Name: 동시 매핑 및 인간 미토 콘 드리 아 DNA에 Ribonucleotides의 정량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: 학습하세요 인간 미토콘드리아 DNA의 리보뉴클레오티드를 단일 염기 분해능으로 동시 매핑 및 정량하는 방법을. 효소적 소화와 알칼리 가수분해를 결합한 이 기법은 DNA 무결성 및 질병 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 연구는 스웨덴 연구 위원회에 의해 지원 되었다 (www.vr.se) 호를 부여 (2014-6466와 전략 연구 (www.stratresearch.se) 호 (ICA14-0060)에 대 한 스웨덴 재단. Chalmers 기술 대학이이 작품 MKME에 재정 지원 제공. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

이 그림 1에서 설명 하는 프로토콜과 gDNA, ribonucleotides, 치료는에 알칼리 수를 quantitate 수 금지 효소로 소화의 절연 ribonucleotides의 phosphodiester 채권 gDNA, 무료 5´ 오 끝의 인 산화, 어댑터, 두 번째 가닥 합성 및 PCR 증폭 시퀀싱 전에 ssDNA 결 찰에 통합.
 1. 어댑터 및 인덱스 뇌관 <ol><li>얻을 ARC49 ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, 어댑터, ARC78-ARC107 인덱스 뇌관 (표 1 참조). 
	참고: Oligonucleotides HPLC 정화 해야 합니다. ARC76/77 이중으로 정렬 됩니다.</li>
	<li>트리 스-EDTA (테) 버퍼에 각 oligonucleotide의 준비 100 µ M 재고 솔루션 (재료의 표 참조)-20에서 저장 ° c.</li>
	<li>차입 버퍼 (EB, 참조 테이블의 재료)에 희석 하 여 ARC67/77의 10 µ M 솔루션 및 ARC49 및 인덱스 뇌관의 2 µ M 솔루션을 준비 합니다. -20 ° c.에 게</li>
</ol> 2. 성장과 수확의 셀 <ol><li>성장 HeLa 세포 70 ml Dulbecco &#39; s 37에 250 mL 스피너 플라스 크에서 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보완 수정이 글 매체 (DMEM) ° c.</li>
	<li>셀의 수를 계산 하 고 50 mL 튜브, 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기에서에서 5 x 10 6 세포를 수집 하 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>1 x 20 mL PBS, 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기를 가진 세포를 세척 하 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>동결-20 ° C에서 펠 릿 또는 DNA 정화 계속.</li>
</ol> 3. DNA 정제 및 정량 <ol><li>gDNA 아래에 설명 된 페 놀-클로 프롬 적 출을 사용 하 여 정화.
	<ol><li>Resuspend 2 mL 세포의 용 해 버퍼의 셀 (테이블의 자료 참조)와 열 블록에 42 ° C에서 30 분 동안 품 어. 
		주의: 세포의 용 해 버퍼 유해 구성 요소를 포함합니다. SDS 솔루션은 자극, 가수분해 K은 sensitizing, 자극, 및 독성. 보호 옷과 장갑을 착용.</li>
		<li>두 2 mL 튜브에 샘플을 분할 하 고 페 놀-클로 프롬-isoamyl 알콜 (25:24:1)의 1 볼륨 (V) 추가. 
		주의: 페 놀-클로 프롬-isoamyl 알콜은 독성, 변이 원 성, 부식성, 및 수생 환경에 유해. 증기 두건에서 사용 하 고, 보호 옷과 장갑을, 착용 하 고 특별 한 페 놀-클로 프롬 폐기물에서 폐기.</li>
		실 온에서 30-60 s에 대 한 반전 및 15000 x 5 분 원심 분리기 <li>믹스 g. 
		참고: 결과 왜곡할 것 이다 무작위 스트랜드 나누기 소개 피하려고 하지 소용돌이 DNA 할.</li>
		<li>새 2 mL 튜브 위, 수성 단계 전송 및 페 놀-클로 프롬-isoamyl 알콜 (25:24:1)의 V 1.</li>
		<li>반전 및 원심 분리기에서 15000 x g 4에 5 분 동안 혼합 ° c.</li>
		<li>전송 20 µ L을 추가 하 고 새로운 2 mL 튜브에 위, 수성 단계 NaCl (5m)과 차가운 소 프로 파 놀의 V 1. 
		주의: 소 프로 파 놀, 자극, 가연성 및 독성입니다. 통풍이 캐비닛에 그것을 저장, 보호 옷과 장갑, 착용 하 고 화 염에서 멀리 유지.</li>
		<li>반전 하 여 혼합 및 적어도 1 h-20에 대 한 품 어 ° c.</li>
		<li>G, 4 ° C와 폐기 상쾌한 x 15, 000에서 20 분 동안 원심 분리기.</li>
		<li>세척 DNA 펠 릿 200 µ L 찬 70% 에탄올, 4 ° C에서 15000 x g에서 20 분 동안 원심 및 상쾌한 삭제. 
		주의: 70% 에탄올은 가연성 및 자극. 통풍이 캐비닛, 보호 옷을 입고, 장갑,-20 ° C, 그렇지 않으면 저장소에서 작업 솔루션을 유지 하 고 화 염에서 멀리 유지.</li>
		<li>DNA 펠 릿 20-25 분에 대 한 실 온에서 건조</li>
		<li>100 µ L 테 펠 릿 분해 DNA 버퍼링 하 고 1 개의 관에 샘플 수영장.</li>
	</ol></li> <li>Quantitate DNA 농도 제조 업체에 따르면 dsDNA 정량 시 약을 사용 하 여 &#39; s 사양 (재료의 표 참조). 
	참고: dsDNA 정량 시 약을 사용 하는 spectrophotometric DNA 정량 잔여 페 놀에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에.</li>
	<li>-20 ° C에 게 DNA HincII 치료를 계속 하거나.</li>
</ol> 4. HincII 치료와 알칼리 가수분해 5 µ L 10 x 버퍼 3.1, 1 µ L (10 U)를 포함 하는 <ol><li>반응에서 다이제스트 1 µ g의 DNA 혼합 HincII, 및 nuclease 무료 H 2 O 50 µ L의 최종 볼륨을. 
	참고: 결 찰에 대 한 최적의 조건을 달성 하기 위해, 두 번째 가닥 합성 및 PCR 증폭, 그것은 필요할 수 있습니다 예상 된다 DNA ribonucleotides의 매우 낮은 수를 포함 하는 경우 입력된 DNA 양을 증가 시키는. 마찬가지로, 그것은 ribonucleotides의 수는 매우 높은 경우 입력된 DNA를 감소 해야 할 수도 있습니다.</li>
	<li>37 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>정화 HincII 치료 DNA 상자성 구슬. 
	참고: 관 뚜껑 열고 튜브를 열어서 펠 렛을 방해 하지 하려면 다음 단계에 계속.
	<ol><li>각 상자성 구슬의 1.8 V 추가 샘플, 신중 하 게 pipetting, 혼합 및 10 분에 대 한 실 온에서 품 어</li>
		<li>작은 구슬 5 분에 대 한 다음 제거 하 고 상쾌한을 버리고 자기 랙 사용.</li>
		<li>약 30 s 다음 제거 및 삭제는 상쾌한 70% 에탄올 (실내 온도)의 150 µ L와 펠 릿을 세척.</li>
		<li>세척 약 30 70% 에탄올 (실내 온도)의 200 µ L와 펠 릿 s 다음 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 
		참고: 잔여 에탄올 10 µ L 피 펫으로 제거할 수 있습니다. 방울 짧게 미리 내려 버리고 수.</li>
		<li>건조 약 15-20 분에 대 한 실 온에서 샘플 
		참고: 정확한 시간 구슬의 볼륨 및 펠 릿의 모양에 따라 달라 집니다, 산 탄을 시각적으로 확인 한다 따라서.</li>
		<li>자석 선반에서 튜브를 제거 하 고 45 µ L EB, 신중 하 게 pipetting으로 혼합에에서 펠 릿을 elute.</li>
		<li>5 분 다음 작은 자석 선반에 구슬 하 고 순화 된 DNA의 45 µ L를 사용 하 여 단계 4.4에서에서 품 어.</li>
	</ol></li> <li>코 (3 M) 또는 50 µ L의 총 볼륨을 만드는 DNA에 KCl (3 M)의 추가 5 µ L. 
	주의: 3 M 코 솔루션 부식성입니다. 보호 옷과 장갑을 착용.</li>
	<li>품은 교 잡에서 55 ° C에서 2 h 오븐 얼음에 5 분 뒤 
	참고: 것이 좋습니다 튜브의 균일 한가 열을 유지 하 고 뚜껑에 결로 방지 난방 블록 보다는 오븐에 코 치료를 수행 하.</li>
	<li>침전 DNA 10 µ L 나트륨 아세테이트를 추가 하 여 (3 M, pH = 5.2) 및 125 µ L 감기 100% 에탄올. 5 분 ice에 품 어 
	주의: 100% 에탄올은 가연성 및 자극. 통풍이 캐비닛에 저장, 보호 옷과 장갑을, 착용 하 고 화 염에서 유지.</li>
	<li>Centrifuging 21000 x g, 5 분 동안 4 ° C에 의해 gDNA를 펠 렛 하 고는 상쾌한 삭제.</li>
	<li>세척 DNA 펠 릿 250 µ L 찬 70 %EtOH, 21000 x g, 5 분, 4 ° C에서 원심 및 삭제는 상쾌한. 
	참고: 제거 하려면 방울, 튜브 수 수 스핀 다운 짧게 다시 하 고 상쾌한 10 µ l 피 펫 제거 될 수 있다.</li>
	<li>게 보이는 어떤 액체 증발 될 때까지 약 5-10 분 동안 열려 튜브에서 건조 하는 펠 릿.</li>
	<li>실 온에서 30 분 동안 20 µ L EB에에서 게 DNA 펠 릿 디졸브.</li>
</ol> 5. 5´ 끝 인 산화 <ol>각 샘플 미리 죄수 <li>반응 혼합 준비T4 polynucleotide 키 니 아 제 반응 버퍼, 1 µ L (10 U) 3´-인산 가수분해 효소-마이너스 T4 polynucleotide 키 니 아 제, 및 2.5 µ L ATP (10mm) x 2.5 µ L 10의 isting.</li>
	<li>전송 19 µ L 각 DNA의 새로운 200 µ L 관으로 샘플 및 열 cycler에서 85 ° C에서 3 분 변성.</li>
	<li>멋진 DNA 얼음에 샘플링 하 고 반응 혼합의 6 µ L 각 샘플 추가.</li>
	<li>30 분 및 중지 20 분 65 ° C에서 샘플을 배양 하 여 반응 하는 37 ° C에서 품 반응 혼합</li>
	<li>정화 DNA로 4.3에 상자성 구슬의 1.8 V를 사용 하 여 설명 하지만 14 µ L EB에에서 elute.</li>
</ol> 6. ssDNA 결 찰 <ol><li>0.5 µ L ATP (2mm), T4 RNA 리가 반응 버퍼, 5 µ L CoCl 3 (NH 3) 6 (10 m m), x 5 µ L 10의 사전에 구성 된 각 샘플에 대 한 반응 혼합 준비 0.5 µ L ARC140 (100 µ M), 25 µ L 50% 말뚝 8000. Pipetting으로 잘 믹스. 
	주의: CoCl 3 (NH 3) 6 이며 발암, sensitizing, 수생 환경 유해. 보호 옷과 장갑을 착용.</li>
	<li>전송 13 µ L에서 순화 된 DNA의 새로운 200 µ L 튜브 5.5 단계와 열 cycler에서 85 ° C에서 3 분 변성.</li>
	<li>차가운 얼음에 DNA 각 샘플, pipetting, 혼합 반응 혼합의 36 µ L을 추가 하 고 간단히 스핀 다운.</li>
	<li>추가 1 µ L (10 U) T4 RNA 리가의 각 반응에 pipetting, 혼합 하 고 짧게 스핀 다운.</li>
	<li>어두운 하룻밤에 실 온에서 샘플을 품 어.</li>
</ol> 7. 두 번째 가닥 합성 4.3에 설명 된 대로 <ol><li>Purify DNA 출혈 하지만 상자성 구슬의 0.8 V를 사용 하 여, 작은 구슬 10 분 및 20 µ L EB에에서 elute. 
	참고: 결 찰 반응 혼합의 높은 점도 인해 pelleting의 첫 번째 단계는 연장.</li>
	<li>전송 20 µ L 새로운 200 µ L PCR 튜브에 DNA 샘플의. 제조 업체에 따라 상자성 구슬의 0.8 V를 사용 하 여 정화 단계 반복 &#39; s 사양 및 14 µ L EB에에서 elute.</li>
	<li>10 x T7 DNA 중 합 효소 반응 버퍼, 2 µ L의 2 µ L의 사전에 구성 된 각 샘플에 대 한 반응 혼합 준비 ARC76/77 (2 µ M), 2 µ L dNTPs (2mm), 및 0.8 µ L BSA (1 mg/mL).</li>
	<li>새 200 µ L 튜브에 DNA를 정화 하는 전송 12.8 µ L, 열 cycler에서 85 ° C에서 3 분 변성.</li>
	<li>얼음에 DNA를 냉각 하 고 각 샘플, pipetting으로 혼합, 짧게, 스핀 다운 및 실 온에서 5 분 동안 품 어 반응 혼합의 6.8 µ L 추가.</li>
	<li>각 반응에 0.4 µ L (4 U) T7 DNA 중 합 효소를 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>정화 DNA로 4.3에 상자성 구슬의 0.8 V를 사용 하 여 설명과 11 µ L EB에에서 elute.</li>
</ol> 8. PCR 증폭 및 라이브러리 정량 <ol><li>준비 새로운 200에서 각 샘플에 대 한 반응 혼합물 µ L 튜브 7.5 µ L의 미리 구성 된 ARC49 (2 µ M), 7.5 µ L 인덱스 뇌관 (2 µ M, 각 샘플에 대 한 독특한), 그리고 뜨거운 시작 x 25 µ L 2 준비 믹스.</li>
	<li>각 반응에 DNA 샘플의 추가 10 µ L. 다음 조건을 사용 하 여 라이브러리를 증폭: 95 ° C 45에서 변성 15 98 ° C의 18 주기 다음 s s, 30 위한 65 ° C s, 72 ° C 30에 대 한 s, 72 ° c에서 4 °에서 2 분 대기 샘플에 대 한 최종 신장으로 끝나는 증폭 후 C.</li>
	<li>4.3, 상자성 구슬의 0.8 V를 사용 하 여에 설명 된 대로 라이브러리를 정화 하 고 20 µ L TE 버퍼에 elute.</li>
	<li>제조 업체에 따르면 dsDNA 정량 시 약을 사용 하 여 라이브러리를 quantitate &#39; s 사양 (재료의 표 참조).</li>
	<li>샘플-20 ° C에서 저장 하거나 라이브러리 분석 계속.</li>
</ol> 9. 라이브러리 분석 및 풀링은 <ol><li>각 라이브러리의 품질을 결정 하 고 디지털 전기 시스템을 사용 하 여 평균 조각 크기를 추정. 
	참고: 평균 조각 크기는 electropherogram의 곡선 아래의 영역은 절반으로 추정 하 여 평가 무시 하는 표식에서 봉우리. 코 또는 KCl 치료 후 적당 한 라이브러리 프로필의 대표적인 결과 그림 2A에 부여 됩니다.</li>
	<li>계산으로 라이브러리의 농도 (nM): 
	(c/10 3) /(p*650)] * 10 9 어디 c ng / µ L에서 라이브러리의 농도 이며 p 혈압, 평균 조각 크기에 예상된 9.1로.</li>
	<li>풀 같은 어 금 니 양의 최대 24 라이브러리 시퀀싱에 대 한 다른 인덱스 뇌관으로 증폭. 25 µ L의 최종 볼륨을 10의 농도 테 버퍼를 추가 nM. 
	참고: 라이브러리 풀링할 수에 따라 각 도서관에서 DNA의 금액은 조정 됩니다. 뇌관 이합체 경우 단계에서 9.1 약 130의 뚜렷한 피크로 정화 단계 4.3, 상자성 구슬, 0.8 V를 사용 하 여에 설명 된 대로 반복 되 고 DNA는 eluted 25 µ L 테 buf에 때문에 bp, 라이브러리 풀의 최종 볼륨 25 µ L를 초과할 수 그다지입니다.
	<li>결정 제조 업체에 따르면 dsDNA 정량 시 약을 사용 하 여 새 라이브러리 풀 농도 <ol>&#39; s 사양 및 평균 피크 크기 위에서 설명한. 시퀀싱 및 데이터 분석 (섹션 10 및 11) 진행.</li>
	</ol></li></ol> 10. 시퀀싱 <ol><li>풀링된 라이브러리 12 75-자료 쌍-엔드 시퀀싱을 수행.</li></ol>
 11. 데이터 분석 <ol><li>트림 어댑터 시퀀스를 제거 하려면 모든 읽기 품질에 대 한 필터링 및 길이 읽기. 
	참고:이 수행할 수 명령으로 cutadapt 1.2.1 20을 사용 하 여 ' cutadapt-f fastq-와일드 카드 일치-읽기--조용한-m 15-q 10-한 NNNNNNN &#60; 파일 &#62;', NNNNNNN 실제 어댑터 시퀀스로 대체 됩니다 및 &#60; 파일 &#62;는 fastq 파일 이름으로 바뀝니다.</li>
	<li>사용자 지정 스크립트를 사용 하 여 이전 단계에서 삭제 된 읽기의 동료를 제거.</li>
	<li>남은 친구 1 정렬 라이브러리 준비에 사용 되는 모든 oligonucleotides의 시퀀스를 포함 하는 인덱스에 쌍 (예를 들어, Bowtie 0.12.8 21와 명령줄을 사용 하 여 옵션-m1-v2). 성공적인 정렬 모든 쌍 삭제.</li>
	<li>Bowtie 명령줄과 함께 사용 하 여 유기 체 참조 게놈을 나머지 쌍 정렬 옵션-v 2-X 10000-최고.</li>
	<li>지도 모든 정렬 되지 않은 쌍의 친구 1을 정렬 하 여 미토 콘 드 리아 분자 시작과 끝 사이의 간격을 읽고 (Bowtie 명령줄과 함께 사용 하 여 옵션-v2).</li>
	<li>모든 단일 및 결합 끝 정렬에 대 한 5´-끝의 수를 결정합니다. 분해 된 ribonucleotides가 있던 위치에 이러한 기본 상류의 위치를 이동.</li>
	<li>Bowtie 파일에서 데이터를 내보낼 게놈 브라우저 공통 시각화에 대 한 사용자 지정 스크립트를 사용 하 여 bedgraph 파일 형식으로 서식을. 각 가닥 당 읽기에 대 한 읽기를 정상화 백만.</li>
	<li>Incorp의 정체성을 결정 하는 유기 체 게놈 시퀀스를 참조 bedgraph 파일에서 위치 및 개수를 사용 하 여ribonucleotides orated. 
	참고: 인간 미토 콘 드리 아 게놈 16,200-300 및 5,747-5,847에 대 한 영역에서 읽기에 대 한 각 제외 되어야 이후이 지역 많은 무료 5´-끝 ribonucleotide 법인 DNA 중 합 효소 γ에 의해 무관 포함.</li>
	<li>분할 단일 가닥 휴식, (즉, 미토 콘 드 리아 분자 당 ribonucleotides의 수) 당 ribonucleotides의 번호를 HincII 사이트 당 읽기 평균 수와 11 HincII 사이트에서 읽기를 제외한 총 읽습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

여기 우리는 동시에 지도 하 고 시퀀스 특정 사이트 설립된 하이든-seq 프로토콜에 추가로 게놈에서 DNA 분열의 간단한 소개에 의해 gDNA, 및 mtDNA에서 ribonucleotides 특히, 계량 기법 제시. 이 연구는 인간 mtDNA에 초점을 맞추고, 하는 동안 원래 하이든 seq 메서드 Saccharomyces cerevisiae, 다른 유기 체12,16메서드의 번역 설명에서 개발 되었다.
신뢰할 수 있는 결과 위해,이 접근 방식에서 얻은 몇 가지 중요 한 단계를 주목 해야 한다: (A) 시퀀싱 어댑터가 모든 사용 가능한 5´ 끝에 선 이후, 그것은 매우 손상 DNA와 함께 작동 하도록 중요 한. DNA는 격리 되어야 합니다 라이브러리 DNA 분리 직후 선호 여야 한다 또는-20 ° c.에 DNA를 저장 될 수 있다 오랜 동안 DNA는 냉장고에서 저장 반복적으로 동결 하 고 그것을 재개 하는 권장 하지 않습니다. (B)를이 방법으로 적합 한 라이브러리를 생성, 전체 샘플 및 양적 가수분해의 균일가 열을 보장 하는 난방 블록 보다는 외피 오븐에서 DNA의 코 치료를 수행 하기 위해 결정적 이다. (C) 또한, 그것은 풀링 및 시퀀싱 하기 전에 라이브러리의 품질을 제어 하는 중요 한입니다. DNA 계량 한다 고 적절 한 조각 크기를 확인 하 고 뇌관 이합체 검사 라이브러리 DNA의 적절 한 금액을 보장 하는 자동된 전기 영동 시스템을 사용 하 여 분석.
의미 있는 데이터 분석을 위해 그것은 또한이 방법의 유익한 값은 배경 및 시퀀스 또는 가닥 편견을 평가 하기 위해 적절 한 컨트롤에 의존 하는 것이 중요. 우리는 정기적으로 때만 시퀀스 특정 endonuclease (그림 2B, 왼쪽된 패널)와 소화 KCl 샘플의 70%에서 매핑 효율성 달성. 또한, 그것은 endonuclease 치료 전체에는 영향을 미치지 않습니다 확인 하는 중요 한 HincII를 비교 하 여 법인된 ribonucleotides의 검색 치료 및 치료 샘플 (그림 3B). 이 실험에서 우리는 HincII 소개 사용 특정 사이트 컷, 다른 높은-충실도 제한 효소를 사용 될 수도 있지만.
프로토콜 적응 시킬 수 있는 종료 5´-인산 염 또는 5´ 오를 처리할 수 있는 DNA 장애의 다른 유형을 공부 하. 결과의 정확도 처리의 특이성에 의존 하며 적당 한 컨트롤 (예: 야생 타입 또는 치료) 확인에 대 한. 또한 때이 메서드를 다른 응용 프로그램 또는 다른 유기 체와 함께 사용 하기 위해 적응, 그것의 현재 설치에서 메서드 라이브러리에 처리 되는 DNA의 약 1 µ g 필요 고려해 야 하나. 포함 된 ribonucleotides의 수에 끝 수 이므로,이 따라 유기 체 또는 돌연변이, ribonucleotides의 더 낮은 숫자를 포함 하는 샘플 필요 이상의 DNA 끝에의 충분 한 번호를 입력 합니다 이후 도서관 건설입니다. 마찬가지로, DNA 샘플 ribonucleotides의 훨씬 더 높은 수 있다면, 그것은 요구할 것입니다 또한 결 찰, 두 번째 가닥 합성 및 PCR 증폭에 대 한 최적의 조건을 얻기 위해 덜 입력된 DNA를 사용 하 여. 그것은 주목할 만한 도서관 건축이이 프로토콜에서 설명 된 대로 또한 생성 된 데이터 ( 2D 그림에 표시 된) 대로 핵 게놈을 취재 하 고만 데이터 분석 mtDNA에 집중 했다. 이것은 온건 하 게 낮은 ribonucleotide 주파수로 더 큰 게놈이이 방법으로도 캡처되지는 보여줍니다.
이 메서드를 고려할 경우 특정 제한 한다 고려해:이 방법, 이론, 해야 거의 모든 유기 체에 적용 적합 한 참조 게놈 읽기의 정렬에 대 한 필요는. 또한, 우리의 프로토콜에서 얻은 결과 세포의 많은 수에서 읽기를 나타냅니다. 셀의 하위 집합의 특정 ribonucleotide 설립 패턴이 접근이 방식에 의해 확인 될 수 없습니다. Ribonucleotides ribonucleotides의 매우 낮은 수를 가진 더 큰 게놈에 매핑된, 임의의 닉스에서 ribonucleotides를 구별할 수 어려울 수 있습니다 하 고 적절 한 컨트롤 따라서 필요.
우리가 여기, 설명 방법 하이든-Seq16, Ribose Seq17, Pu Seq18또는 emRiboSeq19같은 기술을 사용할 수 비보에 확장 합니다. 이 접근의 활용 포함 된 ribonucleotides의 감도를 알칼리 또는 RNase h 2 치료, 각각, 그들의 지도의 비교를 허용 하는 ribonucleotides 게놈 넓은 식별 하 다음-세대 시퀀싱을 채용 상대 설립입니다. DNA 순서를 구체적으로 고착 하 여 알칼리 가수분해 포함된 ribonucleotides에서 뿐만 아니라, 위에서 설명한 대로 ribonucleotides에 대 한 읽기 정규화 할 수 있습니다 그 분열 사이트 뿐만 아니라 식별을 허용 하 고의 매핑 ribonucleotides, 뿐만 아니라 각 DNA 분자에 대 한 그들의 정량. DNA 복제와 관련 된 질병의 맥락에서 우리의 기술 응용 DNA 수리, 및 TLS은 분자 메커니즘 및 게놈 무결성을 일반적으로 기본에서 ribonucleotides의 역할에 대 한 깊은 이해를 제공할 수 있습니다.

진 핵 세포에서 ribonucleotides (rNTPs)의 농도 deoxyribonucleotides (dNTPs)1의 농도 보다 훨씬 높다. DNA polymerases ribonucleotides, 차별만이 차별 완벽 한 이며, 결과적으로, deoxyribonucleotides 대신 ribonucleotides 수 있습니다 통합할 수 게놈 DNA 복제 하는 동안. Ribonucleotides 가장 일반적인 정식이 아닌 뉴클레오티드 게놈2에 통합 될 수 있습니다. 대부분 이러한 ribonucleotides의 RNase h 2 시작된 ribonucleotide 절단 선 (RER) 또는 Topoisomerase 1 (참조3검토) 오카자키 조각 성숙 하는 동안 제거 됩니다. Ribonucleotides는 제거할 수 없습니다 DNA2,4 에 안정적으로 통합 유지 하 고 (검토5검토) 하는 유해 하 고 유익한 방법으로 그것을 영향을 미칠 수 있습니다. 긍정적인 신호 역할을 할 수 있는, 게다가 예 유형 짝짓기에 스위치 Schizosaccharomyces pombe 6 와 불일치 하는 동안 초기 DNA 가닥을 표시 복구 (MMR)7,8, ribonucleotides에 영향을 미칠는 구조9 그리고 일차 스트레스 및 게놈 불안정성11의 결과로 그들의 ribose10, 2´-수 산 기 그룹이 주변 DNA의 안정성. 게놈 DNA (gDNA)에 ribonucleotides와 복제 및 복구 메커니즘으로 게놈 안정성에 대 한 의미에 그들의 관련성의 풍부한 게놈 넓은 방법에 있는 그들의 정확한 발생과 주파수를 조사 하는 이유를 제공 합니다.
RNase h 2 활동 인간의 미토 콘 드리 아에서 발견 되지 않은 그리고 ribonucleotides는 따라서 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA)에 효율적으로 되지 제거. 여러 경로 인간의 미토 콘 드리 아에 뉴클레오티드의 공급에 참여 하 고 미토 콘 드리 아 뉴클레오티드 풀에서 교란 인간 mtDNA에 ribonucleotides의 높은 수를 발생 시키는 지 여부를 조사, 우리 지도를 quantitate 프로토콜 개발 섬유 아 세포, HeLa 세포, 및 환자 셀 라인12에서 고립 된 인간 mtDNA에 이러한 ribonucleotides.
경쟁 rNTPs 반응에 포함 되어 단일 ribonucleotide 삽입 또는 뇌관 연장 실험을 기반으로하는 대부분의 생체 외에서 (검토 검토13) DNA polymerases' rNTPs에 대 한 선택도 결정 방식 믹스, 식별 또는 ribonucleotide 관 상대 정량 짧은 DNA 템플렛에 허용. 짧은 시퀀스에 양적 접근 하지 dNTP와 rNTP 풀 세포 농도 반영 하 고 따라서 제공 중 합 효소 선택도에 대 한 통찰력 하지만 전체 게놈에 관한 제한 된 의미의 수 있습니다. 그것은 보였다 ribonucleotides는 플라스 미드와 같은 더 긴 DNA 템플렛의 복제 하는 동안 통합의 상대적인 양이 방사선된 dNTPs를 사용 하 여 hydrolyzing14는 알칼리 성 환경 DNA 시퀀싱 젤에 구상 될 수 있다. 또한, gDNA 남쪽 오 점 다음 알칼리 가수분해, 물가 관련 조사 및 ribonucleotide 법인 vivo에서15의 절대 속도의 결정에 분석 되어 있다. 이러한 접근 법인 주파수의 상대 비교를 허용 하지만 위치 또는 법인된 ribonucleotides의 id에 아무 대 한 통찰력을 제공. 더 최근 접근 gDNA에서 vivo에서, 하이든-Seq16, Ribose Seq17, Pu Seq18또는 emRiboSeq19활용 포함 된 ribonucleotides' 같은 ribonucleotide 콘텐츠 분석 감도를 알칼리 또는 RNase h 2 치료, 각각, 다음-세대 시퀀싱 ribonucleotides 게놈 넓은 식별 하 고. 이러한 메서드는 검색 된 ribonucleotides의 절대 법인 주파수에 대 한 통찰력을 제공 하지 않습니다. 하이든-seq 프로토콜 시퀀스 특정 효소 분열의 단계를 추가 하 여 우리가 여기에 편리 하 게 설명 하는 방법은 동시 매핑 수 있도록 시퀀싱 접근에서 얻은 정보를 확장 하 고 정량의 임베디드 ribonucleotides12. 이 방법은 매우 그대로 DNA 추출 생성 될 수 있고 적합 한 참조 게놈은 사용할 수 있는 거의 모든 유기 체에 적용 됩니다. 메서드 quantitate는 nuclease에 의해 소화 될 수 있는 잎 5´ 인산 염 또는 5´ 오 끝을는 병 변의 위치 확인을 적용할 수 있습니다.
지도 및 genomic DNA에서 ribonucleotides을 quantitate, 메서드 시퀀스 특정 endonuclease에 의해 분열을 결합 하 고는 endonuclease에 대 한 특정 인식 순서는 및 5´-5´-인산 염을 생성 하는 알칼리 가수분해 사이트 끝 오 ribonucleotides 있었다 위치에서 끝납니다. 생성 된 무료 끝 어댑터와 출혈 이후에 있기 때문에 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 시퀀싱, 그것 매우 그대로 DNA를 사용 하 여 DNA 추출 및 라이브러리 준비 하는 동안 임의의 조각화 방지 중요성 이다. 이러한 읽기 endonuclease 분열에 읽기로 표준화 평가 동시 정량 및 매핑 검색된 ribonucleotides 수 있습니다. 무료 5´ 끝 제어 실험 KCl와 치료에 의해 DNA의 알칼리 가수분해가 대체 어디에서 검색 됩니다. 인수 데이터 ribonucleotide 위치 및 수량에 대 한 통찰력을 제공 하 고 ribonucleotide 콘텐츠 및 법인 주파수에 관하여 분석을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>10x T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 반응 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>B0201S</td><td></td></tr><tr><td>10x T4 RNA 리가아제 반응 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>B0216L</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Medicago</td><td>09-9400-100</td><td>1 정제를 H2O에 용해시켜 1 L</td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33539-1L-GL-R</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>525-0610</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5'-트리포스페이트(ATP, 10mM)</td><td>New England Biolabs</td><td>P0756S</td><td>EB로 희석하여 2mM</td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>BSA, 분자 생물학 등급(20mg/mL)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td>뉴클레아제가 없는 H2O를 1mg/mL</td></tr>로 희석한 <tr><td>Buffer EB</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td>(EB <td></td></tr><tr><td>CleanPCR 상자성 비드</td>라고 함) <td>CleanNA</td><td>CPCR-0050</td><td></td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) 용액 혼합물(각 10mM)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td>을 <td>EB로 2mM DMEM으로 희석</td></tr>, <tr><td>고포도당, GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag 96 Side</td><td>Thermo Fisher</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 99.5% 분석 등급</td><td>Solveco</td><td>1395</td>를 <td>milliQ 물로 70%</td></tr> <tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산 용액(EDTA, 0.5M)</td>으로 희석<td>Sigma-Aldrich</td><td>03690-100ML</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 완충액 pH 8.0(1M) 멸균 BC</td><td>AppliChem</td><td>A6906,0125</td><td></td></tr><tr><td>헥사민 코발트(III) 염화물 (CoCl3(NH3)6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7891-5G</td><td>는 10&><><nbsp; M 용액, 멸균 필터. 주의 : 발암성, 민감성 및 수생 환경에 유해합니다.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>NEBuffer 3.1</td></tr><tr><td>Hybridiser HB-1D</td><td>Techne</td><td>FHB4DD</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 &micro; g/mL), 1% SDS</td></tr><tr><td>마이크로 튜브 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 5424R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 MiniStar silverline</td><td>VWR</td><td>521-2844</td><td></td></tr><tr><td>Multiply&nbsp; &마이크로; StripPro 0.2 mL 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.992</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>페놀 &ndash; 클로로포름 &ndash; 이소 아밀 알코올 (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>VWR</td><td>26764.232</td><td>뉴클레아제가 없는 H2O에 용해 3&nbsp; M 용액, 멸균 필터</td></tr><tr><td>수산화칼륨(KOH)</td><td>VWR</td><td>26668.296</td><td>뉴클레아제가 없는 H2O에 용해 3&nbsp; M 용액, 멸균 필터</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 형광측정기</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 어세이 튜브</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 어세이 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td>주의: 가연성 및 독성 성분</td></tr><tr><td>포함 Qubit dsDNA HS 어세이 키트</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>주의: 가연성 및 독성 성분 포함</td></tr><tr><td>냉장 원심분리기 4K15</td><td>Sigma Laboratory 원심분리기</td><td>No. 10740</td><td></td></tr><tr><td>SDS 용액, 10%</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨 완충액, pH 5.2, 3M(NaAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td>뉴클레아제가 없는 H2O에 5&nbsp 용해; M solution, 멸균 필터</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(3' 인산가수분해효소 마이너스)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0236L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td><td>PEG 8000 (50%)</td>T7 DNA Polymerase (unmodified)와 함께 제공되는 <td>New England Biolabs</td><td>M0204L</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F2.0</td><td>Eppendorf</td><td>5387000013</td><td></td></tr>와 함께 제공</tbody></table>

동시 매핑 및 인간 미토 콘 드리 아 dna에 ribonucleotides의 정량

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Ribonucleotides는 게놈에 존재의 수를 추정 하 설립된 접근은 제한 법인된 ribonucleotides 템플릿으로 짧은 합성 DNA 파편 또는 플라스 미드를 사용 하 고 전체 결과 추정 하는 다음의 정량 게놈입니다. 또는, 알칼리 젤 또는 남부도 말을 사용 하 여 ribonucleotides는 게놈에 존재의 수를 견적 될 수 있습니다. 최근 비보에 접근 위치와 포함 된 ribonucleotides의 id를 제공 하는 ribonucleotides의 게놈 넓은 매핑 허용 다음-세대 시퀀싱을 사용 합니다. 그러나, 그들은 정량의 게놈으로 통합 되는 ribonucleotides의 수를 허용 하지 않습니다. 여기는 동시에 지도 하 고 차세대 시퀀싱에 의해 인간의 미토 콘 드리 아 DNA에서 에 비보에 통합 하는 ribonucleotides의 수를 quantitate 하는 방법에 설명 합니다. 우리가 매우 그대로 DNA를 사용 하 고 시퀀스 특정 이중 가닥 나누기는 endonuclease, 알칼리 이후에 hydrolyzing 법인된 ribonucleotides와 함께 그것을 소화 하 여 소개. 생성 된 끝은 어댑터와 출혈 그리고이 끝 다음-세대 시퀀싱 컴퓨터에서 시퀀싱 되. Ribonucleotides의 절대 수는 순서 특정 endonuclease 인식 사이트에서 읽기 평균 수 당 인식 사이트 밖에 서 읽기의 수로 계산할 수 있습니다. 이 프로토콜 또한 지도 및 DNA에 무료 흠을 quantitate 활용 될 수 있습니다 및 수 5´ 오를 처리할 수 있는 다른 DNA 병 변 지도를 적응 또는 5´-인산 염 끝. 또한,이 방법은 적합 한 참조 게놈은 사용할 수 있는 모든 유기 체에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 따라서 DNA 복제, 5´ 간 처리, DNA 손상, 및 DNA 복구 하는 중요 한 도구를 제공 합니다.

12를셀 위에서 설명한, 대표적인 데이터 생성 헬러에서 인간의 미토 콘 드리 아 DNA를 분석 하는 방법론을 설명 합니다. 그림 2B 요약된 읽기 모든 HincII 사이트에 보여줍니다 무거운 (HS)와 인간 mtDNA의 가벼운 물가 (LS) KCl 치료 (왼쪽된 패널) 후. 약 70% 모든 검색된 5´ 끝의 HincII 소화의 높은 효율을 보여주는 컷 사이트에 지역화 합니다. 라이브러리 포함 된 ribonucleotides에서 DNA를은 하 코 치료 약 40% (그림 2B, 오른쪽 패널)에 HincII 사이트에서 읽기 수가 감소 합니다. 이 많은 5´ 끝 ribonucleotide 관의 사이트에서 생성 되므로 충분 한 라이브러리 품질 지표입니다. 그림 2C 보여줍니다 지역화 및 5´-끝 (녹색)의 주파수 KCl 치료 및 읽기 생성 후 하이든-seq (마젠타)에 의해 코 치료 후, 무료 5´-끝과 끝에 ribonucleotides 알칼리 가수분해에 의해 생성 된. 무료 5´ 끝 및 ribonucleotides 인간 mtDNA의 HS에 지역화 왼쪽된 패널에 표시 되 고 그는 ls 지역화 오른쪽 패널에 표시 됩니다. Ribonucleotides (2D 그림, 상단 패널) 또는 HincII 사이트 (하단 패널) HS와 LS mtDNA의 원시 읽기의 상대적 숫자 표시, 각각, HS, 기준으로 LS의 14-fold 또는 31-fold 강한 범위 비슷한 편견에 대 한 관찰 하지 핵 한 DNA 이 스트랜드 바이어스 두 가닥의 기본 구성에 뚜렷한 차이 의해 설명 될 수 있습니다 고 HincII 사이트에 읽기에 정상화의 중요성을 보여 줍니다.
읽기를 정상화 미토 콘 드리 아 게놈 (그림 3A) 당 ribonucleotides의 수의 양적 측정 HincII 제공을 계산 합니다. 그림 3B에서 볼 수 있듯이 각 ribonucleotide 코 치료 각 가닥의 시퀀스 구성으로 정규화 후 읽기 표시 비율 1, 뚜렷한 ribonucleotide 제안 읽기의 비 무작위 분포를 나타내는 다른 패턴 및 높은 라이브러리 품질입니다. 그 비율은 이전 소화 효소의 분열 특이성을 확인 하는 HincII와의 영향을 받지 않습니다. 얼마나 많은 각 ribonucleotide 1000 보완 기지 ( 당 통합의 양적 측정을 생성 HincII 분열 사이트에서 그 뿐만 아니라 게놈 뉴클레오티드 내용에 포함 된 ribonucleotides의 사이트에서 읽기를 정상화 그림 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig1.jpg"> 
그림 1: DNA 처리 및 라이브러리 준비에 대 한 도식. (1) 전체 게놈 DNA는 죽 습 HincII에 의해 ribonucleotides의 후속 정량에 정규화에 대 한 생성 하는 HincII 사이트 (검은 화살표)에서 무뚝뚝한 끝. (2) DNA 2´, 3´ 끝 및 무료 5´ 오 끝에 3´ 순환 인산 염 (빨간 국방부)로 이어지는 코 ribonucleotide 사이트에서은 하와 함께 처리 됩니다. (3) 5´-오 끝 T4 Polynucleotide 키 니 아 제 3´-인산 가수분해 효소-빼기에 의해 phosphorylated는. (4) 모든 5´ 끝 인산 염 그룹을 들고 T4 RNA 리가 여 ARC140 oligonucleotide를 출혈 됩니다. (5) 두 번째 가닥 T7 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 임의의 N6 시퀀스를 포함 하는 ARC76-77 oligonucleotides 합성 됩니다. (6) 도서관은 한 고 충실도 DNA 중 합 효소 ARC49 및 다중화 고유 바코드를 포함 하는 ARC107 인덱스 뇌관을 ARC78 중 하나를 사용 하 여에 의해 증폭 된다. (7) 5´-끝 쌍 간 연속 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig2.jpg"> 
그림 2: 유효성 검사 메서드. (A) 대표 electropherograms의 품질을 결정 하는 자동화 된 전기 시스템을 사용 하 여 생성 생성 중 (HS)와 가벼운 물가 (LS) HincII 사이트에서 코 또는 KCl. (B) 요약 신호 처리 라이브러리 인간 mtDNA KCl (왼쪽된 패널) 또는 코 (오른쪽 패널) 치료 후. (C) Circos 무료 5´-끝 (녹색)의 하이든-Seq (무료 5´ 끝 및 ribonucleotides, 마젠타색) HS (왼쪽된 패널)과 LS (오른쪽 패널) 인간 mtDNA에서에서 그림. 봉우리는 백만 읽기 당으로 정규화 하 고 최대 피크 하이든-seq 라이브러리의 읽기의 최대 수를 조정 됩니다. (D) 요약 원시 ribonucleotides (위 패널)와 HincII (하단 패널) 무거운 (H)와 빛 (L) 가닥 인간 mtDNA (미토.) 또는 반전 (RV) 또는 핵 (Nuc.)에서 포워드 (FW) 가닥에서 읽습니다. DNA입니다. 그림 B, C 및 D는 참조12에서 적응. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig3.jpg"> 
그림 3: 대표 결과. (A) 상대 수 코 처리 라이브러리 무거운 (H) 또는 빛 (L) 물가에 대 한 HincII 사이트에서 읽기를 정규화 하는 ribonucleotides입니다. 코에 대 한 mtDNA 게놈에 ribonucleotide 정체성의 (B) 비 (코)를 취급 하 고 HincII 코 취급 (HincII + 코)와 무거운 (H) 또는 mtDNA의 빛 (L) 물가에 라이브러리 죽 습. (C) HincII 및 코 처리 라이브러리 무거운 (H) 또는 mtDNA의 빛 (L) 물가에 대 한 Ribonucleotide 주파수 1000 보완 기지를 정규화. 수치는 참조12에서 적응. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56551/56551fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>이름</td>
			<td colspan="4">시퀀스</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC49</td>
			<td colspan="4">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC76</td>
			<td colspan="4">GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC77</td>
			<td colspan="4">AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC78</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC84</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC85</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC86</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC87</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA</td></tr></tbody></table>TCT
		
		<tr>
			<td>ARC88</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC89</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC90</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC91</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC93</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC94</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC95</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC96</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC97</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC98</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC99</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC100</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC101</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC102</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC103</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC104</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC105</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC106</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC107</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC140</td>
			<td colspan="4">/ 5AmMC6/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
	

표 1: Oligonucleotides. 하이든이 사용 oligonucleotides 같습니다 대담한 얼굴 색인을 나타냅니다. * phosphorothioate 본드를 나타냅니다. ARC140 C6 링커 함께에서 5´ 오 그룹 대신 5´ 아미노 그룹을 포함 되어 있습니다. 이 수정 결 찰 하는 동안 ARC140 concatemers의 형성을 감소 시킨다.

여기 우리는 동시에 quantitate 의무가 메서드와 알칼리 가수분해와 후속 5´-엔드 genomic DNA의 효소 분열을 결합 하 여 단일 뉴클레오티드 해상도 높은 그대로 DNA에 게놈 넓은 지도 ribonucleotides 설명 시퀀싱.

동시 매핑 및 인간 미토 콘 드리 아 DNA에 Ribonucleotides의 정량

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

이 실험의 전반적인 목표는 단일 뉴클레오티드 분해능 수준에서 통합된 리보뉴클레오티드의 위치를 매핑하고 인간 미토콘드리아 DNA에 존재하는 리보뉴클레오티드의 수를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 DNA 무결성, DNA 복제 메커니즘, DNA 복구 메커니즘 및 이러한 메커니즘의 결함이 어떻게 질병을 유발하는지에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 미토콘드리아 DNA에 통합된 리보뉴클레오티드의 위치와 수를 모두 단일 실험에서 결정할 수 있다는 것입니다.이 방법은 인간 미토콘드리아 DNA의 리보뉴클레오티드 함량에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 모델 유기체의 염기서열 게놈에서 핵 DNA 및 리보뉴클레오티드 함량을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다. 이전에 HeLa 세포에서 분리하고 텍스트 프로토콜의 섹션 2 및 3에 설명된 게놈 DNA가 이 실험에 사용됩니다. DNA를 소화하려면 마이크로분리관에 다음을 조심스럽게 섞습니다.DNA 1마이크로그램, 10X 버퍼 3.1 5마이크로리터, HincII 1마이크로리터 및 뉴클레아제가 없는 물을 최종 부피 50마이크로리터로 만듭니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 분해가 완료되면 각 샘플에 1.8 부피의 상자성 비드를 추가하고 피펫팅으로 조심스럽게 혼합한 다음 실온에서 10분 동안 배양합니다.튜브를 마그네틱 랙에 5분 동안 올려 놓고 비드를 펠릿화한 다음 상층액을 제거하고 버립니다. 펠릿을 150마이크로리터의 70% 에탄올로 약 30초 동안 세척한 다음 상등액을 제거하고 버립니다. 200마이크로리터의 70% 에탄올로 30초 더 세척을 반복합니다.샘플을 실온에서 약 15-20분 동안 건조시킵니다. 그런 다음 마그네틱 랙에서 튜브를 제거합니다. 각 펠릿을 45마이크로리터의 용리 완충액에 용리시키고 조심스럽게 피펫팅하여 혼합한 후 5분 동안 배양합니다.마그네틱 랙에 비드를 펠렛으로 넣고 각 DNA 샘플 45마이크로리터를 새 튜브로 옮깁니다. 각 45마이크로리터의 분리 또는 정제된 DNA에 5마이크로리터의 3몰 수산화칼륨 또는 5마이크로리터의 3몰 염화칼륨을 추가하여 총 50마이크로리터의 부피를 만듭니다. 8가지 반응이 이 표에 요약되어 있습니다.섭씨 55도의 교잡 오븐에서 2시간 동안 배양한 다음 얼음에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. pH 5.2에서 10 마이크로 리터의 3 몰 아세트산 나트륨과 125 마이크로 리터의 차가운 100 % 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시키고 5 분 동안 얼음에서 배양합니다. 21, 000 시간 G에서 5 분 동안 섭씨 4도에서 원심 분리하여 DNA를 펠렛화합니다.상층액을 버리고 각 DNA 펠릿을 250마이크로리터의 냉기, 70% 에탄올로 세척하고 다시 원심분리기를 하고 상등액을 버립니다. 눈에 보이는 액체가 증발할 때까지 열린 튜브에서 펠릿을 약 5-10분 동안 건조시킵니다. 마지막으로 20마이크로리터의 용리 완충액을 넣고 DNA 펠릿을 실온에서 30분 동안 용해시킵니다.각 샘플에 대한 반응 혼합물을 마스터 혼합물로 준비하여 이 절차를 시작합니다. 각 샘플에 대해 2.5마이크로리터의 10x T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 반응 완충액, 2.5마이크로리터의 ATP 및 1마이크로리터의 3프라임 포스파타아제-마이너스 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 추가합니다. 각 DNA 샘플의 19 마이크로 리터를 새로운 200 마이크로 리터 튜브로 옮기고 3 분 동안 열 순환기에서 섭씨 85도에서 변성시킵니다.그런 다음 DNA 샘플을 얼음에서 식히고 준비된 반응 혼합물 6마이크로리터를 각 샘플에 추가합니다. 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양한 다음 섭씨 65도에서 20분 동안 배양하여 반응을 중단합니다. 앞서 설명한 것처럼 상자성 비드를 사용하여 DNA를 정제하되 14마이크로리터의 용리 완충액으로 용리합니다.반응 혼합물을 각 샘플에 대해 다음을 포함하는 마스터 혼합물로 미리 준비합니다. 5마이크로리터의 10x T4 RNA 리가제 반응 완충액, 5마이크로리터의 헥사미네코발트(III)클로라이드, 0.5마이크로리터의 ARC140 올리고뉴클레오티드, 0.5마이크로리터의 ATP 및 25마이크로리터의 50%PEG 8000. 피펫팅으로 잘 섞습니다.정제된 각 DNA 13마이크로리터를 새로운 200마이크로리터 튜브로 옮기고 열순환기에서 섭씨 85도에서 3분 동안 변성시킵니다. 얼음에서 DNA를 식힌 다음 각 샘플에 36마이크로리터의 반응 혼합물을 추가하고 피펫팅으로 혼합한 다음 잠시 스핀다운합니다. 각 반응에 1마이크로리터의 T4 RNA 리가아제를 첨가하고 피펫팅으로 혼합한 다음 간단히 스핀다운합니다.밤새 어두운 실온에서 샘플을 배양합니다. 단일 가닥 DNA 접합이 완료되면 앞서 설명한 대로 DNA를 정제하되 0.8부피의 상자성 비드를 사용하고 비드를 10분 동안 펠릿화합니다. 20마이크로리터의 용리 완충액을 용리하고 각 DNA 샘플 20마이크로리터를 새로운 200마이크로리터 튜브로 옮깁니다.0.8 부피의 상자성 비드로 정제를 반복하고 14 마이크로리터의 용리 완충액에서 용리합니다. 각 샘플에 대해 2마이크로리터의 10x T7 DNA 중합효소 반응 완충액, 2마이크로리터의 ARC76/77, 2마이크로리터의 dNTP 및 0.8마이크로리터의 BSA로 구성된 마스터 믹스로 반응 혼합물을 준비합니다. 정제된 DNA 12.8마이크로리터를 새로운 200마이크로리터 튜브로 옮기고 열순환기에서 섭씨 85도에서 3분 동안 변성시킵니다.얼음에서 DNA를 식힌 다음 각 샘플에 6.8마이크로리터의 반응 혼합물을 첨가하고 피펫팅으로 혼합한 다음 잠시 스핀다운하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 각 반응에 0.4마이크로리터의 T7 DNA 중합효소를 첨가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 상자성 비드를 사용하여 DNA를 정제한 후 11마이크로리터의 용리 완충액에서 용리합니다.PCR 증폭을 시작하려면 7.5 마이크로리터의 ARC49, 7.5 마이크로리터의 고유 인덱스 프라이머 및 25 마이크로리터의 2X 핫 스타트 레디 믹스로 구성된 새로운 200 마이크로리터 튜브에서 각 샘플에 대해 반응 혼합물을 개별적으로 준비합니다. 각 반응에 10마이크로리터의 DNA 샘플을 추가합니다. 다음 조건을 사용하여 라이브러리를 증폭합니다.섭씨 95도에서 45초 동안 변성된 후 섭씨 98도에서 15초 동안, 섭씨 65도에서 30초, 섭씨 72도에서 30초 동안 18회 변성하고 2분 동안 섭씨 72도에서 최종 연신으로 끝납니다. 증폭 후 샘플을 섭씨 4도에서 유지합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라이브러리를 정제하고 20마이크로리터의 TE 버퍼에서 용리합니다.디지털 전기영동 시스템을 사용하여 각 라이브러리의 품질과 평균 단편 크기를 결정합니다. 수산화칼륨 또는 염화칼륨 처리 후 적합한 라이브러리 프로파일의 대표적인 결과가 표시됩니다. 각 라이브러리의 농도를 계산한 후, 텍스트 프로토콜의 섹션 9 및 10에 설명된 대로 염기서열분석을 위해 서로 다른 인덱스 프라이머로 증폭된 최대 24개 라이브러리의 동일한 몰 양을 추출합니다.TE 완충액을 25마이크로리터의 최종 부피와 10나노몰의 농도에 추가합니다. 염기서열분석 후 텍스트 프로토콜의 섹션 11에 지정된 대로 생물정보학 데이터 분석을 수행합니다. 이 그래프는 염화칼륨 처리 후 가벼운 가닥 및 두꺼운 가닥 인간 미토콘드리아 DNA의 모든 HincII 부위에서 요약된 판독을 보여줍니다.약 70%의 검출된 5개의 프라임 말단이 절단 부위에 국한되어 HincII 분해의 높은 효율성을 보여줍니다. 수산화칼륨으로 라이브러리를 처리하여 내장된 리보뉴클레오티드에서 DNA를 가수분해하면 HincII의 판독 횟수가 약 40%로 감소합니다.미토콘드리아 DNA와 핵 DNA의 상대적인 판독 횟수는 적용 범위의 차이를 보여주고 가닥 편향을 제거하기 위한 적절한 정규화의 중요성을 보여줍니다. 판독 횟수를 HincII로 정규화하면 무겁거나 가벼운 가닥에서 미토콘드리아 게놈당 리보뉴클레오티드의 수를 정량적으로 측정할 수 있습니다.각 리보뉴클레오티드에 대한 수산화칼륨 처리 후 각 가닥의 염기서열 조성으로 정규화된 판독은 1과 다른 비율을 보여주며, 이는 판독의 비무작위 분포를 나타내고 뚜렷한 리보뉴클레오티드 패턴과 높은 라이브러리 품질을 시사합니다. 끼워넣어진 리보뉴클레오티드의 위치에 읽을, 뿐 아니라 게놈 뉴클레오티드 내용에 HincII 위치에 그들에 정상화해서, 각 리보뉴클레오티드의 얼마나 많은 것이 1 당 통합되는지, 000의 자유로운 기초 생성한다. 일단 마스터하면 이 프로토콜이 제대로 수행되면 이틀 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 DNA를 매우 정확하게 유지하고 라이브러리 준비 중에 이중 가닥 절단을 도입하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 리보뉴클레오티드 정량화 데이터를 확인하기 위해 다음과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 차세대 염기서열분석을 사용하여 리보뉴클레오티드와 DNA의 맵핑 및 정량화를 위해 라이브러리를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.수산화칼륨과 같은 화학 물질로 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 보안경 및 장갑 착용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

simultaneous-mapping-quantitation-ribonucleotides-human-mitochondrial

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수...

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

우리는 mtDNA의 biogenesis를 공부하기 위해서는 각각의 세포에서 새로 합성된 DNA mitochondrial (mtDNA)를 라벨에 민감한 기술을 개발했습니다. 기술은 뉴런의 subcellular 구획 내에 mtDNA 복제를 시각화하는 tyramide 신호 증폭 (TSA) 프로토콜과 함께 에듀의 결합이 결합되어 있습니다.

에듀 신호 증폭 개별 세포 Mitochondrial DNA 복제의 시각화

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

이 프로토콜은 시판되는 DNA 젤 얼룩이 있는 미토콘드리아 핵종의 특정 라벨링, 초고해상도 구조조명 현미경(SR-SIM)에 의한 라이브 라벨링 세포의 타임랩스 시리즈 획득, 핵운동의 자동 추적을 설명합니다.

시간 경과 구조화 조명 현미경 검사법에 대한 미토콘드리아 핵의 특정 라벨링

우리는 원형 RT-PCR, 정량적 RT-PCR, RNA 5' 폴리포스파타제 처리 및 북부 블롯을 결합하여 원형 RT-PCR 기반 전략을 제시합니다. 이 프로토콜은 불안정한 5' 삼인산염의 영향을 최소화하기 위한 정규화 단계를 포함하며, 옥수수 미토콘드리아에 안정적으로 축적된 1차 및 처리된 전사체를 차별하고 매핑하는 데 적합하다.

원형 RT-PCR 기반 전략을 사용하여 옥수수 미토콘드리아의 기본 및 처리된 성적증명서의 차별 및 매핑

파이로시퀀싱 분석은 이형질 세포 또는 조직에서 미토콘드리아 DNA 단일 뉴클레오티드 다형성의 강력하고 신속한 유전형 분석을 가능하게 합니다.

파이로시퀀싱에 의한 미토콘드리아 게놈의 단일 뉴클레오티드 다형성 유전자형 분석

mtDNA 합성 및 분포를 검출하고 정량화하기 위해 다중 웰 플레이트 형식 및 자동화된 면역형광 이미징을 사용하여 세포에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 대사의 역학을 연구하는 절차가 설명되어 있습니다. 이것은 mtDNA 대사에 대한 다양한 억제제, 세포 스트레스 및 유전자 침묵의 효과를 조사하는 데 추가로 사용될 수 있습니다.

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이 비디오에서는, 우리는 인간의 배아 줄기 세포의 mitochondrial 호흡 체인 단지가 겔 활동 assays 사용하여 분석할 수있는 방법을 보여줍니다.

인간 배아 줄기 세포에서 Mitochondrial 복잡한 활동에 대한 탐색

특정 세포로 hESCs의 감독 차별은 재생 의학에 많은 관심을 생성했다. 우리는 결정을위한 간결하고 단계별 절차를...

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γH2AX foci을 바탕으로 DNA 이중 가닥 나누기의 Quantitation는 조직 radiosensitivity 방사선 수정 화합물의 효과 평가를 위해, 특히 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 조직 샘플에서 γH2AX foci의 quantitation위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

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학습하세요 인간 미토콘드리아 DNA의 리보뉴클레오티드를 단일 염기 분해능으로 동시 매핑 및 정량하는 방법을. 효소적 소화와 알칼리 가수분해를 결합한 이 기법은 DNA 무결성 및 질병 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

동시 매핑 및 인간 미토 콘 드리 아 DNA에 Ribonucleotides의 정량

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