Name: 시 냅 스 아연 Histochemistry 다른 지역과 개발 및 성인 두뇌에서 하기의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 배우세요 시냅스 아연 히스토화학법을 이용하여 족제비 뇌 조직에서 발달 및 성인 뇌의 다양한 영역과 층을 구분하는 방법을 연구하세요. 이 기술은 신경과학 연구에서 신경세포 분포를 정확히 식별하는 데 활용됩니다.

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이 작품 연구 자원 (2G12RR03060-26A1);에 대 한 국립 센터에서 교부 금에 의해 지원 되었다 소수 민족 건강과 건강 격차 (8G12MD007603-27) 건강; 국립 보건원에서 국립 연구소 뉴욕 (CUNY PSC);의 전문 직원 의회 도시 대학 그리고 교수 연구 그랜트 (FRG II) 아메리칸 대학의 샤. 우리는 이러한 방법에 우리를 도입에 대 한 Vidyasagar Sriramoju 감사 합니다.

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<li>Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dithizone%2C+Timm%27s+sulphide+silver+and+the+selenium+methods+demonstrate+a+chelatable+pool+of+zinc+in+CNS%3A+a+proton+activation+%28PIXE%29+analysis+of+carbon+tetrachloride+extracts+from+rat+brains+and+spinal+cords+intravitall+treated+with+dithizone%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone.</a> Histochemistry. 83, 419-422 (1985).</li>
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<li>Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Areal+organization+of+the+posterior+parietal+cortex+of+the+ferret+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

현재 연구는 Danscher (1982) 방법10, 시 냅 스 아연 지역화를 감지 하 고 뇌에서 시각 수 있습니다 그것에 의하여의 수정된 된 버전에 따라 조직화 학적인 기술을 사용 합니다. 이 메서드는 기본적으로 아연 chelator 나트륨 selenite (나2서구3)를 가진 동물 (15 mg/kg)를 주입 하 여 작동 합니다. 주입, 따라는 selenite 두뇌에 여행 하 고 아연을 포함 하는 신경의 연 접 소포를 지역화 된 무료 아연을 바인딩합니다. 아연 이온 분자 내의 시 냅 스 소포 침전에 있으며 실제 개발2,11이후에 구상 될 수 있다. 원래 Timm의 황화는 방법 얼룩 검사 및 다양 한 생물 학적 조직22Au, Ag, Pt, Fe, Cd, Cu, Ni, 및 Zn 등 금속을 시각화 하기 위한...

조직학 얼룩 전통적으로 건축 술 기능에 차이 공개 하 여 다양 한 종에서 대뇌 피 질의 영역 식별에서 돕기 위해 사용 되었습니다. 그들은 두뇌의 비슷한 면적 경계 공개 Nissl 물질, 시 토 크롬 산화 효소 (CO) 반응, 또는 수 초 같은 조직화 학적인 기술 사용 유익한 증명할 수 있다. 그러나, 이러한 조직화 학적인 얼룩 대뇌 피 질의 영역 및 미 성숙한 뇌에 레이어 사이의 명확한 경계를 항상 적절 하 게 공개 하지 않습니다.
중앙 신 경계, 아연에는 효소 공동 인자, 다양 한 규제 기능에 참여 하 고 시 냅 스 소포에 그것의 존재를 통해 neuromodulator 역할 역할 DNA 구조 안정화를 포함 하는 몇 가지 중요 한 기능 1. 시 냅 스 아연은 독특한 그것은 구상 될 수 있다 조직학 방법 반면 단백질 바인딩 아연 시각된2수 없습니다. 이 기능은 다른 대뇌 피 질의 영역에 시 냅 스 아연 패턴을 이용 되 고 시 냅 스 아연 histochemistry 연구의 숫자에 사용 되었습니다. 대뇌 피 질 신경 세포 glutamatergic의 하위 집합 포함 그들의 축 삭 맨끝3,4내 연 접 소포에 아연. 조직화 학적인 연구는 대뇌 피 질5,,67에서 시 냅 스 아연의 다른 유형의 분포를 계시 했다. 다른 대뇌 피 질의 영역 (예를 들어, 시각적 somatosensory 피 대), 또는 레이어 histochemically 반응 아연의 다른 영역 및 층 류 분포 나타납니다 (예를 들어,는 supragranular에 있는 아연 수준 및 기본 시각 피 질 infragranular 레이어는 상대적으로 낮은 시 냅 스 아연 레벨 thalamocortical 입력 계층 4 보다 실질적으로 더 높은)5,,89. 면적 및 층 류 식별을 용이 하 게 하는으로 시 냅 스 아연 피 질에 얼룩에 특히 유리 하다.
여기 우리는 Danscher의 1982 메서드10의 수정된 된 버전은 시 냅 스 아연 조직화 학적인 절차에 대 한 자세한 설명을 제시. 이 메서드는 chelating 에이전트로 동물에 selenite intraperitoneally 주입 (IP)를 사용합니다. selenite 두뇌 glutamatergic 시 냅 스의 부분 집합의 소포에 있는 자유로운 아연의 수영장으로 반응 하는 뇌에 여행. 이 반응은 실버 개발2,,1011이후 강화 될 수 있다 침전을 생성 합니다.
이 절차 시 냅 스 아연 얼룩;의 층 류 영역 패턴을 보여준다 densitometric 분석은 성인과 미 성숙한 뇌의 감각, 환경, 약물, 또는 유전자 조작 같은 다른 개입의 효과 연구에서 이러한 패턴을 질적 및 양적 평가를 사용할 수 있습니다. 또한, 하나 또한 다른 모델 시스템에 다른 피 질 또는 subcortical 구조에서 시 냅 스 아연의 분포에 잠재적인 발달 변화를 평가 하 고 있습니다. Densitometric 분석이 메서드에서 제공 하는 양적 정보는 시간이 지남에 따라 다음 두뇌 개발을 위한 유리한 될 수 있습니다. 이 프로토콜을 다른 면역-조직화 학적인 마커 동반자를 층 류 및 영역 경계를 표시를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>Euthasol (안락사 용액)</td><td>Henry Schein</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>셀렌산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>케타민 (케타베드)</td><td>Henry Schein</td><td>48858</td><td>100 mg/ml 주사제</td></tr><tr><td>자일라진(Anased)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td>100 mg/ml 주사제</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>F8775</td><td>희석 4%</td></tr><tr><td>껌 아라비아</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>G9752-500G</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>구연산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>하이드로퀴논</td><td>시그마-알드리치</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>은 젖산염</td><td>시그마-알드리치</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>생선 젤라틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>사이토크롬 c</td><td>시그마-알드리치</td><td>C2506</td><td>(유형 III, 말 심장에서)</td></tr><tr><td>카탈세</td><td>시그마-알드리치</td><td>C10</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>도미노</td><td></td><td></td></tr><tr><td>자일렌</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>퍼마운트</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A406-20</td><td>슬라이드 장착 전 탈수에 사용</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3660-1</td><td></td></tr><tr><td>Frosted unsubbed 슬라이드</td><td>Brain Research Laboratories</td><td>#3875-FR</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>American Optical Company</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX-60</td><td></td></tr><tr><td>Adope Photoshop</td><td>Adobe Systems, San Jose, CA</td><td></td><td>이미지를 조합하려면</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>무료 소프트웨어를 http://rsb.info.nih.gov/ij/</td><td></td> 에서 다운로드할 수 있습니다. 치<td>도 측정의 경우</td></tr><tr><td>플라스틱 트레이</td><td>모든 표준 플라스틱 트레이를 사용하여</td><td></td><td>슬라이드를 현상액 핫 플레이트에 담글</td>수</tr> 있습니다. 모든 <tr><td></td><td>표준 핫 플레이트를 사용할</td><td></td><td></td> 수 있습니다</tr></tbody></table>.

시 냅 스 아연 histochemistry 다른 지역과 개발 및 성인 두뇌에서 하기의 사용

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

해 부 학적 및 기능적 뇌 조직 및 개발의 고유한 신경 회로 지역 미 숙 하 고 성인 두뇌의 정확한 식별을 필요합니다. 여기는 다른 레이어 및 두뇌 영역 중에서 얼룩 패턴에 차이 밝혀 아연 조직화 학적인 얼룩 절차에 설명 합니다. 다른 사람을 아연 포함 된 신경 및 두뇌에서 회로의 분포 뿐만 아니라 성공적으로 여러 종에서 개발 및 성인 두뇌에 있는 영역 및 박판 모양 경계 윤곽을 그리 다이 절차를 활용 했습니다. 여기 우리가 설명이 절차 개발에서 이미지와 함께 얼룩 및 성인 흰 족제비 두뇌. 우리는 아연 얼룩 패턴 영역과 레이어의 해 부 감 적 역할을 계시 하 고 개발 및 성인 시각 피 질에서 시각 피 질 영역을 구별 하 안정적으로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 레이어 및 지역 개발 및 성인 두뇌 그렇게 할 다른 방법이 실패 하는 곳에서 정확한 식별 수 있도록 조직화 학적인 방법을 제시 하는. Secondarily, densitometric 이미지 분석 함께,이 방법을 하나 수 있습니다 개발을 통해 잠재적인 변화를 공개 시 냅 스 아연의 분포를 평가 하. 시 약, 도구, 및 연속적으로 냉동된 뇌 섹션 얼룩 필요한 단계가이 프로토콜은 자세하게에서 설명 합니다. 하지만이 프로토콜 사용 하 여 흰 족제비 뇌 조직의 설명, 그것은 쉽게 설치류, 고양이, 또는 다른 뇌 영역에서 뿐만 아니라 원숭이에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.

뇌 시 냅 스 아연에 대 한 섹션을 얼룩이 프로토콜에 관련 된 주요 단계는 그림 1의 순서도에 표시 됩니다. 프로토콜은 3 단계로 분할 될 수 있다: 1) 관류 및 조직 수집, 2) 조직 준비와 얼룩, 및 3) 아연 histochemistry. 간단히, 프로토콜의 첫 번째 단계 동물 마 취는 고 나트륨 selenite의 적절 한 복용량과 함께 IP를 주입. 기간 후에 충분 한 시간 (이상적으로 60-90 분), 동물은 이후 안락사, 0.9 %NaCl 솔루션 4 %paraformaldehyde 솔루션 다음 끼얹는다. 머리 참 하 고 두뇌는 두개골에서 신속 하 게 제거 된다. 두뇌 다음 4 %paraformaldehyde 플러스 cryoprotectant로 30% 자당 해결책에 싱크대 수 있습니다. 프로토콜의 두 번째 단계에서 냉동된 섹션은 40 µ m에서 슬라이딩 톰에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)로 잘라내어 번호...

우리는 서로 다른 뇌 영역에 패턴을 얼룩이 지기 특성 박판 모양 및 면적 아연을 조직화 학적인 절차를 설명 합니다. 아연 얼룩 패턴 함께에서 다른 해 부 마커와 레이어 및 지역 개발 및 성인 두뇌에서 안정적으로 구별 하 사용할 수 있습니다.

시 냅 스 아연 Histochemistry 다른 지역과 개발 및 성인 두뇌에서 하기의 사용

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

이 방법의 전반적인 목표는 발달 중인 뇌와 성인 뇌의 다양한 영역과 층을 구별하는 데 시냅스 아연 염색 패턴의 활용을 설명하기 위해 페럿 동결 뇌 절편에 조직화학적 염색을 수행하는 것입니다. 이 방법은 서로 다른 뇌 영역과 층 간의 시냅스 아연 염색 패턴의 질적 및 양적 차이와 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 가장 큰 장점은 이 기술이 간단하고 신뢰할 수 있어 고유한 염색 패턴을 기반으로 발달 중인 성인 뇌의 다양한 영역과 층을 식별할 수 있다는 것입니다.이 방법은 야생 시각 피질의 영역과 층을 구분하는 데 통찰력을 제공하는 데 사용되었지만 설치류, 고양이 또는 영장류의 다른 뇌 영역에 있는 층을 구별하는 데에도 사용할 수 있습니다. 200ml의 개발자 용액을 준비하려면 뜨거운 물 120ml에 아라비아 고무 40g을 천천히 넣고 유리 막대로 계속 저어 완전히 녹입니다. 그런 다음 몇 분 동안 식힌 다음 깔때기에 있는 6-8겹의 거즈 천으로 걸러냅니다.다음으로 증류수 20ml에 구연산 5.04g과 구연산나트륨 4.7g을 넣고 용해시켜 구연산염 완충액을 만듭니다. 그런 다음 가열된 증류수 30ml에 하이드로퀴논 1.7g을 추가합니다. 물 30ml에 0.22g의 젖산을 첨가하여 젖산은 용액을 만듭니다.다음 순서로 아라비아 고무, 시트르산 완충액, 하이드로퀴논, 마지막으로 젖산은 용액을 혼합하여 현상액을 준비하고 어두운 곳에 보관합니다. 이 절차를 시작하려면 아연 킬레이터인 아셀렌산나트륨 용액(체중 1kg당 15mg)을 마취된 페럿에 복강내 주사합니다. 그런 다음 아셀렌산나트륨 용액이 뇌에 도달할 때까지 60-90분 동안 기다립니다.그런 다음 킬로그램당 100mg의 페노바르비탈을 복강내 과다 투여하여 동물을 안락사시키고 유타솔이 작용할 때까지 몇 분 동안 기다립니다. 안락사된 페럿에 대해 먼저 일반 식염수로 1분 동안 심간 관류를 수행한 다음 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 수행합니다. 그런 다음 자당이 함유된 정착제를 사용하여 1시간 안에 전체 고정 절차를 완료합니다.메스를 사용하여 코에서 시작하여 목까지 정중선을 절개하여 두개골을 노출시킵니다. 뇌를 섬세하게 제거한 다음 메스 날을 사용하여 반구를 분리합니다. 그런 다음 뇌의 뒤쪽 부분을 잘라 뇌의 나머지 부분과 분리하고 2-4시간 동안 후수정을 합니다.0.1 몰 인산염 완충액에 30% 자당 용액에 조직을 유지하여 뇌를 가라앉히십시오. 뇌가

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

기록 칼슘 활동을위한 칼슘 표시기 염료와 subventricular 영역 (SVZ) 세포를로드 할 방법이 설명되어 있습니다. 출생 후의 SVZ는 신경 전구 세포와 neuroblasts 포함 단단히 포장 세포가 포함되어 있습니다. 오히려 목욕로드를 사용하는 것보다 우리가 더 나은 염료 확산을 허용 조직 내부의 압력에 의해 염료를 주입했다.

칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성

출처: McLeod, F., et al. 해마 설치류 뇌 절편의 시냅스 밀도 평가. J. Vis. 특급 (2017). 이 비디오는 컨포칼 면역형광 분석을 사용하여 해마 뇌 절편에서 시냅스 마커를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 슬라이스는 시냅스전 및 시냅스후 마커를 표적으로 하는 1차 항체로 면역 염색된 후 형광단 접합 2차 항체로 면역 염색됩니다. 그런 다음 표지된 마커는 공초점 현미경을 사용하여 시각화하여 공동 국소화를 통해 시냅스 구조를 평가합니다.

면역형광을 이용한 마우스 해마 절편의 시냅스 현미경 분석

우리는 zebrafish의 배아에서 MAUTHNER 뉴런과 다른 reticulospinal 세포 패치 클램프 녹음을 통해 전기적 활동을 기록하고 모니터링 할 수있는 그대로 뇌 - 척수 준비를 개발했습니다. 따라서, 우리는 배아의 주요 신경 세포에서 흥분성과 억제 성 시냅스 전류, 전압 문 채널 활동 및 활동 전위를 기록 할 수 있습니다.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

여기에서 우리는 Organotypic 슬라이스 문화 기술을 사용하여 해마 출생 후 신경 세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이 방법은 성인 신경의 체외에서 조작이 가능하며 배양 된 해마되는 약물의 직접 적용이 가능합니다.

출생 후 신경 발생의 연구 Organotypic 슬라이스 문화

이 프로토콜은 biocytin 충전 및 후속 면역 후 처리를 사용하여 전기 생리 녹음하는 동안 패치 신경 세포의 형태 학적 복구를위한 방법을 제시한다. 우리는 염색 coverslipped 된 두꺼운 biocytin 채워진 부분은 나중에 두 번째 차 항체 일 개월 restained 될 수 있음을 보여줍니다.

신경 화학적 마커에 대한 Biocytin 충전 및 가공 섹션의 면역 염색

정확 하 게 파악 하 고 분석 hippocampal 조각 면역 형광을 사용 하 여 시 냅 스에 대 한 프로토콜은이 문서에 설명 되어.

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

여기에 설명 된 프로토콜 설명 면역 형광 분석, biocytin 복구 hippocampal CA2 수는 세포내 electrophysiological 녹음 생체 외에서, 수 있도록 신경 다음의 높은-품질 개조 특성화 고 궁극적으로 훌륭한 신경 해부학 공부를 해야.

Biocytin 복구 및 채워진된 Hippocampal CA2 수의 3D 복원

전송 전자 현미경 검사 법 및 utero에서 변환의 조합을 개발 하는 동안 신경 시스템의 정밀한 열 대권 외의 형태학 적 변화를 공부에 대 한 강력한 접근 이다. 이 결합 된 메서드는 그들의 지형 표현에 관하여 neuroplasticity 기본 구조 세부 사항에 변화에 대 한 깊은 통찰력을 수 있습니다.

평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수

우리는 신경 터미널에서 시 냅 스 소포 분포의 형태학 적 분석을 위한 고해상도 전자 현미경을 얻기 위해 신생아 쥐 뇌 조직을 처리 하는 절차를 설명 합니다. 이러한 방법으로 얻은 마이크로 그래프는 다양 한 세포 구성 요소와 그 차원 구조적 관계의 형태를 연구 하는 데에도 사용 될 수 있습니다.

신경 말단에서 시 냅 스 소포 분포의 미세 구조 형태학 적 분석을 위한 신생아 쥐 뇌 조직의 제조

크릴로 단부-해부는 깊은 정량적 프로테오메 분석을 위해 뮤린 뇌에서 가장 큰 신경 성 틈새 시장을 신선하고 냉동 준비 할 수 있습니다. 이 방법은 정확하고 효율적이며 최소한의 조직 혼란을 일으킵니다. 따라서, 그것은 이상적으로이 틈새 시장, 뿐만 아니라 다른 장기, 지역 및 종의 분자 미세 환경을 공부에 적합.

정확하고 심도 있는 정량적 프로테아메 분석을 위한 성인 Subependymal 영역의 극저온 단면 해부

제시된 프로토콜은 주로 시냅스 수와 수지상 척추 형태에 초점을 맞춰 마우스 배럴 피질의 일주기 변화를 정량화하기 위해 투과 전자 현미경(TEM)의 사용을 설명합니다.

마우스 배럴 피질의 일주기 시냅스 가소성 분석을 위한 시각화 기술로서의 투과 전자 현미경

배우세요 시냅스 아연 히스토화학법을 이용하여 족제비 뇌 조직에서 발달 및 성인 뇌의 다양한 영역과 층을 구분하는 방법을 연구하세요. 이 기술은 신경과학 연구에서 신경세포 분포를 정확히 식별하는 데 활용됩니다.

시 냅 스 아연 Histochemistry 다른 지역과 개발 및 성인 두뇌에서 하기의 사용

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