Name: 위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 학습하세요 희귀하고 민감한 세포의 3차원 침윤 분석 방법을. 이 실험은 세포 미세환경을 보존하며 암 세포 이동 및 침윤 능력을 정량화하여 항암 치료제 개발에 활용됩니다.

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이 작품에서 잭슨 주립 대학 및 미국 부서 방어, 아이디어 상 11-1-0205의 환경 건강을 위한 RCMI 센터를 통해 건강의 국가 학회 (NIMHD-G12MD007581)에 의해 지원 되었다.

참고:이 프로토콜은 McArdle 외 에 설명 11. 시간 표시 막대를 그림 1에 제공 됩니다.
1입니다. 문화 접시의 준비
<ol><li>유리 아래쪽의 hydrophobicity 낮은 15 분 1 mL의 1 M 염 산 (HCl)와 10 m m 유리 바닥을 포함 하는 35 m m 문화 접시 세척.</li>
	<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 모든 HCl을 제거의 1 mL로 두 번 문화 접시 세척.</li>
	<li>70% 에탄올의 1 mL로 두 번 문화 접시 세척.</li>
	<li>셀 특정 문화 매체의 1 mL와 함께 문화 접시 린스 (여기, 사용 α-MEM 10% 열 보충 비활성화 FBS와 1% 비 본질적인 아미노산). 참고: 대우 문화 접시 문화 매체를 포함 하는 다음 날까지 37 ° C에서 가습기와 CO2 인큐베이터에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>35 m m 문화 접시의 잘 처리 유리 하단에 100 %confluency 세포 (MSCs 및 MCF-7 공동 문화)를 성장. 공동 문화 35000 MSC 세포와 24 h MCF7 셀 75000.</li>
</ol>2입니다. 콜라겐 젤의 준비
<ol><li>접촉 시 콜라겐의 중 합을 방지 하기 위해 냉동 실에 콜라겐 젤 pipetting 사용 micropipette 팁을 저장 합니다. 참고: 이것은 가장 중요 한 단계 이다.</li>
	<li>볼륨을 확인 사용 되 나 콜라겐의 농도에 따라 쥐 꼬리 콜라겐의. 이 분석 결과 대 한 콜라겐 젤 100 µ L를 준비 합니다. 참고: 쥐 꼬리 콜라겐 나 재고의 높은 농도 더 작동 합니다. 10 배 따라 콜라겐을 희석 하는 데 사용할 Dulbecco의 수정이 글의 중간의 볼륨을 결정 합니다.</li>
	<li>난 (3.8 µ g/mL 증권), 10 x Dulbecco의 수정 독수리의 매체 및 1 x 세포 배양 매체 2% 태아 둔감 한 혈 청 및 2.4 mg/mL의 콜라겐의 최종 농도에 적절 한 chemoattractant 보충 얼음 쥐 꼬리 콜라겐에 결합.</li>
	<li>나트륨 중 탄산염 해결책 콜라겐 젤 중화의 혼합물 4.5%를 추가 합니다. 참고: 나트륨 중 탄산염 솔루션 추가의 볼륨은 다른 시 약의 정확한 pH에 따라 달라질 수 있습니다. 이 pH 중립 해결책을 보장 하거나 산도 표시기를 사용 하 여 문화 매체에 스트립으로 혼합물을 테스트 하려면 좋습니다.</li>
	<li>바닥에 유리-잘 접시의 바닥 문화 내의 셀 콜라겐 혼합물의 80 µ L.</li>
	<li>37 ° c.에서 가습기와 CO2 배양 기에서 30 분 동안 유해를 콜라겐 젤 허용</li>
	<li>감소 된 혈 청 (2%)와 세포 매체의 2 mL와 함께 콜라겐 젤 커버 하 고 37 ° c 24, 48 또는 72 h에 대 한 가습기와 CO2 인큐베이터에서 세포를 품 어. 주의: 접시는 콜라겐 젤 유리 바닥에서 분리 하지 않도록 주의 처리 되어야 합니다.</li>
</ol>3. 콜라겐의 준비의 예 젤 3.8 µ g /mL의 쥐 꼬리 콜라겐 재고를 사용 하 여
<ol><li>얼음, 쥐 꼬리 콜라겐의 114.5 µ L, DMEM, x 10의 16.6 µ L, 문화 매체를 포함 하는 chemoattractant의 33.1 µ L를 결합 한다.</li>
	<li>나트륨 중 탄산염의 14.0 µ L로 콜라겐 혼합을 무력화.</li>
	<li>2.5 단계에서 계속 합니다.</li>
</ol>4. 셀의 이미징
<ol><li>부드럽게 요리에서 미디어를 제거 합니다.</li>
	<li>부드럽게 1 mL의 PBS로 젤 린스.</li>
	<li>15 분 동안 4 %paraformaldehyde 1 mL와 함께 셀을 수정 합니다.</li>
	<li>두 번 1 mL의 PBS로 세포 세척.</li>
	<li>DAPI 솔루션 (100 ng/mL) 실 온에서 20 분에 대 한 셀을 얼룩.</li>
	<li>Confocal 현미경을 사용 하 여 다른 위치에서 400 µ m z-스택 이미지를 16 µ m 단계에서 각 위치의 셀을 이미지. 사용 하는 현미경 confocal 영상 하얀 빛, 아크 여기 소스를 사용 하 여 수 있도록 단위 스캔 디스크가 있다. 0.75의 숫자 조리개와 활용 20 X 렌즈를 사용 합니다.</li>
	<li>이미지 reconstitute<ol>
<li>주어진된 젤 (약 25 이미지)에 대 한 이미지를 열고 이미지 스택 스택 이미지 → 스택 → 이미지를 클릭 하 여 만듭니다. 첫 번째 이미지는 젤 아래쪽에 대응 (z = 0 µ m), 두 번째 이미지는 z 방향에서 첫 번째 단계에 대응 (z = 16 µ m), 세 번째 이미지는 z 방향에서 두 번째 단계에 대응 (z = 32 µ m). 각 이미지 깊이에 각 핵을 평가 하 고 있는 핵 했다 날카로운 초점에 해당 특정 셀에 대 한 침입 깊이 깊이 지정.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Brocker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+cell+locomotion+within+three-dimensional+extracellular+matric%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).</li>
<li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture%3A+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).</li>
<li>Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell+migration+assay+using+scratch+wound+healing%2C+a+comparison+of+image-based+readout+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods.</a> BMC Biotechnol. 4, 21(2004).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration%3A+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).</li>
<li>Sahai, E., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differing+modes+of+tumour+cell+invasion+have+distinct+requirements+for+Rho%2FROCK+signalling+and+extracellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis.</a> Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).</li>
<li>Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+circular+invasion+assay+mimics+in+vivo+invasive+behavior+of+cancer+cell+lines+and+distinguishes+single-cell+motility+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro.</a> BMC Cancer. 8, 198(2008).</li>
<li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).</li>
<li>Poujade, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).</li>
<li>Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis-induced+cancer+cell+fusion%3A+a+mechanism+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis.</a> FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).</li>
<li>McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Inverted+Vertical+Invasion+Assay+to+Avoid+Manipulation+of+Rare+or+Sensitive+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types.</a> J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).</li>
<li>Noubissi, F. K., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Cell+Fusion%3A+Mechanisms+Slowly+Unravel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel.</a> Int J Mol Sci. 17, (2016).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li>
<li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat Materials. 13, 645-652 (2014).</li>
</ol>

저자는 경쟁 관심 있는지 선언.

여기, 희귀 및 그들의 microenvironment에 의존 하는 셀을 포함 하 여 세포 유형의 다양 한 편리한 간단한 반전된 세로 침공 분석 결과 설명 합니다. 이 3D 침공 분석 결과에서 세포는 그들의 원래 microenvironment에 남아 하 고 콜라겐 젤 포함 하는 chemoattractant에 의해 보호 됩니다. 세포 이동 그리고 콜라겐에 침공. 이 분석 결과에서 셀 스테인드 고 쉽게 젤 내 모니터링 될 수 있습니다. 단순 하 고이 분석 결과의 재현성은 공부 하는 암 세포 이동과 내 습 3D 시스템에 대 한 편리한 도구 합니다. 그러나, 강한 chemoattractants 셀 선호도 문화 접시의 바닥에 휴식 하는 데 필요한 것 같다.
우리는 35 m m 문화 접시에 거꾸로 세로 침공 분석 결과 최적화. 이 문화 요리는 10 m m 유리 하단 잘 이미징에 대 한 잘 장착. 이 문화 접시의 한 가지 한계 분석을 수행 하는 데 필요한 콜라겐 젤의 상당한 금액입니다. 디자인...

세포 운동 성 세포의 정상적인 발달 및 생리 적 과정 이다. 그러나, 변화 패턴 및를 침공 하는 세포의 능력에 염증 성 질환 및 암 전이1,2,3를 포함 하 여 병 적인 상태와 연결 됩니다. 전이 암에 가장 저조한 이해 측면. 전이, 암 세포 해야 합니다 여분의 세포 매트릭스 (ECM)을 저하를 현지 조직 및 intravasate를 침략. 혈액 순환, 암 세포는 먼 사이트에 유포 됩니다, 일단 extravasate 하 고 2 차 종양을 형성 한다. 따라서, 능력 저하는 ECM 셀, 마이그레이션, 침략 하 고 관련이 그들의 전이성 잠재력. 다른 방법은 분석 하 고 세포의 이동과 침략 기능 척도 개발 되었습니다. 가장 많이 사용 되는 접근 분석 결과, 시간 경과 현미경 검사 법, 그리고 Boyden 챔버 분석 결과 치유 하는 상처를 포함 한다. 상처 치유 분석 결과4 와 시간 경과 현미경 검사 법은 간단 하 고 편리한 분석 셀 마이그레이션에 예비 통찰력을 줄 것 이라고. 그러나, 둘 다는 세포 생체 내에존재 하는 3D 환경을 반영 하지 않는 2D 분석 실험입니다. 연구 결과 세포 2D 한5,6에 비해 3D 환경에 다르게 반응으로 나타났습니다. 또한, 상처 치유 분석 실험은 재현 하 고 양적 결과7,,89를 어렵습니다. 셀 제외 영역 분석 결과, 분석 결과 치유 하는 상처의 3D 수정 이면 더 순수 관련 분석 결과 이지만 하이브리드 셀 셀 퓨전 이벤트10,11 인 등 수에 낮은 셀에 적합 하지 않습니다. .
Boyden 챔버 분석 결과 세포 연구에 대 한 관련 microenvironments를 제공 하는 3 차원 분석 결과가 이다. 그러나, 그것은 그들의 원래 microenvironment에서 제거 하 고 예금 Boyden 분석 결과 시스템 마이그레이션 및 chemoattractant 포함 매체를 향해 아래쪽으로 침략의 위 상공으로 셀 필요 합니다. 이 3D 접근 취약 그들의 microenvironment 또는 제한 번호10,,1112셀의 마이그레이션 및 침략 기능 분석에 적합 하지 않다. 셀 마이그레이션 및 침략을 분석 하는 새로운 접근은 미세 그라데이션 챔버 시험13. 적합 하 고 마이그레이션 및 침략에 신뢰할 수 있는, 비록이 분석 결과 더 비싼 이며 전형적인 실험실에 대 한 기술적으로 어려울 수 있습니다. 여기 그들의 microenvironment에 민감한 세포를 포함 한 많은 세포 종류와 호환은 숫자에 제한 된 간단한 반전된 세로 침공 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과 후 퍼 그 외 여러분 에 의해 제안 된 프로토콜에서 적응 시켰다 14.이 분석 결과에서 셀 그들의 원래 microenvironment 및 그들의 이동에 남아 있고 chemoattractant11를 포함 하는 콜라겐 젤에서 위쪽으로 이동 침입 모니터링. 이 분석 결과 재현성 및 최적화 되었으며 35 m m 문화 접시에. 그것은 다른 세포 문화 크기, 다른 행렬 또는 접착, 및 다른 chemoattractants의 강도 포함 하 여 다른 시험 조건에 적응 시킬 수 있었다. 이 분석 결과 약 발견 과정에서 초기 심사를 위한 생체 외에서 플랫폼으로 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>MatTek P35G-1.5-10C</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Mattek 유리 바닥 접시</td></tr><tr><td>쥐꼬리 콜라겐 I</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>354236</td><td>콜라겐 젤</td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>H1758</td><td>HCl</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA</td><td>10010023</td><td>PBS (PBS)</td></tr><tr><td>10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>D2429</td><td>10X DMEM</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Confocal Fluorescent microscope</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td><td>Olympus IX81</td><td>Confocal&nbsp; 현미경</td></tr><tr><td>정의 태아 소 혈청</td><td>GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA</td><td>SH30070.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Ti:Sapphire 다광자 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA</td><td>40x NA 0.8 objective</td><td>MPLSM</td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Bitplane Inc. Zurich, CH</td><td>Imaris 7.5.2</td><td>Imaris software</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA</td><td>50980487</td><td>PFA</td></tr><tr><td>&alpha;-minimum essential medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC; 미국 버지니아주 매너서스</td><td>HBT-22</td><td></td></tr><tr><td>MSC</td><td>Trivedi and Hematti, 2007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X 렌즈 UPLAPO</td><td>Olympus America, 미국 펜실베니아 센터 밸리</td><td>36-064</td><td>Olympus UPLSAPO 20X 대물렌즈</td></tr></tbody></table>

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

3D 침입 분석을 개발 하 고, 그들의 microenvironment의 무결성을 영향을 주지 않고 세포를 연구 하는 도전 남아 있다. 전통적인 3D Boyden 챔버 필요한 셀은 원래 문화 위치에서 전치 하 고 새로운 환경에 이동와 같은 분석 실험. 뿐만 아니라이 microenvironment, 내부는 세포질 과정을 방해 하지만 그것은 종종 세포의 손실에 결과. 이러한 문제는 드문, 또는 그들의 microenvironment에 매우 민감한 세포와 거래 할 때 특히 도전. 여기, 우리 둘 다 문제를 방지 하는 3 차원 침공 분석 결과의 개발을 설명 합니다. 이 분석 결과에서 세포는 잘 작은 내 도금 고는 ECM 매트릭스는 chemoattractant를 포함 하는 셀 위에. 이 없는 셀 변위를 요구 하 고 행렬에 위쪽으로 침략을 셀 수 있습니다. 이 분석 결과에서 셀 침공으로 세포 형태 콜라겐 젤 내 평가 될 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리는 희귀 하 고 민감한 세포;의 침략 적 용량 특징 유방암 세포 MCF7 고 엽/multipotent 사이의 융합에서 발생 하는 하이브리드 세포 줄기/기질 세포 (MSCs).

우리 유리 아래쪽와 쥐 꼬리 콜라겐 35 m m 문화 접시 사용 개발 하 고 생체 외에서 3D 침공 최적화 나 프로토콜을 분석. 우리는 유 방 암 세포 MCF7 및 MSC 보였다이 분석 결과 사용 하 여 셀 48 h 후 각각 0.04 ± 1.8 µ m 및 41.3 ± 76.0 µ m의 평균 거리에 콜라겐 젤으로 침략 수 때 IGF1 (18.6 ng/mL) chemoattractant (그림 2)로 사용 되었다. 더 중요 한 것은, 우리는 드문 셀 인 MSC와 MCF7 셀에서 퓨전 제품 뿐만 아니라 콜라겐 젤으로 침입할 수 보였다. 48 h에 침략의 그들의 평균 거리 10.7 ± 12.4 μ m 때 IGF 18.6 ng/mL에 사용 되었다 chemoattractant (그림 2). MCF7와 MSCs 침공 기능에 차이 통계적으로 유의 한 (P &lt;...

이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

이 침입 분석의 전반적인 목표는 미세 환경에서 세포를 제거하지 않고 3D 환경에서 희귀하고 민감한 세포의 이동 및 침입 능력을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 암 세포 융합 산물과 같은 민감하고 oray 이벤트의 침입 능력에 대한 암 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포가 3D 설정을 사용하여 원래의 마이크로 환경에서 분석된다는 것입니다.이 기술의 의미는 암세포 침입 및 전이를 억제할 수 있는 약리학적 제제를 스크리닝하는 데 사용할 수 있기 때문에 암 치료로 확장됩니다. 이 기술을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 콜라겐 혼합물의 온도와 pH에 흡인은 중합에 영향을 미치고 거친 취급으로 인해 겔이 분리됩니다.먼저 10mm 유리 바닥이 있는 35mm 배양 접시에 1밀리리터의 염산 몰을 처리하여 유리의 소수성을 낮추는 것으로 시작합니다. 15분 후 세척당 1ml의 PBS로 플레이트를 두 번 세척한 다음 1mL의 70% 에탄올로 한 번 세척합니다. 다음으로, 사용할 관심 세포에 특이적인 1ml의 배양 배지로 플레이트를 헹굽니다.그리고 관심 세포가 있는 플레이트에 씨를 뿌립니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 100% 포화도에 도달하면 갓 준비한 쥐꼬리 콜라겐 114.5마이크로리터, 10 X DMEM 배지 16.6마이크로리터, 얼음 위의 마이크로 원심분리기 튜브에 관심 화학 유인제가 보충된 33.1마이크로리터의 배양 배지를 결합합니다.콜라겐 혼합물을 14마이크로리터의 중탄산나트륨으로 중화하고 세포에 80마이크로리터의 겔을 오버레이합니다. 콜라겐이 섭씨 37도의 가습된 온도와 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 30분 동안 중합되도록 합니다. 그런 다음 2밀리리터의 환원된 2% 혈청 세포 배양 배지를 겔 위에 겹겹이 쌓고 콜라겐을 제거하지 않고 적절한 실험 기간 동안 세포를 조심스럽게 인큐베이터에 되돌려 놓습니다.배양이 끝나면 배지를 부드럽게 제거하고 PBS 1ml로 젤을 조심스럽게 헹굽니다. 15분 동안 4% 파라포름알데히드 1밀리리터로 세포를 고정한 다음 세척당 1밀리리터의 PBS를 2회 세척합니다. 그런 다음 실온에서 20분 동안 DAPI 용액으로 세포에 라벨을 붙이고 컨포칼 현미경으로 체외 3차원 콜라겐 침입을 이미지화합니다.여기에서는 48시간의 이동 기간 동안 화학 유인물질에 대한 반응으로 유방암 세포주 및 유방암 세포 융합 산물에 의한 콜라겐 겔의 침입을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 특히, 화학 유인 물질에 대한 반응으로 희귀 유방암 세포 융합 산물이 콜라겐 겔로 이동하는 것도 관찰되었습니다. 세포는 콜라겐 겔 실험 내내 건강한 상태를 유지하며, 겔 중합 후 48시간 동안 강력한 세포 수와 형태를 유지하는 것으로 입증되었습니다.이 수직 콜라겐 겔 분석법은 또한 침입 시 세포 이동의 동역학을 분석하고, Z 시리즈에서 세포 이동을 이미징하여 분석할 수 있을 뿐만 아니라 이동하는 세포의 형태를 현장에서 캡처할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 현미경과 호환되는 배양 접시를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 콜라겐의 강도를 수정하거나 다른 화학 유인제를 사용하는 것과 같은 다른 변수를 도입하여 세포 침입에 대한 ECM 참여의 효과 또는 세포 침입에 대한 다른 화학 유인제의 효과에 대한 추가 질문에 각각 답할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 생물학 및 암 분야의 연구자들이 전이의 약리학적 억제제를 스크리닝하고 생체 내 모든 염증 반응에서 상처 치유를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마이크로 침범에서 세포를 왜곡하지 않고 3D 환경에서 희귀하고 민감한 세포의 이동 및 침입 능력을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간 암세포, 염산, 파라포름알데히드 및 DAPI와 함께 걷는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 2번 바이오 정화조 캐비닛 및 흄 홀드를 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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암 연구

이 비디오는 형광 기반의 방법론을 사용하여 세포 배양 삽입을 통해 세포의 공격을 측정하는 방법을 보여줍니다.

체외에서 FluoroBlok 종양의 침략 분석

입체 세포외 매트릭스에 종양 세포 침공의 모델이 더...

모델링 및 3 차원 이미징 단체 셀 침략

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

주변 정상 조직의 침입은 악성 종양을 정의하는 특징입니다. 우리는 여기에서 여러 진행성 인간 암 모델로 예시된 자연 3D 바이오매트릭스로의 침입에 대한 간단한 반자동 마이크로 플레이트 분석을 제공합니다.

3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다.  스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다.  이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)는 암이 침습적이 될 수 있도록 합니다. EMT를 조사하기 위해 혈청과 효소가 없는 신경줄기세포(NSC) 기반 체외 모델을 설명합니다. 이 표준화된 시스템을 통해 세포 이동, 유전자 및 단백질 발현에 대한 정량적 및 정성적 평가를 수행할 수 있습니다. 이 모델은 신약 개발에 적합합니다.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

방광 암 침공을 관리 하는 프로세스는 바이오 마커 및 치료 개발을 위한 기회를 나타냅니다. 여기 우리는 종양 spheroids 시간 경과 화상 진 찰, confocal 현미경 검사 법의 3 차원 문화를 통합 하는 방광 암 침공 모델 제시. 이 기술은 침략 과정의 기능을 정의 하 고 치료제 심사에 대 한 유용 합니다.

침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

침습은 암의 발병과 진행에 있어 중요한 생물학적 현상입니다. 이 과정은 비종양 세포와 종양 미세환경의 구성 요소에 의해 영향을 받습니다. 이 연구의 목적은 3차원(3D) 배양을 사용하여 종양 세포 침입을 in vitro 분석하는 대체 방법을 설명하는 것입니다.

3D 배양의 In vitro 세포 침입을 분석하기 위한 대안 전략

학습하세요 희귀하고 민감한 세포의 3차원 침윤 분석 방법을. 이 실험은 세포 미세환경을 보존하며 암 세포 이동 및 침윤 능력을 정량화하여 항암 치료제 개발에 활용됩니다.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

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