동시 매핑 및 인간 미토 콘 드리 아 DNA에 Ribonucleotides의 정량

이 실험의 전반적인 목표는 단일 뉴클레오티드 분해능 수준에서 통합된 리보뉴클레오티드의 위치를 매핑하고 인간 미토콘드리아 DNA에 존재하는 리보뉴클레오티드의 수를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 DNA 무결성, DNA 복제 메커니즘, DNA 복구 메커니즘 및 이러한 메커니즘의 결함이 어떻게 질병을 유발하는지에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 미토콘드리아 DNA에 통합된 리보뉴클레오티드의 위치와 수를 모두 단일 실험에서 결정할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 인간 미토콘드리아 DNA의 리보뉴클레오티드 함량에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 모델 유기체의 염기서열 게놈에서 핵 DNA 및 리보뉴클레오티드 함량을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 이전에 HeLa 세포에서 분리하고 텍스트 프로토콜의 섹션 2 및 3에 설명된 게놈 DNA가 이 실험에 사용됩니다. DNA를 소화하려면 마이크로분리관에 다음을 조심스럽게 섞습니다.

DNA 1마이크로그램, 10X 버퍼 3.1 5마이크로리터, HincII 1마이크로리터 및 뉴클레아제가 없는 물을 최종 부피 50마이크로리터로 만듭니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 분해가 완료되면 각 샘플에 1.8 부피의 상자성 비드를 추가하고 피펫팅으로 조심스럽게 혼합한 다음 실온에서 10분 동안 배양합니다.

튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 올려 놓고 비드를 펠릿화한 다음 상층액을 제거하고 버립니다. 펠릿을 150마이크로리터의 70% 에탄올로 약 30초 동안 세척한 다음 상등액을 제거하고 버립니다. 200마이크로리터의 70% 에탄올로 30초 더 세척을 반복합니다.

샘플을 실온에서 약 15-20분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 마그네틱 랙에서 튜브를 제거합니다. 각 펠릿을 45마이크로리터의 용리 완충액에 용리시키고 조심스럽게 피펫팅하여 혼합한 후 5분 동안 배양합니다.

마그네틱 랙에 비드를 펠렛으로 넣고 각 DNA 샘플 45마이크로리터를 새 튜브로 옮깁니다. 각 45마이크로리터의 분리 또는 정제된 DNA에 5마이크로리터의 3몰 수산화칼륨 또는 5마이크로리터의 3몰 염화칼륨을 추가하여 총 50마이크로리터의 부피를 만듭니다. 8가지 반응이 이 표에 요약되어 있습니다.

섭씨 55도의 교잡 오븐에서 2시간 동안 배양한 다음 얼음에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. pH 5.2에서 10 마이크로 리터의 3 몰 아세트산 나트륨과 125 마이크로 리터의 차가운 100 % 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시키고 5 분 동안 얼음에서 배양합니다. 21, 000 시간 G에서 5 분 동안 섭씨 4도에서 원심 분리하여 DNA

상층액을 버리고 각 DNA 펠릿을 250마이크로리터의 냉기, 70% 에탄올로 세척하고 다시 원심분리기를 하고 상등액을 버립니다. 눈에 보이는 액체가 증발할 때까지 열린 튜브에서 펠릿을 약 5-10분 동안 건조시킵니다. 마지막으로 20마이크로리터의 용리 완충액을 넣고 DNA 펠릿을 실온에서 30분 동안 용해시킵니다.

각 샘플에 대한 반응 혼합물을 마스터 혼합물로 준비하여 이 절차를 시작합니다. 각 샘플에 대해 2.5마이크로리터의 10x T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 반응 완충액, 2.5마이크로리터의 ATP 및 1마이크로리터의 3프라임 포스파타아제-마이너스 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 추가합니다. 각 DNA 샘플의 19 마이크로 리터를 새로운 200 마이크로 리터 튜브로 옮기고 3 분 동안 열 순환기에서 섭씨 85도에서 변성시킵니다.

그런 다음 DNA 샘플을 얼음에서 식히고 준비된 반응 혼합물 6마이크로리터를 각 샘플에 추가합니다. 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 다음 섭씨 65도에서 20분 동안 배양하여 반응을 중단합니다. 앞서 설명한 것처럼 상자성 비드를 사용하여 DNA를 정제하되 14마이크로리터의 용리 완충액으로 용리합니다.

반응 혼합물을 각 샘플에 대해 다음을 포함하는 마스터 혼합물로 미리 준비합니다. 5마이크로리터의 10x T4 RNA 리가제 반응 완충액, 5마이크로리터의 헥사미네코발트(III)클로라이드, 0.5마이크로리터의 ARC140 올리고뉴클레오티드, 0.5마이크로리터의 ATP 및 25마이크로리터의 50%PEG 8000. 피펫팅으로 잘 섞습니다.

정제된 각 DNA 13마이크로리터를 새로운 200마이크로리터 튜브로 옮기고 열순환기에서 섭씨 85도에서 3분 동안 변성시킵니다. 얼음에서 DNA를 식힌 다음 각 샘플에 36마이크로리터의 반응 혼합물을 추가하고 피펫팅으로 혼합한 다음 잠시 스핀다운합니다. 각 반응에 1마이크로리터의 T4 RNA 리가아제를 첨가하고 피펫팅으로 혼합한 다음 간단히 스핀다운합니다.

밤새 어두운 실온에서 샘플을 배양합니다. 단일 가닥 DNA 접합이 완료되면 앞서 설명한 대로 DNA를 정제하되 0.8부피의 상자성 비드를 사용하고 비드를 10분 동안 펠릿화합니다. 20마이크로리터의 용리 완충액을 용리하고 각 DNA 샘플 20마이크로리터를 새로운 200마이크로리터 튜브로 옮깁니다.

0.8 부피의 상자성 비드로 정제를 반복하고 14 마이크로리터의 용리 완충액에서 용리합니다. 각 샘플에 대해 2마이크로리터의 10x T7 DNA 중합효소 반응 완충액, 2마이크로리터의 ARC76/77, 2마이크로리터의 dNTP 및 0.8마이크로리터의 BSA로 구성된 마스터 믹스로 반응 혼합물을 준비합니다. 정제된 DNA 12.8마이크로리터를 새로운 200마이크로리터 튜브로 옮기고 열순환기에서 섭씨 85도에서 3분 동안 변성시킵니다.

얼음에서 DNA를 식힌 다음 각 샘플에 6.8마이크로리터의 반응 혼합물을 첨가하고 피펫팅으로 혼합한 다음 잠시 스핀다운하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 각 반응에 0.4마이크로리터의 T7 DNA 중합효소를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 상자성 비드를 사용하여 DNA를 정제한 후 11마이크로리터의 용리 완충액에서 용리합니다.

PCR 증폭을 시작하려면 7.5 마이크로리터의 ARC49, 7.5 마이크로리터의 고유 인덱스 프라이머 및 25 마이크로리터의 2X 핫 스타트 레디 믹스로 구성된 새로운 200 마이크로리터 튜브에서 각 샘플에 대해 반응 혼합물을 개별적으로 준비합니다. 각 반응에 10마이크로리터의 DNA 샘플을 추가합니다. 다음 조건을 사용하여 라이브러리를 증폭합니다.

섭씨 95도에서 45초 동안 변성된 후 섭씨 98도에서 15초 동안, 섭씨 65도에서 30초, 섭씨 72도에서 30초 동안 18회 변성하고 2분 동안 섭씨 72도에서 최종 연신으로 끝납니다. 증폭 후 샘플을 섭씨 4도에서 유지합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라이브러리를 정제하고 20마이크로리터의 TE 버퍼에서 용리합니다.

디지털 전기영동 시스템을 사용하여 각 라이브러리의 품질과 평균 단편 크기를 결정합니다. 수산화칼륨 또는 염화칼륨 처리 후 적합한 라이브러리 프로파일의 대표적인 결과가 표시됩니다. 각 라이브러리의 농도를 계산한 후, 텍스트 프로토콜의 섹션 9 및 10에 설명된 대로 염기서열분석을 위해 서로 다른 인덱스 프라이머로 증폭된 최대 24개 라이브러리의 동일한 몰 양을 추출합니다.

TE 완충액을 25마이크로리터의 최종 부피와 10나노몰의 농도에 추가합니다. 염기서열분석 후 텍스트 프로토콜의 섹션 11에 지정된 대로 생물정보학 데이터 분석을 수행합니다. 이 그래프는 염화칼륨 처리 후 가벼운 가닥 및 두꺼운 가닥 인간 미토콘드리아 DNA의 모든 HincII 부위에서 요약된 판독을 보여줍니다.

약 70%의 검출된 5개의 프라임 말단이 절단 부위에 국한되어 HincII 분해의 높은 효율성을 보여줍니다. 수산화칼륨으로 라이브러리를 처리하여 내장된 리보뉴클레오티드에서 DNA를 가수분해하면 HincII의 판독 횟수가 약 40%로 감소합니다.미토콘드리아 DNA와 핵 DNA의 상대적인 판독 횟수는 적용 범위의 차이를 보여주고 가닥 편향을 제거하기 위한 적절한 정규화의 중요성을 보여줍니다. 판독 횟수를 HincII로 정규화하면 무겁거나 가벼운 가닥에서 미토콘드리아 게놈당 리보뉴클레오티드의 수를 정량적으로 측정할 수 있습니다.

각 리보뉴클레오티드에 대한 수산화칼륨 처리 후 각 가닥의 염기서열 조성으로 정규화된 판독은 1과 다른 비율을 보여주며, 이는 판독의 비무작위 분포를 나타내고 뚜렷한 리보뉴클레오티드 패턴과 높은 라이브러리 품질을 시사합니다. 끼워넣어진 리보뉴클레오티드의 위치에 읽을, 뿐 아니라 게놈 뉴클레오티드 내용에 HincII 위치에 그들에 정상화해서, 각 리보뉴클레오티드의 얼마나 많은 것이 1 당 통합되는지, 000의 자유로운 기초 생성한다. 일단 마스터하면 이 프로토콜이 제대로 수행되면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 DNA를 매우 정확하게 유지하고 라이브러리 준비 중에 이중 가닥 절단을 도입하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 리보뉴클레오티드 정량화 데이터를 확인하기 위해 다음과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 차세대 염기서열분석을 사용하여 리보뉴클레오티드와 DNA의 맵핑 및 정량화를 위해 라이브러리를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

수산화칼륨과 같은 화학 물질로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 보안경 및 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.