Name: 단일 좌 골 신경 및 Cytometry 사용 하 여 단일 마우스에서 지 루트 신경 절에 면역 세포의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 학습하세요 마우스 좌골신경과 척수후근신경절에서 면역세포를 분리하는 흐름세포분석법을. 이 방법은 신경염증 및 면역병리 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 도이치 가운데 (DFG;에 의해 지원 되었다 SFB1118)입니다. 저자는 해 부의 대부분을 수행 하 고 유익 하 게이 지식을 전송에 대 한 악 셀 Erhardt와 박사 Volker 엑스 타인과 교류 cytometer의 기술적인 측면에 도움을 위한 감사 하 고 싶습니다.

야생-타입 C57BL/6 마우스 (남성, 10 ~ 12 주) 표준 12 h 명암 주기에서 유지 했다 그리고 표준 차 다이어트와 물에 대 한 무료 액세스를 제공 했다. 모든 동물 실험 지역 동물 관리 및 사용 위원회 관련 지침에 따라에서 실시 하 고 Karlsruhe, 독일 (G216/10)에 지역 권위에서 로컬 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.
1입니다. 마우스의 관류
<ol><li>희생 마우스 (C57BL/6; 남성; 10-12weeks) CO2 를 사용 하 여 지역 규정에 따라. 참고: EDTA 코팅 1.5 mL 튜브를 사용 하 여 제어 백혈구를 수행할 수 있습니다 복고 궤도 출혈. 이 방법은 출혈만 희생 직후 효율적입니다. 더, 복 막 구멍 게 (PCL) 융합 관류를 방해할 수 있습니다 혈액의 찬 들을 피하기 위해 37 ° C에서 미리가 열된 PBS를 사용 하 여 제어 세포를 얻기 위해 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>후 한 70 %v / v 에탄올과 모피는 복 부에 살포 하 고 반복적으로 코 튼 거 즈와 휴지로 닦아 하 여 마우스를 소독. 세로 절 개 하 여 복 부 피부 오픈 컷 무딘가 위를 사용 하 여.</li>
	<li>처음 만드는 곡선, 무딘가 위를 사용 하 여 및 다음 흉 곽의 전체 길이 따라 절 개를 확장 횡 경 막으로 절 개 하 여 흉 막 캐비티를 노출 합니다. 흉 골 떨어져 신중 하 게 해제를 수 때까지 contralateral 쪽에 비슷한 상처를 확인 합니다.</li>
	<li>심장과 주요 혈관의 명확한 전망, 삽입 나비 23¾ 계기 바늘, 50 mL 주사기에 연결 되어 심장의 왼쪽된 상공에 얼음 처럼 차가운 PBS, 가득 합니다.</li>
	<li>하강 대동맥 손상 없이 가능한 콘센트의 대형을 아이리스가 위를 사용 하 여 심장의 오른쪽 아 트리 움을 절 개 하 고 다음 주사기를 약을 부드럽게 우울 30 mL PBS의. exudate 분명 실행 되어야 합니다. 간 및 신장의 좋은 관류의 지시자로 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>2입니다. 좌 골 신경 및 DRG의 해 부
참고: 좌 골 신경의 해 부에 대 한 gluteus 막시무스 제거 되 고 마우스는 피부 위의 위치 복 부 측 아래로 더 낮은 사지에 밖으로 기지개 하는 동안.
<ol><li>양측 위 지 허벅지에서 근육 조직을 구분 하 여 전체 좌 골 신경 해 부 고 신경 척추를 따라 따라. 잘라 신경 척추에서 및 즉시 다른 끝에서 무릎 위에 어디 종료 됩니다. 참고: 분쇄 또는 당기는 집게와 같은 신경의 과도 한 처리를 하지 마십시오.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 삭제 nerve(s), 신경, 얼음 처럼 차가운 PBS와 얼음가 게의 1 mL를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 약 2 cm 전송. 참고: 신경 얼음에 하룻밤 저장할 수 있습니다. 참고: DRG 절 개, 포 셉, 메스를 사용 하 여에 대 한 분리는 기본 부드러운 조직에서 피부 노출 자 궁 경부, 흉부, 요 추 척추 지역 나머지 다시 피부를 벗 겨 부드럽게 합니다. 무딘가 위의 쌍을 사용 하 여 두개골의 기지에서 절단 하 여 머리를 제거 합니다.</li>
	<li>척추의 앞쪽 측면에 연결 된 내장을 분리 하기 전에 갈비뼈를 병렬와 척추 양쪽에 가까이 잘라. 화관을 잘라 고는 화관의 수준에서 컷 통과 의해 척추 열을 제거 합니다. 아이리스가 위를 사용 하 여 모든 근육, 지방, 그리고 척추에서 다른 부드러운 조직 떨어져 잘라.</li>
	<li>등 쪽 면이 위로 향하도록 척추 열을 배치 하 고, 3 시 위치와 잘라 뼈에서 척추 운하로가 위의 1 개의 끝을 슬라이딩 하 여 꼬리 끝에서 시작. 9 시 위치에서 절차를 반복 합니다. 참고:는 DRG의 손상을 방지 하려면 센터에 정확 하 게 잘라 중요 하다.</li>
	<li>Rostral 끝에 도달 하 고 척수가 완전히 노출 될 때까지 사이드-투-사이드에서 절단을 반복 합니다. 해 부 현미경을 사용 하 여, 척추 신경, 척추 내 Drg를 찾는 데 사용 될 수 있는 노출 척수를 제거 합니다.</li>
	<li>부드럽게 잡아 당 겼 지 루트 다음 클리핑 신경 및 결합 조직 아이리스가 위는 Drg를 제거 하는 척추 운하에는 DRG를에 의해 허리 Drg를 제거 합니다. 참고: 가능 하다 L4-L6 DRG 컬렉션을 제한 하는 좌 골 신경에 기여 하고있다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 약 1 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 하는 1.5 mL 튜브에는 Drg를 전송 하 고 얼음에 저장 합니다. 참고: 신경 얼음에 하룻밤 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3입니다. 좌 골 신경 및 DRG의 소화
<ol><li>100 µ g/mL deoxyribonuclease, 그리고 얼음에 저장소의 보충 소화 미디어 (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, 1.6 mg/mL 콜라 유형 4)를 준비 합니다. 참고: 마우스 (좌 골 신경 + Drg) 당 필요한 소화 매체의 금액은 1 mL. 일단 준비, 소화 미디어의 aliquots-20 ° c.에 저장 될 수 있다</li>
	<li>좌 골 신경 및 Drg 한 마우스에서 소화 미디어의 500 µ L을 포함 하는 별도 1.5 mL 튜브에 전송. 좌 골 신경에 대 한 소재 봄이 위를 사용 하 여 15 ~ 20 조각으로 절단 하 고 부드러운 동요 (≤ 450 rpm)와 함께 20 분 동안 37 ° C에서 떨고 인큐베이터에서 조직 정지를 품 어.</li>
	<li>반복적으로 triturate 1000 µ L 피 펫 팁 어떤 불완전 소화 조직을 기계적으로 해리를 통해 세포 현 탁 액. 참고: 현 탁 액 적정 하기 어려운 경우 다음 잘라 피 펫 팁 만들 무뚝뚝한 끝을가 위로. 조직의 정지 부드러운 동요 (≤ 450 rpm)와 20 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>1000 µ L 피 펫 팁을 통해 분쇄를 반복 하 고 부드러운 동요 (≤ 450 rpm)와 함께 37 ° C에 추가 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>FACS 버퍼 PBS (보충 10 %FCS 및 1 mM EDTA)를 준비 하 고 얼음에 저장. 린스 하 고 60 x 15 mm 페 트리 접시에 얼음에에서 FACS 버퍼 140 µ m의 메쉬 크기 스테인리스 스틸 화면을 담근 다. 참고: nucleated 세포의 수율에 중대 한 손실을 리드 나일론 스크린 필터를 피해 야 한다.</li>
	<li>반복적으로 통과 조직 정지 140 µ m 스크린 필터로 그것은 얼음에 무딘 집게와 페 트리 접시에 개최 됩니다. 페 트리 접시에서 세포 현 탁 액을 수집 하 고 얼음에 저장 된 새로운 1.5 mL 튜브에 그것을 전송.</li>
	<li>1000 µ L 피 펫 팁 반복된 분쇄 하 여 통해 필터에 남아 있는 어떤 불완전 소화 조직을 밀어. FACS 버퍼의 500 µ L로 두 번 스크린 필터를 헹 구 고 단계 3.6에서에서 세포 현 탁 액 결합을 페 트리 접시에 결과 세포 현 탁 액을 수집 합니다. 참고: 사용 하는 교류 cytometer 파편에 민감한 경우에, 단계의 3.7 세포 현 탁 액 수 통과 70 µ m 스크린 필터; 그러나,이 nucleated 세포의 수확량에 손실이 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 셀 정지 원심 삭제는 상쾌한 고 FACS 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 한 번이 세 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>150-350 µ L의 FACS 버퍼, 얼룩의 수에 따라 필요한 (150 µ L FACS 버퍼 얼룩 패널 당)는에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
</ol>4. Cytometry에 대 한 좌 골 신경 및 붙일 레이블된 항 체와 DRG의 얼룩
<ol><li>얼음에 V 96 잘 접시에 모양으로 좌 골 신경 또는 DRG 세포 현 탁 액의 100 µ L를 전송. 참고: 단일 스테인드 셀은 그들은 광 전 증폭 관 관 (PMT) 전압 이득 및 보상, cytometry 구별에서 특정 도움말 설정 하기 위한 필요한 컨트롤을 제공 합니다 사용 하는 모든 항 체에 필요한 일반적인 바인딩입니다. 좌 골 신경 및 Drg에서 사용할 수 있는 제한 된 자료로 인해 혈액 백혈구 및 PCL (1.1-1.2 단계)에서 대 식 세포는 얼룩이 지는 단일 스테인드 컨트롤으로 사용할 수 있습니다 하는 좌 골의 얼룩과 병렬로 수행 해야에 대 한 신경 및 Drg 있습니다.</li>
	<li>수영장 나머지 정지 (약 50 µ L 샘플 당) 좌 골 신경 또는 흠 없는 컨트롤 역할을 DRG 샘플에서 세포.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 격판덮개 원심 위에 빈 접시를 반전 하는 손목의 날카로운 영화를 적용 하 여는 상쾌한을 삭제 하 고 부드럽게 건조 종이 타월에 누릅니다.</li>
	<li>표면 얼룩에 대 한 관심 (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5, MHC 클래스 II-Biotin)의 항 체를 포함 하는 FACS 버퍼의 20 µ L에서 각 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 품 어, 30 분 동안 얼음에 빛 으로부터 보호. 참고: (1) 최적 항 체 희석 결정된 전에 제조 업체의 제품 정보; 희석 시리즈를 수행 하 여 사용 해야 합니다. (2) 일반적인 stainings; 제조업체의 지침에 따라이 단계에서 Fc-블록 외피에 의해 감소 될 수 있다 그리고 (3) Isotype 제어 stainings는 일반적으로 필요 하지 않습니다는 fluorophore와 또는 관심의 antigen(s) 고유 인구 생산에 직접 활용 된 1 차 항 체를 사용 하는 경우.</li>
	<li>각 우물에 FACS 버퍼의 130 µ L을 추가 하 고 접시 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 이전 (4.3 단계)에 설명한 FACS 버퍼의 150 µ L로 두 번 셀 펠 릿을 세척으로 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 결합형된 기본 항 체 또는 비타민 b 복합체에 활용 된 1 차적인 항 체를 사용 하는 경우는 적절 한 보조 시 약, fluorophore에 활용 된이 시점에서 추가 될 수 있다 그리고 단계 4.4-4.5 반복 됩니다. 이 프로토콜의 경우 streptavidin-PE/Cy7 또는 Streptavidin PerCP MHC 종류 II 또는 CD68 APC와 함께 F4/80-PE/Cy7, CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5와 함께에서 각각 검출 하기 위하여 사용 되었다.</li>
	<li>마지막 세척 단계 후 고정을 위한 PBS (pH 7.4)에 4 %paraformaldehyde 100 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 10 분 동안 얼음에 플레이트를 품 어와 다음 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 앞에서 설명한 (4.3 단계)으로 상쾌한을 삭제 하 고 FACS 버퍼의 150 µ L 한번 셀 펠 릿을 세척. 주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 보호 장갑과 안경, 등등을 착용 하십시오. 참고: FACS 버퍼와 최대 2 일 동안 4 ° C에서 빛 으로부터 보호 저장소의 150 µ L에서 셀 펠 릿을 Resuspend. 세포내 얼룩이 지 하는 것이 필요한 경우 다음 단계로 진행 4.11 centrifuging 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 플레이트 후</li>
	<li>세포내 얼룩, FACS buffer+0.5% 세제, 150 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 15 분 분리기 400 x g에서 접시 4 ° c.에서 5 분에 대 한 빛에서 보호 하는 실 온에서 품 어 앞에서 설명한 (4.3 단계)으로 상쾌한 삭제 하 고 150 µ L FACS 버퍼 + 0.5% 세제로 한 번 셀 펠 릿을 세척. FACS buffer+0.5% 세제 (CD68-APC, CD206 PE)의 항 체를 포함 하는 20 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 품 어, 30 분 동안 실내 온도에 빛 으로부터 보호.</li>
	<li>각 우물에 FACS buffer+0.5% 세제의 130 µ L을 추가 하 고 접시 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 이전 (4.3 단계)에 설명한 FACS 버퍼 + 0.5% 세제의 150 µ L로 두 번 셀 펠 릿을 세척으로 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 결합형된 기본 항 체 또는 비타민 b 복합체에 활용 된 1 차적인 항 체를 사용 하 여 다음에 fluorophore를 활용 한 적절 한 보조 시 추가할 수 있습니다이 시점에서 그리고 단계 4.9-4.10 반복.</li>
	<li>최대 2 일 동안 4 ° C에서 빛 으로부터 보호 FACS 버퍼 + 0.5% 세제와 저장소, 150 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>Resuspend 셀 알 약 150 µ L FACS 버퍼 + 0.5% 세제 5 µ g/mL DAPI 보충 하 고 빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 5 분 동안 품 어. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g에서 격판덮개 원심 앞에서 설명한 상쾌한 (4.3 단계)를 삭제 합니다.</li>
	<li>PBS 및 레이블이 표시 된 FACs 튜브에 150 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 분석에 대 한 준비까지, 빛에서 보호 하는 실내 온도에 상점. 참고: PBS에 물의 resuspension, 후 셀 분석 되어야 합니다 시간, 이후는 DAPI 신호에서 손실에 지도 하는 DNA에서 해리 천천히 것입니다.</li>
</ol>5. 설치 Cytometry 및 샘플의 실행의
<ol><li>교류 cytometer는 적절 한 레이저를 갖추고 또는 필터 fluorophores 셀 얼룩에 사용을 측정 하기 위해 설정 확인 하십시오. 이 시스템에 기본 cytometer 구성에서 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우 셀 흐름 cytometer 3 레이저 장비를 사용 하 여 분석 했다 (405 nm, 488 nm와 633 nm) 5 fluorophores ≤의 검출에 대 한 허용.</li>
	<li>관심의 fluorophores의 검출에 대 한 적절 한 채널을 선택 합니다. 모든 형광 신호 로그 증폭 검색 잘 됩니다.</li>
	<li>샘플에 대 한 적절 한 유량을 선택 합니다. 이 매개 변수 사용 하는 시스템에 따라 다를 수 있습니다 그리고 실험적으로 결정 되어야 한다. 이 프로토콜의 경우 클럽 메 드-하-안녕 (35-60 µ L/min)의 흐름 속도 바늘의 막힘을 방지 하기 위해 사용 되었다.</li>
	<li>샘플 당 수집 될 이벤트/셀의 총 수를 선택 합니다. 최소 이벤트 수 1000000 이어야 한다입니다.</li>
	<li>점도의 SSC-대 전역 워크시트에서 만들 뿐 각 fluorophore FCS-. 대 관심의에 대 한 FSC-A 이벤트 및 선택한 fluorophores에 의미 한 형광 강도 (MFI)의 수를 표시 하는 통계 보기를 만듭니다.</li>
	<li>작은 셀 맞는 점도의 더 낮은 왼쪽된 10%에는 FSC와 SSC-A 채널의 전압을 설정 합니다. 결정 배경 형광 및 좌 골 신경 또는 Drg. 결정 부모 (P1) 게이트는 분산형 기반에서 흠 없는 컨트롤에서 최소 샘플 형광 DAPI 전용에서 플롯 컨트롤 얼룩. 참고:이 아니다 컬렉션 게이트 인해 부분적으로, 인구의 DAPI + PNS에서 이기종 자연.</li>
	<li>관심의 fluorophores의 각 플롯 FSC 분산형을 사용 하 여, 그들의 각각 점도 낮은 분기 속하는 흠 없는 컨트롤의 셀 전압을 조정 합니다. 빌 게이츠 다음 각각 마커/fluorophores의 각각에 대 한 긍정적인 그 셀을 정의 하기 위해이 지역 위에 만들어집니다. 게이트의 위치는 단일 스테인드 컨트롤 (단계 4.1)의 실행에 의해 확인 된다. 참고: 중복 방출 스펙트럼에 대 한 보상이 시점에서 수행 하거나 적절 한 분석 소프트웨어를 사용 하 여 소급 적용 될 수 있습니다.</li>
	<li>교류 cytometer 설정 되었습니다, 설명 된 대로, 일단 샘플을 실행할 수 있습니다.</li>
	<li>실행 후 나머지 샘플 자료를 삭제 될 수 있습니다 하 고 FCS 파일 추가 분석을 위해 내보낼 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는이 연구에 관한 관심의 없습니다 충돌 있다.

좌 골 신경 축 삭 주위 myelin의 콘텐츠로 인해 콜레스테롤 같은 지질의 큰 비율을 포함합니다. 온도와 지질의 속성 변경, 다른 온도에 다른 결과 얻을 수 있습니다. 셀 보존 되도록 소화 후이 프로토콜의 모든 단계는 얼음에 수행 했다. 일관성 결과의 재현성을 위해서 권장 하는 동안 그것은 3.6, 3.7 실 온에서 단계를 수행 하 여 수율을 높일 수 수 있습니다. 3.8 단계에서 신경 충분히 소화 하지 해야 하는 경우 메쉬에 신경의 작은 조각 볼 수 있을 것입니다. 부족 한 소화 시에 메쉬 소재 다시 소화 미디어 및 반복 단계 3.2-3.6 250 µ L을 포함 하는 새로운 1.5 mL 튜브에 전송 하 여 소화 될 수 있습니다. 경우 수율 이다 가난한 사람, 세포 현 탁 액의 샘플 trypan 블루와 가벼운 현미경 볼 수 메쉬 화면 (단계 3.6) 통과 후. 가능한, 비-블루, 셀 axons의 조각 막대 모양의 구조를 함께 표시 되어야 합니다. 실행 가능한 셀 경우 다음 소화 조건 및 재료의 잘못 된 전달 발생 했습니다 괴 ...

면역 세포는 순환에서 PNS를 입력 CD45 그리고 CD11b의 식에 의해 정의 된 대로 재생 및 변성1에서 두 역할을 신경의 무결성을 유지 도움이. 대 식 세포 (그들의 표현의 CD68 마우스에 의해 정의 된) 더 MHC를 표현 하는 염증 성 표현 형을 향해 왜곡 수 있습니다 클래스 II 및 CD86 (M1), 그들의 표면에 또는 항 염증 제 표현 형으로 표현 더 많은 세포내 CD206 (M2)2 . 대 식 세포 표현 형의 기울이기 Akt 신호3, 반사 체 (M1)에 대 한 방어에 대 식 세포 및 조직 재생 (M2)에서 역할의 다양 한 작업을 통해 규제 하는 역동적인 과정 이다. 손상 된 신경의 재생 먼저 신경4,5, 및 항 염증 세포 myelin 파편 식 균 작용 해야 (CD68+CD206+) M2 세포 축 삭 파생물에 홍보 보였다는 PNS6. PNS, 채용 또는 대 식 세포 감소 또는 먹어서 장애인된 능력 장애인된 재생 및 신경 무결성의 유지 관리 될 수 있습니다. 염증 성 m 1 대 식 세포, MHC 종류 II, 표현 M2 세포 보다 덜 먹어서 수 있으며 신경 염증은 여러 가지 신경 퇴행 성 질병7의 병 인에 연루.
신경 거주 면역 체계 손상 때문에 발생 하는 변화는 양적, CD45의 손실에 명시 수 있습니다+ 백혈구 (CD45의 침투를 증가 또는+ 경우 염증에 백혈구), 또는과 같은 질적 m 1 형 m 2에서 대 식 세포 표현 형의를 변경 합니다. PNS의 면역 세포는 전통적으로 냉동된 섹션 또는 파라핀 끼워 넣어진 소재8를 사용 하 여 IF를 사용 하 여 분석 되었습니다. 만약 관심의 세포의 지역화를 결정 하는 데 필요한. 그러나, 부 량 사용 하는 경우 종종 불안정 하 고 취약 선택 바이어스에 정량화를 만드는 조직의 좁은 부분에 셀의 상대적으로 작은 수를 계산에 의존 합니다. 면역 세포의 특정 하위 집합의 식별을 위해 세포 외 또는 세포내 표식의 동시 검출이 필요, 대 식 세포 표현 형의 결정은 적어도 두 개 이상 표시, 특히 CD206와 MHC를 필요 합니다 하는 동안 클래스 Ii입니다. 가장 일반적으로 사용 가능한 현미경 fluorescein isothiocyanate (FITC) 등 phycoerythrin (PE), 적어도 2 색상 채널에 제한 됩니다 경우 면역 세포의 특정 하위 집합의 특성 수 제한 하 고, 불완전 한 요구 얼룩이 고 병렬로 분석 필요 여러 슬라이드는 동일한 지역에서 파생. 이 시간이 많이 걸리는 측면은 따라서 하지 않습니다 필요한 큰 샘플 세트의 분석에 빌려. 또한, 관심의 표시의 대부분은 세포 외, 중 파라핀 또는 cryoconserved에 포함 되어, 조직에서 검출 수 막 무결성의 파괴와 epitopes, 마스킹의 손실 때문에 문제 아세톤과 메탄올9같은 용 매를 사용 하 여 관심의 항 원.
대조적으로, cytometry, 광학 측정 흐름 고 형광 특성에에서 단일 셀의 빛의 광선을 통과 제공 합니다 셀 인구의 분석을 위해 더 실용적이 고 포괄적인 의미. 셀의 상대적인 크기와 앞으로 분산형 (FSC), 복잡 한 단위/내부로 반사 인덱스를 포함 하는 매개 변수 설정된의 자동화 된 정량화를 제공 하는 조직의 디지털 이미지를 생산 하는 것 보다는 cytometry, 또는 측면 살포 (SSC), 그리고 상대 형광 강도 제공 하는 셀 활용 된 항 체와 같은 적절 한 fluorophore와 분류 되었습니다. 전형적인 교류 cytometer 이루어져 있다 2, 공 냉 식된 레이저; 488에서 푸른 빛을 생산 하는 아르곤 레이저 및 헬륨-네온 레이저 생산 633에 빛 nm. 이 조합은 최소 5 목표 표면에 또는 세포내 구획 내에서 동시에, 탐지 및 측정, 대 한 수 있습니다. 고급 흐름 cytometers 허용 한 번에 최대 8 개의 다른 형광의 탐지를 위해 선택 된 형광의 피크 방출 파장 크게 중복 되지 않도록 제공 하는 여러 레이저 구성할 수 있습니다.
Cytometry 분석, 대 한 관심의 조직 해야 합니다 먼저 수 효소 소화, 일반적으로 단일 세포 현 탁 액을 생성 하기 위해 콜라와 함께. 분석 murine 좌 골 신경의 이전 조직의 각 마우스에서 얻은 작은 금액으로 인해 어려운 되었습니다. 또한, 축 삭 주위 myelin의 고 지방 내용 셀 복구를 저해 하며 많은 양의 파편을 생성 합니다. 좌 골 신경 준비 및 소화에 대 한 여기에 설명 된 메서드 외. 여 자용 머리 핀 Schwann 세포 격리 프로토콜에서 적응 시켰다 7, 그리고 쥐 간의 편차를 줄이기 위해 충분 한 흐름 cytometry 분석에 대 한 개별 쥐의 신경 세포를 분리 하는 것을 목표로. DAPI를 사용 하 여 원시 조직 다이제스트에서 단일 세포의 식별에 대 한 축 삭 파편, 일반적으로 셀 손실에 이르게 제거할 필요가 circumvents. 셀의 출시에 세제-풍부한 버퍼 에이즈로 여러 번 세척 수확량 증가 지방 파편 안에서 갇혀. 이 프로토콜에 따라 단일 마우스에서 두 길이 좌 골 신경의 소화 ≥30, 000 단일 nucleated 이벤트를 생성 하 고 3 배 이상 그 숫자는 DRG에서 검색. CD45 비율+ 백혈구는 총 셀 내용 좌 골 신경 다이제스트 및 약의 약 5% DRG 다이제스트에서 5-10%. 대부분은 CD45의+ 좌 골 신경에 있는 세포 대 식 세포 마커, CD68 및 CD206을 표현.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>Charles River</td><td>C57BL/6NCrl</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (+1g/L 포도당, 글루타민, 피루브산염)</td><td>Thermo</td><td>31885023</td><td>이 물질의 출처는 중요하지 않습니다</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 유형 4</td><td>Worthington Biochemical Corp., US</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS004188 소 췌장에서 추출한 데옥시리보뉴클레아제(DNase) I</td><td>시그마-알드리치</td><td>DN25-1g</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청(FCS), 열 비활성화</td><td>시그마-알드리치</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>클론 M1/70</td></tr><tr><td>에 대한 항체MHC class II, biotinylated</td><td>Biolegend</td><td>107603</td><td>Clone M5/114.15.2</td></tr> 항체 <tr><td>CD45-A647</td><td>Biolegend</td><td>107603</td><td>Clone 30-F11</td></tr><tr><td>CD68-APC</td><td>Biolegend</td><td>137007</td><td>Clone FA/11</td></tr><tr><td>CD206-PE</td><td>Biolegend</td><td>141706</td><td>Clone C068C2</td></tr><tr><td>F4/80-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>에 대한 항체123113</td><td>클론 BM8</td></tr><tr><td>Streptavidin-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>405206</td><td>CD45-A647 및 CDllb-PerCP/Cy5.5로 MHCII-비오틴을 검출하는 데 사용</td></tr><tr><td>Streptavidin-PerCP</td><td>Biolegend</td><td>405213</td><td>CD68-APC 및 F4/80-PE/Cy7</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>로 MHCII-비오틴을 검출하는 데 사용됩니다.PBS에서 50배로 희석하고 4°C에서 보관하십시오. 어둠 속의 C</td></tr><tr><td>세포 해리 체 - 조직 분쇄기 키트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CD1</td><td></td></tr><tr><td>V-모양, 96웰 플레이트</td><td>Greiner/Sigma</td><td>M8185</td><td></td></tr><tr><td>5ml 폴리스트리엔 라운드 바닥 튜브, 12x75mm</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>60x15mm 페트리 접시</td><td>Greiner/Sigma</td><td>Z643084</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

단일 좌 골 신경 및 cytometry 사용 하 여 단일 마우스에서 지 루트 신경 절에 면역 세포의 분석

Analysis of Immune Cells in Single Sciatic Nerves and Dorsal Root Ganglion from a Single Mouse Using Flow Cytometry

말 초 신 경계 (PNS) 신경 상주 면역 세포는 건강 한 신경에 신경 원 완전성을 유지 하기 위해 필수적입니다. PNS의 면역 세포는 상해 및 질병, 신경 기능 재생 능력에 영향을 미치는 영향을. 신경 면역 세포 면역 형광 검사 (면)에 의해 일반적으로 분석 된다. 경우 경우 신경에 면역 세포의 위치를 결정 하기 위한 에센셜만 반 정량적 이며 방법은 동시에 분석할 수 있는 마커 수와 표면 식의도로 제한 하는 동안. 이 연구에서 cytometry 좌 골 신경이 나 개별 쥐의 지 루트 절 (Drg)에 백혈구 침투의 정량 분석을 위해 사용 되었다. 단일 세포 분석 DAPI를 사용 하 여 수행 하 고 여러 가지 단백질 동시에 표면 또는 세포내 식에 대 한 분석 했다. 이 프로토콜에 따라 치료 한 마우스에서 두 좌 골 신경 ≥ 30000 단일 nucleated 이벤트 생성. 좌 골 신경, CD45의 식에 의해 결정에 백혈구의 비율이 전체 셀 내용 좌 골 신경에서의 5%와 대략 5-10%는 DRG에 약 했다. 하지만이 프로토콜 PNS 내 면역 세포 인구에 주로 초점을 맞추고, cytometry 마커 수를 동시에 측정 하의 유연성 즉 신경, Schwann 세포, pericytes 등 내의 다른 세포 인구 섬유 아 세포와 내 피 세포, 또한 분석 될 수 있다이 방법을 사용 하 여. 따라서이 메서드는 PNS, neurotoxicology 등 신경 병 또는 당뇨병 같은 만성 질환에서 유전자 모델에 조직의 효과 공부에 대 한 새로운 의미를 제공 합니다.

전체 길이 좌 골 신경 및 모든 주요 DRG에서 셀 정지 했다 6 건강 한 C57BL/6 마우스에서 프로토콜에 따라 준비 하 고 얼룩에 대 한 3 개의 동등한 aliquots로 분할. DAPI, DNA, 얼룩과 얼룩 카운터 단일 셀 인구 (그림 1A-B, 상단 패널)의 검출에 대 한 수 있습니다. DAPI cytometry, 분석 이전에 밖으로 세척 단일 nucleated 이벤트 또는 singlets의 FSC 축에는 이산의 선택에 대 한 수 비 nucleated 파편의 형광 강도 정도로 감소. 아니 컬렉션 게이트는 PNS에서 singlets는 FSC의 큰 범위와 SSC (그림 1C)를 통해 배포 됩니다 적용 됩니다. 불완전 하 게 포함 된 FSC 축의 높은 끝에 자료 조직 소화, 내의 인구 (<strong...

정량 분석 murine 좌 골 신경 내에서 셀 내용의 조직의 부족으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜 조직 소화와 개별 쥐의 신경에서 면역 세포 인구의 흐름 cytometry 분석에 대 한 충분 한 세포를 제공 하는 준비 하는 방법을 설명 합니다.

단일 좌 골 신경 및 Cytometry 사용 하 여 단일 마우스에서 지 루트 신경 절에 면역 세포의 분석

Nerve-resident immune cells in the peripheral nervous system (PNS) are essential to maintaining neuronal integrity in a healthy nerve. The immune cells of ...

이 절차의 전반적인 목표는 개별 마우스에서 등뿌리 신경절과 좌골 신경에서 충분한 세포를 얻어 세포의 유세포 분석을 수행할 수 있도록 하는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 말초 신경 물질이 소화될 때 많은 양의 파편을 생성하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 주요 장점은 여러 마커를 동시에 사용하여 여러 세포 유형을 식별할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 신경병증 중 염증 및 면역병리학 진단으로 확장됩니다. 이 방법은 쥐 모델에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 약간의 수정으로 인간 및 돼지 신경과 같은 다른 유기체에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 소화에 의해 생성되는 많은 양의 파편으로 인해 어려움을 겪을 것입니다.이 방법의 시각적 시연은 마우스당 신경 세포의 재료가 제한되어 있기 때문에 해부 및 세포 해리 단계를 수행하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 우리는 Steve Lacroix의 실험실에서 좌골 신경에서 백조 세포를 분리하는 프로토콜을 보았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스를 준비하고 아래쪽 다리를 쭉 뻗으면서 복부 쪽이 아래로 향하도록 배치합니다.다음으로, 한 쌍의 집게를 사용하여 전체 좌골 신경을 양측으로 절개합니다. 먼저 등쪽 허벅지 위쪽에서 근육 조직을 분리하고 척추를 따라 신경을 따라 올라갑니다. 척추에서 나오는 신경과 다른 쪽 끝의 무릎 바로 위에 있는 신경을 절단합니다.그런 다음 절제된 신경을 1.5ml의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 1ml 튜브로 옮깁니다. 얼음 위에 신경을 보관하십시오. 다음으로, 등뿌리 신경절을 분리합니다.갈비뼈를 양쪽의 척추와 평행하고 가깝게 자르는 것으로 시작합니다. 그런 다음 뒤쪽의 대퇴골 수준에서 척추를 가로로 자르고 앞쪽의 두개골에 가깝게 자릅니다. 척추를 제거하고 홍채 가위를 사용하여 척추의 모든 근육, 지방 및 기타 연조직을 잘라냅니다.다음으로, 배쪽이 위를 향하도록 척추를 놓고 꼬리 끝부터 시작하여 가위의 한쪽 끝을 12시 방향의 척추관에 밀어 넣고 뼈를 잘라 엽니다. 척추 전체가 절단될 때까지 진행하고 척추가 반으로 자랄 때까지 6시 위치에서 이 절차를 반복합니다. 척추의 두 반쪽을 분리한 다음 샘플을 해부 현미경 아래에 놓습니다.척수를 제거하여 척추 신경을 노출시킨 다음, 등쪽 뿌리를 부드럽게 잡아

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

현재 문서는 효율적으로 효과적으로 흐름 cytometric 분석을 위해 활용할 수 뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

이 비디오는 쥐의 뇌 조직에서 면역 세포의 단세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여줍니다. 여기에는 뇌 조직에서 세포를 분리하기 위한 효소 소화와 밀도 구배 원심분리를 포함하여 밀도에 따라 면역 세포를 분리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

쥐 뇌 조직에서 면역 세포의 단세포 현탁액 준비

출처: Hidmark, A. S., et al. 유세포 분석을 이용한 단일 마우스 좌골 신경 및 배근 신경절의 면역 세포 분석. J. Vis. 특급{{TAG_ 27}} (2017).  이 비디오는 마우스 좌골 신경과 등쪽 뿌리 신경절(DRG)의 면역 세포를 분석하기 위해 유세포 분석을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로세스에는 형광단 및 비오틴 태그가 지정된 항체로 면역 세포를 라벨링하고, 세포를 안정화 및 투과화하고, 형광 마커를 사용하여 세포 표면 및 핵 특성을 감지하는 작업이 포함됩니다. 이 기술을 사용하면 신경 조직에서 면역 세포의 이질성을 정량적으로 평가할 수 있습니다.

유세포 분석을 사용한 마우스 신경 조직의 면역 세포 분석

염증은 허혈성 뇌졸중의 발병기전에서 중심적인 역할을 합니다. 점점 더 많은 증거에 따르면 그것은 초기 뇌 손상을 악화시키는 양날의 검으로 작용하지만 나중에 회복하는 데에도 기여합니다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌에서 면역 세포를 분리하고 그에 따른 유세포 분석 표현형을 설명합니다.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

이 프로토콜은 유행 세포 계측법에 의한 성체 마우스 중추 신경계에서 대 식세포 모집단의 분석을 제공하며, 이들 세포에 의해 표현되는 다중 마커의 연구에 도움이됩니다.

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

여기, 선물이 murine thymus, 림프절, 비장 추가 연구를 cytometry를 사용 하 여 이러한 셀을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하는 프로토콜. 또한,이 프로토콜 cytometry 사용 규제 T 세포의 하위 집합을 결정 하는 데 사용 되었다.

Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

여기에서, 우리는 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 교압 조직 내의 엑스트라 세포 염색 분석체를 모두 사용하여 단세포/대식세포 및 T 세포 하위 세트를 식별하기 위해 상세하고 재현 가능한 유동 세포 측정 프로토콜을 설명하며, 골관절염의 확립된 수술 모델을 활용합니다.

골관절염 모델에서 뮤린 비장, 골수, 림프절 및 치압 조직 내의 면역 세포 하위 집합의 흐름 세포 분석

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

뇌 질환에 대한 면역 반응을 조사하기 위한 한 가지 일반적인 접근법은 면역 세포의 변화를 분석하는 것입니다. 여기에서는 쥐 뇌 조직과 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하기 위한 두 가지 간단하고 효과적인 프로토콜이 제공됩니다.

생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리

손상된 척수에서 미세아교세포(MG)와 말초 침투 대식세포(Mø)를 식별하는 것은 어렵습니다. 이 프로토콜에서는 유세포 분석법(FCM)을 사용하여 각각 M1-like MG, M2-like MG, M1-like Mø 및 M2-like Mø를 식별했습니다. 이 기술은 MG와 Mø의 역할을 이해하기 위해 다른 중추 신경계 질환에도 적용될 수 있습니다.

유세포분석을 사용하여 손상된 척수에서 미세아교세포(microglia) 및 말초 침투 대식세포(peripheral infiltrating macrophages in the injured spinal cords) 확인

이 프로토콜은 유세포 분석과 단일 세포 RNA 시퀀싱을 결합하여 출생 후 초기 마우스 뇌의 소뇌에서 미세아교세포 상태를 분리하고 특성화합니다. 효소 해리, Percoll 원심분리 및 면역염색을 사용하여 미세아교세포의 이질성을 밝히고 소뇌 발달 및 질병에서의 역할에 대한 이해를 향상시킵니다.

출생 후 초기 마우스 뇌 발달에서 미세아교세포 활성화를 특성화하기 위한 유세포 분석 및 단일 세포 분석

학습하세요 마우스 좌골신경과 척수후근신경절에서 면역세포를 분리하는 흐름세포분석법을. 이 방법은 신경염증 및 면역병리 연구에 활용됩니다.

단일 좌 골 신경 및 Cytometry 사용 하 여 단일 마우스에서 지 루트 신경 절에 면역 세포의 분석

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