대동맥-생식-mesonephros Explant 문화 시스템 개발 조에의 응용
2017년 11월 3일
조 혈 줄기에 규제 요인 및 신호 통로의 효과 결정 하 식 분석, 문화와 비장, 장기 재구성에 콜로 니 형성 단위에 대 한 교양된 대동맥-생식-Mesonephros를 사용 하 여이 프로토콜에 설명 합니다. 셀 개발입니다. 이 조 혈 줄기 세포 생물학을 연구 하 고 기능에 대 한 효과적인 시스템으로 입증 되었습니다.
이 실험의 전반적인 목표는 대동맥-생식선-메소네프로스 외식술 배양을 사용하여 조혈모세포 발달의 중요한 조절자를 조사하는 것입니다. 이 방법은 포유류의 HSC 발달 조절과 관련된 요인을 식별하는 방법에 대한 HSC 생물학 및 기능 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 DNA 발현 분석과 HSC의 콜로니 형성 능력 및 재구성 능력을 통해 이러한 조절자를 검증할 수 있다는 것입니다.
일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 몸통 영역의 주변 조직에서 AGM을 정확하게 분리하려면 숙달하기 위한 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 절차를 시작하기 전에 스테인리스 스틸 메쉬를 웰당 2밀리리터의 갓 준비된 플루옥세틴 보충 배지가 들어 있는 6웰 플레이트의 개별 웰에 넣습니다. 실험용 웰당 하나의 UV 멸균된 0.65마이크로리터 필터를 신선한 끓는 물이 담긴 유리 세포 배양 접시에 넣고 3분 동안 두 번 세척한 후 필터를 실온 PBS 용기에 담궈 세척할 때마다 2분 동안 보관합니다.
그런 다음 각 웰의 공기-액체 계면에 있는 각 강철 메쉬에 하나의 필터를 놓습니다. 다음으로, 해부 가위를 사용하여 임신한 11일차 배아 마우스에서 자궁을 제거하고 자궁에서 배아를 채취합니다. 해부 가위를 사용하여 배아체에서 난황낭, 탯줄 및 내장을 제거합니다.
그리고 등쪽 신경 조직과 주변 근육 조직을 조심스럽게 제거합니다. 겸자를 사용하여 앞다리와 뒷다리의 조직을 제거합니다. 그리고 배아체에서 AGM 영역을 분리합니다.
그런 다음 각 AGM을 각 웰의 공기-액체 계면에 있는 단일 필터에 놓습니다. 배양물을 섭씨 37도, 5%CO2 인큐베이터에 넣습니다. 2-3일 후, AGM 샘플을 200마이크로리터의 콜라겐분해효소가 들어 있는 개별 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 섭씨 37도에서 5분마다 흔들면서 약 20분 동안 해리합니다.
분해가 끝나면 이식당 200마이크로릴터의 혈청으로 반응을 중지합니다. 각 튜브의 전체 내용물을 웰당 500-600마이크로리터의 M3434 배지가 들어 있는 24웰 초저 부착 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 각 웰의 세포를 바늘 없이 1밀리리터 주사기로 혼합합니다.
플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다. 각 우물 내의 군체 형성 단위의 수는 7일에서 10일의 배양 후에 점수를 매길 수 있습니다. 방금 시연된 바와 같이 AGM 배양 2-3일 후 생체 내 AGM 이식의 경우 9개의 회색 방사선을 가진 8-10주 된 수컷 C57 검은색 6마리 마우스를 치명적으로 방사선에 방사선을 방출합니다.
4-5시간 후 수확된 외식을 샘플당 200마이크로리터의 콜라겐분해효소로 해리합니다. 생성된 단일 세포 현탁액에 해당하는 0.5 대 1 배아를 수용 동물 당 1 밀리리터 주사기 1 개에 적재합니다. 첫 번째 방사선 조사된 쥐를 구속기에 넣고 75% 에탄올을 적신 면봉으로 꼬리를 닦아 꼬리 정맥 혈관 확장을 촉진합니다.
주사기 한 개의 전체 내용물을 확장된 꼬리 정맥에 정맥 주사합니다. 바늘을 제거한 후 출혈을 멈추기 위해 소독용 면봉을 사용하십시오. 그런 다음 동물을 우리로 되돌리고 다음 동물에게 주사합니다.
입양 이식 후 11일 후, 비장은 눈에 보이는 비장 군집의 거시적 계수를 위해 Bouin의 용액에 고정될 수 있습니다. 플루옥세틴이 보충된 AGM 배양은 mRNA 및 단백질 발현 수준에서 HSC 발달을 위한 중추적인 유전자인 Runx1의 발현이 증가했음을 보여줍니다. 플루옥세틴은 또한 버스트 형성 단위 적혈구, 집락 형성 단위 과립 단핵구 및 집락 형성 단위 과립구, 적혈구, 대식세포 및 거핵세포를 포함하여 AGM에서 HSC의 집락 형성 능력을 크게 증가시킬 수 있습니다.
또한, AGM 이식에서 분리된 플루옥세틴 처리된 HSC의 생체 내 이식은 방사선 조사된 성체 수용 동물의 비장에 있는 집락 수를 증가시킵니다. 이 비디오를 시청한 후에는 AGM 내에서 HSC 발달의 중요한 조절자를 식별하기 위해 AGM을 분리하고 AGM 이식 배양을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 프로토콜은 조혈모세포(HSC) 발달을 연구하기 위해 배양된 대동맥-생식샘-중신장(AGM)을 이용한 발현 분석 및 콜로니 형성 단위(CFU) 측정 방법을 설명합니다. 이는 HSC 생물학에 관여하는 조절 인자와 신호 전달 경로를 조사하는 데 효과적인 시스템입니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 조혈모세포 생물학
- 세포 배양 기술
- 발달 조절 인자
배경
- AGM 영역은 포유류의 HSC 발달에 매우 중요합니다.
- HSC 조절 메커니즘을 이해하는 것은 재생 의학의 발전으로 이어질 수 있습니다.
- 군락 형성 분석(Colony-forming assay)은 HSC의 기능성을 평가하는 데 필수적입니다.
- 주변 조직으로부터 AGM을 분리하려면 숙련도와 연습이 필요합니다.
연구 목적
- HSC 발달의 핵심 조절 인자를 조사하기 위함입니다.
- HSC 조절에 관여하는 요인들을 식별하기 위함입니다.
- HSC 생물학 및 기능에 대한 이해를 높이기 위함입니다.
사용된 방법
- AGM 외식물 배양 기술.
- 조절 인자 검증을 위한 DNA 발현 분석.
- HSC 능력을 평가하기 위한 콜로니 형성 분석.
- 장기 재구성 연구.
주요 결과
- HSC 발달에 영향을 미치는 주요 조절 인자의 규명.
- DNA 발현 분석을 통한 인자 검증.
- 배양된 HSC의 콜로니 형성 능력의 성공적인 입증.
- HSC 생물학에 관여하는 신호 전달 경로에 대한 통찰.
결론
- AGM 배양 시스템은 HSC 발달 연구에 효과적입니다.
- 조절 인자를 이해하면 치료 전략 수립에 도움이 될 수 있습니다.
- 이 방법은 조혈 작용의 향후 연구를 위한 플랫폼을 제공합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
AGM 외식편 배양 시스템은 생식선 넉아웃 모델 없이도 기전 연구를 가능하게 함으로써 조혈모세포(HSC) 연구의 핵심 병목 지점을 해결합니다. 이러한 접근 방식은 생리학적으로 관련성이 있는 배아 틈새에서 약리학적 또는 유전적 구조 실험을 가능하게 하여, 초기 발굴 단계에서 표적 검증 및 리스크 감소를 지원합니다. 또한 HSC 발달의 핵심 조절 인자를 식별하는 데 있어 예측 신뢰도를 높여, 조혈 작용 중심의 치료 영역에서의 포트폴리오 결정에 유용한 정보를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: KO 배경에서의 구조 실험(rescue experiments)을 통해 HSC 조절 내 인자의 관여도를 테스트함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: DNA 발현 변화 및 콜로니 형성(colony formation)과 같은 기능적 결과물을 검증할 수 있는 재현 가능한 시스템을 제공하여, 비용이 많이 드는 in vivo 모델에 대한 의존도를 낮춰줍니다.
- 예측적 가치: 분자적 섭동(molecular perturbations)을 재구성 능력과 같은 기능적 HSC 결과물과 연결함으로써 기전적 리스크 감소(de-risking)를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: CFU-E, CFU-GM 및 거핵구 콜로니를 포함한 정량적 다세포 판독값을 생성하여 HSC 분화에 미치는 화합물의 영향을 평가합니다.
- 운용적 가치: 7~10일 후 콜로니 형성 단위 점수를 통해 HSC 기능 평가를 표준화함으로써 화합물 라이브러리 전반에 걸친 분석 확장성을 가능하게 합니다.
- 중개적 가치: 검증된 HSC 집단을 준비하여 후속 이식 연구에 활용함으로써, 발견 단계에서 전임상 검증 단계로의 연결을 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 배아 조혈 니치(hematopoietic niche)를 보존하여 질병 관련성을 유지함으로써 포유류 HSC 발달 기전을 연구할 수 있게 합니다.
- 운영적 가치: 방사선 조사 수신체에서 재구성 능력이 입증된 이식 가능한 HSC를 생성하여, 발견 단계부터 전임상 연구까지의 연속성을 지원합니다.
- 리스크 완화: 비용이 많이 드는 in vivo 연구 이전에 타겟의 기능적 검증을 가능하게 하여, go/no-go 결정의 신뢰도를 높여줍니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
AGM 외식편 배양은 표적 식별부터 리드 최적화, 그리고 전임상 검증에 이르는 발견 연속체 단계에 부합하며, 특히 조혈 작용 및 재생 의학 프로그램에 유용합니다.
- 발견 생물학: HSC의 출현 및 확장에 영향을 미치는 신호 전달 경로 및 전사 조절 인자의 가설 검증을 용이하게 합니다.
- 스크리닝: 용량-반응 분석 및 히트 확인을 지원하는 정량적인 형광 또는 현미경 기반의 콜로니 결과물을 제공합니다.
- 분석: mRNA/단백질 발현(예: Runx1), 콜로니 형태 및 in vivo 재구성 단위(repopulation units)를 통한 다매개변수 평가가 가능합니다.
- 중개 연구: 경쟁적 이식 모델에서 입증된 장기 재구성을 통해 기전적 발견을 전임상 단계의 연속성과 연결합니다.
- 기업적 재사용: 줄기세포 및 혈액 질환 치료 분야의 여러 프로젝트에서 반복적인 타겟 검증을 위해 재사용 가능한 플랫폼으로 활용됩니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 발달 단계적으로 정확한 시스템에서 분자적 개입을 기능적 HSC 표현형과 연결함으로써 표적 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 외식물 분리, 배양 및 해리 프로토콜을 통해 재현성을 향상시키고 기능 분석의 변동성을 줄입니다.
- 전략적 가치: HSC 표적의 조기 단계 위험 제거(de-risking)를 가능하게 하여, 기전적 통찰력 부족으로 인한 후기 단계의 실패를 최소화함으로써 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 표적 순위 결정을 위한 HSC 자가 재생 및 분화 능력에 대한 기능적 데이터를 제공하여 위험 조정 우선순위 지정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 주변 조직의 오염 없이 AGM 영역을 분리하기 위해 배아 해부 및 미세 수술 기법에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- CO2 배양기, 저부착 플레이트, 배지 및 시약의 멸균 여과를 포함한 멸균 세포 배양 인프라가 필요합니다.
- 데이터 비교 가능성을 보장하기 위해 엑스플란트 배치, 콜라게나아제 소화 시간 및 콜로니 판정 기준에 대해 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 비마우스 모델로의 적용은 종 특이적인 배아 발달 시기와 조직 접근성에 의해 제한될 수 있으며, 각 시스템에서의 검증이 필요합니다.
- 실제적인 제약 사항으로는 AGM 분리를 위한 좁은 배아 윈도우(마우스의 경우 E10.5–E11.5)가 있으며, 이는 발견 캠페인의 처리량과 일정 계획에 영향을 미칩니다.
