2018년 1월 28일
이 방법을 사용 하면 선택적 얼룩이 지 고 젤에서 DNA의 정량화 SYBR 녹색에서 젤을 몸을 담글 하 여 난 / 니트로 블루 Tetrazolium 솔루션 및 다음 햇빛 또는 파란색 광원을 노출. 이 보이는 침전 생성 하 고 필드 사용에 대 한 이상적 거의 장비가 필요 합니다.
DNA 염색 프로토콜에는 세 가지 일반적인 단계가 있습니다. 첫 번째는 NBT라고도 하는 SYBR Green I과 니트로 블루 테트라졸륨 용액에 겔을 넣는 것입니다. 그런 다음 겔을 폴리아크릴아미드 겔인 경우 25분 동안 교반하고 아가로스 겔인 경우 한 시간 동안 교반합니다.
마지막 단계는 젤을 파란색 LED 또는 햇빛과 같은 파란색 광원에 노출시키는 것입니다. 이 단계에서 일부 침전 띠가 나타납니다. 이 밴드는 DNA 농도와 직접적인 상관 관계가 있으며 DNA를 정량화하기 위해 사무실 스캐너에서 겔을 디지털화할 수 있습니다.
polyacrylamide 젤을 위해, non-denaturing polyacrylamide 젤은 준비됩니다. 그런 다음 겔에 샘플이 로드되고 전기영동 공정이 시작됩니다. SYBR Green I을 1.2X로 희석하고 NBT 20 밀리몰 용액이 준비되었습니다.
겔을 플라스틱 용기에 넣고 16.75mils의 희석된 SYBR Green I과 325mils의 NBT를 20millimolar로 첨가합니다. 그런 다음 용기를 파라 필름과 알루미늄 호일로 덮고 60rpm에서 25 분 동안 교반합니다. 마지막으로 알루미늄 호일과 파라필름을 제거하고 젤을 햇빛 또는 청색 광원에 노출시킵니다.
밴드 정량화 및 보정 곡선의 경우, 겔을 사무용 스캐너에 넣은 다음 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석합니다. 마지막으로, 정규화된 신호 대 농도의 이식이 이루어집니다. 아가로스 젤이 만들어집니다.
웰에는 암피실린 저항성이 있는 플라스미드가 로드되고 젤은 두 조각으로 절단되며 각 조각은 다른 염색으로 염색됩니다. 그런 다음 플라스미드 밴드를 추출하고 화학적 변형을 통해 암피실린을 포함하는 배지를 가진 유능한 세포로 형질전환시킵니다. 1% 아가로스 겔은 TAE 1X 완충액에서 준비되고 마이크로리터당 약 100나노그램의 4마이크로리터의 플라스미드가 적재됩니다.
그런 다음 전기영동 챔버의 겔을 1시간 동안 100볼트에서 작동합니다. 겔의 절반은 SYBR Green I 및 NBT 방법으로 염색하고 나머지 절반은 SYBR Green I UV 방법으로 염색합니다. 아가로스 겔의 경우, SYBR Green I NBT 방법은 1.2X 농도의 SBYR Green I과 2밀리몰의 NBT를 사용하여 수행됩니다.
겔을 플라스틱 용기에 넣고 용액 부피를 젤을 덮도록 조정하고 교반 시간을 1시간으로 연장합니다. 아가로스 겔의 경우, 일반적으로 사용되는 SYBR Green I 방법은 1X SYBR Green I 용액으로 겔을 덮고 한 시간 동안 교반하는 방식으로 수행됩니다. 그런 다음 겔을 UV 투과광기에 노출시켜 2분 동안 밴드 시각화를 수행합니다.
겔이 염색되면 메스로 플라스미드 밴드를 절단하고 상용 추출 키트로 플라스미드를 추출합니다. DNA는 화학적 유능한 대장균 XL 10 박테리아를 변형시키기 위해 마이크로리터당 9.1나노그램으로 정규화됩니다. 마지막으로 식민지가 계산됩니다.
군체 형성 단위가 계산됩니다. 결과를 접목하고 SYBR Green I NBT 및 SYBR Green I UV에서 얻은 결과를 비교합니다. DNA가 위치한 곳에 자주색 포르마잔 침전물이 나타납니다.
실험에서는 DNA ladder를 로드하여 1, 500 염기쌍에서 192 피코그램의 검출 한계를 가진 보정 곡선을 만들었습니다. 아가로스 겔을 사용하면 시판되는 키트를 사용하여 샘플을 회수할 수 있으며 추출을 방해하지 않습니다. 청색 LED와 함께 이 방법을 사용하면 일부 복구가 transilluminator를 사용하는 SYBR Green I에 비해 더 나은 품질을 얻을 수 있습니다.
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이 방법은 SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium 용액을 사용하여 겔 내 DNA를 선택적으로 염색하고 정량화할 수 있게 합니다. 이 과정은 최소한의 장비만을 필요로 하므로 현장 적용에 적합합니다.
이 DNA 염색 방법은 특수 장비 없이도 핵산을 직접 시각화하고 정량화할 수 있어, 자원이 제한된 환경에서 신속한 표적 검증을 지원합니다. UV 투과조명기(transilluminator)에 대한 의존도를 없앰으로써 초기 발견 워크플로우에서의 안전 위험과 운영 복잡성을 줄여줍니다. 이 접근 방식은 DNA 농도와 염료 기반 신호 간의 재현 가능한 상관관계를 통해 예측 신뢰도를 높여, 리드 화합물 발굴 파이프라인에서 진행 여부(go/no-go) 결정을 용이하게 합니다.
이 방법은 핵산 추출부터 기능적 분석 검증에 이르는 발견 연속체에 적합하며, 특히 장비 접근이 제한적이거나 신속한 반복 실험이 필요한 경우에 유용합니다.