단일 좌 골 신경 및 Cytometry 사용 하 여 단일 마우스에서 지 루트 신경 절에 면역 세포의 분석

이 절차의 전반적인 목표는 개별 마우스에서 등뿌리 신경절과 좌골 신경에서 충분한 세포를 얻어 세포의 유세포 분석을 수행할 수 있도록 하는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 말초 신경 물질이 소화될 때 많은 양의 파편을 생성하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 주요 장점은 여러 마커를 동시에 사용하여 여러 세포 유형을 식별할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 신경병증 중 염증 및 면역병리학 진단으로 확장됩니다. 이 방법은 쥐 모델에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 약간의 수정으로 인간 및 돼지 신경과 같은 다른 유기체에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 소화에 의해 생성되는 많은 양의 파편으로 인해 어려움을 겪을 것입니다.

이 방법의 시각적 시연은 마우스당 신경 세포의 재료가 제한되어 있기 때문에 해부 및 세포 해리 단계를 수행하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 우리는 Steve Lacroix의 실험실에서 좌골 신경에서 백조 세포를 분리하는 프로토콜을 보았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스를 준비하고 아래쪽 다리를 쭉 뻗으면서 복부 쪽이 아래로 향하도록 배치합니다.

다음으로, 한 쌍의 집게를 사용하여 전체 좌골 신경을 양측으로 절개합니다. 먼저 등쪽 허벅지 위쪽에서 근육 조직을 분리하고 척추를 따라 신경을 따라 올라갑니다. 척추에서 나오는 신경과 다른 쪽 끝의 무릎 바로 위에 있는 신경을 절단합니다.

그런 다음 절제된 신경을 1.5ml의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 1ml 튜브로 옮깁니다. 얼음 위에 신경을 보관하십시오. 다음으로, 등뿌리 신경절을 분리합니다.

갈비뼈를 양쪽의 척추와 평행하고 가깝게 자르는 것으로 시작합니다. 그런 다음 뒤쪽의 대퇴골 수준에서 척추를 가로로 자르고 앞쪽의 두개골에 가깝게 자릅니다. 척추를 제거하고 홍채 가위를 사용하여 척추의 모든 근육, 지방 및 기타 연조직을 잘라냅니다.

다음으로, 배쪽이 위를 향하도록 척추를 놓고 꼬리 끝부터 시작하여 가위의 한쪽 끝을 12시 방향의 척추관에 밀어 넣고 뼈를 잘라 엽니다. 척추 전체가 절단될 때까지 진행하고 척추가 반으로 자랄 때까지 6시 위치에서 이 절차를 반복합니다. 척추의 두 반쪽을 분리한 다음 샘플을 해부 현미경 아래에 놓습니다.

척수를 제거하여 척추 신경을 노출시킨 다음, 등쪽 뿌리를 부드럽게 잡아당겨 척추관으로 당겨 요추 등쪽 뿌리 신경절을 찾아 제거합니다. 다음으로, 홍채 가위를 사용하여 등뿌리 신경절 주변의 신경과 결합 조직을 클립합니다. 겸자를 사용하여 등뿌리 신경절을 1.5ml 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관합니다.

등뿌리 신경절의 위치를 파악하고, 손상시키지 않고 추출하고, 척추 신경에서 벗어나게 하려면 운동과 기술이 필요합니다. 소화 매체를 준비하고 밀리리터당 100마이크로그램의 디옥시리보뉴클레아제를 보충하고 얼음에 보관하십시오. 그런 다음 500마이크로리터의 소화 매체를 좌골 신경과 등뿌리 신경절이 있는 각 튜브에 추가합니다.

좌골 신경의 경우 스프링 가위를 사용하여 재료를 15-20회 자른 다음 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터에서 20분 동안 부드러운 교반으로 조직 현탁액을 배양합니다. 배양 후 1, 000 마이크로리터 피펫 팁을 통해 세포 현탁액을 반복적으로 분쇄하여 불완전하게 소화된 조직을 기계적으로 해리합니다. 1, 000 마이크로 리터 피펫 팁을 통해 분쇄를 반복합니다.

그런 다음 부드러운 교반으로 섭씨 37도에서 추가로 10분 동안 샘플을 배양합니다. 얼음처럼 차가운 FACS 버퍼를 준비하고 이를 사용하여 얼음 위의 60mm 페트리 접시에 140미크론의 메쉬 크기의 스테인리스 스틸 스크린을 헹구고 담그는 데 사용합니다. 그런 다음 뭉툭한 집게를 사용하여 140미크론 스크린 필터를 페트리 접시 위에 잡고 조직 현탁액을 필터를 통해 반복적으로 통과시킵니다.

페트리 접시에서 세포 현탁액을 수집하여 얼음에 보관된 동일한 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 필터에 남아 있는 불완전하게 소화된 조직을 1, 000 마이크로리터 피펫 팁으로 반복적인 분쇄로 밀어 넣습니다. 그런 다음 스크린 필터를 500마이크로리터의 FACS 버퍼로 두 번 헹구고 1.5ml 튜브의 셀 현탁액과 결합합니다.

너무 많은 샘플이 불완전하게 분해되어 금속 메쉬를 통과하면 세포 손실이 발생할 수 있으며 유세포 분석이 불가능할 수 있습니다. 세포 현탁액을 원심분리하고 상층액을 버립니다. 그런 다음 세포 펠릿을 1ml의 FACS 버퍼에 다시 현탁시킵니다.

이 세척 단계를 한 번 반복하여 최종 세포 펠릿을 150-350마이크로리터의 FACS 완충액에 다시 현탁시킵니다. 이제 세포를 염색할 준비가 되었습니다. 컴퓨터에서 관심 형광단을 검출하기 위한 적절한 채널, 샘플의 적절한 유속 및 샘플당 수집할 총 이벤트 수를 선택합니다.

최소 이벤트 수는 100만 개여야 합니다. 다음으로, 측면 산란 A 대 전방 산란 A, 관심 있는 각 형광단과 전방 산란 A에 대한 글로벌 워크시트 아래에 산점도를 만듭니다.또한 선택한 형광단에 대한 이벤트 수와 평균 형광 강도를 표시하는 통계 보기를 만듭니다. DAPI 전용 염색 대조군의 산점도를 기반으로 상위 게이트 P1을 결정합니다.

샘플을 유세포분석에 첨부하고 acquire를 클릭합니다. DAPI 대 FSC 플롯을 관찰하고 DAPI+집단이 보일 때까지 DNA 태평양 청색 채널의 전압을 줄입니다. 사각형 게이팅 도구를 사용하여 DAPI+인구 주위에 상자를 그립니다.

이것은 P1 게이트를 나타냅니다. 각 형광단에 대한 산점도를 선택하고 DAPI+events만 표시합니다. 이것은 각 형광단에 대한 배경 형광을 나타냅니다.

사각형 게이팅도 사용하여 y축의 103에서 시작하여 각 형광단에 대한 산점도에 상자를 그립니다. 이 게이트는 명시된 각 마커에 대한 긍정적 인 이벤트를 찾아야하는 영역을 나타냅니다. DAPI 전용 염색 컨트롤을 사용하여 각 형광단의 전압을 조정합니다.

샘플을 유세포분석에 첨부하고 acquire를 클릭합니다. 각 형광단에 대한 DAPI+개체군의 위치를 관찰하고 개체군이 사각형 게이트 밖으로 떨어지도록 해당 전압을 조정합니다. 유세포 분석기가 설정되면 샘플을 실행하고 추가 분석을 위해 Forward Scatter 파일을 내보냅니다.

유세포 분석법에 의한 분석 전에 DAPI 염색을 세척하면 비핵 파편의 형광 강도가 감소했습니다. 이를 통해 불완전하게 소화된 조직을 포함하는 Forward Scatter 축의 상한선에 있는 물질이 singlet 집단의 선택에서 제외될 수 있었습니다. 전반적으로, 30 이상, 000 싱글릿은 2개의 가득 차있는 좌골 신경에서 정기적으로 얻어질 수 있고 200 이상, 000 싱글릿은 등뿌리 신경절에서 얻어질 수 있다.

좌골 신경에서 약 5%의 싱글릿이 표면에 CD45를 발현하는 반면, 약 5%에서 10%는 배근 신경절에서 CD45를 발현하는 것으로 밝혀져 이러한 세포를 조혈 기원의 백혈구로 정의했습니다. CD45 양성 싱글렛의 대다수는 또한 MHC 클래스 II를 점진적으로 발현했습니다. 그러나 등뿌리 신경절에서 CD11b는 미세아교세포와 같은 세포를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 이 미세아교세포 집단은 좌골 신경에 없습니다.

좌골신경과 등뿌리신경절에서는 단식신경절의 2%에서 5%가 CD68을 발현하였다. 좌골 신경에서는 CD68 양성 대식세포의 약 60%80%가 CD206을 발현했습니다. CD68 양성의 더 적은 비율이 배근 신경절에서 CD206을 동시 발현했습니다.

이 절차를 수행하는 동안 일관된 결과를 보장하기 위해 일관된 온도를 유지하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술을 통해 당뇨병 분야의 연구자들은 생쥐에서 당뇨병을 유발하는 데 사용되는 스트렙토조토신의 독성 효과를 탐구할 수 있었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 말초 신경 조직에서 유세포 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

파라포름알데히드로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 항상 장갑과 보안경을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.