동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

이 방법론의 전반적인 목표는 렌즈가 없는 비디오 현미경 검사법을 통해 모니터링되는 많은 부착 세포 집단의 역학을 획득하고 분석하는 것입니다. 따라서 우리는 이 기술이 생물학의 많은 분야와 세포 증식, 세포 방광염, 약물 스크리닝 또는 다양한 바이오 프로세스 모니터링을 연구하는 데 흥미롭다고 생각합니다. 따라서 이 기술은 레이블이 없으며 매우 간단합니다.

그러나 큰 세포 집단을 연구하는 데 매우 효과적입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 박테리아 검출 분야에서 포유류 세포 이미징 분야로 전환했을 때 어떤 아이디어입니까? 그런 다음 생물학자가 인큐베이터에 직접 회로를 타임 랩스 획득해야 하는 것이 유용했습니다.

그런 다음 인큐베이터와 호환되는 맞춤형 렌즈 없는 비디오 현미경을 제작하고 홀로그램 재구성 알고리즘을 개발하여 매우 넓은 시야에 존재하는 수천 개의 세포를 사진으로 얻을 수 있습니다. 6웰 유리 바닥판을 실온에서 1시간 동안 피브로넥틴으로 코팅하여 이 절차를 시작합니다. 1시간 후 과도한 피브로넥틴을 제거하고 PBS로 6웰 유리 바닥판을 헹굽니다.

DMEM에서 성장한 헬라 세포와 활성화된 태아 송아지 혈청에 10%의 열이 보충된 글루타민 배지, 1%의 페니실린 및 스트렙토마이신이 이 시연에 사용됩니다. 배양 플레이트당 20,000개의 세포를 파종합니다. 바닥이 유리인 용기를 사용하는 것이 중요합니다.

렌즈가 없는 획득의 품질을 위해. 배양 플레이트를 렌즈가 없는 비디오 현미경 위에 있는 인큐베이터에 놓습니다. 이 타임 랩스 획득에 사용된 렌즈 없는 비디오 현미경은 상업적으로 이용 가능합니다.

이미징 영역이 29.4제곱밀리미터이고 픽셀 피치가 1.67마이크로미터인 금속 산화물 반도체 이미지 센서가 있습니다. 다중 파장 조명은 셀에서 약 5cm 거리에서 150마이크로미터 핀홀 위에 위치한 다중 칩 발광 다이오드 장치에 의해 제공됩니다. 타임랩스 획득을 시작하기 전에 커버 플레이트에 결로 현상이 없는지 확인하는 것이 중요합니다.

응결은 획득의 이미지 품질을 저하시키기 때문입니다. 배양판 덮개에 결로 현상이 발생하면 덮개를 청소하십시오. 시중에서 판매되는 획득 소프트웨어로 렌즈 없는 비디오 현미경을 제어하십시오.

타임랩스 획득과 홀로그램 재구성을 모두 수행합니다. 소프트웨어 인터페이스에 필요한 입력 매개변수를 입력합니다. 프레임 속도를 10분마다 1 획득으로, 세포 배양 유형을 고착으로, 실험 기간을 3일로 설정합니다.

타임랩스 획득을 시작합니다. 이 이미지는 한 프레임에서 29.4제곱밀리미터 영역의 파란색 채널에서 원시 획득의 전체 시야의 예를 보여줍니다. 패널 B는 패널 A의 세부 사항이고 패널 C는 패널 B의 세부 사항이며 홀로그램 재구성 알고리즘은 렌즈 없는 획득을 자동으로 처리하여 세포 배양의 위상 이미지를 얻습니다.

단계 언래핑 전의 셀 예시 이미지가 표시되고, 그 다음에는 위상 언래핑 후의 이미지가 표시됩니다. 세포 추적은 단일 입자의 자동 추적을 위한 오픈 소스 피지 플러그인인 TrackMate 알고리즘을 사용하여 수행됩니다. 로드 후 피지로 전체 타임랩스를 획득하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 알고리즘을 구성하고 입력 매개변수를 설정합니다.

예상 블롭 직경을 15픽셀로, 검출기 임계값을 0.25로, 연결 최대 거리를 15픽셀로, 갭 클로징 최대 거리를 15픽셀로, 트랙의 스폿 수를 3.5픽셀로 설정합니다. 세포 추적 알고리즘의 첫 번째 단계는 렌즈가 없는 획득에서 세포를 감지하는 것입니다. 셀 추적 알고리즘의 결과가 표시되며, 50개 프레임 또는 약 8시간 동안 모든 셀 추적이 표시됩니다.

중간 속도에 해당하는 색상 코드가 있습니다. 아래쪽 패널은 위쪽 패널의 노란색 사각형에 대한 자세한 이미지입니다. 세포 추적의 대표적인 비디오 클립이 여기에 표시됩니다.

세포 추적 프로세스가 끝나면 분석 버튼을 선택하여 결과를 3개의 텍스트 파일 형태로 생성합니다. 이 데이터를 기반으로 세포 분할을 수행하고 텍스트 프로토콜 및 보충 코드 파일에 자세히 설명된 대로 전용 알고리즘을 사용하여 세포 분열을 감지합니다. 전체 타임 랩스 획득에 대한 모든 단일 세포 측정값을 컴파일하면 시간 함수로 여러 메트릭의 산점도가 생성됩니다.

전체 시야에 있는 총 셀 수는 2.7일 만에 2,000개에서 최대 15,000개까지 증가합니다. 여기에 시점의 수를 곱하면 검출된 셀의 대규모 데이터 세트가 생성됩니다. 각각은 좌표와 형태학적 특징(예: 건조 질량, 면적, 평균 두께, 주요 접근 길이 및 종횡비)을 특징으로 합니다.

세포 추적과 세포 분할 알고리즘의 결합으로 단일 세포 수준에서 kinetic 측정이 가능합니다. 이 예는 약 66시간 동안 지속되는 세포 추적의 분석을 보여주며, 노란색 원으로 표시된 시점에서 4개의 세포 분열을 나타냅니다. 여러 메트릭이 시간:세포 표면적, 건조 질량, 평균 두께 및 세포 운동성의 함수로 계산되었습니다.

2.7일 관찰에 대한 세포 주기 지속 기간의 분포는 agouzian에 가까웠습니다. 평균 16.5 시간. 자동으로 측정된 세포 주기 길이는 수동으로 측정된 길이와 상관관계가 높습니다.

세포 초기 건조 질량, 최종 건조 질량 및 세포 주기 동안의 평균 성장률과 같은 다른 매개변수도 조사했습니다. 일단 마스터하면 타임 랩스 획득에 대한 완전한 데이터 분석은 CPU 구성 및 하드웨어 성능에 따라 몇 시간 내에 완료 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 초기 세포 농도를 주의 깊게 확인하는 것이 매우 중요합니다.

초기 세포 농도가 너무 크면 세포 추적 알고리즘이 세포 궤적을 제대로 정의하지 못합니다. 그러나 세포 농도가 너무 낮으면 전체 분석의 통계도 너무 낮아집니다. 이 절차에 따라 자동화된 유사 세포 추적 분석을 수행하여 생물학, 기초 생물학 또는 화학주성 분야의 다른 질문에 답할 수 있습니다.

이 새로운 기술은 또한 세포주기 연구에 흥미로운 통찰력을 제공할 세포 계통을 모니터링할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 렌즈 없는 비디오 현미경을 사용하여 타임 랩스 획득을 수행하는 방법과 많은 세포 집단을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.