Name: 동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 렌즈 무료 비디오 현미경을 이용한 부착 세포 배양의 정량 분석 방법입니다. HeLa 세포를 2.7일간 추적하여 세포 주기 역학과 형태학적 특성을 연구하는 이 기술은 세포 생물학 및 약물 스크리닝 연구에 활용됩니다.

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저자는 인정 하는 없다.

1. 세포 배양 수집을 모니터링
<ol><li>DMEM + 글루타민 (예, GlutaMAX) 헬러 세포 성장 매체 10% (v/v) 열 비활성화 태아 송아지 혈 청, 1% 페니실린과 스 보완.</li>
	<li>6 잘 유리 하단 문화 접시 fibronectin (25 µ g/mL) 1 h 코트. 다음에 잘 당 2 × 104 셀 씨.</li>
	<li>인수, 동안 매체를 3 일 마다 변경 합니다.</li>
	<li>시간 경과 수집에 대 한 비디오 렌즈 무료 현미경 (상용)을 사용 합니다. 참고: 이것은 근거한 전산 렌즈 무료 이미징 기술에 Ozcan 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 16 는 37 ° C12,15의 제어 온도에 인큐베이터에서 지속적인 모니터링을 수행 하도록 수정 되었습니다. 그것은 1.67 μ m의 픽셀 피치와 6.4 x 4.6 m m2의 이미징 영역 보완 금속 산화물 반도체 (CMOS) 이미지 센서를 갖추고 있습니다. 여러 파장 조명 장치에 의해 멀티 칩 빛 발광 다이오드 (Led), 빨강, 녹색 및 파랑 조명 제공 제공 됩니다. 파장은 중심, 636, 521, 452 nm 각각 25, 45, 25의 스펙트럼 대역폭으로 nm 각각. 빨강-녹색-파랑 (RGB) Led 세포에서 약 5 cm의 거리에서 150 µ m pinhole 위에 있습니다. 빛 전원 LED 주변 측정은 각 파장에 10 µW 낮은 이며 조명 시간 인수 당만 1 초. 따라서, 셀 문화는 렌즈 무료 비디오 현미경 관찰 사진 독성 문제가 예상 된다.</li>
	<li>셀 문화 컨테이너 CMOS 센서 (그림 1)과 접촉을 넣어. 컨테이너를 사용 하 여 렌즈 무료 취득의 품질에 대 한 중요 한 맨 유리 coverslip로. 플라스틱 용기를 사용할 수 있습니다 하지만 렌즈 무료 취득 이러한 컨테이너의 광학 품질 때문에 타락 될 것 이다.</li>
	<li>제어 비디오 렌즈 무료 현미경 수집 (상용) 소프트웨어와 함께 시간 경과 수집 및 홀로그램 재구성을 수행 합니다. 소프트웨어 인터페이스에서 사용자가 입력 해야 하는 매개 변수는 프레임 속도 실험, 세포 배양, 즉 부착 셀 또는 부동 셀의 종류의 기간.</li>
	<li>수집 소프트웨어의 입력된 매개 변수를 설정 합니다. 1 수집 10 분 간격으로 설정 하 고 '부착' 셀 문화 유형을 설정 프레임 속도 설정 합니다. 참고: 한 인수 10 분 마다의 프레임 속도 좋은 타협으로 안정적인 셀 추적 분석 결과 데이터 집합의 크기는 여전히 합리적인 보장. 빠른 프레임 속도이 현미경 렌즈 무료 설치와 함께 달성 한 인수 5 분 마다입니다. 과도 한 난방 문화에 있는 세포의 생존 능력에 영향을 미칠 수 있는 CMOS 센서의 결과 프레임 속도 더 증가.</li>
	<li>시간 경과 수집을 시작 하 고 홀로그램 재구성 알고리즘 (상용) 세포 배양의 위상 이미지를 렌즈 무료 수집을 자동으로 처리 됩니다. 홀로그램 재구성 알고리즘 기반으로 다중 파장 위상 검색 알고리즘17 하며 RGB 재건된 단계 이미지의 범위에 [-π, π +] 29.4 m m2의 넓은 시야를 통해 각 단일 셀에 대 한. 밝히는 얇은 샘플 렌즈 무료 인라인 홀로 그래피의 원리는 (z = 0) (진폭 1 정규화 후)의 평면 파로 짧은 거리 z에 후속 회절 강도 이미지 CMOS 센서에 감지 하 고 = Z, 후 일반적으로 1 m m는 샘플입니다. 우리의 설정에서 조명 순차적으로 전환 3 파장 (λ1= 0.450 µ m 이다, λ20.540 µ m 이다, λ3= = 0.647 µ m) 동일한 샘플의 3 개의 회절 패턴 측정 하.</li>
</ol>2. 세포 문화 데이터 분석
<ol><li>셀 추적용 Trackmate 알고리즘, 단일 입자18의 자동화 된 추적에 대 한 오픈 소스 피지 플러그인을 사용 합니다. 에 먼저, 피지 (부하 이미지 시퀀스 명령)에 전체 시간 경과 수집 로드. 일반적으로 400 RGB 프레임 29.7 Mb의 기능, 데이터 집합의 큰 크기 때문에 빠릅니다 8 비트 포맷에 그들을 로드. 다음 Trackmate 피지 플러그인 즉 셀 감지 단계, 셀 추적 단계 및 셀 탐지 및 계산된 트랙에 적용 되는 여러 필터 셀 추적 알고리즘의 여러 단계를 통해 사용자를 안내 합니다. 모든 단계에서 알고리즘을 구성 하 고 결과 표시 즉시를, 필요한 경우, 하나 쉽게 이동할 수 있습니다와 설정을 재조정. Trackmate 인터페이스의 다양 한 메뉴는 HeLa 세포 실험에 사용 된 실제 설정 함께 그림 2 에 표시 됩니다.</li>
	<li>( 그림 2참조) 다음과 같은 수집 소프트웨어의 입력된 매개 변수를 설정 합니다. 15 픽셀, 15 픽셀 간격 닫기 최대 거리 및 3.5 트랙에 관광 명소의 수를 예상된 blob 직경 15 픽셀, 0.25 검출기 임계값, 연결 최대 거리를 설정 합니다. 참고: 이러한 설정은 분명 다릅니다 한 실험에서 특히 '예상된 blob 직경' (1.67 μ m의 픽셀에 주어진 여기) 셀 크기에 해당 하는 다른. 같은 발언 '연결 최대 거리' 최대 거리에 대 한 계정 (1.67 μ m의 픽셀에 주어진 여기)의 연속 프레임 두 개 내 셀 여행에 적용 됩니다. 최적의 값 셀 운동에 뿐만 아니라 세포 밀도에 따라 것입니다.</li>
	<li>셀 추적 과정의 끝에, 세 개의 텍스트 파일의 형태로 결과 생성 ('분석' 버튼을, 그림 2참조). 인수, 그들의 프레임 번호 및 트랙 번호에 그들의 각각 (x, y) 위치와 검색 된 모든 셀을 나열 하는 테이블 '트랙 통계의 관광 명소' 라는 가장 유용한 파일에 의하여 이루어져 있다. 이 데이터를 기준으로 셀 세분화를 수행 하 고 전용된 알고리즘 (보충 코드 파일 참조)를 사용 하 여 세포 분열을 감지. 두 개의 다른 파일 이름이 '트랙 통계에서 링크'와 '통계를 추적 하 는'와 트랙, 트랙 기간 예를 들면 , 감지 된 간격의 수를 취급 하는 모든 결과 포함, 초기 프레임, 등을 추적.</li>
	<li>셀 분할 알고리즘을 사용 하 여 재건된 단계 이미지에서 셀 형태를 설명 하는 몇 가지 통계를 자동으로 추출 (참조 보충 코드 파일). 이러한 메트릭은 셀 표면적 (S), 세포 주 축 길이 (L), 셀 부 축 길이 (l)와 셀 가로 세로 비율 (L/l)입니다. 위상 현미경 렌즈 무료에서 발견 한 듯이15표본 층의 두께 밀도에 비례 이다.</li>
	<li>세포의 형태학 적 기능 외에 재건된 단계13,,1920 에서 양적 셀 건조 질량 (CDM) 측정을 추출 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq1v3.jpg">식 (1) φ(x,y)는 재건된 단계 교대19, λ는 파장 및 α = 1.8 x 10-4 m3/k g 건조 질량1, 굴절률의 변화에 관련 된 특정 굴절률 19.</li>
	<li>문화 매체의 굴절률 셀 사이의 차이의 추정을 사용 하 여 셀 간격을 평가 합니다. 셀 두께 h(x,y)와 측정 된 위상 변화 사이의 관계는20에 의해 주어진 다: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq2v3.jpg">식 (2.1) <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq3v3.jpg">식 (2.2) Δn(x,y) = n셀 (x,y)- n매체 (x,y), 셀 및 문화 매체의 굴절률 차이. 다음, 가정 Δ의 상수 값n 0.025 =, HeLa 세포 핵에서 측정 하는 굴절률에서 추정 되는 (n = 1.35511) 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 문화 미디어의 (n = 1.33). 셀 간격 값은 가정에 기반으로 나타내는, 상대 유사 의미 하 고 나누어 셀을 검출 악용 될 수 있습니다.</li>
	<li>전용된 알고리즘을 사용 하 여 측정 두께 8 µ m 보다 큰 세포가 세포 분열의 발생을 감지 하 여 다음 세포 분열을 탐지 하기 위해 검색 된 셀 사단에 관련 된 셀 트랙을 추출 (참조 보충 코드 파일) 먼저 식별 됩니다, 그리고 확인 여부는 새 셀에 밀접 하 게 나타납니다 공간 시간. 이 방법에서는, 세포 분열의 감지 두 강력한 조건에 의존합니다. 세포 분열 탐지를 위한 더 정교한 방법과 대안 lensfree 시간 경과 인수21,,2223에 적용할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

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이 문서에서 우리는 그 렌즈 무료 비디오 현미경 세포의 수천의 활동을 캡처 인큐베이터 안에 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 전반적인 방법론을 설명 하기 위해 우리는 어떻게 문화에 HeLa 세포의 2.7 일 경과 수집 표준 셀 추적 알고리즘으로 분석 될 수 있다 설명 했다. 2.2 x 106 셀 측정 및 10,584 세포 주기 트랙을 갖춘 데이터 집합입니다. 인수는 비교적 큰 셀 셀 거리 Hela 세포의 문화에 수행 (셀 밀도 < 500 세포/mm2) 세포 형태학 디스크 접근 될 수 있다. 이 두 기능은 같은 큰 데이터 집합을 수집 가능 하 게 하는 자동 셀 추적 분석의 응용 프로그램을 촉진 한다. 다른 셀 라인 작은 셀 셀 거리 또는 더 복잡 한 형태학 추적 하기 더 어려울 것 이다 고 후속 데이터 집합 더 작을 것 이다.
우리는이 이렇게 많은 연구, 예를 들어 세포 증식과 세포 크기 연구에 대 한 흥미로운 믿습니다. 후자는 기본적인 생물학...

여러 가지 세포 주기 전체에 걸쳐 경작된 한 포유류 세포를 모니터링 하 고 정확 하 게 측정 셀 크기와 셀 건조 질량은 어려운 작업. 여러 레이블 없는 광학 기술이 작업1,2를 수행할 수 있습니다: 위상 이동 간섭계3, 디지털 홀로그램 현미경 (DHM)4,,56, 7, quadriwave 측면 전단 간섭계8,9 그리고 양적 단계 단층 촬영10,11. 이러한 방법은 포유류 세포의 세포 주기의 이해에 많은 새로운 통찰력을 끌고있다. 그러나 그들은 거의 알고리즘을 추적 하는 자동 셀과 결합 된 측정 될 때 그들의 처리량 제한 유지 세포 대량 궤도1 (N < 각각3,,45 에서 20 , 6). 따라서 소설 광 방법 큰 통계와 셀 대용량 궤적을 측정 필요 (N > 1000).
이 문서에 동시에 인큐베이터, 내부 직접 세포의 이미지 다음 개별 세포 주기 트랙의 수천에 따라 단일 셀 통계를 계량을 렌즈 무료 비디오 현미경의 기능을 설명 합니다. 현미경 렌즈 무료 양적 위상 이미징 기술을 매우 큰 시야에 밀도가 포장된 셀의 위상 이미지의 인수를 허용 하는 (일반적으로 여러 가지 수만 m m2, 여기 29.4 m m2)12,13 ,,1415. 단일 셀 수준에서 몇 가지 통계 결정 됩니다, 예를 들어, 셀 지역, 건조 질량, 셀 간격, 셀 주요 축 길이 셀 및 가로 세로 비율12,15, 각 이미지에서 셀. 그런 다음 셀 추적 알고리즘을 적용 하 여 이러한 기능 그릴 수 있습니다 모든 단일 셀에 대 한 실험 시간14,15의 기능으로. 또한, 셀 트랙에 세포 분열의 발생을 감지 하 여 그것은 초기 세포 (세포 분열) 후, (세포 분열) 직전 최종 셀 건조 질량 질량과 셀 건조와 같은 다른 중요 한 정보를 추출할 수 기간, 즉, 2 개의 연속적인 사단15시간 주기. 모든이 측정은 매우 좋은 통계 계산 될 수 있다 (N > 1000) 이후 큰 시야 일반적으로 200 ~ 10000 셀 단일 렌즈 무료 획득의 분석 허용.
렌즈 무료 비디오 현미경 검사 법에 따라이 방법론을 설명 하기 위하여 감시 하 고 2.7 일 HeLa 세포 배양을 계량 프로토콜을 설명 합니다. 데이터 분석은 다중 파장 홀로그램 재건, 셀 추적, 셀 분할 및 세포 분열 알고리즘에 따라 4 단계 프로세스입니다. 여기 공간 해상도이 렌즈 무료 비디오 현미경 설치 얻은 비교적 빠른 프레임 속도 (한 인수 10 분 마다) 표준 셀 추적 알고리즘와 호환 되는지 표시 됩니다. 이 데이터 집합의 전체 분석 완전 한 세포 주기에 10,584 셀 트랙의 측정에서 발생합니다.
요약, 렌즈 무료 비디오 현미경은 자동으로 레이블이, 동기화, 수천 및 실험; 당 수정 되지 않은 셀을 모니터링 하는 강력한 도구 여러 가지 세포 주기를 통해 추적 되 고 각 셀입니다. 우리의 측정은 따라서 세포의 큰 인구에 간 세포 가변성을 더 중요 하 게, 하지만 몇 가지 셀 매개 변수 평균 값을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Cytonote 렌즈 없는 비디오 현미경&nbsp;</td><td>Iprasense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horus 획득 소프트웨어</td><td>Iprasense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-well 유리 바닥 문화 플레이트</td><td>MatTek corporation</td><td>부품 번호: P06G-0-14-F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX 매체&nbsp;</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 태아 송아지 혈청&nbsp;</td><td>유로바이오</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린과 스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab, 이미지 처리 도구 상자&nbsp;</td><td>매스웍스</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

여기, 우리가 보여 그 렌즈 무료 비디오 현미경을 동시에 인큐베이터 안에 직접 세포의 수천의 활동을 캡처 수 있습니다 하 고 모니터링 하 고 여러 세포 주기에 따라 단일 셀 계량 가능 하다. 우리는 모니터 2.7 일 HeLa 세포 배양을 계량 하는 데 사용 하는 전체 프로토콜을 설명 합니다. 첫째, 셀 문화 수집 렌즈 무료 비디오 현미경으로 수행 되 고 다음은 데이터를 4 단계 절차에 따라 분석: 다중 파장 홀로그램 재건, 셀 추적 셀 세분화 및 세포 분열 검출 알고리즘입니다. 결과적으로, 우리는 수집 하는 데이터 집합을 갖춘 10000 세포 주기 트랙과 2 x 10 이상6 셀 형태학 측정 보다는 더 가능 하다는 것을 보여줍니다.

홀로그램 재건 과정에 대 한 가벼운 분야는 스칼라 필드 설명 (어디 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq4v3.jpg"> 샘플, 그리고 측면 위치에서 거리 z 에서 비행기에 A 의 복잡 한 값은 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq5v3.jpg"> 및 파장 λ에서). 빛의 전파 전파 커널 제공 하는 호이 겐 스-프레넬 이론에 의해 모델링 됩니다 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq6v3.jpg"> . 따라서, 필드 진폭 검출기 비행기에서 z 다음 관계식에 의해 빛의 진폭 0 에 관련 되어: <img alt="Equation 7" src="/f...

렌즈 무료 비디오 현미경 셀 문화 인큐베이터 안에 직접 모니터링할 수 있습니다. 여기 우리가 획득 하 고 배양된 HeLa 세포의 2.7 하루 종일 수집 분석 하는 데 사용 하는 전체 프로토콜 설명, 개별 셀 형태학 및 10584 세포 주기6 측정 추적 2.2 x 10의 데이터 집합에 지도.

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

이 방법론의 전반적인 목표는 렌즈가 없는 비디오 현미경 검사법을 통해 모니터링되는 많은 부착 세포 집단의 역학을 획득하고 분석하는 것입니다. 따라서 우리는 이 기술이 생물학의 많은 분야와 세포 증식, 세포 방광염, 약물 스크리닝 또는 다양한 바이오 프로세스 모니터링을 연구하는 데 흥미롭다고 생각합니다. 따라서 이 기술은 레이블이 없으며 매우 간단합니다.그러나 큰 세포 집단을 연구하는 데 매우 효과적입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 박테리아 검출 분야에서 포유류 세포 이미징 분야로 전환했을 때 어떤 아이디어입니까? 그런 다음 생물학자가 인큐베이터에 직접 회로를 타임 랩스 획득해야 하는 것이 유용했습니다.그런 다음 인큐베이터와 호환되는 맞춤형 렌즈 없는 비디오 현미경을 제작하고 홀로그램 재구성 알고리즘을 개발하여 매우 넓은 시야에 존재하는 수천 개의 세포를 사진으로 얻을 수 있습니다. 6웰 유리 바닥판을 실온에서 1시간 동안 피브로넥틴으로 코팅하여 이 절차를 시작합니다. 1시간 후 과도한 피브로넥틴을 제거하고 PBS로 6웰 유리 바닥판을 헹굽니다.DMEM에서 성장한 헬라 세포와 활성화된 태아 송아지 혈청에 10%의 열이 보충된 글루타민 배지, 1%의 페니실린 및 스트렙토마이신이 이 시연에 사용됩니다. 배양 플레이트당 20,000개의 세포를 파종합니다. 바닥이 유리인 용기를 사용하는 것이 중요합니다.렌즈가 없는 획득의 품질을 위해. 배양 플레이트를 렌즈가 없는 비디오 현미경 위에 있는 인큐베이터에 놓습니다. 이 타임 랩스 획득에 사용된 렌즈 없는 비디오 현미경은 상업적으로 이용 가능합니다.이미징 영역이 29.4제곱밀리미터이고 픽셀 피치가 1.67마이크로미터인 금속 산화물 반도체 이미지 센서가 있습니다. 다중 파장 조명은 셀에서 약 5cm 거리에서 150마이크로미터 핀홀 위에 위치한 다중 칩 발광 다이오드 장치에 의해 제공됩니다. 타임랩스 획득을 시작하기 전에 커버 플레이트에 결로 현상이 없는지 확인하는 것이 중요합니다.응결은 획득의 이미지 품질을 저하시키기 때문입니다. 배양판 덮개에 결로 현상이 발생하면 덮개를 청소하십시오. 시중에서 판매되는 획득 소프트웨어로 렌즈 없는 비디오 현미경을 제어하십시오.타임랩스 획득과 홀로그램 재구성을 모두 수행합니다. 소프트웨어 인터페이스에 필요한 입력 매개변수를 입력합니다. 프레임 속도를 10분마다 1 획득으로, 세포 배양 유형을 고착으로, 실험 기간을 3일로 설정합니다.타임랩스 획득을 시작합니다. 이 이미지는 한 프레임에서 29.4제곱밀리미터 영역의 파란색 채널에서 원시 획득의 전체 시야의 예를 보여줍니다. 패널 B는 패널 A의 세부 사항이고 패널 C는 패널 B의 세부 사항이며 홀로그램 재구성 알고리즘은 렌즈 없는 획득을 자동으로 처리하여 세포 배양의 위상 이미지를 얻습니다.단계 언래핑 전의 셀 예시 이미지가 표시되고, 그 다음에는 위상 언래핑 후의 이미지가 표시됩니다. 세포 추적은 단일 입자의 자동 추적을 위한 오픈 소스 피지 플러그인인 TrackMate 알고리즘을 사용하여 수행됩니다. 로드 후 피지로 전체 타임랩스를 획득하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 알고리즘을 구성하고 입력 매개변수를 설정합니다.예상 블롭 직경을 15픽셀로, 검출기 임계값을 0.25로, 연결 최대 거리를 15픽셀로, 갭 클로징 최대 거리를 15픽셀로, 트랙의 스폿 수를 3.5픽셀로 설정합니다. 세포 추적 알고리즘의 첫 번째 단계는 렌즈가 없는 획득에서 세포를 감지하는 것입니다. 셀 추적 알고리즘의 결과가 표시되며, 50개 프레임 또는 약 8시간 동안 모든 셀 추적이 표시됩니다.중간 속도에 해당하는 색상 코드가 있습니다. 아래쪽 패널은 위쪽 패널의 노란색 사각형에 대한 자세한 이미지입니다. 세포 추적의 대표적인 비디오 클립이 여기에 표시됩니다.세포 추적 프로세스가 끝나면 분석 버튼을 선택하여 결과를 3개의 텍스트 파일 형태로 생성합니다. 이 데이터를 기반으로 세포 분할을 수행하고 텍스트 프로토콜 및 보충 코드 파일에 자세히 설명된 대로 전용 알고리즘을 사용하여 세포 분열을 감지합니다. 전체 타임 랩스 획득에 대한 모든 단일 세포 측정값을 컴파일하면 시간 함수로 여러 메트릭의 산점도가 생성됩니다.전체 시야에 있는 총 셀 수는 2.7일 만에 2,000개에서 최대 15,000개까지 증가합니다. 여기에 시점의 수를 곱하면 검출된 셀의 대규모 데이터 세트가 생성됩니다. 각각은 좌표와 형태학적 특징(예: 건조 질량, 면적, 평균 두께, 주요 접근 길이 및 종횡비)을 특징으로 합니다.세포 추적과 세포 분할 알고리즘의 결합으로 단일 세포 수준에서 kinetic 측정이 가능합니다. 이 예는 약 66시간 동안 지속되는 세포 추적의 분석을 보여주며, 노란색 원으로 표시된 시점에서 4개의 세포 분열을 나타냅니다. 여러 메트릭이 시간:세포 표면적, 건조 질량, 평균 두께 및 세포 운동성의 함수로 계산되었습니다.2.7일 관찰에 대한 세포 주기 지속 기간의 분포는 agouzian에 가까웠습니다. 평균 16.5 시간. 자동으로 측정된 세포 주기 길이는 수동으로 측정된 길이와 상관관계가 높습니다.세포 초기 건조 질량, 최종 건조 질량 및 세포 주기 동안의 평균 성장률과 같은 다른 매개변수도 조사했습니다. 일단 마스터하면 타임 랩스 획득에 대한 완전한 데이터 분석은 CPU 구성 및 하드웨어 성능에 따라 몇 시간 내에 완료 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 초기 세포 농도를 주의 깊게 확인하는 것이 매우 중요합니다.초기 세포 농도가 너무 크면 세포 추적 알고리즘이 세포 궤적을 제대로 정의하지 못합니다. 그러나 세포 농도가 너무 낮으면 전체 분석의 통계도 너무 낮아집니다. 이 절차에 따라 자동화된 유사 세포 추적 분석을 수행하여 생물학, 기초 생물학 또는 화학주성 분야의 다른 질문에 답할 수 있습니다.이 새로운 기술은 또한 세포주기 연구에 흥미로운 통찰력을 제공할 세포 계통을 모니터링할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 렌즈 없는 비디오 현미경을 사용하여 타임 랩스 획득을 수행하는 방법과 많은 세포 집단을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포의 Lensfree 온 - 칩 이미징 및 특성은 그림이다. 이 온칩 세포 이미징 접근 방식은 자원 가난한 설정을 위해 특히 적합, 의료 진단 및 높은 처리량 세포 생물학 애플 리케이션을위한 소형 및 비용 효율적인 도구를 제공합니다.

셀 Lensless 온 - 칩 영상은 높은 처리량 세포 생물학 및 의료 진단을위한 새로운 도구를 제공합니다

lensless 온칩 형광 현미경 플랫폼 시연입니다 예의 울트라 와이드 뷰 필드 이상의 이미지를 형광 물체 수, 디코딩 알고리즘을 기반으로 압축 샘플링을 사용하여 &lt;4μm 해상도&gt; 0.6-8 cm2. 이러한 작고 넓은 분야 형광 온 칩 영상 양상은 높은 처리량 cytometry, 희귀 세포 연구와 microarray 분석을 위해 도움이 될 수 있습니다.

칩에 Lensless 형광 현미경

이 방법은 실제 시간과 같은 속도, 변위와 속도 등 다양한 세포 이주 매개 변수의 양적 측정에 세포의 모니터링이 가능합니다. 전통적인 방법과는 달리,이 실시간 접근법 끝점 양적 마이 그 레이션 측정에 기초하지 않고 대신 그것은 모니터링하고 지속적으로 서로 다른 매개 변수를 계산할 수 있습니다.

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

우리는 미크론 크기의 긴축의 시퀀스를 통해 전송하여 셀에 대한 척도를 측정하기 위해 마이크로 유체 기반 분석을 보여준다.

미세 유체 기술은 셀 변형능을 검사 할

신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

Fónster 공명 에너지 전송 (FRET) 기반 센서의 내재 된 낮은 신호 대 잡음 비율 (SNR)으로 인해, 특히 세 공간 차원에서 cAMP 신호의 측정이 도전하고있다. 여기서는 3개의 공간 차원에서 cAMP 분포를 측정할 수 있는 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석 방법론을 설명합니다.

4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 3차원 cAMP 분포 측정

우리는 1500 배양 장치, 향상된 연동 펌프의 배열및 현장 믹싱 계수로 구성된 복잡한 생명 기계에 대한 높은 처리량 연구를위한 미세 유체 시스템을 제시합니다. 미세 유체 칩은 생체 내 매우 복잡하고 역동적인 미세 환경 조건을 분석할 수 있게 해줍니다.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

iTACS(셀룰러 신호)를 분석하는 통합 툴킷은 부착 셀에서 다양한 화학 및 기계적 신호를 동시에 측정하는 과정을 자동화합니다. iTACS는 지역 사회 기반의 개발을 용이하게하고 연구원이 교육 배경에 관계없이 모든 플랫폼 기능을 사용할 수 있도록 설계되었습니다.

세포 신호를 분석하는 통합 툴킷: 힘, 동작, 형태학 및 형광

이 원고는 계면 형태를 시각화하면서 계면 장력과 표면 팽창 유변학을 동시에 측정하기 위해 마이크로 텐시오미터 / 공초점 현미경의 설계 및 작동을 설명합니다. 이것은 기술 및 생리학에서 중요한 인터페이스의 구조 - 속성 관계의 실시간 구축을 제공합니다.

동적 인터페이스의 공초점 현미경 시각화를 위한 마이크로텐시오미터

제시된 프로토콜은 미세유체 동적 배양 채널과 기존의 고정 웰 정적 배양 챔버에서 부착 세포층 구조를 시각화하기 위해 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 팔로이딘 기반 필라멘트-액틴 염색 기술의 개발 및 사용을 설명합니다. 이 접근법은 세포층 밀도, 단층 형성 및 층 두께 균일성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

생리학적 크기의 미세유체 배양 장치에서 상피 세포 단층의 준비 및 구조 평가

여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

배우세요 렌즈 무료 비디오 현미경을 이용한 부착 세포 배양의 정량 분석 방법입니다. HeLa 세포를 2.7일간 추적하여 세포 주기 역학과 형태학적 특성을 연구하는 이 기술은 세포 생물학 및 약물 스크리닝 연구에 활용됩니다.

동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

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