Name: 분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 배우세요 시상피질 축삭 분기와 시냅스 형성을 동시에 관찰하는 organotypic coculture 기법을 활용한 신경회로 발달 연구 방법입니다. 이 기술은 개별 살아있는 세포에서 축삭 성장과 시냅스 발달의 동적 변화를 실시간으로 분석하여 신경가소성 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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우리는 또한 중요 한 독서에 대 한 가브리엘 손을 감사합니다.

모든 실험은 오사카 대학 및 일본 신경 과학 학회의 동물 복지 위원회에 의해 설립 하는 지침에 따라 수행 했다.
1. Organotypic cocultures의 시상과 대뇌 피 질
참고: 자세한 절차를 참조 원래 간행물7,8,13. 모든 절차는 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다. Sprague-Dawley (SD) 쥐 신경 문화 사용 됩니다.
<ol><li>
시 약의 준비 참고: 다음 시 약의 한 쥐 두뇌에 대 한 있습니다.<ol>
<li>
수정 된 n 2 보충 x 10 준비 13: 인슐린 (50 μ g/mL), 황 체 호르몬 (200 nM), 하이드로 코 티 손 (200 nM), 나트륨 selenite (300 nM), 올려진다 (1 mg/mL), putrescine (1mm), 포도 (60 mg/mL)</li>
		<li>
준비 포함 하는 혈 청 문화 매체 (10 mL): 85 %DMEM / F12, 10% 수정 10 x n 2 보충, 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)</li>
		<li>
준비 혈 청 무료 문화 매체 (20 mL): 90 %DMEM / F12, 10% 수정 10 x n 2 보충</li>
		<li>쥐 꼬리 콜라겐 솔루션 (0.5 mL)을 준비 합니다. 간단히, 무 균 조건 하에서 쥐 꼬리에서 부드러운 섬유를 초 산 솔루션에서 밤새 품 어. 원심, 후 상쾌한 (몇 mg/mL)를 수집 하 고 냉장고13에 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화 요리 준비
	<ol>
<li>35 mm 페 트리 접시에 막 삽입을 놓습니다.</li>
		<li>막에 쥐 꼬리 콜라겐 솔루션의 40-50 μ를 추가 하 고 중심 콜라겐 솔루션을 확산.</li>
		<li>공기 깨끗 한 벤치에 완전히 막 건조.</li>
		<li>막이는 매체와 젖, 접시에 포함 하는 혈 청 문화 매체의 1.5-2 mL를 넣어.</li>
		<li>인큐베이터에서 (37 ° C, 습도 95%, 공기와 5% CO2) 도금 하기 전에 문화 접시를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
대뇌 피 질의 조각 준비
	<ol>
<li>모든 수술 기구 70% 에탄올과 10 분 이상 소독.</li>
		<li>출생 후 하루 (P) 2에서 신속 하 게 뇌를 해 부 (몇 분 동안 얼음 조각에 몰두) 하는 차가운 취 쥐.</li>
		<li>장소 100 mm 페 트리 접시 찬 행 크 스의 100 mL를 포함으로 뇌 균형 소금 솔루션.</li>
		<li>좋은 겸으로 두뇌에서 피아 문제를 제거 하 고 microsurgical가 위 시각과 somatosensory 피 질에서 대뇌 피 질의 조각 (300-400 μ m 두께)를 잘라 (세부 사항, 그림 1참조). 참고: 대뇌 피 질의 조각의 두께 쌍 안 현미경 격자의 규모에 의해 대략 추정 된다. 참고: 또는, 대뇌 피 질의 조각 무 균 조건 하에서 vibratome로 할 수 있다.</li>
		<li>일회용 플라스틱 피 펫으로 막 삽입에 몇 대뇌 피 질의 조각 전송 합니다.</li>
		<li>(자세한 내용은 참조8,13) 화재 광택 파스퇴르 피펫으로와 문화 삽입의 중앙 조각의 위치를 조정 하 고 삽입에서 초과 매체를 제거 합니다. 참고: 슬라이스 가스 매체의 충분 한 공급 받을 수 있도록 조각의 표면 보다 약간 중간의 레벨을 조정 합니다. 이것은 세포 생존 능력에 대 한 중요 합니다.</li>
		<li>혼자 하루 전에 thalamic 블록을 촬영 하 고 그것을 옆에 배치 되어 습도 95% 공기와 5% CO2, 그리고 문화의 환경에서 37 ° C에서 포함 하는 혈 청 문화 매체에서 분할 영역을 유지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Thalamic 블록의 준비
	<ol>
<li>모든 수술 기구 70% 에탄올과 10 분 이상 소독.</li>
		<li>임신한 쥐 (배아 하루 15) 복 주사 pentobarbital (50 mg/kg) 마 취를 포함 하 여 anesthetize.</li>
		<li>자 궁 뿔에서 각 태아를 해 부 고 배아 100 mm 페 트리 접시 찬 행 크 스 균형된 소금 솔루션의 100 mL를 포함 합니다.</li>
		<li>쌍 안 현미경 각 배아에서 뇌를 제거 하 고 주로 microsurgical가 위 ( 그림 1참조)를 사용 하 여 ventrobasal 복잡 하 고 측면 geniculate 핵 (약 0.5 m m x 3)7 을 포함 하는 thalamic 블록을 잘라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화 및 organotypic cocultures를 유지
	<ol>
<li>파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 멤브레인 필터에 배치 되어 있는 대뇌 피 질의 조각의 심 실 표면 옆 thalamic 블록을 배치 합니다.</li>
		<li>습도 95% 공기와 5% CO2의 환경에서 37 ° C에서 포함 하는 혈 청 문화 매체에서 cocultures을 유지 관리 합니다.</li>
		<li>문화에 있는 2 일 후 혈 청 무료 문화 매체와 매체의 절반을 교환 합니다. 그 후, 매체 2-3 일 마다 교환 합니다. 참고: 매체의 수준으로 세포 생존에 대 한 중요 한 중간 교환 후 확인 되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. Electroporation
모든 절차는 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.
참고: Electroporation 블록의 분리를 방지 하기 위해 thalamic 블록의 준비 후에 1 일을 수행 합니다.
<ol><li>
플라스 미드
	<ol>
<li>플라스 미드의 혼합물을 다음과 같이 확인: pCAGGS-DsRed 2 μ g/μ; pCAG SYP EGFP 3.5 μ g/μ. 참고: 내 무료 Maxiprep 키트를 사용 하 여 두 플라스 미드 정화 하 고 행 크 스 균형된 소금물에 용 해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electroporation 장비 설치 자극과는 아이 솔 레이 터 등 전기 악기는 그림 2와 같이 연결 되어야 합니다.<ol>
<li>복 형 아이 솔 레이 터에는 자극을 연결 합니다.</li>
		<li>전극 (실버 와이어 0.2 m m 직경)는 아이 솔 레이 터의 부정적인 터미널에 연결 합니다.</li>
		<li>전극 (실버 와이어 1 m m 직경) 시리즈는 100 Ω 저항 하는 아이 솔 레이 터의 긍정 맨끝에 연결 합니다.</li>
		<li>전기 전류 저항는 증폭기와 전압을 측정 하 여 전달 여부를 모니터링 하는 오실로스코프에 앰프를 연결 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
유리 펫의 준비 참고: 두 가지 유형의 유리 펫 플라스 미드 솔루션의 방출 및 전기 펄스의 응용 프로그램에 대 한 사용 됩니다.<ol>
<li>전극 끌어당기는 사람와 유리 모 세관에서 펫을 확인 합니다.</li>
		<li>휴식 방출 피 펫에 대 한 팁 (팁 직경 20-50 μ m 이어야 한다).</li>
		<li>갈기 고 화재 연마 (내부 직경 50-200 μ m 이어야 한다) 다음 샌드 페이퍼와 전극 피 펫의 끝을 폴란드어. 참고: 전극 팁은 직접 조직 접촉으로 평평 하 고 부드러운, 이어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Electroporation 절차
	<ol>
<li>배출 및 전극 펫은 컨트롤러에 연결 합니다.</li>
		<li>전극 피 펫에 실버 와이어 (0.2 m m 직경)를 삽입 합니다.</li>
		<li>플라스틱 튜브 1 mL 주사기를 방출 피 펫을 연결 합니다.</li>
		<li>차지 > 주사기 흡입에 의해 방출 피 펫에 플라스 미드 솔루션의 5 μ.</li>
		<li>Electroporation 단계에 coculture를 넣어 하 고 문화 매체에 1mm 직경 전극 삽입.</li>
		<li>Thalamic explant에 방출 피 펫을 놓습니다.</li>
		<li>팁 thalamic 블록의 표면 접촉 후 주사기를 수동으로 밀어. 참고: 플라스 미드의 0.5 μ에 대 한 솔루션으로 하나의 thalamic 블록 당 사용 됩니다.</li>
		<li>즉시 방출 피 펫의 철회 후 전극 피 펫을 thalamic 블록에 놓습니다.</li>
		<li>전기 펄스 (50-400 µ A, 200 Hz에서 1 ms 기간 200 평방 펄스의 3 ~ 5 열차)를 제공 합니다. 진폭 및 오실로스코프에 열차의 수를 모니터링 합니다. 참고: 전기 전류 진폭 전극 피 펫13의 내부 직경에 따라 다릅니다.</li>
		<li>전극 피 펫을 철회 하 고 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
현미경 관찰
	<ol>
<li>문화 요리 EGFP에 대 한 두 개의 필터 집합을 갖춘 올바른 confocal 현미경의 현미경 단계에 넣어 (여기, 488 nm; 방출, 515 nm) 및 DsRed (여기, 514 nm, 방출, 565 nm).</li>
		<li>1-7 µ m 단계 크기는 20 X 긴 작동 거리 대물 렌즈에서 10-25 광 섹션의 이미지를 가져가 라. DsRed와 SYP EGFP 표현 하는 개별적으로 구별할 수 레이블이 축 삭을 선택 합니다. 참고: 관찰된 지역 (1024 x 1024 픽셀, 즉 해당, 0.68 μ m/픽셀) 약 0.7 x 0.7 m m 이다.</li>
		<li>캡처 이미지 매일 이미징에 대 한 모든 24 h. 실 온에서 10 분 이내 완료 하 고 문화 인큐베이터에 반환. 짧은 간격 시간 경과 영상에 대 한의 환경 습도 95% 공기와 5% CO2 37 ° c.에 유지 문화 실에서 문화 유지</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Kageyama, G. H., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+geniculocortical+projections+to+visual+cortex+in+rat%3A+evidence+early+ingrowth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis.</a> J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).</li>
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<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li>
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<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+specificity+of+extrinsic+cortical+connections+studied+in+coculture+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations.</a> Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).</li>
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<li>Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+laminar+specificity+and+activity-dependent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching.</a> J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).</li>
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<li>Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-dependent+and+independent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching+are+regulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity.</a> Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).</li>
<li>Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282233732_Electroporation_Method_for_Mammalian_CNS_Neurons_in_Organotypic_Slice_Cultures">Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures.</a> Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).</li>
<li>Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regional+specificity+for+connections+formed+between+thalamus+and+cortex+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture.</a> Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+mechanism+by+polysialic+acid+for+lamina-specific+branch+formation+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons.</a> J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+factors+regulating+lamina-specific+growth+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons.</a> J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).</li>
<li>Ohnami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RhoA+in+activity-dependent+cortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching.</a> J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).</li>
<li>Yamada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pre-+and+postsynaptic+activity+in+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

현재 프로토콜은 또한 TC 프로젝션11의 다른 축 삭 성장 발달 측면을 연구 하는 강력한 도구입니다. 예를 들어, 대뇌 피 질의 조각 문화와 electroporation 기술은의 조합을 대뇌 피 질의 신경 세포와 장기 관찰9,18의 개별 axonal 형태를 시각화 수 있습니다.
현재 프로토콜을 사용 하 여 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성에 흥미 있는 유전자의 역할은 또한 형광 단백질 및 관심 유전자의 공동 식으로 분석할 수 있습니다. 일반적으로, 이상의 형광 단백질 표현 세포의 90%는 공동 페 두 번째 플라스 미드와 플라스 미드 솔루션의 어 금 니 비율 1:218,19로 조정. 그러나, 최적의 비율 공동 transfection ...

포유류 두뇌에 있는 thalamocortical (TC) 투영 축 삭 지도 메커니즘을 대상으로 조사에 적합 한 시스템입니다. 개발 하는 동안 감각 TC axons 외피 격판덮개 및 양식 지점과 시 냅 스에 우선적으로 레이어 IV의 대뇌 피 질1,2차 감각 영역에서 성장 한다. 근본적인 연결의 설립 후에 axonal 아 버와 시 냅 스 터미널은 환경 변화3,4에 따라 리 모델링. 그러나, 어떻게 TC 축 삭 형태학 동적으로 변경 되는 제대로 이해. 주된 이유 중 하나는 단일 세포 수준에서 구조적인 변화를 관찰 하는 적절 한 기법의 부족 이다. 전반적인 TC 궤적5, 을 캡처에 대 한 여전히 기술적인 제한이 있다 현미경 검사 법, 2 광자 현미경 등 최근 개발 허용 생활 대뇌 피 질의 뉴런에 vivo에서의 직접 관찰, 비록 6. 따라서, TC 축 삭의 라이브 이미징 방법 체 외에서 축 삭 분기 및 시 냅 스 대형의 구조 분석을 위한 강력한 도구를 제공 것.
처음으로 우리 그룹 설립 투과성 막7정적 슬라이스 문화 방법. 이 방법을 사용 하 여, 쥐 대뇌 피 질의 조각 했다 감각 thalamic 블록, cocultured 그리고 lamina 특정 TC 연결 했다이 organotypic cocultures7,8지. 형광 단백질으로 스파스 라벨 추가 수 있었습니다 TC 축 삭 성장 및 지점 형성9,,1011관찰. 최근에, 분기의 동시 이미징에 대 한 새로운 방법을 개발 했습니다 그리고는 organotypic에서 개별 TC 축 삭 시 냅 스 형성 cocultures12. TC 축 삭과 연 접 사이트를 동시에 시각화할 DsRed EGFP 태그 synaptophysin (SYP EGFP) 했다 organotypic coculture의 electroporation에 의해 thalamic 뉴런의 작은 수로 공동 transfected. 현재 메서드는 TC axons의 형태소 분석을 용이 하 게 하 고 장기 관찰, 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이의 인과 관계를 표시 하는 데 사용할 수 있습니다 허용 합니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)</td><td>Nissui</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>Fetal 소 세럼 (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396-03</td><td>Hyclone</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td></td><td>Sigma P8783</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma& 주의;</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 셀렌트</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>192-10843</td><td></td></tr><tr><td>트랜스퍼린&nbsp;</td><td>시그마</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>35mm 페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM 인서트</td><td>Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>100mm 페트리 접시</td><td>BIO-BIK</td><td>I-90-20</td><td>페트리 접시 sterrile</td></tr><tr><td>HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>K210006</tr><tr><td>일회용 멸균 플라스틱 피펫</td><td></td><td>202-IS</td><td>트랜스퍼 피펫 멸균</td></tr><tr><td>유리 모세관: OD 1.2 mm</td><td>Narishige</td><td>&nbsp; G-1.2</td><td>내경, 1.2 mm</td></tr><tr><td>실버 와이어: 0.2 및 1 mm&nbsp;</td><td>Nilaco</td><td>AG-401265 (직경, 0.2 mm), AG-401485 (직경, 1.0 mm)</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator&nbsp;</td><td>A.M.P.I</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td>바이페이식 아이솔레이터&nbsp;</td><td>BAK ELECTRONICS</td><td>BSI-2</td><td></td></tr><tr><td>증폭기&nbsp;</td><td>A-M 시스템</td><td>모델 1800</td><td></td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>Hitachi</td><td>VC-6723</td><td></td></tr><tr><td>조작기</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 조작기</td><td>Narishige</td><td>MO-10</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td>범용 스탠드&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZ-STU2</td><td></td></tr><tr><td>조명 시스템&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>LG-PS2, LG-DI, HLL301</td><td></td></tr><tr><td>전극 풀러&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td>Digital eclipse C1 레이저</td><td></td></tr><tr><td>x20 대물</td><td>렌즈 Nikon</td><td>ELWD 20x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>배양실</td><td>Tokai Hit</td><td>UK A16-U</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) rat</td><td>Japan SLC 및 Nihon-Dobutsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsurgery scissors</td><td>Natsume&nbsp;</td><td>MB-54-1</td><td></td></tr></tbody></table>

분기 thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 organotypic cocultures에서 형성

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 하는 정확한 신경 회로 설정 하기 위한 중요 한 프로세스입니다. 개발 하는 동안 감각 thalamocortical (TC) 축 삭 대뇌 피 질의 특정 레이어에 지점과 시 냅 스 형성합니다. 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이 명백한 공간 상관 관계에도 불구 하 고 그들 사이의 인과 관계가 제대로 이해 된다. 이 문제를 해결 하려면 우리는 최근 organotypic cocultures에서 개별 TC 축 삭의 분기 및 시 냅 스 대형의 동시 이미징 방법을 개발.
이 프로토콜 organotypic coculture 및 electroporation의 조합으로 구성 되는 방법을 설명 합니다. 시상과 대뇌 피 질의 Organotypic cocultures 유전자 조작 및 axonal 프로세스, 박판 모양 구성 등 독특한 구조를 보존의 관측을 촉진 한다. 두 가지 플라스 미드 DsRed EGFP 태그 synaptophysin (SYP EGFP) 인코딩 했다 electroporation 기술에 의해 thalamic 뉴런의 작은 수로 공동 transfected. 이 메서드를 사용 하 여 TC 뉴런의 개별 axonal 형태학 및 연 접 사이트를 동시에 시각화 수 있었습니다. 메서드는 또한 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이의 인과 관계를 밝혀 장기 관찰을 사용할 수 있습니다.

실험 여기 TC 축 삭 분기 및 시 냅 스 형성 사이의 관계를 공개 하는 것을 목표로 설명 합니다. 동시에 시각화 axonal 궤도 및 연 접 사이트, 단일의 위치 또는 몇 thalamic 셀 organotypic cocultures 인코딩 SYP EGFP 및 DsRed electroporation를 사용 하 여 두 개의 플라스 미드와 페 했다. 문화에서 두 번째 주 동안 개별적으로 구별할 수 TC axons 했다 DsRed (그림 3)에 의해 명확 하 게 표시 됩니다. DsRed 및 SYP EGFP 전시 axons만 관찰에 대 한 선정 됐다. 레이블이 지정 된 TC axons 대뇌 피 질의 조각 침공과 organotypic에서 thalamic axons vivo에서7, 있는 층 류 특이성 닮은와 양식 지점 cocultures를 나타내는 상...

이 프로토콜 thalamocortical 축 삭 분기 및 시 냅 스 대형의 organotypic cocultures에서 시상과 대뇌 피 질의 동시 이미징 하는 방법을 설명합니다. 개별 thalamocortical 축 삭 및 그들의 연 접 맨끝 DsRed와 GFP 태그 synaptophysin 단일 셀 electroporation 기법으로 시각화 됩니다.

분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

이 방법의 전반적인 목표는 시상 피질 돌기에서 축삭 분지 및 시냅스 형성의 동적 형태 학적 변화를 연구하는 것입니다. 이 방법은 새로운 신경 회로 형성과 같은 신경 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 개별 살아있는 세포에서 축삭 성장과 시냅스 형성을 동시에 관찰할 수 있다는 것입니다.이 방법은 시상 피질 돌기에서 축삭 분기와 시냅스 형성 사이의 관계에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한 대뇌 피질의 내재적 연결과 같은 다른 신경 회로에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 모든 수술 기구를 70% 에탄올로 10분 이상 소독하십시오.다음으로, 얼음처럼 차가운 마취 상태에서 출생 후 2일차 쥐에서 전체 뇌를 빠르게 해부합니다. 그런 다음 40ml의 차가운 Hank's Balanced Salt Solution이 들어 있는 100mm 페트리 접시에 뇌를 넣습니다. 양안 현미경으로 미세한 집게로 피아 물질을 조심스럽게 제거하고 미세 수술 용 가위를 사용하여 1 차 시각 및 체성 감각 피질을 300-400 미크론 두께의 조각으로 자릅니다.그 후, 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 피질 조각을 배양 삽입물의 멤브레인 필터로 옮깁니다. 일회용 플라스틱 피펫으로 배양 인서트 중앙 근처의 슬라이스 위치를 조정하고 인서트에서 여분의 매체를 제거합니다. 혈청 함유 배양 배지에서 슬라이스를 섭씨 37도로 유지하고 하루 동안 단독으로 배양한 후 그 옆에 E15 배아의 시상 블록을 놓습니다.슬라이스가 가스와 매체 모두를 충분히 공급할 수 있도록 슬라이스 표면보다 약간 아래에 있는 매체의 수준을 조정합니다. 이것은 슬라이스의 생존 가능성에 매우 중요합니다. 이 단계에서는 전극 풀러로 유리 모세관을 만듭니다.그런 다음 플라스미드 주입을 위해 유리 모세혈관의 끝을 끊습니다. 전극 피펫의 경우 유리 모세관의 끝을 사포로 갈아서 연마합니다. 그런 다음 내경이 50-200 미크론이 되도록 화재 연마합니다.다음으로, 전극 피펫과 배출 피펫을 매니퓰레이터에 부착합니다. 5마이크로리터의 플라스미드 용액을 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 모세관 작용으로 용액을 전극 피펫에 끌어 당깁니다.0.2mm 직경의 전극을 전극 피펫에 삽입합니다. 배출 피펫을 플라스틱 튜브가 있는 1ml 주사기에 연결한 후 5마이크로리터의 플라스미드 용액을 페트리 접시에 다시 옮깁니다. 그런 다음 주사기를 사용하여 용액을 배출 피펫으로 천천히 끌어옵니다.그런 다음 전기천공법 단계에서 공동 배양을 옮기고 직경 1mm의 전극을 배양 배지에 삽입합니다. 그런 다음 배양된 시상 블록에 배출 피펫을 놓습니다. 팁이 시상 블록의 표면에 닿은 후 주사기를 수동으로 누릅니다.배출 피펫이 후퇴한 직후 시상 블록에 전극 피펫을 놓습니다. 이제 전기 펄스를 전달하십시오. 오실로스코프의 진폭과 트레인 수를 모니터링합니다.그런 다음 전극 피펫을 집어넣고 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 샘플을 관찰하려면 EGFP 및 DsRed용 필터 세트 2개가 장착된 직립 컨포칼 현미경의 스테이지에 배양 접시를 놓습니다. 그런 다음 20x long working distance 대물 렌즈를 사용하여 1 - 7 미크론 단계 크기에서 10 - 25 광학 섹션의 이미지를 촬영합니다.DsRed와 Syp-EGFP를 모두 발현하는 개별적으로 구별할 수 있는 라벨링된 축삭돌기를 선택합니다. 여기에 표시된 것은 12 DIV 이후의 시상 및 피질 절편의 유기형 공동 배양입니다. 다음은 박스형 영역의 확대된 이미지입니다.그리고 여기 DsRed 표지된 시상 세포가 축삭돌기를 피질 절편으로 확장하고 상층부에 가지를 형성합니다. 이 이미지는 DsRed 표지된 시상 피질 축삭돌기와 Syp-EGFP 반점을 보여줍니다. Syp-EGFP의 이산적 축적은 단일 시상피질 축삭돌기를 따라 관찰되었습니다.DsRed와 Syp-EGFP 플라스미드를 전기천공법을 사용하여 하나의 DIV에서 배양된 시상 세포에 도입했습니다. 이 축삭돌기는 4일 동안 매일 이미지화되었습니다. 축삭돌기 분지와 시냅스 형성은 동적이었으며 덧셈과 제거가 있었습니다.이러한 절차에 따라 축삭 분지 및 시냅스 형성에서 유전자의 역할을 조사하기 위해 Syp-EGFP 및 DsRed와 함께 흥미로운 유전자를 사용한 전기천공법을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 신경 생물학 분야의 연구자들이 신경 회로의 동적 변화 메커니즘을 탐구 할 수있는 길을 열어줍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

E12.5 murine 배아 midbrain에서 organotypic 조각을 생성하는 방법을 설명합니다. organotypic 슬라이스 문화가 dopaminergic 신경이나 다른 복부 midbrain의 뉴런의 행동을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

배아 복부 Midbrain의 Organotypic 슬라이스 문화 : Dopaminergic의 연결을 개발 연구하는 시스템 체외에서</em

출처: Winkle, CC, et al. 축삭 분지 및 신경 형태 형성 동안 원형질막 전달의 역할을 정의하기 위해 결합된 방법론을 활용합니다. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 피질 뉴런에서 실시간 축삭 분기를 관찰하기 위해 DIC(Differential Interference Contrast) 현미경을 사용하는 라이브 이미징 기술을 보여줍니다. 타임랩스 비디오는 축삭에서 국소적인 엑소사이토시스 및 세포골격 재배열을 유도하는 신호 분자인 netrin-1 처리의 효과를 포착합니다. 이러한 과정은 성숙한 축삭 가지로 발달하는 막 돌출을 시작하여 신경 발달에 대한 통찰력을 제공합니다.

마우스 피질 뉴런에서 축삭 분지의 실시간 체외 이미징

암 세포와 뇌의 Organotypic 슬라이스 공 배양은 뇌 조직의 암 세포 침략의 과정에서 형광뿐만 아니라 시야 (비디오) 현미경으로 형태 학적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 전지 교환 및 보충 접근이 가능하며 조작 및 분석의 다양한 제공합니다.

뇌의 Organotypic 슬라이스와 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 공 배양 시스템

여러 각도를 사용하여 마우스 강아지의 머리를 잘라, 우리는 주요 청각 중뇌와 전뇌 구조의 가장 사이의 연결을 캡처 이전에 설명 급성 뇌 조각을 개선.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

여기에서 우리는 체외에서 propriospinal 연결 기능 재생을 연구하기 위해 다중 전극 배열에 배양 척수 조각을 기반으로하는 프로토콜을 제시한다.

다중 전극 배열에 성장의 Organotypic 척수 공동 문화 기능 재생 조사

이 문서는 포유류 외피가에서 평평된 접선 섹션을 가져오고 피 질 조직화 학적인 사용 모듈과 immunohistochemical 방법을 시각화 하는 상세한 방법론을 설명 합니다.

병합 된 포유류 외피가 대뇌 피 질의 모듈의 시각화

이 프로토콜에서 결합 해리 인간의 pluripotent 줄기 세포 파생 뉴런에 대 한 재현 방법에 설명 하 고 이다 3D에 범위 cocultures, 무료 부동 조건, 그리고 이후 이러한 분야를 유지 하 immunoanalysis와 multielectrode 배열 녹음 분야의 측정 시 냅 스 회로 활동.

3D Cocultures 이다 인간 만능 줄기 세포에서 신경 세포의 시 냅 스 마이크로 회로 모델링

신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

이 프로토콜은 현장 축삭 성장 및 성장 원뿔 역학 을 연구하는 간단하고 강력한 방법을 보여줍니다. 생체외 생리학적으로 관련된 급성 뇌 조각을 준비하는 방법을 설명하고 사용자 친화적인 분석 파이프라인을 제공합니다.

시투에서 Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures 시각화

신피질(neocortex)의 일차 감각 영역은 발달 과정에서 독특한 자발적 활동을 보입니다. 이 기사에서는 생체 내 신생아 마우스의 영역별 동기 활동을 분석하기 위해 개별 뉴런 활동과 주요 감각 영역을 시각화하는 방법을 설명합니다.

단일 뉴런 해상도에서 신생아 마우스 감각 피질의 자발적 활동에 대한 In vivo 시각화

배우세요 시상피질 축삭 분기와 시냅스 형성을 동시에 관찰하는 organotypic coculture 기법을 활용한 신경회로 발달 연구 방법입니다. 이 기술은 개별 살아있는 세포에서 축삭 성장과 시냅스 발달의 동적 변화를 실시간으로 분석하여 신경가소성 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

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