Name: 대동맥-생식-mesonephros Explant 문화 시스템 개발 조에의 응용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 학습하세요 대동맥-생식-mesonephros(AGM) 외식 배양 기술을 활용하여 조혈줄기세포 발달의 핵심 조절인자를 연구하는 방법을. DNA 발현 분석과 콜로니 형성 능력을 통해 조절인자를 검증할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

그림 준비에 도움에 감사 Suwei가 오 하 고. 이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81530004, 31425016) 사역의 과학 및 중국의 기술 (2016YFA0100500)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. : J.L. 실험 수행 및 초안 원고; 플로리다는 원고 편집. 두 저자는 읽기와 최종 원고를 승인.

동물 주제를 포함 하 여 모든 절차 동물학 연구소, 중국 과학원, 베이징, 중국에서 윤리 검토 위원회에 의해 승인 되었습니다.
 1. 재료 준비 <ol><li>Sterilize는 0.65 μ m 필터 자외선 자외선 아래 생산 4 h에 대 한 깨끗 한 벤치에 램프를 레이 2 h 마크 후 필터를 넘겨. 
	참고: UV 라이트를 사용할 경우 적절 한 보호를 착용.</li>
	<li>소독 30 분 동안 121 ° C에 고압 소독 기와 스테인레스 스틸 메쉬. 
	참고: 스테인레스 스틸 메시의 특정 높이 공기 액체 인터페이스에서 필터를 지원 하기 위해 필요 하다 고이 강철 메시 ( 그림 1 A)에 와이어로 실현 될 수 있다.</li>
	<li>M5300 장기로 10 µ M의 최종 농도에 희석 부정맥 문화 매체와 혼합 균등 하 게. 
	참고: 6-잘 접시 2 mL M5300 장기 배양은 각 잘 적합 합니다. 10 -6 M에 날린 선택적으로 매체에 희석 수 있습니다.</li>
	<li>6 잘 플레이트 나 요리에 10 µ M에서 부정맥으로 보충 하는 매체를 전송 하 고 매체에 넣고 멸 균된 스테인레스 스틸 메쉬.</li>
	<li>때마다 살 균에 대 한 유리 셀 문화 접시에 두 번 3 분 동안 끓는 물으로 0.65 μ m 필터 세척. 각 세척, 염 인산 염 버퍼에 필터를 넣어 (PBS) 2 분 및 장소는 스테인리스에 젖은 필터 메쉬 공기 액체 인터페이스에 서 보듯이 그림 1 A [도식 후 센터]. 
	참고: 끓는 물 생성 될 수 있습니다와 무 균 상태를 달성 하기 위해 고압 소독 기 및 장비 온도 감소를 피하기 위해 적시에 고압 소독 기에서 취해야 한다.</li>
</ol> 2. AGM Explant 문화 <ol><li>신중 하 게 집게와 E10.5 또는 E11 배아에서 AGM 영역을 분리.
	<ol><li>해가 위로 임신한 쥐에서 uteruses를 벗기고 배아는 uteruses에서 분리.</li>
		<li>노른자위 낭, 탯 줄, 및 태아 몸에서 내장 닦아.</li>
		<li>신중 하 게 등 쪽 신경 조직 및 주변 근육 조직 제거.</li>
		<li>컷 앞쪽에 및 후방 사지의 사이트에 집게와 조직와 관련해 지역 태아 몸에서 분리. 그림 1 B C 표현식 및 해 부 AGM의 형태 표시.</li>
	</ol></li> <li>2-3 일 동안 37 ° C에서 5% CO 2 문화와 공기 액체 인터페이스 ( 그림 1 A)에서 필터에 별도로 해 부 AGMs explant. 
	참고: 않습니다 하지 강철 메시의 와이어에 해 부 관련해 놓고 필터 문화 중 공기 액체 인터페이스에는 다는 것을 확인 합니다. AGM, 외 노 른 자 sac와 태아 간 수 또한 될 교양이 시스템 7.</li>
</ol> 3. 식 분석 <ol><li>mRNA 수준 <li>1 mL PBS에 교양된 AGMs 수집 및 4 ° c, 310 x g 6 분에 대 한 원심</li> <ol>
		<li>제거한 후에 상쾌한, 총 RNA 추출에서 monophasic 솔루션 페 놀의 수집된 AGMs 제조 업체에 따르면 &#39; s 지침.</li>
		<li>총 RNA (2 µ g)은 역방향 다음 템플릿으로 cDNA를 M MLV 역전사를 사용 하 여 복사할. 양적 실시간 PCR 분석 실험 SYBR 녹색 공연과 Gapdh 내부 통제로 사용 됩니다.</li>
	</ol></li> <li>단백질 수준 <ol><li>단계 3.1.1에서에서 위에서 설명한 대로 교양된 관련해 수집.</li>
		<li>세포 세포의 용 해 버퍼와 교양된 AGM에서 단백질을 준비 (10 mM Tris HCl, 10 mM NaCl, 그리고 0.5 %NP-40) 포함 하는 효소 억제제와 단백질 수준으로 이전 검색 서양 blotting에 대 한 사용 설명 13.</li>
	</ol></li></ol> 4. 식민지 형성 단위 (CFU-C) 문화 분석 결과에 <ol><li>2-3 일 동안 배양 후 1 mL 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 및 4 ° C, 6 분 310 x g에서 원심 분리기에 관련해 지역 수집 하 고 37에서 200 µ L 콜라 (PBS에 0.1%)와 해리 ° C. 
	참고: 단일 셀-정지를 생성 하는 콜라에 필요한 시간은 약 20 분입니다. 관련해 포함 된 튜브를 떨고 5 분 마다 소화 과정을 가속화할 수 있습니다. 200 µ L 0.1% 콜라 각 관련해 사용 되 고 200 µ L 10% 혈 청 반응을 중지 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>문화 초 저 첨부 파일 24-잘 접시에서 M3434 매체에 단일 셀 정지. 
	참고: 오염을 피하기 위해, 페니실린 스 솔루션 추가할 수 있습니다 선택적으로 매체에. M3434 매체 점성 때문에 1.0 cc 주사기 바늘 없이 세포와 매체는.</li>
	<li>후 7-10 일 식민지 형성 단위-erythroid (BFU-E), CFU-granulo-monocyte (CFU-GM) 및 CFU granulocyte, 버스트를 포함 한 적혈구, 대 식 세포, megakaryocyte (CFU-GEMM)의 각 유형에 대 한 수, 5% CO 2에서 37 ° C에서 배양 고유 형태에 따라 하 고 ( 그림 2 C) 거꾸로 현미경으로.</li>
</ol> 5. Vivo에서 분석 결과 이식 explant 경작의 <ol><li>식민지 형성 단위-비장 (CFU-S) 분석 결과 <ol><li>후 2-3 일은 AGMs 수집 하 고 준비 20 200 µ L 콜라 (PBS에 0.1%)와 함께 배양 하 여 단일 셀-정지 분</li>
		<li>8에 10 주 된 남성 C57BL/6 마우스의 치명적인 방사선 (x-레이의 9 Gy)을 수행 셀 주입 하기 전에 4-5 h.</li>
		<li>Restrainer의 활동을 제한 하에 비친된 마우스 넣어.</li>
		<li>꼬리 정 맥의 vasodilatation를 홍보 하기 위해 75% 알코올에 면봉을 사용 하 여 닦아.</li>
		<li>0.5 배아 상응 (ee) 또는 1 ee AGM의 단일 셀-정지 정 맥에 주사 방사능된 쥐의 꼬리 정 맥 1.0 cc 주사기. 
		참고: 세포는 PBS로 일시 중단 하 고 받는 당 0.5 mL PBS는 적합 한 볼륨. 25 게이지 또는 26 게이지 크기 바늘 1.0 cc 주사기 주입에 사용 됩니다. 공기는 주사기에 도입 될 수 있습니다. 눌러 출혈을 멈추게 하는 살 균 면봉으로 사출 사이트.</li>
		<li>11 일 이식, 수집 게시 하 고 받는 사람 마우스의 spleens Bouin 수정 &#39; s 솔루션 (15 mL 1.22 %Picric 산 포화 용액 2 mL 40% 메탄올, 아세트산 1 mL) 1-2 일 및 또 다른 1-2 일 동안 80% 알코올로 세척. 거시적 비장에 보이는 식민지를 계산 하 고 ee 당 식민지의 수를 결정. 
		&#8203; 참고: Bouin &#39; s 정착 액, 마모 보호.</li>
	</ol></li> <li>장기 이식 분석 결과 <ol><li>경작 explant는 AGMs를 수집 하 고 준비 하는 20 분에 대 한 200 µ L 콜라 (PBS에 0.1%)와 함께 배양 하 여 단일 셀 정지 후 2-3 일</li>
		<li>수행 8에 10 주 된 남성 C57BL/6 마우스의 치명적인 방사선 (x-레이의 9 Gy) 셀 주입 하기 전에 4-5 시간.</li>
		<li>Restrainer의 활동을 제한 하에 비친된 마우스 넣어.</li>
		<li>꼬리 정 맥의 vasodilatation를 홍보 하기 위해 75% 알코올에 면봉을 사용 하 여 닦아.</li>
		< l나 > 0.5 배아 상응 (ee)를 주입 또는 1 ee 1.0 cc 주사기 비친된 마우스의 꼬리 정 맥에 정 맥 AGM의 셀 정지를 단일. AGM의 2 × 10 5 골 수 세포 (CD45.1 배경)와 받는 사람 당 1 ee 복용량 주입. 
		참고: 공기는 주사기에 도입 수 있습니다. 눌러 출혈을 멈추게 하는 살 균 면봉으로 사출 사이트.</li>
		<li>4 개월 후 이식 받는 사람의 골 수를 수집 하 고 FACS에 의해 재구성 분석 결과 대 한 그것을 사용 하 여. 함께 받는 &#8805; 10% 기증자 파생 된 chimerism 성공적인 재구성 전시 여겨진다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., Robin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+founder+of+adult+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta.</a> Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).</li>
<li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).</li>
<li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells+long-term+repopulating+units+%28HSC%2FRUs%29%3A+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+%28AGM%29+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129, 4891-4899 (2002).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86, 897-906 (1996).</li>
<li>Peeters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+embryonic+tissues+and+Hedgehog+proteins+induce+early+AGM+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development.</a> Development. 136, 2613-2621 (2009).</li>
<li>Taoudi, S., Medvinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+in+the+ventral+domain+of+the+embryonic+dorsal+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta.</a> PNAS. 104, 9399-9403 (2007).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+Hedgehog+Regulate+Distinct+AGM+Hematopoietic+Stem+Cells+Ex+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo.</a> Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).</li>
<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stromal+clones+reveal+developmental+regulators+of+definitive+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells.</a> PNAS. 104, 20838-20843 (2007).</li>
<li>Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpl+receptor+defect+leads+to+earlier+appearance+of+hematopoietic+cells%2Fhematopoietic+stem+cells+in+the+Aorta-Gonad-Mesonephros+region%2C+with+increased+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis.</a> Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).</li>
<li>Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxytryptamine+synthesized+in+the+aorta-gonad-mesonephros+regulates+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival.</a> J Exp Med. 214, 529-545 (2017).</li>
<li>Souilhol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+interactions+mediated+by+interplay+of+asymmetric+signalling+underlie+development+of+adult+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells.</a> Nature communications. 7, 10784(2016).</li>
<li>Fitch, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).</li>
<li>Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+swimming+test+and+fluoxetine+treatment%3A+in+vivo+evidence+that+peripheral+5-HT+in+rat+platelet-rich+plasma+mirrors+cerebral+extracellular+5-HT+levels%2C+whilst+5-HT+in+isolated+platelets+mirrors+neuronal+5-HT+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes.</a> Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).</li>
<li>Ortiz, J., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monoamine+uptake+inhibitors+on+extracellular+and+platelet+5-hydroxytryptamine+in+rat+blood%3A+different+effects+of+clomipramine+and+fluoxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine.</a> Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).</li>
<li>Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+inhibitor+of+serotonin+uptake%3A+Lilly+110140%2C+3-%28p-trifluoromethylphenoxy%29-N-methyl-3-phenylpropylamine%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine.</a> Life sciences. 15, 471-479 (1974).</li>
<li>Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+is+required+for+the+endothelial+to+haematopoietic+cell+transition+but+not+thereafter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter.</a> Nature. 457, 887-891 (2009).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+together+the+organoid+field%3A+from+early+beginnings+to+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead.</a> Development. 144, 963-967 (2017).</li>
</ol>

저자 아무 충돌 금융 관심 있다.

그것은 잘 알려진 골 수에서 성숙 HSCs 조사 받는 사람 혈액 시스템을 다시 수 있습니다. 이러한 기능 HSCs 달리 마우스 배아의 AGM에 신흥 HSCs 성숙 하지 않습니다. 직접 이식 결과 유형을 보여 난 (VE-cad+ CD45- CD41+) 유형 II와 (VE-cad+ CD45+) 사전 HSCs 없이 재구성 능력20소유. AGM explant 문화 시스템 관련해 지역에서 초기 HSCs의 활용 이식 분석 결과4,20에서 받는 사람 다시 구성할 수 있습니다. 또한,이 마우스 배아의 자궁내 개발 때문 vivo에서 실험 코 쥐에 장애인된 조 구출을 수행 하기 편리 하지 않습니다. AGM explant 문화는 중간13,...

조 혈 줄기 세포 (HSCs)는 자체 갱신 하는 기능 뿐만 아니라 erythroid, 골수성를 포함 하는 multilineage 잠재력 및 림프 세포 조직 관련 성인 줄기 세포 이다. 최근 연구 초기 HSCs 조 혈 등 쪽 대동맥1,2의 복 부 벽에 전환 (EHT) 내 피를 통해 (그는), hemogenic endothelium로 알려진 전문된 내 피 인구에서 발생 ,,34. HSCs 확장을 위한 태아 간으로 이동 되며 마지막으로 개인의 생활 내내 성인 조를 유지 하 골 식민지 대동맥-생식-mesonephros (AGM) 지역에 배아 (E) 10.5에서에서 E12.5 마우스 배아 형성, 면 5 , 6.이 몇 년 동안 공부 하고있다, 비록 HSC 출현 그리고 발달의 기본 메커니즘 남아 불완전 하 게 이해.
체 외에서 수정 및 zebrafish 태아의 개발와 달리 마우스 배아의 자궁내 개발은 확실 한 조 연구 embryogenesis 동안 훨씬 더 불편. 녹아웃 (KO) 마우스를 사용 하 여 유전 실험은 일반적으로 활용 하 고, 비록 특정 KO 마우스의 부족 또한 조 혈 연구 분야에서 그들의 사용을 제한 합니다. 또한, 구조 실험 vivo에서 KO 생쥐에서 쉽게 수행 하지 않습니다. 1996 년 이래로, AGM explant 문화 분야7에 개척자에 의해 조 혈 연구 개발 되었습니다. 이 문화 시스템의 도움으로 관련해 지역의 복 부 조직 등 조직 반대 효과8,9발휘 하는 동안 HSC 활동, 홍보 확인 되었습니다. AGM explant 문화 시스템 또한 세로토닌, Mpl, SCF, BMP, HSC 개발10,,1112,13, 신호 고슴도치의 역할 결정에 적용 된 14. 중요 한 것은, 그것은 또한 돌연변이 배아13,15조 혈 결함을 구출 하는 데 사용 하는 인기 있는 방법.

<table><tbody><tr><td>듀라포어 0.65 &마이크로; m 필터</td><td>Millipore</td><td>R5BA63787</td><td>AGM 이식 배양</td></tr><tr><td>M5300 장기 배양 매체</td><td>줄기 세포 기술</td><td>5300</td><td>AGM 이식 배양</td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Tiangen</td><td>5829</td><td>RNA 외삽</td></tr><tr><td>M-MLV 역전사효소</td><td>Promega</td><td>90694</td><td>역전사</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>A6002</td><td>정량적 real-time PCR</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>Roche</td><td>55622</td><td>단백질 외삽</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>AGM 조직</td></tr><tr><td>분해 MethoCult GF M3434 매체</td><td>줄기 세포 기술</td><td>3434</td><td>CFU-C 분석</td></tr><tr><td>초저 부착 24 웰 플레이트</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>CFU-C 분석</td></tr><tr><td>C57BL / 6 CD45.2 마우스</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>CFU-S 분석</td></tr><tr><td>C57BL / 6 CD45.1 마우스</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>장기 이식</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Life Technologines</td><td>8115284</td><td>AGM 컬렉션</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>AGM 이식 배양</td></tr><tr><td>항 CD45.2-PE-CY7</td><td>eBioscience</td><td>25-0454-80</td><td>장기 이식</td></tr><tr><td>항 CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>장기 이식</td></tr><tr><td>UV 램프</td><td>Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD</td><td>039-14402</td><td>힘: 30W</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 메쉬</td><td>AS ONE SHANGHAI Corporation</td><td>2-9817-10&nbsp;</td><td>조리개 직경 : 2.5 mm</td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>Sigma</td><td>H0396</td>을 <td>M5300 배지에 선택적으로 희석</td></tr></tbody></table>

대동맥-생식-mesonephros explant 문화 시스템 개발 조에의 응용

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

조 연구에 대 한 마우스 배아를 사용 하 여 제한 주로 태아의 자궁내 개발 하는 작업에 추가 불편입니다. 녹아웃 (KO) 마우스에서 유전자 데이터를 설득 하지만 필요에 따라 모든 유전자에 대 한 코 쥐를 생성할 비현실적 이다. 또한, vivo에서 수행 코 쥐에서 얻은 데이터를 통합 하는 구조 실험은 하지 편리. 이러한 한계를 극복 하기 위해 대동맥-생식-Mesonephros (AGM) explant 문화는 조 혈 줄기 세포 (HSC) 개발을 공부 하는 적절 한 시스템으로 개발 되었다. 구조 실험을 위해 특히 코 쥐에 장애인된 조 복구 사용할 수 있습니다. 매체에 적합 한 화학 물질을 추가 하 여 장애인 신호 재 활성화할 수 있습니다 또는 위로 경로 저해 될 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여, 많은 실험 HSC 개발의 중요 한 레 귤 레이 터를 식별 하기 위해 수행할 수 있습니다, 그리고 HSC를 포함 하 여 관련 된 mRNA와 단백질 수준, 식민지 형성 능력, 및 재구성 능력에서 유전자 발현. 이 일련의 실험 포유류에 HSC 개발에 필수적인 기본 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 될 것 이다.

최근 간행물 보고 내 피 세포 유래 세로토닌 관련해13프로 apoptotic 통로 억제 함으로써 HSCs의 생존을 촉진. HSC 개발에 세로토닌의 홍보 효과 확인 하려면 팩 포함 되었다. 선택적 세로토닌 재 이해 억제제 (SSRI)로 부정맥 주변 조직16,,1718세로토닌 재 흡수를 억제 하기 위해 입증 되었습니다. 문화 시스템 explant AGM를 사용 하 여, HSC 개발에 Fluoxetine의 효과 위의 절차에 따라 조사 되었다. 식 분석 각각 HSC 개발19, 부정맥 치료 AGMs mRNA와 단백질 수준에 대 한 중추적인 유전자로 정의 되는 Runx1의 증가 식 보였다 (그림...

조 혈 줄기에 규제 요인 및 신호 통로의 효과 결정 하 식 분석, 문화와 비장, 장기 재구성에 콜로 니 형성 단위에 대 한 교양된 대동맥-생식-Mesonephros를 사용 하 여이 프로토콜에 설명 합니다. 셀 개발입니다. 이 조 혈 줄기 세포 생물학을 연구 하 고 기능에 대 한 효과적인 시스템으로 입증 되었습니다.

대동맥-생식-mesonephros Explant 문화 시스템 개발 조에의 응용

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

이 실험의 전반적인 목표는 대동맥-생식선-메소네프로스 외식술 배양을 사용하여 조혈모세포 발달의 중요한 조절자를 조사하는 것입니다. 이 방법은 포유류의 HSC 발달 조절과 관련된 요인을 식별하는 방법에 대한 HSC 생물학 및 기능 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 DNA 발현 분석과 HSC의 콜로니 형성 능력 및 재구성 능력을 통해 이러한 조절자를 검증할 수 있다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 몸통 영역의 주변 조직에서 AGM을 정확하게 분리하려면 숙달하기 위한 연습이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 절차를 시작하기 전에 스테인리스 스틸 메쉬를 웰당 2밀리리터의 갓 준비된 플루옥세틴 보충 배지가 들어 있는 6웰 플레이트의 개별 웰에 넣습니다. 실험용 웰당 하나의 UV 멸균된 0.65마이크로리터 필터를 신선한 끓는 물이 담긴 유리 세포 배양 접시에 넣고 3분 동안 두 번 세척한 후 필터를 실온 PBS 용기에 담궈 세척할 때마다 2분 동안 보관합니다.그런 다음 각 웰의 공기-액체 계면에 있는 각 강철 메쉬에 하나의 필터를 놓습니다. 다음으로, 해부 가위를 사용하여 임신한 11일차 배아 마우스에서 자궁을 제거하고 자궁에서 배아를 채취합니다. 해부 가위를 사용하여 배아체에서 난황낭, 탯줄 및 내장을 제거합니다.그리고 등쪽 신경 조직과 주변 근육 조직을 조심스럽게 제거합니다. 겸자를 사용하여 앞다리와 뒷다리의 조직을 제거합니다. 그리고 배아체에서 AGM 영역을 분리합니다.그런 다음 각 AGM을 각 웰의 공기-액체 계면에 있는 단일 필터에 놓습니다. 배양물을 섭씨 37도, 5%CO2 인큐베이터에 넣습니다. 2-3일 후, AGM 샘플을 200마이크로리터의 콜라겐분해효소가 들어 있는 개별 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨 섭씨 37도에서 5분마다 흔들면서 약 20분 동안 해리합니다.분해가 끝나면 이식당 200마이크로릴터의 혈청으로 반응을 중지합니다. 각 튜브의 전체 내용물을 웰당 500-600마이크로리터의 M3434 배지가 들어 있는 24웰 초저 부착 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 각 웰의 세포를 바늘 없이 1밀리리터 주사기로 혼합합니다.플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다. 각 우물 내의 군체 형성 단위의 수는 7일에서 10일의 배양 후에 점수를 매길 수 있습니다. 방금 시연된 바와 같이 AGM 배양 2-3일 후 생체 내 AGM 이식의 경우 9개의 회색 방사선을 가진 8-10주 된 수컷 C57 검은색 6마리 마우스를 치명적으로 방사선에 방사선을 방출합니다.4-5시간 후 수확된 외식을 샘플당 200마이크로리터의 콜라겐분해효소로 해리합니다. 생성된 단일 세포 현탁액에 해당하는 0.5 대 1 배아를 수용 동물 당 1 밀리리터 주사기 1 개에 적재합니다. 첫 번째 방사선 조사된 쥐를 구속기에 넣고 75% 에탄올을 적신 면봉으로 꼬리를 닦아 꼬리 정맥 혈관 확장을 촉진합니다.주사기 한 개의 전체 내용물을 확장된 꼬리 정맥에 정맥 주사합니다. 바늘을 제거한 후 출혈을 멈추기 위해 소독용 면봉을 사용하십시오. 그런 다음 동물을 우리로 되돌리고 다음 동물에게 주사합니다.입양 이식 후 11일 후, 비장은 눈에 보이는 비장 군집의 거시적 계수를 위해 Bouin의 용액에 고정될 수 있습니다. 플루옥세틴이 보충된 AGM 배양은 mRNA 및 단백질 발현 수준에서 HSC 발달을 위한 중추적인 유전자인 Runx1의 발현이 증가했음을 보여줍니다. 플루옥세틴은 또한 버스트 형성 단위 적혈구, 집락 형성 단위 과립 단핵구 및 집락 형성 단위 과립구, 적혈구, 대식세포 및 거핵세포를 포함하여 AGM에서 HSC의 집락 형성 능력을 크게 증가시킬 수 있습니다.또한, AGM 이식에서 분리된 플루옥세틴 처리된 HSC의 생체 내 이식은 방사선 조사된 성체 수용 동물의 비장에 있는 집락 수를 증가시킵니다. 이 비디오를 시청한 후에는 AGM 내에서 HSC 발달의 중요한 조절자를 식별하기 위해 AGM을 분리하고 AGM 이식 배양을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

application-aorta-gonad-mesonephros-explant-culture-system

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

mStrawberry OP9 세포가 공동 문화의 모든 ES - 파생 자손의 완전한 평가를 위해 수 있습니다.

수정 ES / OP9 공동 문화 프로토콜 조혈 제니의 향상된 특성화를 제공합니다

조혈을위한 3D 문화 시스템은 인간 코드 혈액과 leukemic 골수 세포를 사용하여 설명합니다. 방법은 세포외 기질 단백질로 코팅 다공성 합성 폴리 우레탄 발판의​​ 사용을 기반으로합니다. 이 발판은 세포의 광범위한 수용하는 적응이다.

정상과 비정상적인 인간 조혈의 전직 생체내 흉내

이 프로토콜은 쥐 배아 갑상선 항라겐의 해부와 반다공성 필터 또는 현미경 플라스틱 슬라이드의 외식자리 배양을 설명합니다. 이 시스템은 야생형 또는 녹아웃 배아의 갑상선 발달 과정에서 발생하는 형태발생학적 또는 분화 현상을 연구하는 데 이상적이며, 이득 및 기능 상실 실험에 적합합니다.

<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 문화 시스템 갑상선 개발을 연구하는

생체 외 직립 액적 배양은 현재의 시험관 내 및 생체 내 실험 기술의 대안입니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고 더 적은 양의 시약이 필요하며 태아 혈관화, 형태 형성 및 기관 형성을 조작하고 연구할 수 있는 기능을 허용합니다.

사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 전체 태아 기관의 강직 한 방울 문화 마우스 기관 형성 기간 동안 발달 프로세스를 연구

이 프로토콜은 마우스 배아에서 metanephric의 기초를 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다.

마우스 배아 신장의 해부 및 배양

배아와 perinatal murine 대동맥 여기 vivo에서 클론 분석 및 운명 매핑, 대동맥 explants 및 격리 된 부드러운 근육 세포 상세를 사용 하 여 공부에 대 한 프로토콜. 이러한 다양 한 접근의 정상적인 발전에서 배아 및 perinatal 대동맥 및 질병의 병 인 morphogenesis 조사를 촉진 한다.

Morphogenesis 배아 및 Perinatal 대동맥의 병 인을 공부 하 고 Vivo에서 , 조직 및 세포 Explant 접근을 사용 하 여

여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

이 문서에서는 소설 비켜 및 생체 외에서 실험 절차를 결합 하 여 기관 형성, 공부 클래식 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 업데이트 접근 합니다.

2 단계 접근-그리고 늦은-초기 조류 모델에서 기관 형성의 탐구: Thymus 및 부 갑 상선 동맥 Organogenesis 패러다임

이 작품은 장기 발달을 연구하기위한 두 가지 방법, 배양 배아 장기 및 오르가노이드의 혈관 을 허용하는 조류 배아에서 융모난성 막 (CAM)에 개선 된 이종이식 설정및 새로운 고정 z 방향을 설명합니다. 고해상도 시간 경과 공초점 이미징을 허용하는 수정 된 실험 조건을 가진 장기 배양 방법.

혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 Organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰

여기서, 1차 신생아 골린 고환 세포로부터 고환 오르가노이드를 발생시키는 네 가지 방법은 즉, 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM-없는 2D 및 3D 배양 환경으로 기술된다. 이러한 기술은 여러 연구 응용 프로그램을 가지고 있으며 시험관 내고 발달 및 생리학을 연구하는 데 특히 유용합니다.

추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

여기서, 우리는 손상된 조혈 및 면역 체계의 재건을 위해 치료용 조혈 줄기세포/전구 세포를 수확하기 위해 뼈 형태 유전 단백질-2 로딩 젤라틴 골격에 의해 유발되는 생체 내 골 오가노이드를 확립했습니다. 전반적으로 이 접근법은 세포 치료를 위한 유망한 세포 공급원을 제공할 수 있습니다.

치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

학습하세요 대동맥-생식-mesonephros(AGM) 외식 배양 기술을 활용하여 조혈줄기세포 발달의 핵심 조절인자를 연구하는 방법을. DNA 발현 분석과 콜로니 형성 능력을 통해 조절인자를 검증할 수 있습니다.

대동맥-생식-mesonephros Explant 문화 시스템 개발 조에의 응용

더 많은 동영상 탐색