Name: 포화 지방산은 세 라마 이드 관련 된 대 식 세포 세포 죽음을 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 배우세요 BSA-지방산 결합물을 이용한 대식세포 사멸 유도 방법을 통해 세라마이드 축적과의 상관관계를 확인하는 기술입니다. 이 연구는 대사성 염증 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품 루이빌 대학 시작 기금에 의해 부분적으로 지원 하 고 국립 암 연구소 (베 데스 다, 메릴랜드) R01CA177679, R01CA180986를 부여 합니다.

프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 루이스 빌 대학에 의해 승인 되었다.
 1. 마우스 골 수 유래 세포 (BMDMs) <ol><li>Euthanize CO 2를 사용 하 여 6에 8-주 오래, 건강 한 야생 타입 마우스. 폼 보드로 고정 하 고 그것이 젖 었 때까지 70% 에탄올 스프레이. 집게와가 위 경골/대 퇴 골 뼈를 제거 합니다. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 5 mL 1와 페 트리 접시에 넣어. 무 균 조건 하에서 모든 절차를 수행 합니다.</li>
	<li>오픈는 시저와 경골/대 퇴 골 뼈의 양쪽 끝에서에서 잘라 무 균 조직 문화 후드. 15 mL 튜브에 PBS + 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 25g 바늘 뼈를 플러시.</li>
	<li>500 x g, 4 ° C 5 분 대에 골 수 세포를 원심</li>
	<li>미만 1 분 9 mL 1 x PBS 가진 즉시 Dilute 위해 lyse 적혈구 (RBC)를 1 mL 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼에 셀 펠 릿 resuspend. 1.3 단계에서 원심 분리기 다시입니다. supernatants 가만히 따르다.</li>
	<li>셀 펠 릿 10 mL 1 x PBS에 resuspend, 세포 파편/덩어리를 제거 하려면 다른 15 mL 튜브에 불 임 40 μ m 나일론 메쉬를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 합니다. 1.3에서 원심 분리기 다시입니다. supernatants 가만히 따르다.</li>
	<li>15 mL 로스웰 파크 기념 연구소 중간 (RPMI) 1640 5 %FBS 10 μ g/mL gentamicin, 37 o C 인큐베이터에서 100 m m 조직 문화 접시에 셀 60 분 부드럽게 요리, 소용돌이 대 한 부동 꺼내 접시에 셀 펠 릿 resuspend 세포, 그리고 그들을 계산.</li>
	<li>10 ng/mL 재조합 마우스 대 식 세포와 미디어 (5 %FBS 30 %L929 바른된 미디어 10 혼합 10 μ g/mL gentamicin RPMI 1640) 차별화 12 mL macrophage 6 x 10 6 셀 100 mm 접시에 접시 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 2 일.</li>
	<li>5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 2 일간 배양 후 각 접시 6 mL 신선한 macrophage 차별화 10 ng/mL M-CSF와 미디어 피드.</li>
	<li>5 일에 밖으로 오래 된 미디어의 8 mL 셀을 방해 하지 않고 고 추가 10 mL 신선한 macrophage 미디어 10 ng/mL M-CSF와 차별화.</li>
	<li>셀 기중 장치를 사용 하 여 골 수 유래 세포 (BMDMs) 수확 7 일에. 
	참고: 연결 된 대 식 세포 수 또한 될 해리 했다 5 mL 1 m m 5 ~ 10 분의 1 x PBS에 EDTA와 float 세포를 제거 하 고 두 번 5 mL 1 x PBS 가진 접시를 세척 후. 1.3 단계에서 세포를 원심., 미디어, 차별 하는 신선한 macrophage에 그들을 resuspend 및는 hemocytometer로 그들을 계산.
	<li>확인은 BMDMs <ol>&#39; 표현 형으로 cytometry에 의해 설명 5. 다음과 같은 연구에 대 한 특정 농도에 세포 파생된 마우스 준비.</li>
	</ol></li></ol> 2. BSA-지방산 산 켤레 준비 <ol><li>준비 2mm BSA 살 균 PBS에. 예를 들어 추가 30 mL 1 x PBS를 해산, 6.65 g BSA, 무게 추가 더 많은 PBS 50 mL까지 1 x PBS에 2mm BSA를 만들기 위해 구성 요소를 확장.</li>
	<li>2mm BSA에에서 지방산의 준비 5mm 개별 나트륨 소금. 필요한 경우, 37 ° C 이상가 열 하 고 명확한 해결책을 얻을 때까지 2mm BSA의 혼합물 및 지방산의 나트륨 염을 sonicate. 
	참고: 불포화 지방산에 비해, 포화 지방산 필요 더 높은 온도 및 더 많은 쥡니다 시간 해산.</li>
	<li>필터는 0.22 통해 지방-산 성-BSA 솔루션 μ m 필터, 약 수 1.5 mL 메 마른 microcentrifuge에 그것은 튜브, 단기 사용을 위한 4 ° C에 또는 긴 기간 저장을 위해-20 ° C에서 그들을 저장 하 고. 아니 강 수는 냉장고에서 4 ° C에서 저장 후 관찰 해야 합니다.</li>
</ol> 3. 포화 지방산 유도 세포 죽음의 마우스 골 수 파생 된 세포 <ol><li>미디어를 차별화 하는 대 식 세포에 10 6 /mL x 0.4 BMDMs 24-잘 조직 문화 접시에 접시.</li>
	<li>0.4 m m 팔 미 틴 산 및 스 테아 르 산 5% CO 2와 37 ° C 배양 기에서 16 ~ 24 h에 대 한 세포 치료. BSA를 사용 하 여 부정적인 컨트롤로.</li>
	<li>셀 치료 후 셀 기중을 수확 하 고 500 x g, 5 분에 4 ° C에서 셀 아래로 회전</li>
	<li>Annexin V-알 렉 사 488와 100에서 7-aminoactinomycin D (7-AAD) 세포를 얼룩이 μ annexin V 바인딩 버퍼 실 온에서 15 분.</li>
	<li>Annexin 바인딩 버퍼의 200 µ L로 샘플을 희석, 부드럽게, 혼합 후 잠복기 후 얼음 샘플을 유지.</li>
	<li>흐름 cytometry 5 스테인드 셀을 최대한 빨리 분석. FITC 채널에 감지 annexin V-알 렉 사 488와 7 AAD PerCP/PerCP-Cy5.5 채널에서 발견 되.</li>
</ol> 4. 세포내 세 라마 이드 얼룩 <ol><li>지방산 치료 후 수확 단계 3.3 에서처럼 셀. 다음 30 분에 대 한 4 %paraformaldehyde 셀 수정</li>
	<li>1 mL 1 x PBS와 샘플을 세척, 스핀 다운로 3.3에 고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
	<li>30 분에 대 한 100 μ 1 x permeabilization 버퍼에 셀 안티-세 라마 이드 1 차적인 항 체 (1: 200 희석)을 얼룩</li>
	<li>세척 및 스핀 아래로 단계 4.2에서 다시 셀.</li>
	<li>반대로 마우스 IgM 이차 항 체 (1: 500 희석)와 세포 30 분에 대 한 100 μ 1 x permeabilization 버퍼에 얼룩</li>
	<li>세척 및 스핀 다운 단계 4.2에서 다시 셀. 250 μ 1 x PBS를 추가 하 고 교류 cytometry 5 스테인드 세포 분석. 
	: 참고 장비 및 시 약의 테이블의 자세한 시 약 목록.</li>
</ol>

<ol><li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+%28J774%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li>
<li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li>
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<li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+as+fatty+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li>
<li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+%28sterol+carrier+protein-2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li>
<li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li>
</ol>

저자는 금융 충돌의 관심을 선언합니다.

지방 산 성 해결책의 적절 한 준비는 지방산의 생물학적 기능 연구에 중요 한 중요성의 이다. 지방산의 중립화 수성 해결책에 있는 그것의 가용성을 증가 시킵니다. 그러나, 특히 포화 지방산, 지방산의 나트륨 염 우리가 관찰 물 또는 PBS에서 낮은 용 해도의 여전히 있습니다. 한 가지 방법은 지방산1해산 있도록 95-100% 에탄올을 사용 하는. 이 메서드를 사용 하 여 셀에 높은 독성 적은 독성 불포화 지방산에 대 한 낮은 농도 에서도 관찰 될 수 있습니다. 지방 산 성 솔루션을 준비 하는 또 다른 방법은 지방산이 최적의 조건, 그들의 단위체 양식9,11솔루션에 남아 있는 메 틸-β-cyclodextrin 배달 시스템으로 활용 하는 것입니다. 같은 방법으로 준비 하는 지방산은 정상적인 기능, 나타나지만 메서드를 수행 하는 것은 복잡. 메 틸-β-cyclodextrin 세포 성장에 미...

지방산이 에너지 대사에서와 다른 종류의 세포 막 인지질 합성에 중요 한 역할. 지방산은 낮은 수성 가용성이 있다. 지방산의 적절 한 준비는 포유류 세포에서 지방산의 생물 학적 기능을 공부를 위한 중요 한 중요성 이다. 지방산 에탄올 준비가 때 많은 지방산1상대적으로 낮은 농도 에서도 세포 막에 그들의 독성 비누 (세제) 효과 보여줄 수 있습니다. 무료 지방산은 혈 청에 대 한 자연, 주요 전송으로 혈 청 알 부 민 지방산 배달에서 생체 외에서 지방산 기능 분석 실험2,,34에 대 한 좋은 통신사를 간주 됩니다. 그러나, 지방산 및 혈 청 알 부 민 켤레의 준비의 세부 대개 하지 사용할 수 있습니다 지방산을 사용 하 여 많은 연구 논문 출판 되었습니다 비록.
대 식 세포는 매우 표 피 지방산 의무적인 단백질 및 지방 지방산 의무적인 단백질5,6,,78표현 한다. 그들은 적극적으로 호응을 포화 및 불포화 지방산이 면역 기능을 조절 수 있습니다. 대 식 세포와 다른 세포에 지방산의 영향 연구, 지방산 준비의 다른 방법이 적용된1,,79했다. 지방산은 대 식 세포 기능에 미치는 영향을 조사 하기 위해 적절 하 게 준비 된 지방산/혈 청 알 부 민 어원이 같은 말을 사용 하 여 생물학적으로 의미 있는 데이터를 얻기에 중요 한 중요성 이다. 대 식 세포 기능에 지방산의 영향에 대 한 연구는 기본적인 지식 및 대 식 세포 관련 질병에 지방 산 성 대사에 관련 된 잠재적인 치료 표적 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>CPX 초음파 수조&nbsp;</td><td>Bransonic</td><td>모델 2800</td><td></td></tr><tr><td>팔미틴산 나트륨 (PA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1109</td><td>MW 278</td></tr><tr><td>스테아린산 나트륨 (SA)</td> <td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1111</td><td>M.W. 306</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA), 무지방산</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>마우스 대식세포 콜로니 자극 인자 (mM-CSF)&nbsp;</td><td>세포 신호 기술,&nbsp; Inc.</td><td>5228</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>VWR International</td><td>71002-878</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Fisher Scientific</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-ceramide 항체 (mouse IgM)</td><td>Sigma</td><td>C8104-50TST</td><td>Clone: MID 15B4</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgM 항체, &micro; chain, FITC conjugate</td><td>Sigma</td><td>AP128F</td><td></td></tr><tr><td>고정 버퍼</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilization 버퍼</td><td>Ebioscience</td><td>4307693</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V 결합 완충액</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>L929 세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 셀 리프터&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-364</td><td></td></tr><tr><td>참고: MW는 분자량입니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

포화 지방산은 세 라마 이드 관련 된 대 식 세포 세포 죽음을 유도

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

대 식 세포는 매우 상피 지방산 의무적인 단백질 및 지방 지방산 의무적인 단백질을 표현 한다. 그들은 적극적으로 호응을 포화 및 불포화 지방산, 면역 기능 조절에 중요 한 역할을 수 있습니다. 수많은 연구 다양 한 지방산, 포화 또는 불포화, 세포 성장 및 기능에 다른 영향을 보유. 그러나, 지방산 준비를 위해 사용 하는 방법 다는 비 생리 적인 결과 이어질 수 있습니다. 혈 청 알 부 민, 자연 캐리어 포유류 주변 혈액에서 지방산은 지방산 비누의 독성을 최소화 포유류 세포에서 지방산의 기능을 공부 하 공액 지방산의 나트륨 소금 복잡 한 성형에 대 한 것이 좋습니다. 따라서, 간단 하 고, 상대적으로 빠른 난방 및 메서드 sonicating 개발 이며 BSA 지방 산 성 어원이 형성에 대 한 여기에 제시. 우리는 포화 지방산, 특히 스 테아 르 산 마우스 골 수 유래 세포에 심각한 세포 죽음을 유도 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 더 포화 지방산 유도 된 세포 죽음은 긍정적으로 축적 된 세포 세 라마 이드 수준 연관 보여 줍니다. 이 메서드는 다른 포유류 세포에서 지방산의 영향 연구에 대 한 확장할 수 있습니다.

비만에 혈 청 자유로운 지방산 농도 증가합니다. 전문 식 세포로 세포 적극적으로 차지 지방산 호스트 항상성 유지를 합니다. 이 프로세스 동안 오버 로드 된 지질 대 식 세포 세포 죽음을 유도 수 있습니다. 이 위해, 우리는 BMDMs에서 체 외에 식이 지방산 및 흐름 cytometric 얼룩을 사용 하 여 측정 된 대 식 세포 세포 죽음의 비만 수준으로 교양. BSA 제어, 포화 지방산에 비해 특히 스 테아 르 산, 유도 BMDMs. 죽은 세포 Annexin V와 7-AAD (그림 1a-b) 스테인드 이중 긍정적인 채우기로 표시 했다 중요 한 세포 죽음. 메모의 불포화 지방산은 상당한 대 식 세포 세포 죽음5을 유도 하지 않았다. 데이터는 vivo에서무료 포화 지방산의 증가 수준의 독성 효과 제안합니다.
<...

우리는 murine 기본 세포 골 수 세포에서 파생 하는 스트레이트-앞으로 방법을 설명 하 고 BSA 지방산을 준비 하는 간단한 방법 변화. 포화 지방산은 대 식 세포 세포 죽음을 일으킬 수 있다 그리고 이러한 세포의 죽음은 확실히 세 라마 이드 레벨의 세포 축적와 관련 다음 설명 합니다.

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

대식세포를 포화 지방산으로 처리하는 이 실험의 전반적인 목표는 포화 지방산에 의한 대식세포 세포 사멸이 축적된 세포 수준의 세라마이드와 관련이 있음을 입증하는 것입니다. 이 방법은 대사성 염증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예: 포화 지방산 유도된 세포 죽음 및 염증.이 기술의 주요 장점은 BSA 지방산 접합체를 추진하기 위한 간단하지만 상세한 접근 방식을 제공한다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 일관된 결과를 가진 정확하고 안정적인 BSA 지방산 접합 용액을 준비하는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 안락사된 6-8주 된 건강한 야생형 마우스에서 경골과 대퇴골을 제거하는 것으로 이 절차를 시작합니다.경골과 대퇴골 뼈의 양쪽 끝을 가위와 멸균 조직 배양 후드로 자릅니다. PBS가 함유된 25게이지 바늘과 2% 소 태아 세럼을 15ml 튜브에 넣고 뼈를 씻어냅니다. 골수 세포를 섭씨 4도의 500g에서 5분 동안 원심분리합니다.다음으로, 적혈구 용해 완충액 1ml에 세포 펠릿을 다시 현탁시켜 적혈구를 1분 미만으로 용해시킵니다. 즉시 9ml의 1x PBS로 세포를 희석합니다. 이전과 같이 다시 원심분리기를 만들고 상층액을 디캔팅합니다.세포 펠릿을 10ml의 1x PBS에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 멸균 40미크론 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 다른 15ml 튜브로 여과하여 세포 파편과 덩어리를 제거합니다. 이전과 같이 원심분리 후 세포 펠릿을 15ml의 Roswell Park Memorial Institute medium 1640에 5% FBS와 10μg/mL의 Gentamicin으로 다시 현탁시킵니다.그런 다음 100mm 조직 배양 접시에 세포를 플레이트하고 섭씨 37도의 인큐베이터에 60분 동안 넣습니다. 접시를 부드럽게 휘젓고 떠 있는 세포를 꺼내 세십시오. 다음으로, 100mm 접시에 6, 000, 000개의 세포를 12ml의 대식세포 분화 배지와 10밀리리터당 10나노그램의 재조합 마우스 대식세포 군집 자극 인자(MCSF)로 2일 동안 플레이트합니다.섭씨 37도의 인큐베이터에서 5%의 CO2로 이틀 동안 배양한 후 MCSF 1밀리리터당 10나노그램이 함유된 6ml의 신선한 대식세포 분화 배지를 각 접시에 공급합니다. 5일차에는 세포를 방해하지 않고 8ml의 기존 배지를 제거하고 10밀리리터의 새로운 대식세포 분화 배지와 10밀리리터의 MCSF를 10나노그램 첨가합니다. 7일째에는 세포 리프터를 사용하여 골수 유래 대식세포(BMDM)를 채취합니다.text protocol에서 참조된 대로 유세포분석(Flow Cytometry)을 통해 BMDM의 표현형을 확인합니다. BSA 지방산 접합체를 준비하려면 2 밀리몰 BSA에 5 밀리몰의 지방산 나트륨 염을 준비합니다. 필요한 경우 혼합물을 섭씨 37도 이상으로 가열합니다.그런 다음 맑은 용액이 얻어질 때까지 2 밀리 몰 BSA와 지방산의 나트륨 염의 혼합물을 가열합니다. 초음파 처리 후 0.22 미크론 필터를 통해 지방산 BSA 용액을 여과합니다. 그런 다음 여과된 용액을 1.5ml 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다.튜브는 단기 사용을 위해 섭씨 4도에서 보관하거나 장기 보관을 위해 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 냉장고에서 섭씨 4도의 온도에서 보관한 후에는 강수량이 관찰되지 않아야 합니다. 대식세포 분화 배지에서 밀리리터당 40만 개의 세포가 있는 24웰 조직 배양 플레이트에 BMDM을 플레이트화합니다.섭씨 37도의 인큐베이터에서 0.4 밀리몰의 팔미트산과 스테아르산으로 16-24시간 동안 5%의 CO2로 세포를 처리합니다.BSA를 음성 대조군으로 사용합니다. 치료 후 세포 리프터로 세포를 수확합니다.그런 다음 500g, 섭씨 4도에서 5분 동안 셀을 회전시킵니다. 100마이크로리터의 Annexin-V 결합 완충액에 Annexin V-Alexa 488 및 7-AAD를 넣어 실온에서 15분 동안 세포를 염색합니다. 샘플을 Annexin 결합 완충액 200마이크로리터로 희석하고 부드럽게 혼합합니다.배양 기간이 끝난 후 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 유세포분석법(Flow Cytometry)을 통해 가능한 한 빨리 염색된 세포를 분석합니다. Annexin V-Alexa 488은 FITC 채널에서 감지되고 7-ADD는 PerCP PerCP-Cy5.5 채널에서 감지됩니다.지방산 처리 후 이전과 같이 세포를 수확합니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드로 세포를 30분 동안 고정합니다. 이전과 같이 샘플을 회전시키기 전에 1mm PBS의 1밀리터로 샘플을 세척합니다.상등액을 디캔팅한 후 100마이크로리터의 1x Permeabilization Buffer에 Anti-Ceramide Primary Antibody로 세포를 30분 동안 염색합니다. 이전과 같이 세포를 세척하고 원심분리한 후 100마이크로리터의 1x Permeabilization Buffer에 Anti-Mouse IgM Secondary Antibody로 세포를 30분 동안 염색합니다. 이전과 같이 세포를 씻고 다시 회전시킵니다.그런 다음 250마이크로리터의 1x PBS를 첨가하고 유세포분석으로 염색된 세포를 분석합니다. BMDM은 비만 수준의 식이 지방산으로 체외에서 배양되었으며 대식세포 세포 사멸은 유세포 염색을 사용하여 측정되었습니다. BSA 대조군과 비교했을 때, 포화 지방산, 특히 스테릭산은 BMDM의 상당한 세포 사멸을 유도했습니다.죽은 세포는 Annexin V 및 7-AAD에 의해 염색된 이중 양성 집단으로 나타났습니다. 더욱이, 포화 지방산에 의한 세포 사멸은 대식세포에 축적된 세포 세라마이드 수치와 긍정적인 관련이 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 BSA 지방산 접합체를 준비하고 BSA 지방산 접합체로 대식세포를 치료하여 세포 사멸 및 염증을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.개발 과정에서 이 기술은 대사 염증 분야의 연구자들이 포화 지방산에 의한 세포 사멸 및 비만의 염증을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

saturated-fatty-acids-induce-ceramide-associated-macrophage-cell-death

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리가 맥스와 Annexin V - 복합 자석 구슬과 대상 지질 및 Annexin V - 구속력 phosphatidylserine의 합성 지질 vesicles를 사용하여 자사의 목표 지질과 단백질의 상호 작용을 테스트하려면. 대상 지질에 바인딩 단백질은 공동 정화 및 비즈에서 용출 후 분석하고 있습니다.

자기 활성 셀 정렬 (LIMACS)를 사용하여 지질 소포 - 중재 동질 크로마 토그래피 : 단백질 지질 상호 작용을 분석하는 소설 방법

이 비디오는 이분자 형광 보완 리포터 단백질을 사용하여 인간 대식세포에서 카스파아제 단백질의 활성화를 보여줍니다. 카스파제-1의 프로 도메인은 비너스 단백질의 비형광 단편과 융합되며, 이 단백질은 인플라마솜 복합체에 동원됩니다. 인플라마솜의 근접성은 금성 단편의 재접힘과 형광을 유도하여 대식세포에서 카스파아제 활성화를 확인합니다.

Visualization of Caspase Activation in Human Monocyte-Derived Macrophages

이 비디오는 인플루엔자 바이러스를 자극하여 골수 유래 대식세포에서 여러 카스파아제 활성화를 평가하는 방법을 보여줍니다. 대식세포 용해, 용해물의 열 불활성화 및 원심분리 후 후속 면역학적 분석을 위해 세포 내 카스파제를 수집합니다.

대식세포에서 다중 카스파제의 활성화에 대한 평가

여기에서는 인접한 사멸 또는 죽어가는 세포와의 물리적 상호 작용에 의해 생존 가능한 세포에서 유도되는 세포 내 신호 전달 이벤트를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 죽은 세포의 식세포 흡수 또는 용해성 매개체의 방출과 대조적으로 죽은 세포의 수용체 매개 인식에 의해 유도되는 신호 전달 이벤트에 중점을 둡니다.

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

이 프로토콜 수 있습니다 격리 하 고 특성화 연구원 조직 상주 다양 한 세포 특징 염증된 조직 변화 무질서의 다이어트 유발 모델에서 추출.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

이 프로토콜은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 유래 대식세포 (MDM)를 얻는 워크 플로우, 세포 생존력과 행동을 손상시키지 않고 염증성 카스파제 BiFC (BiFC) 리포터를 인간 MDM에 효율적으로 도입하는 간단한 방법, 살아있는 세포에서 염증성 카스파제 활성화를 측정하기위한 이미징 기반 접근법을 설명합니다.

인간 단핵구 유래 대식세포에서 근접성을 유도한 염증성 카스파제의 시각화

이 프로토콜은 시험관 내 및 생체 내 (마우스내) 감염, 무균 손상 및 암 모델 모두에 대한 반응으로 카스파제 활성화(카스파제-1, 카스파제-3, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9 및 카스파제-11)를 평가하여 파이롭토시스, 세포자멸사, 괴사 및 PANoptosis와 같은 세포 사멸 경로의 개시를 결정합니다.

선천면역세포사멸을 평가하기 위한 카스파아제 활성화 평가

이 프로토콜은 PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸을 기반으로 합니다. 당사는 유세포 분석을 사용하여 Annexin V 및 7-AAD 이중 염색을 분석하여 세포 사멸을 검출하며, 전체 세포를 사용하고 주사 전자 현미경을 사용하여 세포막 형태를 관찰합니다.

PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸 및 그 검증

셀 - 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

배우세요 BSA-지방산 결합물을 이용한 대식세포 사멸 유도 방법을 통해 세라마이드 축적과의 상관관계를 확인하는 기술입니다. 이 연구는 대사성 염증 메커니즘 연구에 활용됩니다.

포화 지방산은 세 라마 이드 관련 된 대 식 세포 세포 죽음을 유도

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