Name: DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 배우세요 SYBR Green I와 NBT 용액을 사용하여 젤에서 DNA를 선택적으로 염색하고 정량하는 간단한 방법을. 최소한의 장비만으로 현장에서도 적용 가능하며, 바이오화학 및 분자생물학 연구에 유용합니다.

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이 작품, Fondo 나시오날 드 개발 Científico y Tecnológico (Fondecyt), 칠레, 프로젝트 11130263 (CW)에, NERC 프로젝트 CONICYT + 프로그램이 드에 의해 지원 되었다 (CW)에 Colaboración 국제 PCI-PII20150073 및 Vicerrectoría de에서 U-inicia Investigación 대학 데 칠레 (CW)입니다.
Ciencias Químicas y를 박사 호르헤 Babul 그리고 디에고 Quiroga-로저 유용한 토론, 원고 및 주소 드 extensión 드 라 Facultad 드 수정에 대 한 로버트 Lesch에 대 한이 프로젝트의 초기 단계에 있는 도움에 대 한 타 호텔 팔 마에 감사 합니다. 칠레 대학에서에서 Farmacéuticas입니다. 마르셀 페 레 스는 비디오 편집을 제공 하는 음성-텍스트 및에 롤 왓슨 해결을 위한 닐 스티븐 스 너무 감사.

1. 준비 하 고 실행 하는 젤
<ol><li>비 변성 시키기 12 %polyacrylamide 젤 젤 Sambrook와 러셀14 에 찾았지만 SDS 대신 물을 사용 하 여 나트륨 라우릴 황산 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 제조 법을 사용 하 여 준비 합니다.<ol>
<li>젤을 해결의 5 mL를 준비 하려면 1.7 mL 증류수, 아크릴 아 미드/비스 아크릴 아 미드 (30/0.8 %w / v)의 2 개 mL, 1.5 M Tris pH 8.8의 1.3 mL, 10% 염화 persulfate의 0.05 mL 및 0.002 mL TEMED의 사용 합니다.</li>
		<li>준비의 겹쳐 쌓이는 젤 2 mL 물 1.5 mL, 아크릴 아 미드/비스 아크릴 아 미드 (30/0.8 %w / v)의 0.33 mL, 1 M Tris pH 6.8의 0.25 mL, 10% 염화 persulfate, 0.02 mL 및 0.002 mL TEMED의 사용 합니다. 젤의 크기는 7.3 c m x 8.2 c m 0.075 x cm (l x w x d). 참고: 0.75 m m 두께의 15 잘 빗을 사용 하 여 최고의 감도 대 한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>버퍼 및 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (6 x 로딩 버퍼 DNA 샘플의 5 µ L의예: 사용 1 µ L)에 DNA 샘플 로드 x 6의 적절 한 금액을 추가 합니다.</li>
	<li>수직 전기 영동 챔버에 젤을 놓습니다.<ol>
<li>2 젤을 실행 1 x TAE 버퍼의 750 mL 챔버를 채우십시오. 50의 1 리터를 준비 하기 x TAE, 트리 스 기지의 442 g, 빙 초 산의 57.1 mL 및 100 mL의 0.5 M EDTA pH 8 사용 하 여. 증류수 1 l.의 최종 볼륨을 추가</li>
		<li>젤에서 샘플을 로드 합니다. 100 V 2 h에 젤을 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>또는, Sambrook14에서 제조 법을 사용 하 여 1 x TAE agarose 젤 준비.<ol>
<li>1의 300 mL를 추가 수평 전기 이동 법 약 실에 x TAE. 100 V에서 45 분 젤을 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NBT SG 나 얼룩 (그림 1).
<ol><li>
아크릴 아 미드 젤 얼룩입니다.
	<ol>
<li>솔루션을 준비: 0.1 %w / v NBT 및 1.2 SG x 나. 참고: 그것은 ethidium 평범한 사람, GelRed 그리고 SYBR 골드 SG 대신 사용할 수, 하지만 SG 최상의 성능을 했다.</li>
		<li>1.2의 16.75 mL를 붓고 x SYBR 그린 나 적절 한 크기의 용기에 솔루션. 참고: 우리는 컨테이너, 피 펫 팁 상자 뚜껑을 사용 하 고 이러한 볼륨 커버 젤;이 컨테이너를 사용 하 여 계산 됩니다. 그것의 차원은 11.6 cm x 7.6 cm x 2.6 c m (w x d x l).</li>
		<li>솔루션에는 젤을 놓습니다. 0.2 m m NBT 주고 0.1 %w / v NBT 솔루션의 3.25 mL을 추가 및 1 x (2.0 µ M에 해당) SG 나 최종 농도.</li>
		<li>플라스틱 필름, 컨테이너를 봉인 하 고 알루미늄 호 일로 어떤 주변광을 차단 하도록 컨테이너를 완전히 포장. 참고: 플라스틱 필름 튀는 방지 하 고 얼룩 솔루션으로 알루미늄 호 일의 반응을 방지 하는 데 사용 됩니다.</li>
		<li>25 분 60 rpm에서 궤도 셰이 커에 흔들어.</li>
		<li>알루미늄과 플라스틱 커버를 제거 합니다. 최대 90 분 동안 햇빛에 노출. 관심의 밴드 표시 될 때까지 5 분 마다 확인 합니다.</li>
		<li>푸른 빛을 사용 하려면 3 발광 다이오드 (LED)와 protoboard를 준비 하 고 젤 표면 (표, 시간으로 얼룩 LED 광원의 강도에 따라 달라 집니다 필요)에서 약 5 m m Led를 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Agarose 젤 얼룩입니다.
	<ol>
<li>준비 하 고 실행 하는 1 %agarose 젤 1.4 섹션에 설명 된 대로 후 (크기는 1 cm x 6.2 cm x 7 cm; l x w x d), 이러한 수정 2.1에서 동일한 단계를 수행:</li>
		<li>1.2의 41.9 mL를 붓고 SG x 나 피 펫 팁 상자;의 뚜껑으로 그것의 차원은 11.6 cm x 7.6 cm x 2.6 c m (w x d x l). 0.1 %NBT 솔루션의 8.1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>플라스틱 필름, 컨테이너를 봉인 하 고 알루미늄 호 일로 어떤 주변광을 차단 하도록 컨테이너를 완전히 포장.</li>
		<li>1 h 60 rpm에서 궤도 셰이 커에 흔들어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 데이터 분석입니다.
<ol><li>
NBT SG 나 보정 곡선.
	<ol>
<li>1200 dpi에서 스캔 하 여 젤 이미지를 얻을.</li>
		<li>이미지 분석을 위한 오픈 소프트웨어입니다. 이미지 편집기를 사용 하 여 이미지 직선 화. 이미지 densitometry를 실행 합니다.</li>
		<li>곡선 아래 면적을 계산 합니다. DNA 농도 대 신호/신호최대 의 그래프를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DNA 복구입니다.
<ol><li>1에 1 %agarose 젤 준비 제조 법을 사용 하 여 x TAE Sambrook14에서 발견.</li>
	<li>1의 300 mL를 추가 수평 전기 이동 법 약 실에 x TAE. 100 ng / µ L pDJ10015 플라스 미드 DNA 사다리 구조 그림 2에 다음의 4 µ L을 로드 합니다. 100 V에 1 시간을 위한 젤을 실행 합니다.</li>
	<li>표시와 두 2 mL microcentrifuge 튜브 무게.</li>
	<li>젤을 두 개의 동일한 반쪽 위해서는 중간에 삭감. 각은 사다리 및 다른 얼룩 기법 비교 샘플 플라스 미드를 포함 해야 합니다. 그림 2에 도식 적인 표현이입니다.</li>
	<li>얼룩 하나 절반 NBT SG 나 2 단계에서.<ol>
<li>깨끗 한 메스를 사용 하 여 플라스 미드 밴드를 잘라. 젤 조각 한 튜브에 저장 하 고 무게.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SG와 젤의 다른 부분에 얼룩이 나 1의 50 mL와 함께 SG x 나 솔루션 천천히 어둠 속에서 (60 rpm) 1 시간을 위한 젤을 흔들어.<ol>
<li>transilluminator에 젤을 놓고 깨끗 한 메스를 사용 하 여 플라스 미드 밴드 2 분 컷에 대 한 노출 합니다.</li>
		<li>다른 튜브에 젤 조각을 저장 하 고 무게. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기-20 ° c.에 튜브를 유지 하면서</li>
	</ol>
</li>
	<li>플라스 미드 추출 상업 젤 추출 키트를 사용 하 여 수행 합니다.</li>
</ol>5. 플라스 미드 정규화입니다.
<ol><li>1.5 mL microcentrifuge 튜브에서 추출 된 플라스 미드의 10 µ L와 내가 물 형식의 60 µ L를 추가 합니다. 믹스 60 µ L 석 영 cuvette에 전송 하거나는 Nanodrop에서 직접 2 µ L를 사용 하 여.</li>
	<li>230 320 사이 흡수 스펙트럼을 측정 nm. 다음 수식을 사용 하 여 샘플의 플라스 미드 농도 계산. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq1v3.jpg"> 여기서 D 는 적용 희석 요소 (이 경우에 그것은 70/10), Ax 는 x nm에서 흡수 하 고 50 µ g/ml dsDNA에 대 한 변환 인수입니다.</li>
	<li>9.1 ng / µ L를 희석 샘플입니다.</li>
	<li>대장균 (대장균) 유능한 세포 (예: XL10 금) 변환 다음 희석 샘플의 5 µ L를 사용 하 여 이노우에 변환 절차16 .</li>
	<li>배양 접시에 식민지의 수를 계산 하 고 희석 합니다. 다음 수식17:: 콜로 니 형성 단위 (CFU) 계산 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56528/56528eq2v2.jpg"> 여기서 D 는 초기 문화에서 적용 되는 희석 비율입니다.</li>
	<li>짝이 없는 t-검정을 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>LePecq, J. B., Paoletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+complex+between+ethidium+bromide+and+nucleic+acids%3A+physical-chemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A fluorescent complex between ethidium bromide and nucleic acids: physical-chemical characterization.</a> J. Mol. Biol. 27 (1), 87-106 (1967).</li>
<li>Singer, V. L., Lawlor, T. E., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+SYBR+Green+I+nucleic+acid+gel+stain+mutagenicity+and+ethidium+bromide+mutagenicity+in+the+Salmonella%2Fmammalian+microsome+reverse+mutation+assay+%28Ames+test%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test).</a> Mutat Res. 439 (1), 37-47 (1999).</li>
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<li>Crandall, I. E., Zhao, B., Vlahakis, J. Z., Szarek, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+imidazole-%2C+imidazolium%2C+and+tetrazolium-containing+compounds+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">The interaction of imidazole-, imidazolium, and tetrazolium-containing compounds with DNA.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1522-1528 (2013).</li>
<li>Paredes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+visible+and+selective+DNA+staining+method+in+gels+with+tetrazolium+salts%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">New visible and selective DNA staining method in gels with tetrazolium salts.</a> Anal. Biochem. 517, 31-35 (2017).</li>
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<li>Hansen, W., Garcia, P. D., Walter, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3009026">In vitro protein translocation across the yeast endoplasmic reticulum: ATP-dependent post-translational translocation of the prepro-α-factor.</a> Cell. 45 (3), 397-406 (1986).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96 (1), 23-28 (1990).</li>
<li>Madigan, M., Martinko, J., Parker, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadigan%2C+M+%22Brock+biology+of+microorganisms%22">Brock biology of microorganisms</a>. , 10th, Prentice Hall/Pearson Education. Upper Saddle River (NJ). (2003).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

소설과 민감한 DNA 방법 얼룩 NBT의 감소 및이 문서에서 제시 했다 SG의 사용에 따라. 이 프로토콜에서 중요 한 단계는 NBT SG에 젤의 부 화 시간이 나 솔루션 및 NBT의 농도. Agarose 젤에 대 한 착 시간 agarose 젤 큰 두께 때문에 아크릴 아 미드 젤에 대 한 이상 이다. 이 메서드는 NBT 그것 접촉 침전으로 SDS 존재 잘 작동 하지 않습니다. 젤 보라색 배경 얻습니다, 경우 다른 젤 준비는 것이 좋습니다 및 빛의 노출 시간을 줄이기 위해. Agarose 젤은 스테인드 하는 경우 충분 한 감도 아니다 빛의 노출 시간을 증가 하는 것이 좋습니다. 감도의 부족 젖 침전은 젤에 존재 하는 경우이 SDS 오염의 결과 수 있습니다. 이 경우, 새로운 젤을 준비 하 고 착 색 시 약을 추가 하기 전에 그것을 씻어.
파란색 LED 또는 햇빛에서 자연적으로 블루 빛 현재의 빛에서 제공 하는 여부는 강수량 블루 빛 조명에 의해 발생 합니다. 이 때문에, 기술의 한계...

생화학과 분자 생물학의 발전, DNA와 관련 된 연구는 DNA 분석을 더 나은 기술을 요구 했다. DNA 얼룩에 대 한 첫 번째 방법은 실버 얼룩, 매우 민감한 하지만 부족 선택 이었고 샘플 복구를 허용 하지 않습니다. 나중에, 형광 DNA 얼룩의 개발 샘플 복구의 가능성과 함께 DNA의 선택적 정량화를 허용. 첫 번째 형광 염료 DNA 정량화 사용 중 하나는 돌연변이2ethidium 평범한 사람1, 이었다.입니다. 그러나, 이제는 안전 하 고 더 민감한, GelRed, SYBR 녹색 등 향상 된 형광 염료 나 (SG 나)3; 그러나 모두 이러한 형광 염료의 자외선 (UV) transilluminator 또는 fluorimeter의 사용을 요구 한다.
가시 메 틸 렌 블루4 등 크리스탈 바이올렛5,6,7,,89, DNA, 얼룩에 대 한 다른 기술이 있다 하지만 이러한 모든 감소 된 감도에서 고통 및 선택도입니다. Tetrazolium 소금은 유기 화합물 감소, 취약 하 고이 경우 그들은 형성 된 불용 성 색된 formazan 침전10,11. 최근, 일부가 tetrazolium 소금 그들의 긍정적인 tetrazolium 반지12때문에 DNA에 바인딩할 표시 되었습니다.
최근 게시13, 얼룩 polyacrylamide 젤에서 DNA를 계량 하는 새로운 표시 기술 제안 했다, 니트로 블루 tetrazolium (NBT) 불리고 ethidium 평범한 사람, GelRed, 같은 형광 염료가 tetrazolium 소금의 감소를 사용 하 여 SYBR 녹색 어 SYBR 골드. 푸른 빛 또는 햇빛 있을 때 일을 하 고 향상 된 품질로 샘플 복구 허용이 반응에 비해 SG 사용 하 여 나 UV transilluminator와 함께. 이 문서의 목적은 tetrazolium를 사용 하 여 착 색 기술의 상세한 프로토콜 제공 하 염입니다.

<table><tbody><tr><td>염색에 사용되는</td> <td>니트로 블루 테트라졸륨</td><td>Gold Biotechnology</td><td>298-83-9</td> 시약</tr><tr>염색에 사용되는<td>SYBR Green I 10000X</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S7563</td><td>시약 염색</td></tr><tr><td>젤 추출 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td>는 무결성 분석 DNA ladder Thermo-Fisher SM 1331<td>에서 겔에서 플라스미드를 추출하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>.<td>보정 곡선을 만들고 무결성 분석에서 절단 밴드를 참조하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>Agar Agar</td><td>Merck</td><td></td><td>는 LB-ampicillin 배양 플레이트를 만드는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Merck</td><td>1064045000</td><td>LB-ampicillin 배양 플레이트를 만드는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>212750</td>은 <td>LB-암피실린 배양 플레이트를 만드는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>펩톤</td><td>Merck</td><td>72161000</td>은 <td>LB-암피실린 배양 플레이트를 만드는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>AMRESCO</td><td>761</td><td>폴리 아크릴아미드 겔 제조에 사용</td></tr><tr><td>과황산 암모늄</td><td>Calbiochem</td><td>2310</td><td>폴리 아크릴아미드 겔 제조에 사용</td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>invitrogen</td><td>15512-023</td><td>폴리아크릴아미드 겔 제조에 사용</td></tr><tr><td>비스아크릴아미드</td><td>SIGMA</td><td>146072</td><td>폴리아크릴아미드 젤</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Merck</td><td>1083821000</td> <td>제조에 사용TAE 완충액 및 비변성 폴리아크릴아미드 겔 트리스-HCl 완충액</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>JT Baker</td><td>8993-01</td><td>TAE 완충</td></tr>액 <tr><td>아세트산</td><td>Merck</td><td>1,000,632,500</td><td>TAE 완충액</td></tr><tr><td>아가로스</td> 제작에 사용 <td>Merck</td><td>16802</td><td>TAE 완충</td></tr>액 <tr><td>분광 광도계</td><td>Tecan</td><td>infinite 200 pro</td>를 만드는 데 사용 <td>DNA 플라스미드</td></tr><tr><td>를 정량화하는 데 사용물 purificatiom 단위</td><td>Merck</td><td>Elix 100</td><td>분광 광도법 및 DNA 희석에 사용되는 물 유형 1 (ASTM)을 만드는 데 사용</td></tr> <tr>\ <td>증류수</td><td></td> <td>-</td> <td>젤, 배양 매체, 염색 및 일반 용액에 사용되는</td></tr><tr><td>HCl</td><td>J.T. Baker</td><td>9535-03</td><td>비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 tris-HCl 버퍼</td></tr><tr><td>6X DNA 로딩 염료</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R0610</td><td></td></tr><tr>을 만드는 데 사용<td>5mm 블루 LED</td><td>Jinyuan 전자</td><td>SP-021</td><td>광원은 무결성 분석</td></tr><tr><td>프로토보드</td><td>KANDH</td><td>KH102</td><td>광원 지원 및 회로에 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>9 V 배터리</td><td>Duracell-LED</td><td></td>의 수평 전기영동 챔버<td>에 전원을 공급하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td></td><td>Biorad</td><td>1704486EDU</td><td>는 무결성 분석에서 아가로스 젤을 만들고 실행하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>수직 전기영동 키트</td>를 사용하는 데 사용됩니다. <td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>는 보정 곡선에서 폴리아크릴아미드 젤을 실행하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr>전원<td>공급 장치</td><td>Biorad</td><td>1645050&nbsp;</td><td>전기영동에 전원을 공급하는 데 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

dna 방법 formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA 얼룩 메서드는 생물 의학 연구에 매우 중요 하다. 우리 설계 색된 침전의 형성에 의해 육안으로 DNA 시각화를 허용 하는 간단한 방법. 아크릴 아 미드를 몸을 담글 하 여 작동 또는 agarose DNA SYBR 녹색 1 x (2.0 µ M에 해당)의 해결책에 있는 젤 나 (SG 나) 보라색을 생성 하는 0.20 m m 블루 니트로 tetrazolium formazan 햇빛에 드러낼 때의 침전 또는 특별히 라이트 블루. 또한, DNA 복구 테스트가 우리의 방법으로 얼룩진 agarose 젤에는 암 피 실린 내성 플라스 미드를 사용 하 여 수행 되었습니다. 식민지의 많은 수와 함께 전통적인 보다 우리의 방법으로 얻은 SG를 사용 하 여 얼룩이 나 자외선 조명. 설명된 방법, 특정, 및 비-독성 DNA 검색, 시각화는 transilluminator 없이 "육안" 생체의 수 이며 저렴 하 고 필드 사용에 대 한 적절 한입니다. 이러한 이유로, 우리의 새로운 DNA 방법 얼룩이 지는 연구와 산업에 잠재적인 이점이 있습니다.

자주색 formazan 침전 (질량 분석13확인) DNA는 나타납니다. 실험에서 DNA 사다리 보정 곡선 (그림 3)을 로드 했습니다. 아크릴 및 agarose 젤에 대 한 프로토콜 작동 하지만 낮은 강도 있으며 agarose에서 더 긴 시간이 걸립니다. 그러나, agarose 젤의 사용 수 상용 키트를 사용 하 여 샘플의 복구 하 고 추출을 방해 하지 않습니다. 블루 Led와 함께이 메서드를 사용 하 여 복구 샘플 SG에 비해 더 나은 품질을가지고 나는 transilluminator (그림 4)를 사용 하 여.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload...

이 방법을 사용 하면 선택적 얼룩이 지 고 젤에서 DNA의 정량화 SYBR 녹색에서 젤을 몸을 담글 하 여 난 / 니트로 블루 Tetrazolium 솔루션 및 다음 햇빛 또는 파란색 광원을 노출. 이 보이는 침전 생성 하 고 필드 사용에 대 한 이상적 거의 장비가 필요 합니다.

DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

DNA 염색 프로토콜에는 세 가지 일반적인 단계가 있습니다. 첫 번째는 NBT라고도 하는 SYBR Green I과 니트로 블루 테트라졸륨 용액에 겔을 넣는 것입니다. 그런 다음 겔을 폴리아크릴아미드 겔인 경우 25분 동안 교반하고 아가로스 겔인 경우 한 시간 동안 교반합니다.마지막 단계는 젤을 파란색 LED 또는 햇빛과 같은 파란색 광원에 노출시키는 것입니다. 이 단계에서 일부 침전 띠가 나타납니다. 이 밴드는 DNA 농도와 직접적인 상관 관계가 있으며 DNA를 정량화하기 위해 사무실 스캐너에서 겔을 디지털화할 수 있습니다.polyacrylamide 젤을 위해, non-denaturing polyacrylamide 젤은 준비됩니다. 그런 다음 겔에 샘플이 로드되고 전기영동 공정이 시작됩니다. SYBR Green I을 1.2X로 희석하고 NBT 20 밀리몰 용액이 준비되었습니다.겔을 플라스틱 용기에 넣고 16.75mils의 희석된 SYBR Green I과 325mils의 NBT를 20millimolar로 첨가합니다. 그런 다음 용기를 파라 필름과 알루미늄 호일로 덮고 60rpm에서 25 분 동안 교반합니다. 마지막으로 알루미늄 호일과 파라필름을 제거하고 젤을 햇빛 또는 청색 광원에 노출시킵니다.밴드 정량화 및 보정 곡선의 경우, 겔을 사무용 스캐너에 넣은 다음 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석합니다. 마지막으로, 정규화된 신호 대 농도의 이식이 이루어집니다. 아가로스 젤이 만들어집니다.웰에는 암피실린 저항성이 있는 플라스미드가 로드되고 젤은 두 조각으로 절단되며 각 조각은 다른 염색으로 염색됩니다. 그런 다음 플라스미드 밴드를 추출하고 화학적 변형을 통해 암피실린을 포함하는 배지를 가진 유능한 세포로 형질전환시킵니다. 1% 아가로스 겔은 TAE 1X 완충액에서 준비되고 마이크로리터당 약 100나노그램의 4마이크로리터의 플라스미드가 적재됩니다.그런 다음 전기영동 챔버의 겔을 1시간 동안 100볼트에서 작동합니다. 겔의 절반은 SYBR Green I 및 NBT 방법으로 염색하고 나머지 절반은 SYBR Green I UV 방법으로 염색합니다. 아가로스 겔의 경우, SYBR Green I NBT 방법은 1.2X 농도의 SBYR Green I과 2밀리몰의 NBT를 사용하여 수행됩니다.겔을 플라스틱 용기에 넣고 용액 부피를 젤을 덮도록 조정하고 교반 시간을 1시간으로 연장합니다. 아가로스 겔의 경우, 일반적으

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

FM의 염료는 시냅스 역학의 이해에 귀중한 도움이되었습니다. FMS는 일반적으로 다른 자극 조건 동안 형광 현미경으로 다음 있습니다. 그러나, 전자 현미경과 함께 FM 염료의 photoconversion는 시냅스 부튼스의 다른 ultrastructure 구성 요소 간의, 서로 다른 시냅스 소포의 수영장의 시각화 수 있습니다.

Styryl 염료의 Photoconversion를 사용하여 시냅틱 소포 풀 유학

이 동영상은 DAPI 염색 분석을 사용하여 전리 방사선(IR) 유도 암 세포주에서 주요 세포 사멸 프로파일을 스크리닝하는 방법을 보여줍니다. 세포 사멸을 겪고 있는 표적 세포의 DAPI 염색 핵은 뚜렷한 형태를 나타내며 형광 현미경으로 쉽게 식별할 수 있습니다.

DAPI 염색을 사용한 세포 사멸 스크리닝: 암 세포주에서 IR 유도 클론 생성 세포 사멸의 신속한 스크리닝 방법

세균성 병인 분야의 중심에는 미생물이 진핵 세포에 노출 된 후 생존 방법 경우 정의 할 수있는 기능입니다. 이 문서는 내부와 숙주 세포와 관련된 개별 박테리아의 생존을 공개 형광 염료의 사용에 대한 프로토콜을 설명합니다.

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

여기에서는 슬라이드 장착형 염색체에서 반복적인 이색성 염기서열을 시각화하기 위해 형광 DNA 제자리 혼성화(DNA ISH)를 수행하는 간단한 방법을 제시합니다. 이 방법은 최소한의 시약만 필요하며 짧거나 긴 프로브, 다양한 조직, 형광 또는 비형광 기반 신호로 검출하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 DNA를위한 간단한 방법<em&gt; 현장에서</em&gt; 숙청 염색체에 하이브리드

우리는 색의 침전물을 대조하여 세 가지 다른 mRNA의 분포 패턴의 동시 특정 검출을 허용 그대로 초파리 배아에서 멀티 타겟 발색 전체 마운트 현장 하이브리드에 (MC-WISH) 절차를 설명합니다.

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

박테리아에 필수적인 프로세스의 기능을 이해은 도전 이다. 대상 특정 염료 형광 현미경 검사 법은 미생물 세포 성장과 세포 주기 진행에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기, Agrobacterium tumefaciens 모델 박테리아로 필수 프로세스의 특성에 대 한 라이브 셀 이미징에 대 한 방법을 강조 하는 데 사용 됩니다.

라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

여기, 선물이 젤 전기 이동 법 실험에서 DNA의 검출을 위한 thiazole 오렌지를 사용 하는 프로토콜. Thiazole 오렌지의 사용 ethidium 평범한 사람의 제거를 허용 하 고 형광 탐지 UV 또는 푸른 빛으로 달성 될 수 있다.

Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법

여기에서, 우리는 핵분열과 신진 효모 세포의 형광 현미경 심상에 있는 지질 방울의 자동적인 탐지 그리고 정량적인 설명의 MATLAB 구현을 제시합니다.

자동 이미지 처리를 사용하여 핵분열 및 신진 효모의 지질 방울 함량 분석

이 프로토콜은 시판되는 DNA 젤 얼룩이 있는 미토콘드리아 핵종의 특정 라벨링, 초고해상도 구조조명 현미경(SR-SIM)에 의한 라이브 라벨링 세포의 타임랩스 시리즈 획득, 핵운동의 자동 추적을 설명합니다.

시간 경과 구조화 조명 현미경 검사법에 대한 미토콘드리아 핵의 특정 라벨링

형광 태그 항생제는 항균 저항의 다중 양상을 공부하기 위하여 이용될 수 있는 강력한 공구입니다. 이 문서는 형광 태그 항생제의 제조 및 박테리아에서 항생제 저항을 공부 하는 그들의 응용 프로그램을 설명 합니다. 프로브는 분광광도법, 유세포 분석 및 현미경 검사법에 의한 세균 저항(예: 유출)의 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

형광 항생제 프로브를 사용한 세균 저항성 시각화

이 프로토콜은 단백질 합성의 천연 산물/소분자 억제제를 식별하기 위해 최적화된 형광측정 스크리닝 방법론을 도입합니다. 그 실용성 덕분에 학부 신약 개발 기술 교육과 의약 화학 캠페인 구현 모두에 적합합니다.

자연 공급원에서 단백질 합성 억제제의 예비 스크리닝을 위한 형광 기반 프로토콜

배우세요 SYBR Green I와 NBT 용액을 사용하여 젤에서 DNA를 선택적으로 염색하고 정량하는 간단한 방법을. 최소한의 장비만으로 현장에서도 적용 가능하며, 바이오화학 및 분자생물학 연구에 유용합니다.

DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

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