타겟된 치료에 저항을 취득의 드라이버 경로 찾고: 약물 내성 Subclone 생성 및 감도 유전자 때 려 눕에 의해 복원

이 전임상 플랫폼의 전반적인 목표는 표적 치료에 대한 후천적 내성을 유발하는 메커니즘을 식별하고 특성화하기 위한 표준 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 종양학에서 게놈 구동을 구현하는 데 도움이 될 수 있으며, 특히 종양 이질성 및 표적 치료에 대한 후천적 내성을 담당하는 여러 메커니즘에 대한 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표적 치료에 대한 내성 기전의 체외 조사를 가능하게 하는 시간 및 비용 효율적인 접근 방식입니다.

이 기술의 의미는 암 치료로 확장되는데, 폐 저항은 새로운 표적 치료법에 대해 여전히 도전적이기 때문입니다. 이 방법은 표적 치료 내성과 관련된 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 기존 화학 요법제의 효능을 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 사용하는 작업자는 표준화하기 가장 어려운 단계인 약물 내성 서브클론 세대에 따라 휘청거리게 됩니다.

이 방법에 대한 아이디어는 HER 양성 위암 세포주에서 트라스투주맙에 대한 후천적 내성 기전을 특성화했을 때 처음 고안되었습니다. 유전자 녹다운(gene knock-down)에 의한 민감도 복원을 포함하여 체외 약물 내성 모델의 생성 및 검증을 위해 여러 기술이 필요하기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 이 절차를 시작하려면 NCI N87 세포를 25제곱센티미터 배양 플라스크에 시딩합니다.

각 플라스크의 배양 배지에 trastuzumab의 밀리리터당 10마이크로그램을 추가합니다. 세포가 성장을 재개할 때까지 이 시작 용량에 노출시킵니다. 약 2주 후에 세포 성장이 재개된 후 밀리리터당 100마이크로그램 농도의 트라스투주맙에 세포를 노출시킵니다.

트라스투주맙 농도를 점진적으로 증가시키면서 각 노출 전에 세포가 성장을 재개할 때까지 기다렸다가 밀리리터당 400마이크로그램의 농도에 도달할 때까지 기다립니다. 세포주는 약물에 따라 다른 민감성을 보일 수 있습니다. 이 문제에 대한 한 가지 해결책은 세포가 계속 성장할 때까지 혈장 피크 농도의 약 10배에 달하는 용량부터 점차적으로 증가하는 약물 용량에 세포를 노출시키는 것입니다.

다음으로, 세포를 24개의 다중 웰 배양 플레이트에 파종합니다. 파종된 세포를 표적 치료 억제제 농도를 밀리리터당 100마이크로그램에서 밀리리터당 400마이크로그램으로 증가시킵니다. 섭씨 37도의 CO2 인큐베이터에서 15일 동안 배양합니다.

그런 다음 배지를 제거하고 10ml의 PBS-1X로 세포를 헹굽니다. PBS-1X를 제거하고 2-3밀리리터의 정착액을 추가합니다. 20분 후 정착액을 제거하고 각 웰에 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액 2밀리리터를 첨가합니다.

실온에서 2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 크리스탈 바이올렛 용액을 조심스럽게 흡입합니다. 플레이트를 수돗물에 담그어 남아 있는 잔여물을 헹굽니다.

실온에서 최대 이틀 동안 자연 건조하십시오. 다음으로, 4X 배율에서 도립 현미경을 사용하여 50개 이상의 세포가 포함된 콜로니를 계수합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 상대 저항 IC50 비율을 계산합니다.

시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 트립신화(trypsinization)를 통해 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 혈구계와 Trypan Blue 염색을 사용하여 세포를 계수합니다. 그런 다음 각 조건에 대해 T-25 플라스크에 10-5 세포를 2.5배 파종합니다.

다음으로, 각 유전자 표적 siRNA 올리고뉴클레오티드 또는 음성 대조군 siRNA 올리고뉴클레오티드를 최소 필수 형질주입 배지에서 12.5마이크로리터로 희석합니다. 양이온성 리포좀 형질주입 시약을 올리고뉴클레오티드와 1:1 비율로 첨가합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다.

그런 다음 각 T-25 플라스크에 700마이크로리터의 형질주입 혼합물을 추가합니다. 섭씨 37도에서 1-3일 동안 배양합니다. RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 유전자 knock-down을 검증합니다.

다음으로, 세포를 24개의 다중 웰 배양 플레이트에 파종합니다. 표적 치료 억제제의 농도를 밀리리터당 100마이크로그램에서 밀리리터당 400마이크로그램으로 증가시키는 것에 세포를 노출시킵니다. 유전자 knock-down의 효능을 위해서는 siRNA 올리고뉴클레오티드가 표적 발현을 줄이기 위해 특이적이어야 합니다.

설계된 도구와 siRNA의 측정은 동일한 타겟 유전자가 이러한 목적에 유용합니다. 섭씨 37도의 CO2 인큐베이터에서 15일 동안 배양합니다. 배지를 제거하고 10ml의 PBS-1X로 세포를 헹굽니다.

PBS를 제거한 후 2-3ml의 고정 용액을 첨가합니다. 그런 다음 정착 용액을 제거하고 0.5% 결정 바이올렛 용액을 첨가합니다. 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

피펫을 사용하여 크리스탈 바이올렛 용액을 조심스럽게 흡인합니다. 다음으로 플레이트를 수돗물에 담그십시오. 실온에서 최대 이틀 동안 자연 건조하십시오.

그런 다음 4X 배율에서 도립 현미경을 사용하여 50개 이상의 세포가 포함된 군집을 계산합니다. 본 연구에서는 HER2 수치가 높고 트라스투주맙에 민감한 3개의 위암 세포주를 표적 치료제를 함유한 배양 배지에서 성장시켰습니다. 이로부터, 안정한 저항성 표현형을 특징으로 하는 3개의 서브클론이 얻어진다.

서브클론 중 HR NCI N87은 상대 저항 IC50이 28.57에 도달하는 가장 저항력이 높은 것으로 보입니다. 단백질 및 유전자 발현 분석은 IQGAP1 유전자가 HR NCI N87 서브라인의 저항성 표현형에서 중추적인 역할을 한다는 가설을 뒷받침합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 IQGAP1 단백질 수준은 부모 세포보다 저항성 하위 클론에서 5배 계층입니다.

그리고 IQGAP1 유전자 발현은 HR NCI N87 서브라인에서 원래 서브클론보다 2.5배 더 높습니다. 그런 다음 IQGAP1 유전자 침묵을 수행하여 trastuzumab 내성 표현형의 발달에서 그 역할을 평가합니다. 클론 생성 분석은 IQGAP의 중요성에 대한 가설을 더욱 확증합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 유전자 침묵은 트라스투주맙에 대한 세포의 민감성을 회복시켜 IC50 값을 밀리리터당 7마이크로그램으로 낮춥니다. 이 시술에 대해 제가 생각하는 것은 일반적으로 약물 내성 세포 서브클론을 얻는 것이 쉽지 않다는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 그리고 이 방법은 잠재적인 고장 위험이 있습니다.

이 절차를 통해 표적 치료에 대한 후천적 내성을 유발하는 서로 다른 메커니즘을 특징으로 하는 클론의 여러 세포를 얻을 수 있습니다. 표적 치료 내성의 체외 모델링을 위한 표준 절차의 개발은 종양학 연구자가 최신 세대 치료법에 대한 가장 큰 비판인 약물 내성을 극복하기 위해 새로운 약물 사용 표적을 조사할 수 있도록 해야 합니다.