Name: 타겟된 치료에 저항을 취득의 드라이버 경로 찾고: 약물 내성 Subclone 생성 및 감도 유전자 때 려 눕에 의해 복원 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 탐색하세요 표적 치료제에 대한 획득 내성 메커니즘을 밝히는 표준화된 시험관내 프로토콜을 통해 암 연구를 진행하세요. 이 방법은 종양 이형성과 내성 유전자를 효율적으로 분석하여 치료 전략 개선에 기여합니다.

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저자 박사 베로니카 Zanoni 원고를 편집 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.

참고:이 프로토콜은 특별히 조정 되었습니다 그녀의 긍정적인 위 암 세포 선의 trastuzumab 인수 저항을 기본 메커니즘의 분석에 대 한. 필요한 모든 실험실 계기는 자료의 테이블에에서 보고 됩니다.
1입니다. 타겟된 치료 저항 Subclones 세대
참고: 이것은 가장 중요 하 고 어려운 사실은 다른 셀 라인 수 전시 하지 다른 감도 타겟된 치료 억제제를 독립적으로 그들의 종양 histotype 또는 약물 농도에서 단계 프로토콜에서을 표준화 하 사용.
<ol><li>문화 NCI N87 셀 RPMI 매체 37 ° C에서 단층으로 송아지 태아 혈 청 (10%)와 글루타민 (2 mM, 1%), 보충에 라인 그리고 25 cm2 문화 플라스 크에 씨앗.</li>
	<li>시작 하는 복용량으로 문화 매체 trastuzumab의 각 플라스 크 10 µ g/ml에서를 추가 합니다. 그들은 성장 하 고 다시 시작할 때까지 시작 하는 복용량에 셀을 표시 합니다. 참고: 대상된 치료 억제제의 시작 하는 복용량의 플라즈마 피크 농도 보다 10 배 낮은 해야 합니다. 플라즈마 피크 농도 약물 농도 일반적으로 다음 표준 치료의 여러 복용량 환자 혈액에서 검출의 가장 높은 수준 이다. 약물 동력 학에 대 한 연구에서이 값을 검색할 수 있습니다.</li>
	<li>Trypan 블루 제외 방법; 세포 성장 모니터링 세포 성장 (일반적으로 2 ~ 3 주 기간) 후 다시 시작할 때 셀 trastuzumab의 사진 높은 복용량 농도에 노출.</li>
	<li>높은 약물 농도 (적어도 2.5-4-fold 플라즈마 피크 보다 높은)의 존재에도 불구 하 고 (약 2 주) 후 성장 세포 유지까지 셀 trastuzumab (400 µ g/mL를 100 µ g/mL)에서 점차적으로 증가 복용량을 노출 합니다.</li>
	<li>
Clonogenic 분석 결과의 문화 매체에서 대상 치료 억제제의 농도 있는 모든 변화에 타겟된 치료 저항 수준을 평가를 수행 하 고 상대 저항 IC50 색인 (RR IC50)를 다음과 같이 정의.
	<ol>
<li>24 다 잘 배양 배지에서 500 셀 씨 참고: 5 우물 각 조건 집합에 대 한 준비 되어야 한다.</li>
		<li>400 µ g/mL까지 100 µ g/mL에서 증가 대상 치료 억제제 (trastuzumab) 농도에 세포를 노출 합니다.</li>
		<li>15 일 동안 37 ° C에서 CO2 배양 기에서 세포를 품 어.</li>
		<li>부 화, 후 수정 하 고 샘플을 다음과 같이 얼룩.<ol>
<li>10 mL 1 x PBS 가진 매체와 린스 셀을 제거 합니다. 1 x PBS를 제거 하 고 고정 솔루션 (아세트산 산: 메탄올, 1:7, (vol/vol))의 2-3 mL를 추가 합니다. 고정 솔루션을 제거 하 고 0.5% 크리스탈 바이올렛 솔루션을 추가 합니다. 2 시간에 대 한 실 온에서 품 어</li>
			<li>피 펫으로 발음 하 여 크리스탈 바이올렛 솔루션을 신중 하 게 제거 하 고 접시 모든 크리스탈 바이올렛 솔루션 잔류물을 씻어 하 수도 물에 담가. 최대 2 일 동안 실 온에서 건조.</li>
		</ol>
</li>
		<li>식민지는 거꾸로 한 현미경 (4 배 확대)를 사용 하 여 50 개 이상의 셀을 계산 합니다. 참고: 두 명의 독립적인 관찰자가 필요 합니다.</li>
		<li>RR IC50 대상 치료 저항 subclone 셀의 IC50 값과 원래/순 진 셀의 값 사이 비율로 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 유효성 검사는 후보에 대 한 프로토콜 타겟 치료 저항 유전자 (R-유전자)
참고: 유전자 발현의 특성, 후 서명 관련 된 대상 치료와 모든 후보 유전자 획득된 저항 저항 드라이버 통해 조사 될 것 이다: a) RT-PCR, 및 b) 서쪽 오 점 분석.
<ol><li>
실시간 RT-PCR
	<ol>
<li>산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-혼합물을 사용 하 여 셀 라인에서 총 RNA 추출 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>반전 녹음 방송 (RT) 반응 임의의 hexamer 뇌관을 사용 하 여 수행 하 고 열 cycler를 다음과 같이 설정: 5 분, 20 분, 46 ° C에서 RT와 RT 비활성화 1 분 동안 95 ° C에서 25 ° C에서 못쓰게.</li>
		<li>20 µ L 반응에 대 한 총 RNA의 사용 400 ng. 다음과 같이 샘플에 대 한 반응 혼합물 준비: 7 µ L RNase 무료 H2O 2 µ L cDNA (10 ng / µ L), 형광 표시 된 특정 대상 조사, x 1 µ L 20 및 10 µ L 2 x 믹스 포함 버퍼, dNTPs, DNA 중 합 효소 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>각 잘 플레이트에 반응 혼합물의 20 µ L을 추가 하 고 다음 프로그램 실행: 2 분, 10 분 (1 사이클); 95 ° C에서 50 ° C에서 무대를 들고 95 ° C에서 15에 대 한 다음 40 주기 s 1 분 동안 60 ° C에서.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
서쪽 오 점
	<ol>
<li>세포 현 탁 액의 0.05 %trypsin / EDTA 용액 2 mL를 추가 하 고 작동 하도록 트립 신에 대 한 2-3 분을 허용 하 여 복구 합니다.</li>
		<li>2 권 중간 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청의 트립 신 (예를 들어, 각 1 mL의 트립 신에 대 한 매체의 2 개 mL)을 중화 하 고 차가운 1 x PBS 가진 삭제 표면에 뜨는 및 세척 셀 5 분에 대 한 1200 x g에서 원심을 추가 합니다.</li>
		<li>5 분 동안 1200 x g에서 centrifuge 고 상쾌한 삭제. 세포의 용 해 버퍼 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 로커에 품 어.<ol>
<li>세포의 용 해 버퍼의 셀 (예를 들어, 1 x 106 셀 100 µ L);의 수에 따라 다릅니다. 매번 신선한 세포의 용 해 버퍼를 준비 해야 합니다. 세포의 용 해 버퍼 준비 (얼음에 두고)의 1 ml: 975 µ M L를 사용 하 여-포유류 lysate 버퍼, 15 µ L 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제, 및 10 µ L 100 µ M PMSF 억제제.</li>
		</ol>
</li>
		<li>15 분 동안 4 ° C에서 13000 x g에 세포 lysate 원심 분리에 의해 표면에 뜨는 단백질을 복구 합니다.</li>
		<li>BCA 단백질 분석 결과 사용 하 여 단백질 농도 결정 합니다.</li>
		<li>단백질 견본 (적어도 20-30 µ g 단백질)을 3 분 동안 100 ° C에서 열 LaemmLi 샘플 버퍼 x 4를 추가 합니다.</li>
		<li>캐스트 4-20% 젤을 사용 하 고 부하 LaemmLi 단백질 해결책의 20-30 µ g 및 샘플 당 표준 단백질의 5-10 µ L.</li>
		<li>서쪽 오 점 링 트리 스/GLICYNE /SDS 1 x 버퍼를 실행 젤 110 V 30-60 분 (시간 중지 염료 젤, 그렇지 않으면 몇 가지 추가 분에 대 한 실행의 끝에 도달 했습니다 확인)</li>
		<li>PVDF 막으로 단백질을 전송 하는 Electroblot ( 재료의 표참조) 세미 건조 시스템을 사용 하 여.</li>
		<li>막 1 시간 실 온에서 흔드는에 적절 한 단백질 해결책 (우유/BSA 5%)에 몸을 담글 하 여 차단 합니다.</li>
		<li>5% 우유 솔루션에서 안티-IQGAP1 1 차 항 체로 1:400 솔루션으로 만들기 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>차가운 방에서 밤새 통에 1 차적인 항 체 솔루션에 막 장소.</li>
		<li>다음 날, 항 체 솔루션을 삭제 하 고 T-큰 술 1 x 솔루션에 흠뻑 젖어 (1 x T-큰 술: 1 x 트리 스 염 분 버퍼 추가 Tween20으로 0.1%) 7 분 동안 실 온에서 통에.</li>
		<li>솔루션 및 바꾸기 x T-큰 술 1을 삭제 합니다. 3 회 반복 한다.</li>
		<li>1:10,000 보조 마우스 항 체 솔루션 표준 서에 대 한 항 체를 추가 하 여 감지 되 리 ( 재료의 표참조) 고 막 통;에 2 시간에 대 한 실 온에 둡니다.</li>
		<li>항 체 솔루션을 삭제 하 고 7 분 동안 실 온에서 통에 T-큰 술 1 x 솔루션에 담근 다.</li>
		<li>솔루션 및 바꾸기 x T-큰 술 1을 삭제 합니다. 3 회 반복 한다.</li>
		<li>화학 영상에 막 이미지와 chemiluminescent 솔루션에 막 5 분을 담근 다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 대상-치료 억제제 감도 후보 R 유전자 때 려 눕에 의해 복원
<ol><li>
세포 준비
	<ol>
<li>Trypsinization에 의해 단일 세포 현 탁 액을 준비 합니다. 세포는 도금 당일 transfection를 수행 합니다.<ol>
<li>씻어 NCI N87 PBS로 세포 그리고 5-10 분 RPMI 중간 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청의 트립 신 (예를 들어, 각 1 mL의 트립 신에 대 한 매체의 2 개 mL)을 중화 하 추가 2 볼륨에 대 한 0.05 %trypsin / EDTA 솔루션 37 ° C에서 품 어.</li>
			<li>Trypan 푸른 얼룩을 사용 하 여 hemocytometer와 셀을 계산. 씨 2.5 x 105 셀 (60% 합류) 각 조건에 대해 T25 cm2 플라스 크에. 참고: 적절 한 시드 셀 수 셀 라인의 2 배 시간 및 실험의 기간에 의해 결정 됩니다. 목표 대상 유전자 실험의 전체 기간에 대 한 노크 다운 달성 하는. 9 개의 T25 cm2 플라스 크 transfection 조건 및 clonogenic 분석 결과 (컨트롤, 부정적인 transfection 컨트롤, 유전자-대상 transfection에 대 한 3 플라스 크 3 플라스 크 3 플라스 크)에 이상적입니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection 역
	<ol>
<li>유전자-대상 준비 하 고 다음과 같이 각 T25 cm2 플라스 크에 대 한 제어 transfection 믹스를 부정.<ol>
<li>각 유전자를 대상으로 siRNA oligonucleotides 또는 최소한의 필수적인 transfection 매체 (비율 1시 55분; 참조 테이블의 재료)에 부정적인 제어 siRNA oligonucleotides의 12.5 µ L를 희석.</li>
			<li>양이온 liposome transfection 시 (siRNA oligonucleotides 유전자를 대상으로 1:1 비율, 참조 테이블의 재료)를 추가 합니다. 20 분 동안 실 온에서 품 어. 참고: transfection 믹스의 총 볼륨 700 µ L입니다.</li>
			<li>각 T25 cm2 플라스 크를 transfection 믹스의 700 µ L를 추가 합니다. 1-3 일 동안 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>유전자를 때 려 눕 RT-PCR 및 서쪽 오 점 분석에 의해 확인 합니다. 상 상속 유전자 R 눕 (반복 단계 1.5) 식민지 형성 실험을 통해 대상된 치료 에이전트에 감도 복원에의 영향을 다시 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01748773. A Study of the Combination of Oxaliplatin, Capecitabine and Herceptin (Trastuzumab) and Chemoradiotherapy in The Adjuvant Setting in Operated Patients With HER2+ Gastric or Gastro-Esophageal Junction Cancer (TOXAG Study). , Available from:
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<li>ClinicalTrials.gov. Identifier NCT01472029. Explorative Phase II Study of Perioperative Treatment in Patients With Adenocarcinoma of the Gastroesophageal Junction or Stomach (HerFLOT). , Available from:
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</ol>

저자는 공개 없다.

맞춤 및 타겟 치료 성장 열정을 elicited 있다, 전통적인 화학 요법 약물, 즉, 약물 내성의 신속 하 고 예측할 수 없는 인수 같은 주요 장애물을 직면 하는이 소위 '스마트' 치료. 타겟된 치료의 결과 개선 하기 위해, 그들을 일으키는 원인이 되는 메커니즘의 더 나은 이해를 통해 약물 저항 문제를 해결 해야 합니다. 여기, 우리는 방법론을 광범위 하 게 액세스할 수 있는 시험관에 암 세포 선 모델에서 타겟된 치료 약물에 저항을 취득된의 메커니즘을 조사을 제시.
타겟된 치료 저항 subclones의 생성은 가장 중요 하 고이 프로토콜을 사용, 셀 라인 사이 고 약 감도의 그들의 다른 학위를 내장 유전이 성분 때문에 단계를 표준화 하기 어렵습니다. 이러한 이유로, 저항 subclones를 얻는 데 필요한 시간이 달라질 수 있습니다. 항 암 분자 에이전트에 만성 노출은 일반적으로 강력한 종양 성장 저해를 발생합니다. 그러나, 기간 후에 가변의 지...

분자와 세포 생물학에 있는 중요 한 발견에 따라, 새로운 합성된 항 암 분자 수 선택적으로 종양 종류의 광범위 한 배열에 종양 신호 경로 대상으로 개발 되었습니다. 특히, 타겟된 치료제 종양학에서 독특한 속성의 두 가지 범주, 즉 합성 화학 화합물 및 재조합 단일 클론 항 체, 임상 성공 및 극적으로 변경 된 암 치료에서 달성 하는 것으로 알려져 있습니다. 최근 수십 년간1,2,3.
그럼에도 불구 하 고, 치료에 그들의 인상적인 초기 대응에도 불구 하 고 암 환자의 대부분 모든 타겟된 치료제, 단일 클론 항 체와 kinase 억제제 약물 저항을 개발 했습니다. 결과적으로, 약물 내성, 고전적인 항 암 약4에 대 한 주요 장애물은 여전히 신흥 표적으로 한 치료5,6에 대 한 큰 도전.
타겟된 치료에 저항을 내장 될 수 있습니다 (즉, 기본) 또는 (즉, 보조)를 인수. 본질적인 저항 보조 저항 약물 치료7응답의 기간 후에 발생 하는 반면 치료, 응답의 드 노 보 부족을 설명 합니다. 후자는 기본 종양의 대부분 내의 종양 세포의 작은 동료의 발생으로 인 한 또는 원심 비밀 해 부 틈새에 자리 잡고 있으며, 최대 90%까지 전시 저항 하나 이상의 타겟 치료제. 기본 타겟된 치료에 저항 개발 주로 분자 메커니즘 대상 유전자 변이 그 이해 완료8멀지는 다른 프로 생존 신호 통로의 중복 활성화에서 유래한 다.
이 작품에서는, 우리는 시간 및 비용 effective 접근의 약물 내성 세포 subclones의 세대에서 시작 하는 침묵의 설명에 타겟된 치료제 인수 저항 메커니즘 체 외에서 조사 제안 사용 감도 억제제, 테스트 작업 가설의 유효성을 검사 하는 사용 되는 중요 한 도구를 복원 하는 절차. 특히, 우리의 접근은 조사, 위 암, trastuzumab (예를 들어, Herceptin), HER2 단백질9의 세포 외 도메인을 대상으로 인간 답게 단일 클론 항 체를 저항 메커니즘에에서 사용 되었다. Trastuzumab + 화학요법 HER2 양성 전이성 유방암에 대 한 표준 첫 줄 치료로 널리 인정 됩니다. 그 안티 HER2 보여주는 최근 전 임상 연구 덕분에 치료에 있는 중요 한 활동 둘 다 생체 외에서 그리고 HER2 양성 vivo에서 위 암 모델10,11, HER2를 표적으로 하는 분자 약물 되었습니다. 임상 시험에서 광범위 하 게 검사, 일부는 여전히 지속적인 환자 위 식도 암12,13,,1415에 있습니다.
이러한 연구 환자 trastuzumab16, 유사 하 게 어떤 다른 타겟된 치료 억제제에 대 한 관찰은 저항을 발생의 상승 수를 강조 했다. 특히, trastuzumab의 응답 속도 47%, 그리고 trastuzumab + 화학요법에 환자에 대 한 평균 전반적인 생존은 불과 2.7 개월 환자 화학 요법 혼자17에 대 한 이상. 이 기본 trastuzumab 저항 유행 이다, 하는 동안 보조 trastuzumab 저항 불가피 하다 제안 했다. 이러한 이유로,이 neoplasia18의 내부 종양 유전자이 주어진 더욱 문제는 위 암에 HER2 타겟 치료 저항을 일으키는 메커니즘을 명확히 하는 긴급 한 필요가 있다.
또한,의 위 암에 trastuzumab 저항 메커니즘 설명 하 고, 부분적으로 신뢰할 수 있는 전 임상 모델 대표가 조건의 취득에 어려움으로 인해 어려운 입증 했다. 오시마 외 는 vivo에서 선택 방법을 trastuzumab 내성 위 암 세포 선, 작은 잔여 복 막 전이의 반복된 문화 trastuzumab19치료 후 구성 된의 보고. 그러나, 필요를, 특정 동물 처리 전문, 그리고 동물 윤리 위원회의 승인의 시간 그리고 비용 소모 메서드에 기여. 우리가이 작품에 설명 하는 방법은 간단 하 고 광범위 하 게 적용 이며 다른 종양 histotypes20에서 다른 치료 약물에 저항 메커니즘을 조사 하기 위해 쉽게 확장할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Trizol 시약</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>TRIzol 시약은 다양한 생물학적 시료에서 고품질 전체 RNA를 분리하거나 RNA, DNA 및 단백질을 동시에 분리하기 위한 시약입니다</td></tr>. <tr><td>ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>iScript cDNA synthesis kit는 real-time qPCR을 사용한 유전자 발현 분석을 위한 민감하고 사용하기 쉬운 1차 가닥 cDNA 합성 키트입니다.</td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 어세이</td><td>Life Technologies</td><td>4331182</td><td>Applied Biosystems TaqMan 유전자 발현 어세이는 한 쌍의 라벨링되지 않은 PCR 프라이머와 5' 말단에 Applied Biosystems FAM 또는 VIC 염료 라벨이 있고 3' 말단에 Minor Groove Binder(MGB) 및 Nonfluorescent quencher(NFQ)가 있는 TaqMan 프로브로 구성됩니다.</td></tr><tr><td>M-PER 포유류 단백질 추출 시약</td><td>Thermo Scientific</td><td>78501</td><td>Thermo Scientific M-PER 포유류 단백질 추출 시약은 배양된 포유류 세포에서 매우 효율적인 총 용해성 단백질 추출을 제공하도록 설계되었습니다.</td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78440</td><td>Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)은 세포 및 조직 용해물에 대한 완전한 단백질 시료 보호 기능을 갖춘 단일 솔루션의 편리함을 제공합니다.</td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 어세이 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Thermo Scientific Pierce BCA 단백질 어세이 키트는 단백질 표준물질과 비교하여 (A562nm)의 총 단백질 농도를 측정할 수 있는 2액형, 고정밀, 세제 호환 어세이 시약 세트입니다.</td></tr><tr><td>4x Laemmli 샘플 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td>SDS PAGE용 샘플 준비를 위해 4x Laemmli 샘플 버퍼를 사용합니다. 시료 감소를 위해 시료와 혼합하기 전에 2-메르캅토에탄올과 같은 환원제를 완충액에 첨가하십시오.</td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 단백질 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1094</td><td>Long-life TGX(Tris-Glycine eXtended) 겔은 새로운 제형을 가지고 있으며 표준 변성 단백질 분리와 천연 전기영동 모두에 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein WesternC 블로팅 표준물질</td><td>Bio-Rad</td><td>1610376</td><td>Precision Plus Protein Prestained 표준물은 Dual Color, All Blue, Kaleidoscope 및 Dual Xtra 형식으로 제공됩니다. 4개 모두 3개의 고강도 reference band(25, 50 및 75 kD)를 가진 동일한 gel migration pattern을 가지고 있습니다.</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td>10x Tris/glycine/SDS는 단백질 샘플을 SDS-PAGE로 분리하기 위한 사전 혼합 실행 버퍼입니다.</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF 트랜스퍼 팩</td><td>Bio-Rad</td><td>1704156</td><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF 트랜스퍼 팩은 Trans-Blot Turbo Transfer System을 사용하여 미니 겔에서 단백질을 빠르고 효율적으로 전달합니다. 진공 밀봉되어 바로 사용할 수 있는 각 전사 팩에는 2개의 완충액 포화 이온 저장소 스택과 사전 습윤 PVDF 멤브레인이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>정밀 단백질 StrepTactin-HRP Conjugate</td><td>Bio-Rad</td><td>1610381</td><td>StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) 콘주게이트는 웨스턴 블롯에서 Precision Plus Protein Unstained Protein 표준물 또는 Precision Plus Protein WesternC 단백질 표준물의 화학발광 또는 비색 검출을 위한 것입니다.</td></tr><tr><td>Immun-Star WesternC 용액</td><td>Bio-Rad</td><td>5572</td><td>Immun-Star WesternC 용액은 단백질 검출 방법으로, 단백질의 중간 펨토그램 양을 검출합니다.</td></tr><tr><td>Universal Negative Control</td><td>Invitrogen</td><td>12935300</td><td>Negative Control siRNA는 마우스, 랫트 또는 인간 유전자 염기서열과 유의미한 염기서열 유사성이 없습니다. 이 대조군은 또한 세포 기반 스크리닝에서 테스트되었으며 세포 증식, 생존력 또는 형태에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 입증되었습니다.</td></tr><tr><td>Opti-MEM Glutamax Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51985026</td><td>Opti-MEM Medium은 성장률이나 형태의 변화 없이 소 태아 혈청 보충제를 최소 50%까지 줄일 수 있는 개선된 최소 필수 배지(MEM)입니다.</td></tr><tr><td>소음기 선택 사전 설계 & 검증된 siRNA</td><td>Ambion</td><td>4390824</td><td>RNA 간섭(RNAi)은 다양한 세포 유형에서 단백질 기능을 연구하기 위해 유전자 발현을 효과적으로 녹다운하는 가장 좋은 방법입니다.</td></tr><tr><td>리포펙타민 RNAiMAX 트랜스펙션 시약</td><td>Invitrogen</td><td>13778075</td><td>Lipofectamine RNAiMAX 트랜스펙션 시약은 siRNA 전달을 위한 효율적인 고급 솔루션을 제공합니다. 다른 어떤 siRNA 특이적 transfection 시약도 일반적인 세포 유형, 줄기 세포 및 일차 세포뿐만 아니라 전통적으로 transfection이 어려운 세포 유형을 포함한 다양한 세포주에서 쉽고 효율적인 siRNA 전달을 제공하지 않습니다.</td></tr><tr><td>마우스 anti-IQGAP1</td><td>Invitrigen</td><td>33-8900</td><td>작업 농도 : 1:400 5 % 우유 용액</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG-HRP : sc-2005</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>작업 농도 : 1 : 10000 5 % 우유 용액</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P 7626</td> 이것은 RT-PCR MJ 연구를위한 <td>세린 프로테아제 및 아세틸 콜린 에스 테라 제</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td>의 억제제입니다.<td> PTC-200 Thermal Cycler</td><td>는 온도 균질성과 최대 3°C의 램핑 속도를 허용합니다. C/초 이 프로토콜은 다른 thermalcycler,</td></tr><tr><td>Real Time RT-PCR 기기</td>, <td>Applied Biosystems</td><td>7500 RT-PCR 시스템</td>으로도 수행할 수 있습니다<td>. 이 플랫폼은 형광 기반 중합효소연쇄반응(PCR) 시약을 사용하여 비교 CT 분석 유형을 사용하여 상대적 정량화를 제공하는 5색 플랫폼입니다. 이 프로토콜은 다른 열순환기와 함께 수행할 수 있습니다</td></tr>: <tr><td>Microvolume Spectrophotometer</td><td>, Thermo Scientific</td><td>Nanodrop</td>, <td>소량의 시료를 사용하여 정확하고 빠른 산 핵 측정을 제공합니다</td></tr>: <tr><td>Blotting 시스템</td>, <td>Bio-Rad, Trans-Blot</td><td>Turbo 시스템</td>, <td>몇 분 내에 semy-dry 전달,</td></tr><tr><td>이미지 획득 시스템 및 겔 문서</td>, <td>Bio-Rad</td>, <td>Chemidoc 이미지 체계</td><td>: 화학발광 검출에 사용하기 쉽습니다</td></tr></tbody></table>.

타겟된 치료에 저항을 취득의 드라이버 경로 찾고: 약물 내성 subclone 생성 및 감도 유전자 때 려 눕에 의해 복원

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

지난 2 년간 의료 종양학에서 타겟된 치료 세포 독성 약물에서 변화를 보았다. 타겟된 치료제 더 인상적인 임상 효능과 전통적인 치료법 보다 부작용 최소화에 표시 하는 있지만 약물 저항 그들의 혜택을 주요 제한 되고있다. 임상 연습에 대상된 에이전트에 저항을 취득된의 여러 전 임상/생체 외에서 또는 vivo에서 모델 두 가지 전략을 사용 하 여 주로 개발 되었습니다: 인수 저항, 및 ii) 생체 외에서 의 genotypes 모델링 i) 유전자 조작 / vivo에서 저항 모델의 선택. 현재 작업에서 우리는 기본 메커니즘의 설명에 약물 내성 세포 subclones의 세대에서 시작 타겟된 치료제에 저항을 취득된에 대 한 책임을 조사 통합 프레임 워크를 제안 입을 절차는 억제 물 감도 복원에 사용. 간단한 시간 그리고 비용 effective 이렇게 광범위 하 게 적용 이며 다른 종양 histotypes에 다른 대상된 치료 약물에 저항 메커니즘을 조사를 쉽게 확장할 수 있습니다.

그림 1 실험 절차의 프레임 워크를 설명합니다. 3 위 암 세포-라인 HER2 trastuzumab에 민감한의 높은 수준의 표현 (IC50 &lt; 마약, 그림 2A, 왼쪽된 그래프의 피크 플라즈마 수준) 타겟된 치료 에이전트를 포함 하는 문화 매체에서 성장 했다. 복용량은 10 배 trastuzumab (10 µ g/mL)의 피크 플라즈마 농도 시작 하는 복용량으로 설정 되었고 점차적으로 8-12 개월의 기간 동안 400 µ g/mL로 증가 보다 낮은. 이후에, 우리는 3 subclones를 IC50 값 trastuzumab (그림 2A, 오른쪽 그래프)의 피크 플라즈마 수준 보다 낮은 안정적인 저항 표현 형 특징을 얻었다. 특히, 가장 저항 subclone, HR NCI...

이것은 시간 및 비용 effective 생체 외에서 프로토콜의 타겟된 치료제 인수 저항 메커니즘을 조사 하는 암 관리에 높은 미 충족된 의료 필요 이다.

타겟된 치료에 저항을 취득의 드라이버 경로 찾고: 약물 내성 Subclone 생성 및 감도 유전자 때 려 눕에 의해 복원

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

이 전임상 플랫폼의 전반적인 목표는 표적 치료에 대한 후천적 내성을 유발하는 메커니즘을 식별하고 특성화하기 위한 표준 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 종양학에서 게놈 구동을 구현하는 데 도움이 될 수 있으며, 특히 종양 이질성 및 표적 치료에 대한 후천적 내성을 담당하는 여러 메커니즘에 대한 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표적 치료에 대한 내성 기전의 체외 조사를 가능하게 하는 시간 및 비용 효율적인 접근 방식입니다.이 기술의 의미는 암 치료로 확장되는데, 폐 저항은 새로운 표적 치료법에 대해 여전히 도전적이기 때문입니다. 이 방법은 표적 치료 내성과 관련된 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 기존 화학 요법제의 효능을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 사용하는 작업자는 표준화하기 가장 어려운 단계인 약물 내성 서브클론 세대에 따라 휘청거리게 됩니다.이 방법에 대한 아이디어는 HER 양성 위암 세포주에서 트라스투주맙에 대한 후천적 내성 기전을 특성화했을 때 처음 고안되었습니다. 유전자 녹다운(gene knock-down)에 의한 민감도 복원을 포함하여 체외 약물 내성 모델의 생성 및 검증을 위해 여러 기술이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 절차를 시작하려면 NCI N87 세포를 25제곱센티미터 배양 플라스크에 시딩합니다.각 플라스크의 배양 배지에 trastuzumab의 밀리리터당 10마이크로그램을 추가합니다. 세포가 성장을 재개할 때까지 이 시작 용량에 노출시킵니다. 약 2주 후에 세포 성장이 재개된 후 밀리리터당 100마이크로그램 농도의 트라스투주맙에 세포를 노출시킵니다.트라스투주맙 농도를 점진적으로 증가시키면서 각 노출 전에 세포가 성장을 재개할 때까지 기다렸다가 밀리리터당 400마이크로그램의 농도에 도달할 때까지 기다립니다. 세포주는 약물에 따라 다른 민감성을 보일 수 있습니다. 이 문제에 대한 한 가지 해결책은 세포가 계속 성장할 때까지 혈장 피크 농도의 약 10배에 달하는 용량부터 점차적으로 증가하는 약물 용량에 세포를 노출시키는 것입니다.다음으로, 세포를 24개의 다중 웰 배양 플레이트에 파종합니다. 파종된 세포를 표적 치료 억제제 농도를 밀리리터당 100마이크로그램에서 밀리리터당 400마이크로그램으로 증가시킵니다. 섭씨 37도의 CO2 인큐베이터에서 15일 동안 배양합니다.그런 다음 배지를 제거하고 10ml의 PBS-1X로 세포를 헹굽니다. PBS-1X를 제거하고 2-3밀리리터의 정착액을 추가합니다. 20분 후 정착액을 제거하고 각 웰에 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액 2밀리리터를 첨가합니다.실온에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 크리스탈 바이올렛 용액을 조심스럽게 흡입합니다. 플레이트를 수돗물에 담그어 남아 있는 잔여물을 헹굽니다.실온에서 최대 이틀 동안 자연 건조하십시오. 다음으로, 4X 배율에서 도립 현미경을 사용하여 50개 이상의 세포가 포함된 콜로니를 계수합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 상대 저항 IC50 비율을 계산합니다.시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 트립신화(trypsinization)를 통해 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 혈구계와 Trypan Blue 염색을 사용하여 세포를 계수합니다. 그런 다음 각 조건에 대해 T-25 플라스크에 10-5 세포를 2.5배 파종합니다.다음으로, 각 유전자 표적 siRNA 올리고뉴클레오티드 또는 음성 대조군 siRNA 올리고뉴클레오티드를 최소 필수 형질주입 배지에서 12.5마이크로리터로 희석합니다. 양이온성 리포좀 형질주입 시약을 올리고뉴클레오티드와 1:1 비율로 첨가합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다.그런 다음 각 T-25 플라스크에 700마이크로리터의 형질주입 혼합물을 추가합니다. 섭씨 37도에서 1-3일 동안 배양합니다. RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 유전자 knock-down을 검증합니다.다음으로, 세포를 24개의 다중 웰 배양 플레이트에 파종합니다. 표적 치료 억제제의 농도를 밀리리터당 100마이크로그램에서 밀리리터당 400마이크로그램으로 증가시키는 것에 세포를 노출시킵니다. 유전자 knock-down의 효능을 위해서는 siRNA 올리고뉴클레오티드가 표적 발현을 줄이기 위해 특이적이어야 합니다.설계된 도구와 siRNA의 측정은 동일한 타겟 유전자가 이러한 목적에 유용합니다. 섭씨 37도의 CO2 인큐베이터에서 15일 동안 배양합니다. 배지를 제거하고 10ml의 PBS-1X로 세포를 헹굽니다.PBS를 제거한 후 2-3ml의 고정 용액을 첨가합니다. 그런 다음 정착 용액을 제거하고 0.5% 결정 바이올렛 용액을 첨가합니다. 실온에서 2시간 동안 배양합니다.피펫을 사용하여 크리스탈 바이올렛 용액을 조심스럽게 흡인합니다. 다음으로 플레이트를 수돗물에 담그십시오. 실온에서 최대 이틀 동안 자연 건조하십시오.그런 다음 4X 배율에서 도립 현미경을 사용하여 50개 이상의 세포가 포함된 군집을 계산합니다. 본 연구에서는 HER2 수치가 높고 트라스투주맙에 민감한 3개의 위암 세포주를 표적 치료제를 함유한 배양 배지에서 성장시켰습니다. 이로부터, 안정한 저항성 표현형을 특징으로 하는 3개의 서브클론이 얻어진다.서브클론 중 HR NCI N87은 상대 저항 IC50이 28.57에 도달하는 가장 저항력이 높은 것으로 보입니다. 단백질 및 유전자 발현 분석은 IQGAP1 유전자가 HR NCI N87 서브라인의 저항성 표현형에서 중추적인 역할을 한다는 가설을 뒷받침합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 IQGAP1 단백질 수준은 부모 세포보다 저항성 하위 클론에서 5배 계층입니다.그리고 IQGAP1 유전자 발현은 HR NCI N87 서브라인에서 원래 서브클론보다 2.5배 더 높습니다. 그런 다음 IQGAP1 유전자 침묵을 수행하여 trastuzumab 내성 표현형의 발달에서 그 역할을 평가합니다. 클론 생성 분석은 IQGAP의 중요성에 대한 가설을 더욱 확증합니다.여기에서 볼 수 있듯이, 유전자 침묵은 트라스투주맙에 대한 세포의 민감성을 회복시켜 IC50 값을 밀리리터당 7마이크로그램으로 낮춥니다. 이 시술에 대해 제가 생각하는 것은 일반적으로 약물 내성 세포 서브클론을 얻는 것이 쉽지 않다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 그리고 이 방법은 잠재적인 고장 위험이 있습니다.이 절차를 통해 표적 치료에 대한 후천적 내성을 유발하는 서로 다른 메커니즘을 특징으로 하는 클론의 여러 세포를 얻을 수 있습니다. 표적 치료 내성의 체외 모델링을 위한 표준 절차의 개발은 종양학 연구자가 최신 세대 치료법에 대한 가장 큰 비판인 약물 내성을 극복하기 위해 새로운 약물 사용 표적을 조사할 수 있도록 해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

임상 증상은 다음 이전에 또는에 - - 타겟 치료제에 대한 약물 저항은 광범위하고 저항의 메커니즘을 식별 할 필요가있다 대체 임상 관리 전략을 안내하기위한 중요합니다. 여기, 우리는 이러한 메커니즘의 발견을 촉진하는 순서와 체외에서 약제 내성 라인의 몇 유도에 프로토콜을 제시한다.

구현<em&gt; 체외</em&gt; 약물 저항 분석법 : 임상 적 저항 메커니즘을 폭로 가능성을 극대화

여기에서 우리는 고형 종양 및 혈액 악성 종양에서 약물 내성에 비정상적인 스 플라이 싱의 영향을 조사하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 목표를 위해, 우리는 RNA-서열을 통해 부모와 체외에서 저항 모델의 transcriptomic 프로필을 분석 후보 유전자를 확인하기 위해 QRT-PCR 기반의 방법을 설립했다.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

여기 우리는 프로토콜 설명 높은 처리량 RNAi 심사 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 폭로를 위한, 특히 rhabodvirus 및 vaccinia 바이러스 치료, 하지만 그것은 다른 oncolytic 쉽게 적용할 수 있습니다 바이러스 플랫폼 또는 변조 바이러스 복제를 일반적으로 호스트 유전자 발견.

RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

여기, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 유전자 및 인간 답게 된 마우스 모델을 사용 하 여 백혈병에서 마약 대상으로 c Fos와 Dusp1의 유전과 화학 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 유전 유효성 검사 및 치료 개발에 대 한 모든 대상에 적용할 수 있습니다.

Oncogene 의존에 c Fos의 역할 및 Dusp1를 평가 하기 위한 방법

Overexpressing 유전자 기능 연구 관심사의 유전자 안정적인 셀 라인 구축 그들에 transfecting 통해 retroviral 감염 후 안정 되어 있는 transfection 따기 단일 클론에 의해 할 수 있습니다. 여기 우리가 HT29 DR3 셀 라인 이런 방식으로 생성 된 메커니즘 수용 체 3 (DR3) antimitotics-유도 된 apoptosis에 기여 하는 어떤 죽음에 의해 명료 하 게 보여줍니다.

Apoptotic 응답 안티 mitotic 치료 학을 평가 하기 위해 DR3 Overexpressing 셀 라인 구축

여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

여기에 제시된 대장 HT29 세포로부터 유래된 확립된 암 줄기 유사 세포를 유지하는 과발현 드라이버 유전자를 발견하는 프로토콜이다. 사용 가능한 생물정보학을 가진 RNAseq는 표적 종양 세포의 생존에 관여하는 잠재적인 기계장치를 해명하기 위한 유전자 발현 네트워크를 조사하고 스크린하기 위하여 수행되었다.

대장 HT29 유래 암 줄기 와 같은 종양스피어에서 드라이버 유전자의 발견

이 프로토콜은 NSCLC 환자 유래 오가노이드 모델에서 표적화된 신호전달 억제제에 대한 약물 민감성의 표준화된 평가를 기술한다.

EGFR 돌연변이 NSCLC 환자 유래 오가노이드에서 표적 치료법에 대한 민감도 프로파일링

렌티바이러스 shRNA의 풀을 이용한 고처리량 RNA 간섭(RNAi) 스크리닝은 악성종양에서 치료적으로 관련된 합성 치사적 표적을 검출하는 도구가 될 수 있다. 우리는 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 후성 유전 학적 이펙터를 조사하기 위해 풀링 된 shRNA 스크리닝 접근법을 제공합니다.

약물 내성 표현형을 조절하는 인자를 식별하기 위한 풀링된 shRNA 라이브러리 스크리닝

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 발생하는 종양과 해당 인간 종양 유형에서 발생하는 종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위해 게놈 분석 및 기능적 게놈 스크리닝을 활용하는 종간 비교 종양유전체학 접근 방식을 개발했습니다.

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

탐색하세요 표적 치료제에 대한 획득 내성 메커니즘을 밝히는 표준화된 시험관내 프로토콜을 통해 암 연구를 진행하세요. 이 방법은 종양 이형성과 내성 유전자를 효율적으로 분석하여 치료 전략 개선에 기여합니다.

타겟된 치료에 저항을 취득의 드라이버 경로 찾고: 약물 내성 Subclone 생성 및 감도 유전자 때 려 눕에 의해 복원

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