위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜
2018년 3월 12일
이 프로토콜 셀 셀 microenvironment를 유지 하면서 3 차원 설정의 마이그레이션 및 침입 기능을 계량 하는 데 사용할 수 있는 반전된 세로 침공 분석 결과를 설명 합니다. 이 분석 결과 희소 한 또는 민감한 세포에 적합 합니다.
이 침입 분석의 전반적인 목표는 미세 환경에서 세포를 제거하지 않고 3D 환경에서 희귀하고 민감한 세포의 이동 및 침입 능력을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 암 세포 융합 산물과 같은 민감하고 oray 이벤트의 침입 능력에 대한 암 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포가 3D 설정을 사용하여 원래의 마이크로 환경에서 분석된다는 것입니다.
이 기술의 의미는 암세포 침입 및 전이를 억제할 수 있는 약리학적 제제를 스크리닝하는 데 사용할 수 있기 때문에 암 치료로 확장됩니다. 이 기술을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 콜라겐 혼합물의 온도와 pH에 흡인은 중합에 영향을 미치고 거친 취급으로 인해 겔이 분리됩니다.
먼저 10mm 유리 바닥이 있는 35mm 배양 접시에 1밀리리터의 염산 몰을 처리하여 유리의 소수성을 낮추는 것으로 시작합니다. 15분 후 세척당 1ml의 PBS로 플레이트를 두 번 세척한 다음 1mL의 70% 에탄올로 한 번 세척합니다. 다음으로, 사용할 관심 세포에 특이적인 1ml의 배양 배지로 플레이트를 헹굽니다.
그리고 관심 세포가 있는 플레이트에 씨를 뿌립니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 100% 포화도에 도달하면 갓 준비한 쥐꼬리 콜라겐 114.5마이크로리터, 10 X DMEM 배지 16.6마이크로리터, 얼음 위의 마이크로 원심분리기 튜브에 관심 화학 유인제가 보충된 33.1마이크로리터의 배양 배지를 결합합니다.
콜라겐 혼합물을 14마이크로리터의 중탄산나트륨으로 중화하고 세포에 80마이크로리터의 겔을 오버레이합니다. 콜라겐이 섭씨 37도의 가습된 온도와 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 30분 동안 중합되도록 합니다. 그런 다음 2밀리리터의 환원된 2% 혈청 세포 배양 배지를 겔 위에 겹겹이 쌓고 콜라겐을 제거하지 않고 적절한 실험 기간 동안 세포를 조심스럽게 인큐베이터에 되돌려 놓습니다.
배양이 끝나면 배지를 부드럽게 제거하고 PBS 1ml로 젤을 조심스럽게 헹굽니다. 15분 동안 4% 파라포름알데히드 1밀리리터로 세포를 고정한 다음 세척당 1밀리리터의 PBS를 2회 세척합니다. 그런 다음 실온에서 20분 동안 DAPI 용액으로 세포에 라벨을 붙이고 컨포칼 현미경으로 체외 3차원 콜라겐 침입을 이미지화합니다.
여기에서는 48시간의 이동 기간 동안 화학 유인물질에 대한 반응으로 유방암 세포주 및 유방암 세포 융합 산물에 의한 콜라겐 겔의 침입을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 특히, 화학 유인 물질에 대한 반응으로 희귀 유방암 세포 융합 산물이 콜라겐 겔로 이동하는 것도 관찰되었습니다. 세포는 콜라겐 겔 실험 내내 건강한 상태를 유지하며, 겔 중합 후 48시간 동안 강력한 세포 수와 형태를 유지하는 것으로 입증되었습니다.
이 수직 콜라겐 겔 분석법은 또한 침입 시 세포 이동의 동역학을 분석하고, Z 시리즈에서 세포 이동을 이미징하여 분석할 수 있을 뿐만 아니라 이동하는 세포의 형태를 현장에서 캡처할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 현미경과 호환되는 배양 접시를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 콜라겐의 강도를 수정하거나 다른 화학 유인제를 사용하는 것과 같은 다른 변수를 도입하여 세포 침입에 대한 ECM 참여의 효과 또는 세포 침입에 대한 다른 화학 유인제의 효과에 대한 추가 질문에 각각 답할 수 있습니다.
개발 후 이 기술은 생물학 및 암 분야의 연구자들이 전이의 약리학적 억제제를 스크리닝하고 생체 내 모든 염증 반응에서 상처 치유를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마이크로 침범에서 세포를 왜곡하지 않고 3D 환경에서 희귀하고 민감한 세포의 이동 및 침입 능력을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인간 암세포, 염산, 파라포름알데히드 및 DAPI와 함께 걷는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 2번 바이오 정화조 캐비닛 및 흄 홀드를 사용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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개요
본 프로토콜은 세포 미세환경을 보존하면서 3차원 환경에서 희귀하고 민감한 세포의 이동 및 침습 능력을 정량화하는 역방향 수직 침습 분석법을 설명합니다. 이 방법은 특히 암 연구에서 유용하게 활용됩니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 세포 이동
- 암 연구
- 침습 분석
배경
- 본 분석법은 세포를 원래의 미세환경 상태에서 분석할 수 있게 합니다.
- 희귀하며 민감한 세포들을 분석할 수 있도록 설계되었습니다.
- 세포 침습을 이해하는 것은 암 치료법 개발에 있어 매우 중요합니다.
- 적절한 실험 수행을 위해서는 해당 기술에 대한 시각적 시연이 필수적입니다.
연구 목적
- 세포의 이동 및 침습 능력을 정량화하기 위함입니다.
- 민감성 세포의 침습 능력을 탐색하기 위함입니다.
- 암세포의 침습 및 전이를 억제하는 약물 후보 물질을 스크리닝하기 위함입니다.
사용된 방법
- 역방향 수직 침습 분석
- 3차원 세포 배양
- 미세환경 내 세포 분석
- 콜라겐 중합에 미치는 온도 및 pH 영향 평가
주요 결과
- 3D 환경에서 세포 거동을 분석하는 능력을 입증함.
- 세포 미세환경 유지의 중요성을 강조함.
- 암세포의 침습 능력에 대한 통찰을 제공함.
- 치료제 스크리닝 가능성을 보여줌.
결론
- 본 분석법은 암 연구를 위한 가치 있는 도구입니다.
- 민감한 세포의 미세환경을 보존합니다.
- 암의 침습 및 전이를 표적으로 하는 치료법 개발에 도움을 줄 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 분석법을 통해 바이오 제약 R&D 팀은 세포-ECM 간의 본래 상호작용을 저해하지 않고, 생리학적으로 유의미한 3D 미세환경 내에서 희귀하고 민감한 세포 모델의 침습 잠재력을 평가할 수 있습니다. 본 방법은 원래의 세포 틈새(niche)를 보존함으로써 전이 관련 표적의 기전적 리스크 제거를 지원하고, 초기 단계 표적 검증의 예측 신뢰도를 높입니다. 이는 기존 분석법이 미세환경의 무결성을 훼손했던 전임상 스크리닝의 결정적인 공백을 메워, 발굴 단계부터 리드 최적화까지의 중개 연속성을 향상시킵니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 천연 미세환경 조건 하에서 희귀 세포 또는 융합 유래 세포 모델의 침습성을 평가함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 세포 변위에 의한 인위적인 변동성을 줄여, 실험 간 침습 표현형의 재현성을 향상시킵니다.
- 예측적 가치: 3D 환경에서 분자적 섭동과 기능적 침습 결과 사이의 연관성을 분석하여 타겟의 위험 요소를 낮추는 것을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 고함량 이미징 및 자동 분석 워크플로우와 호환되는 표준화된 정량적 침습 지표를 생성합니다.
- 재현성: 분석 설정 중 세포층의 기계적 손상을 제거하여 웰 간 변동성을 최소화합니다.
- 확장성: 다양한 콜라겐 농도 및 화학 유인 물질과 호환되어 전이 억제제에 대한 구조-활성 관계(SAR) 연구가 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 질병 관련성: 생체 내 기질-종양 상호작용을 반영하는 섬유아세포-상피 하이브리드 세포를 사용하여 인간 암 침습 모델을 구현합니다.
- 중개 연속성: 침습적 행동에 필수적인 미세환경 단서를 유지함으로써 인비트로(in vitro) 연구 결과와 전임상 검증 사이의 가교 역할을 합니다.
- 위험 조정 결정: 기능적 침습 데이터를 제공하여, 미세환경 모델링 부족으로 인한 후기 단계의 실패 가능성을 낮추고 표적 또는 화합물의 우선순위를 정할 수 있게 합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 분석법은 초기 타겟 검증부터 리드 화합물 도출에 이르는 신약 개발 연속 과정에 적합하며, 전이 관련 연구 프로그램에서 Boyden Chamber 또는 transwell 시스템을 대체하여 미세환경을 보존할 수 있는 대안을 제공합니다.
- 발견 생물학: 생리적 콜라겐 겔 내 세포 이동의 실시간 z-stack 이미징을 가능하게 하여, 침습 경로에 대한 가설 기반 테스트를 지원합니다.
- 스크리닝: 특히 ECM 리모델링 또는 화학주성 신호를 표적으로 하는 약제에 대해, 화합물 라이브러리 스크리닝에 적합한 침습 종말점 데이터를 제공합니다.
- 분석: 침습된 세포 수의 정량화 및 형태학적 분석을 가능하게 하여, 구조-기능 상관관계를 위한 다중 파라미터 판독값을 제공합니다.
- 중개 연구: MSC-암 하이브리드를 사용하여 기질 매개 침습을 모델링함으로써, 바이오마커 연계 기전 연구를 지원합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 암 유형 및 기질 공배양에 적용 가능하여, 전이 및 상처 치유 프로그램에서 플랫폼의 재사용을 촉진합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 미세환경 파괴로 인한 위양성을 줄임으로써 타겟 검증의 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 겔 중합 및 오버레이 프로토콜을 통해 분석의 견고함을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 파이프라인 초기 단계에서 생리학적으로 유의미한 침습 데이터를 제공하여 go/no-go 결정의 품질을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 기능적 3D 침습 프로파일을 기반으로 전이 억제제의 리스크 계층화된 개발 추진을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 정확한 침습 정량을 위해 3D 세포 배양 및 공초점 현미경 분석에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 일관된 겔 중합을 보장하기 위해 콜라겐 준비 과정 중 정밀한 온도 및 pH 조절이 중요합니다.
- 재현 가능한 화학주성 반응을 위해 표준화된 화학유인물질 투여량과 혈청 감소 배지 조건이 필수적입니다.
- 대체 ECM 단백질(예: Matrigel, fibrin)을 적용할 경우, 겔화 속도 및 농도에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 겔 층을 통해 상향 침습이 가능한 부착성 또는 반부착성 세포로 제한되며, 비부착성 부유 세포의 경우 수정이 필요할 수 있습니다.
