; 50 mL). 노란 솔루션 열 내려와 시작 합니다. 2 m HCl 농도 증가 하 고 계속 방출는 eluate 무색이 될 때까지 또는 아주 창백한 녹색 황색. 150-200 mL의 총 볼륨이이 과정에 필요한 것.</li>
		<li>2.5 m (20-50 mL) HCl 농도 증가. 분수에 시험관으로는 eluate를 수집 합니다. 3m HCl 늘립니다. 제품 열에서 녹색 갈색 솔루션으로 elute 것입니다. 레드 브라운 분수 또한 열에서와 서 시작할 수 있습니다. 이 분수는 산화 루 테 늄 빨강 불순물, 녹색 갈색 분수와 수영장 하지 마십시오.</li>
	</ol></li> <li>특성화 및 검증 [(오 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (오 2)] Cl 5의 순수성의 <ol><li>에서 분수의 모든 테스트 1.3.8 단계입니다. UV-마주의 분광학에 의해 이 작업을 수행 하려면 3 M NH3 2 mL에 주어진된 분수의 100 µ L을 추가 하 고 자외선에 대 한 분광학에 의해 분석. 분수 순수한 제품을 포함 하는 큰 흡 광도 밴드 있을 것 이다 360 nm와 600 덜 강렬한 흡 광도 nm. 480 또는 533 nm에서 흡 광도 산화 루 테 늄 빨강 및 루 테 늄 빨강 불순물, 각각.</li>
		<li>수영장 분수 순수한 제품을 포함 하 고 회전 증발에 의해 건조에 대 한 해결책을 증발. 제품 그린 브라운 단색으로 고립 될 것입니다. 수확량은 일반적으로 5-15 mg (수율 10-20%)의 순서. 단일-결정, x 선 회절에 대 한 적합 한 화합물의 수성 해결책에 에탄올의 증기 확산에 의해 얻어질 수 있다.</li>
		<li>확인 순도, pH 7.4 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 솔루션에 대 한 UV 분광학 화합물 분석. 순도 360의 농도의 비율을 복용 하 여 사정 될지도 모른다 nm와 600 nm 봉우리. 이 비율은 이다 순수한 화합물에 대 한 31. 불순 한 화합물에 대 한 비율이 작은 것.</li>
		<li>IR 분광학에 의해는 고체에 샘플을 분석합니다. 진단 밴드 3234 cm -1, 3151 cm -1, 1618 cm -1, 1313 c m -1, 815 cm -1에 있습니다. 일반적인 불순물 밴드 1762 c m -1와 1400 c m -1에서 볼 수 있습니다, 뉴 햄프셔의 특성 4 cl. 루 테 늄 빨강 1404 cm -1, 1300 c m -1, 1037 cm -1 800 cm -1에 악대에 의해 확인 될 수 있다.</li>
	</ol></li> <li>형광 분광학에 의해 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제의 평가 주의! 다음 절차는 포유류 세포를 사용합니다. 작업 생물 안전 수준 2 (BSL2) 연구에 대 한 인증 된 적절 한 층 류 두건에서 실행 되어야 한다. 
	&#8203; 참고: [(오 2) (NH 3) 4 (µ-O) Ru Ru (NH 3) 4 (오 2)] Cl 5 참조 됩니다 [러]로이 단원의 <ol><li>버퍼링 확인 포함 하는 포도 당 생리 식 염 수 (BGSS)로 분석 결과 미디어입니다. BGSS 110 m KCl m, 1 mM KH 2 포 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 5mm 나트륨 호박, 30 µ M 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-구성 된 솔루션은 N, N N &#39;, N &#39;-tetraacetic 산 (EGTA). EGTA는 제외 하 고 모든 것을 결합, pH 7.4에 조정. EGTA를 추가 하 고 pH 7.4에 조정. 분석 결과 미디어의 50 mL에 대 한 추가 1 mg/mL 포도 당의 0.5 mL.</li>
		<li>Dulbecco에 500 cm 2 접시에 문화 HeLa 세포 &#39; s 수정이 글 매체 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 5% CO 2 시드 100 mm 페 트리 접시에에서 성장 하는 37 ° C. 증폭 HeLa 세포에서 습도 인큐베이터에서 500 cm 2 페 트리 접시에 그들을. 큰 접시에 총 미디어 볼륨은 115 mL. 각 큰 접시 약 18 백만 셀, 두 형광 분광학 실험을 위해 이젠 그만 얻을 것입니다.
		<ol><li>성장 셀 90-95%를 도달할 때까지 confluency. 미디어를 제거 하 고 15 mL pH 7.4 PBS 가진 세포를 씻어. PBS에서 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 15 mL를 추가 하 고 셀을 분리를 10 분 동안 품 어. 아래 팔 콘 튜브 라운드 14 mL 셀 전송</li></ol></li> <li>거꾸로 현미경으로 trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 하 고 셀의 총 수와 1.8 mL 볼륨 당 7.5 백만 세포에 도달 하는 데 필요한 미디어의 볼륨 계산 중간. 원심 5310 × g. Decant는 상쾌한 10 분에 대 한 셀을 BGSS의 계산 된 볼륨을 추가 합니다. 부드럽게 세포를 resuspend.
		<ol><li>가 분석이 결과 대 한 순수한 물에 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 1 m m H 2 O 및 H 2 o [Ru]. 재고 솔루션, 10 m m CaCl 2 칼슘 그린-5N에서에서 40 m m digitonin의 재고 솔루션을 준비, 1-3 m m 범위 수. 
			&#8203; 참고: 칼슘 그린-5N은 빛에 민감한. 어둠 속에 저장 하 고 빛의 노출을 최소화.</li>
		</ol></li> <li>506 nm와 532에서 방출 읽기에 흥분 하는 fluorimeter를 설치 37에서 제어 베트 홀더 nm ° C. 준비 볶음 바와 휠, 1.8 mL 세포 현 탁 액 위에, 1.8 µ L digitonin 솔루션, 3.6 1.5.2에서 아크릴 베트 & # 181. L 칼슘 그린-5N (솔루션), 그리고 9 µ L [러] (1 m m 재고 솔루션, 5 µ M 최종 농도)에 대 한. 세포는 fluorimeter에 15 분 동안 품 어.
		<ol><li>원시 흡수 대신 여기/방출 비율으로 데이터를 읽을. 광원에서 동요와 관련 된 오류를 최소화 하는이 연습.</li>
			<li>셀의 응답에 CaCl 2의 추가의 효과 측정 하는 [루]의 부재에서 첫 샘플 분석 수행.</li>
			<li>1.5.4에 설명 된 설정으로 fluorimeter에 시작 분석. 약 2 분 안정 방출 기준을 설정 하 고 CaCl 2 (10 µ M 최종 농도)의 1.8 µ L를 추가 합니다. 방출 강도 CaCl 2의 추가 시 즉시 증가 하 고 칼슘 이온 입력은 미토 콘 드리 아 분의 과정을 통해 다음 부패 합니다. 감퇴가 완료 될 때까지 기다립니다 (&#8776; 5 분). [러] 치료 하지 않을 셀의 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 응답을 확인 하려면 추가 칼슘 boluses 추가.</li>
		</ol></li> <li>다른 멧에 포함 된 5 µ M [Ru] 반복 실험 1.5.4.3에서 위에서 설명한 대로. 억제제, 존재 방출 강도 증가, 그러나 부패 하지 것 이다. 이 관측 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관을 차단 하는 것을 의미 한다..</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enjoy+the+trip%3A+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
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<li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li>
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<li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/244437951_The_component_of_ruthenium_red_responsible_for_inhibition_of_mitochondrial_calcium_ion_transport_Spectra_electrochemistry_and_aquation_kinetics_Crystal_structure_of_m-O-HCO2NH34Ru2Cl_3">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li>
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<li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360%2C+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li>
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</ol>

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미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물 [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5 [Ru (NH3)5Cl] 합성된 Cl2, 잘 알려진 ruthenium(III) 수 있습니다. 이 절차에 설명 된 대로 자료를 시작 합니다. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 의 합성은 쉽게 작은 어려움으로 달성 됩니다. 히드라 진에 RuCl3 16 h 교 반 후 수 화, 솔루션의 pH는 HCl와 2의 값을 조정 한다. PH 드롭은 원하는 제품을 달성 하기 위해 중요 합니다. 원하는 경우,이 합성 HCl 대신 HBr에 의하여 여 양식 [Ru (NH3)5Br] Br2 수정할 수 있습니다....

미토 콘 드리 아 칼슘은 에너지 생산 및 apoptosis를 포함 하 여 정상적인 세포 기능에 중요 한 프로세스의 수에 대 한 키 레 귤 레이 터 이다. 1 , 2 , 3 미토 콘 드리 아 칼슘 uniporter (MCU), 내부 미토 콘 드리 아 막에 상주 하는 이온 운송업 자 단백질은 미토 콘 드리 아로 칼슘 이온의 유입을 통제 한다. 4 , 5 , 6 화학 억제제는 MCU의 기능이 수송 단백질과 미토 콘 드리 아 칼슘의 세포 역할을 공부 하 고 노력을 계속 하는 데 유용한 도구는. 복합 [(HCO2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, 24 µ M.7 보고 Kd 값 MCU에 대 한 유일한 알려진된 선택적 억제제 중 하나입니다. ,8,,910 이 복잡 한 상업적인 정립에서의 루 테 늄 빨강 (RuRed)는 triruthenium 디-μ-oxo 발견 일반적인 불순은 다리의 공식 [(NH3) hexacation 5 Ru (µ-O) Ru (NH3)4(μ O) Ru (NH3)5)]6 +, 또한 칼슘 통풍 관 억제 물으로 사용 되었습니다. Ru360를 상업적으로 사용할 수 있지만 그것은 매우 비용이 많이 드는입니다. 또한, 합성 및 Ru360의 절연 어려운 정화 절차와 모호한 특성 방법에 의해 도전입니다.
우리는 최근 Ru360 아날로그, [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5액세스 절차 보고 있다. 11 이 화합물 높은 선호도, Ru360와 유사한 MCU 억제. 이 프로토콜에서 [Ru (NH3)5Cl] Cl2개시는 화합물의 우리의 가장 효과적인 합성을 설명 합니다. 강하게 산 성 양이온 교환 수 지를 사용 하 여 제품의 정화는이 절차에 대 한 일반적인 함정 함께 상세한입니다. 우리는 또한 특성화 및 복합 순도의 평가 대 한 방법을 제시 하 고 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 차단에 그 효능을 테스트 하는 간단한 방법의 윤곽을 그리 다.

<table><tbody><tr><td>루테늄 트리클로라이드 수화물</td><td>압력 화학 물질</td><td>3750</td><td></td></tr><tr><td>농축 염산</td><td>J.T. Baker</td><td>9535</td><td></td></tr><tr><td>농축 수산화 암모늄</td><td>Mallinckrodt Chemical Works</td><td>A669C-2 1</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50 WX2 200-400 메쉬</td><td>Alfa Aesar</td><td>13945</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 그린 5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Aldrich</td><td>260746</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Aldrich</td><td>471267</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>USB</td><td>20598</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fluka</td><td>54466</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 숙시 네이</td>트 <td>Alfa Aesar</td><td>33386</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Aldrich</td><td>G5000</td><td></td></tr><tr><td>200 둥근 바닥 플라스크</td><td>ChemGlass</td><td>CG-1506-14</td><td></td></tr><tr><td>유리 마개</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3000-05</td><td></td></tr><tr><td>10mm x 15cm 유리 기둥 저장소 사용자</td><td>정의 - Chemglass 기둥과 유사</td><td>CG-1203-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Round bottom Falcon tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>500 cm2 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>아크릴 큐벳</td><td>VWR&nbsp;</td><td>58017-875</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis 분광계</td><td>Agilent 모델 Cary 8454&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광플루오리미터</td><td>SLM 모델 8100C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IR 분광계</td><td>Bruker Hyprion FTIR with ATR 첨부</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>ALC 모델 PM140R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>반전광 현미경</td><td>VWR&nbsp;</td><td>89404-462</td><td></td></tr></tbody></table>

합성 및 루 테 늄 기반 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물의 평가

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

우리는 합성과 정화는 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물, [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)]5 +의 선발. 이 화합물의 최적화 된 합성 1 m에서 [Ru (NH3)5Cl] Cl2 에서 NH4오 그린 솔루션 저조한 닫힌된 컨테이너에서 시작 됩니다. 정화는 양이온 교환 크로마토그래피와 함께 수행 됩니다. 이 화합물과 특징은 순수에 대 한 UV와 IR 분광학에 의해 확인. 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 속성 permeabilized HeLa 세포에 형광 분광학에 의해 평가 됩니다.

이 메서드는 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물 [(오2) (NH3)4(µ-O) Ru Ru (NH3)4(오2)] Cl5 [Ru (NH3)5Cl] Cl2, 시작의 합성에 설명 합니다는 잘 알려진 ruthenium(III) 시작 소재입니다. [Ru (NH3)5Cl] Cl2 IR 분광학, 3200 c m-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1, 798 cm-1 (그림 1)에서 진동 모드와 특징입니다. 2069 cm-1 에 작은 불순 [Ru (NH3...

합성, 정화, 및 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관의 루 테 늄 기반 억제제의 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. Permeabilized 포유류 세포에서 효능을 평가 하는 절차를 설명 했다.

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

합성 및 정제의 전반적인 목표는 시판되는 루테늄 360보다 10배 더 효과적인 미토콘드리아 칼슘 흡수 분석에 사용되는 루테늄 360 유사체를 비교적 쉽게 생산하는 것입니다. 이 방법은 미토콘드리아 칼슘 흡수의 순수한 억제제를 제공함으로써 미토콘드리아 칼슘 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최종 제품이 매우 강력하고 순수하다는 것입니다.이 방법을 처음 접하는 사람들은 정화에 시간과 인내가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 프로듀서를 시연할 사람은 제 연구실의 대학원생인 Sarah Nathan입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 pentaammine chloro ruthenium dichloride의 합성으로 이 절차를 시작합니다.200 밀리리터의 둥근 바닥 플라스크에 1 몰 수산화 암모늄 용액 50 밀리리터에 펜타민 클로로 루테늄 디클로라이드 100 밀리그램을 용해시킵니다. 플라스크를 유리 마개로 느슨하게 덮고 반응 혼합물을 섭씨 75도에서 6시간 동안 가열합니다. 밀봉된 용기를 가열하면 압력이 상승합니다.과도한 압력을 방출할 수 있도록 유리 마개가 느슨한지 확인하십시오. 6 시간 후에 열에서 반응 혼합물을 제거하십시오. 그리고 실온에서 4일 동안 저어주면 짙은 녹색 용액이 나옵니다.생성된 트랜스 디아쿠아 옥토 아민 mu-oxo diruthenium pentachloride를 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하려면 먼저 25ml 비커에 0.1몰 HCL 10ml에 5g의 메쉬 양이온 교환 수지를 현탁합니다. 이 슬러리를 50ml 용매 저장소가 부착된 10ml 컬럼에 로드합니다. 용리액이 무색이 될 때까지 약 20-30 밀리리터의 0.1 몰 HCL로 수지를 세척합니다.다음으로, 이전에 분리된 녹색 반응 용액에 농축된 HCL을 첨가하여 PH를 2로 조정하면 용액 색상이 갈색으로 변합니다. 이 산성화된 용액을 수지 위에 부드럽게 피펫팅하여 양이온 교환 수지 컬럼에 로드합니다. 용리액을 완전히 배출하고 용액을 계속 로드합니다.전체 솔루션이 추가될 때까지 이 프로세스를 반복합니다. 수지의 상단은 짙은 갈색 또는 검은 색입니다. 수지의 부피가 약간 감소합니다.다음으로 수지 상단을 유리 구슬로 덮어 새로운 용액을 추가할 때 수지가 방해받는 것을 방지합니다. 20ml의 1몰 HCL로 컬럼을 용리합니다. 그런 다음 50ml의 증가된 HCL 농도가 1.5어금니로 컬럼을 용리합니다.노란색 용액이 기둥에서 나오기 시작합니다. 다음으로 HCL 농도를 2몰로 높이고 150-200밀리리터로 용리를 계속합니다. 용리액은 매우 옅은 노란색으로 시작하여 밝은 노란색으로 바뀝니다.컬럼에서 나오는 용리액이 다시 매우 창백해질 때까지 기다립니다. 이 단계에서는 인내심이 중요합니다. 용리액은 매우 창백해야 합니다.HCL 농도를 2.5어금니로 더 높입니다. 용리액을 시험관에서 분획으로 수집합니다. 마지막으로 농도를 3 어금니 HCL로 증가시킵니다.생성물은 컬럼에서 녹갈색 용액으로 용리됩니다. 적갈색 분획이 기둥에서 떨어지기 시작할 수도 있습니다. 이러한 분획은 루테늄 갈색 불순물이며 녹색-갈색 분획과 함께 풀링되어서는 안 됩니다.UV-Vis 분광법으로 모든 분획을 테스트하려면 주어진 분획 100마이크로리터를 2밀리리터의 3몰 암모니아에 첨가합니다. 그런 다음 UV-Vis 분광법으로 혼합물을 분석합니다. 순수한 생성물을 함유한 분획은 360나노미터에서 큰 흡광도 대역을 가지며 600나노미터에서 덜 강렬한 흡광도를 갖습니다.480나노미터에서의 흡광도는 루테늄 브라운을 나타내고 533나노미터에서의 흡광도는 루테늄 적색 불순물을 나타냅니다. 다른 불순물은 300 나노 미터 미만의 흡광도에서 볼 수 있습니다. 순수한 생성물을 함유 한 분획을 풀링하고 IR 분광법으로 고체 상태의 샘플을 분석하기 전에 회전 증발에 의해 용액을 건조로 증발시킵니다.텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 형광 분광법(fluorescent spectroscopy)에 의한 미토콘드리아 칼슘 흡수 억제를 평가합니다. 정제된 트랜스 디아쿠아 옥토 아민 mu-oxo diruthenium pentachloride의 UV-Vis 스펙트럼은 각각 360나노미터와 600나노미터에서 주요 흡수와 미량 흡수를 특징으로 합니다. 반대로, 불순한 혼합물은 루테늄 적색 불순물로부터 533 나노미터, 출발 물질로부터 275 내지 300 나노미터에서 흡수 띠를 보인다.적외선 분광법을 사용한 고체 상태 특성화는 아민에서 예상되는 스트레치를 가지고 있습니다. 루테늄뿐만 아니라 산소, 루테늄은 850 반센티미터로 늘어납니다. 칼슘에 민감한 형광 염료와 트랜스 디아쿠아 옥토 아민 뮤-옥소 디루테늄 펜타클로라이드로 처리된 투과증발화된 HeLa 세포는 미토콘드리아로의 칼슘 흡수를 억제합니다.절차를 시도하는 동안 분획이 완전히 용리되도록 하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 인내심은 순수한 제품을 낳을 것입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이 강력한 루테늄 360 아날로그를 합성, 정제 및 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.미토콘드리아 칼슘 수치는 생물 에너지학 및 세포 사멸 조절을 포함한 광범위한 세포 간 과정을 조절합니다. 이 방법으로 생산된 억제제는 다른 생물학적 과정을 매개하는 데 있어 미토콘드리아 칼슘 생물학의 역할을 이해하기 위한 연구에 적용될 수 있습니다. 농축된 산 및 염기로 작업하는 것은 부식성이 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 PPE 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

이 프로토콜은 형광 이미징에 의해 mitochondrial 칼슘 fluxes의 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 이 메서드는 선택 mitochondria로 표현 circularly permutated YFP 기반 듀얼 여기 ratiometric 칼슘 센서 (ratiometric pericam - MT)을 활용합니다.

유전자 변형으로 인코딩된 칼슘 센서를 사용하여 Apoptosis 동안 Mitochondrial 칼슘 레벨에서 동적 변경 사항 모니터링

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 mitochondrial 투과 전환 기공 개구의 측정을위한 spectrofluorometric 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 검정은 미토콘드리아 칼슘의 동시 측정을...

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

이 비디오는 분리된 미토콘드리아에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 플레이트 리더 기반 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 칼슘에 민감한 형광 염료의 형광 신호를 분석하여 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 칼슘 과부하의 역학을 연구합니다.

미토콘드리아 칼슘 흡수 분석법: 분리된 미토콘드리아에서 칼슘 흡수를 측정하기 위한 플레이트 리더 기반 방법

이 동영상은 배양된 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 컨포칼 현미경 이미징 기반 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 칼슘에 민감한 형광 염료 Rhod-2/AM을 사용하여 투과 배양 세포에서 미토콘드리아 칼슘을 측정합니다.

배양된 세포에서 미토콘드리아 칼슘 흡수를 측정하기 위한 칼슘 유입 분석

루테늄 포스 핀 복합체는 널리 균질 촉매 수소화 반응에 사용된다. N -triphos 리간드 N (CH 2 PPH 2) (3)을 담지 세자리 신규 한 루테늄 착물의 시리즈의 합성이보고되어있다. 또한, 레 불린 산 디히 Ru- N -triphos 착체의 화학 양 론적 반응을 설명한다.

루테늄의 시리즈의 합성, 특성 및 반응성<em&gt; N</em&gt; -triphos<sup&gt; 박사</sup&gt; 단지

미토콘드리아는 그들이 세포질 칼슘을 형성하는 2 + 세포 내 신호 전달 수 (2 + 칼슘)을 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (Δ Ψm)에서 전기 잠재력을 활용할 수 있습니다. 우리는 형광 염료 및 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ 분하는 방법을 설명합니다.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

이 프로토콜 Ca2 + 보존 용량 및 캘리포니아2 +검사 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로-트리거 SH-SY5Y의 고립 된 미토 콘 드리 아의 붓기 미토 콘 드리 아 세포 단계.

미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 보존 용량 분석 결과 및 캘리포니아2 +-미토 콘 드 리아 붓기 분석 결과 발생

여기, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입의 측정에 대 한 두 개의 프로토콜을 제시. 고립 된 미토 콘 드리 아에 대 한 우리는 플레이트 리더 기반 Ca2 + 가져오기 세부 분석 결과 사용 하 여 Ca2 + 민감한 염색 칼슘 그린-5N. 경작된 한 세포에 대 한 우리 confocal 현미경 검사 법 방법 Ca2 + 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 설명 합니다.

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

이 프락토콜은 성상세포와 뉴런에서 생체 외 및 생체 내 미토콘드리아 Ca2+ 이미징을 위한 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다.

유전자 인코딩 된 Ca2 + 지표 (GECIs)를 사용하여 성상 세포와 뉴런에서 이미징 미토콘드리아 Ca2 + 섭취

대사 적응은 분화, 지속성 및 세포 독성을 지시하기 때문에 T 세포의 기본입니다. 여기서, 생체외 사이토카인-분화된 인간 일차 T 세포에서 미토콘드리아 호흡을 모니터링하기 위한 최적화된 프로토콜이 제시된다.

사이토카인 분화된 인간 일차 T 세포에서 미토콘드리아 호흡의 실시간 모니터링

배우세요 루테늄 기반 미토콘드리아 칼슘 흡수 억제제의 합성 및 정제 방법을. 이 기법은 상용 제품보다 10배 강력한 효능을 제공하여 미토콘드리아 생물학 연구에 활용됩니다.

합성 및 루 테 늄 기반 미토 콘 드리 아 칼슘 통풍 관 억제 물의 평가

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