분기 Thalamocortical 축 삭과 시 냅 스의 시각화 Organotypic Cocultures에서 형성

이 방법의 전반적인 목표는 시상 피질 돌기에서 축삭 분지 및 시냅스 형성의 동적 형태 학적 변화를 연구하는 것입니다. 이 방법은 새로운 신경 회로 형성과 같은 신경 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 개별 살아있는 세포에서 축삭 성장과 시냅스 형성을 동시에 관찰

이 방법은 시상 피질 돌기에서 축삭 분기와 시냅스 형성 사이의 관계에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한 대뇌 피질의 내재적 연결과 같은 다른 신경 회로에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 모든 수술 기구를 70% 에탄올로 10분 이상 소독하십시오.

다음으로, 얼음처럼 차가운 마취 상태에서 출생 후 2일차 쥐에서 전체 뇌를 빠르게 해부합니다. 그런 다음 40ml의 차가운 Hank's Balanced Salt Solution이 들어 있는 100mm 페트리 접시에 뇌를 넣습니다. 양안 현미경으로 미세한 집게로 피아 물질을 조심스럽게 제거하고 미세 수술 용 가위를 사용하여 1 차 시각 및 체성 감각 피질을 300-400 미크론 두께의 조각으로 자릅니다.

그 후, 일회용 플라스틱 피펫을 사용하여 피질 조각을 배양 삽입물의 멤브레인 필터로 옮깁니다. 일회용 플라스틱 피펫으로 배양 인서트 중앙 근처의 슬라이스 위치를 조정하고 인서트에서 여분의 매체를 제거합니다. 혈청 함유 배양 배지에서 슬라이스를 섭씨 37도로 유지하고 하루 동안 단독으로 배양한 후 그 옆에 E15 배아의 시상 블록을 놓습니다.

슬라이스가 가스와 매체 모두를 충분히 공급할 수 있도록 슬라이스 표면보다 약간 아래에 있는 매체의 수준을 조정합니다. 이것은 슬라이스의 생존 가능성에 매우 중요합니다. 이 단계에서는 전극 풀러로 유리 모세관을 만듭니다.

그런 다음 플라스미드 주입을 위해 유리 모세혈관의 끝을 끊습니다. 전극 피펫의 경우 유리 모세관의 끝을 사포로 갈아서 연마합니다. 그런 다음 내경이 50-200 미크론이 되도록 화재 연마합니다.

다음으로, 전극 피펫과 배출 피펫을 매니퓰레이터에 부착합니다. 5마이크로리터의 플라스미드 용액을 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 모세관 작용으로 용액을 전극 피펫에 끌어 당깁니다.

0.2mm 직경의 전극을 전극 피펫에 삽입합니다. 배출 피펫을 플라스틱 튜브가 있는 1ml 주사기에 연결한 후 5마이크로리터의 플라스미드 용액을 페트리 접시에 다시 옮깁니다. 그런 다음 주사기를 사용하여 용액을 배출 피펫으로 천천히 끌어옵니다.

그런 다음 전기천공법 단계에서 공동 배양을 옮기고 직경 1mm의 전극을 배양 배지에 삽입합니다. 그런 다음 배양된 시상 블록에 배출 피펫을 놓습니다. 팁이 시상 블록의 표면에 닿은 후 주사기를 수동으로 누릅니다.

배출 피펫이 후퇴한 직후 시상 블록에 전극 피펫을 놓습니다. 이제 전기 펄스를 전달하십시오. 오실로스코프의 진폭과 트레인 수를 모니터링합니다.

그런 다음 전극 피펫을 집어넣고 접시를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 샘플을 관찰하려면 EGFP 및 DsRed용 필터 세트 2개가 장착된 직립 컨포칼 현미경의 스테이지에 배양 접시를 놓습니다. 그런 다음 20x long working distance 대물 렌즈를 사용하여 1 - 7 미크론 단계 크기에서 10 - 25 광학 섹션의 이미지를 촬영합니다.

DsRed와 Syp-EGFP를 모두 발현하는 개별적으로 구별할 수 있는 라벨링된 축삭돌기를 선택합니다. 여기에 표시된 것은 12 DIV 이후의 시상 및 피질 절편의 유기형 공동 배양입니다. 다음은 박스형 영역의 확대된 이미지입니다.

그리고 여기 DsRed 표지된 시상 세포가 축삭돌기를 피질 절편으로 확장하고 상층부에 가지를 형성합니다. 이 이미지는 DsRed 표지된 시상 피질 축삭돌기와 Syp-EGFP 반점을 보여줍니다. Syp-EGFP의 이산적 축적은 단일 시상피질 축삭돌기를 따라 관찰되었습니다.

DsRed와 Syp-EGFP 플라스미드를 전기천공법을 사용하여 하나의 DIV에서 배양된 시상 세포에 도입했습니다. 이 축삭돌기는 4일 동안 매일 이미지화되었습니다. 축삭돌기 분지와 시냅스 형성은 동적이었으며 덧셈과 제거가 있었습니다.

이러한 절차에 따라 축삭 분지 및 시냅스 형성에서 유전자의 역할을 조사하기 위해 Syp-EGFP 및 DsRed와 함께 흥미로운 유전자를 사용한 전기천공법을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 신경 생물학 분야의 연구자들이 신경 회로의 동적 변화 메커니즘을 탐구 할 수있는 길을 열어줍니다.