Name: Foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 16 s
Description: 배우세요 전기화학 DNA 바이오센서를 개발하여 Vibrio parahaemolyticus 식품 매개 병원체를 신속하게 검출하는 방법을 익히세요. 금 나노입자와 폴리락틱산을 활용한 전극 개질 기술로 식품 안전 분야의 민감도와 선택성을 향상시킵니다.

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저자는 Universiti 푸 트 라 말레이시아의 지원을 하 고 싶습니다.

참고: 모든는 화학과 생 화 확 적인 시 약 사용 될 분석 등급의 고 추가 정화 없이 사용. 살 균 이온된 수를 사용 하 여 모든 솔루션을 준비 합니다. 오토 클레이 브 살 균 전에 모든 유리.
주의: 사용 하십시오 모든 적절 한 안전 관행 공학적 통제 (연기 후드, 글러브)의 사용을 포함 하 여 실험실 활동을 수행할 때 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 외 투, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발)입니다.
1. 제조 및 특성의 수정 전극 PLA AuNPs를 사용 하 여
<ol><li>
준비 및 PLA AuNPs의 특성화
	<ol>
<li>빨리 끓는 수성 chloroauric 산 성 솔루션 (1 mM) 100 mL를 나트륨 구 연산 염 해결책 (38.8 m m)의 10 mL를 추가 하 고 주위 온도 아래로 냉각. 준비 된 AuNPs 솔루션는 노란색, 거 무스 름 한 변경으로 시작 되 고 마지막으로 어두운 루비 빨간색으로 끝나는 색상의 변화를 관찰 합니다.</li>
		<li>PLA 펠 릿 용 해 공정에 대 한 스테인레스 스틸 몰드에 놓고 10 분 따라 눌러 절차와 190 ° C의 온도에 그들을 예 열: PLA 시트 준비의 일환으로 1 분에 대 한 2.2 MPa의 압력에서 그들을 넣어. PLA 시트는 약 3 시간 냉각 후 사용 하기 위해 준비가 될 것입니다.</li>
		<li>적극적으로 교 반, 실 온에서 클로 프롬의 5 mL에 PLA 시트의 0.68 mg 분해. 이전 준비 AuNPs 솔루션의 10 mL와 함께 녹아 PLA를 혼합 하 고 균질 실내 온도에 그것을 저 어. 균질 혼합물 다음 PLA AuNPs로 표시 될 수 있습니다 하 고 UV-마주, XRD, TEM, 및 FESEM EDX에 사용 특징.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
준비 및 수정된 모티브로 탄소 전극의 특성 참고:이 연구에 사용 된 SPCE 구성 3 전극 시스템: 카운터 전극, 탄소 작업 전극과 Ag/AgCl 기준 전극.<ol>
<li>빠르게 SPCE 그리고 공기에 PLA AuNPs의 동질적인 솔루션의 피 펫 25 µ L 24 h 사용 전에 건조.</li>
		<li>수정 된 전극의 화학적 특성 SPCE/PLA-AuNPs, 칼륨 페로 시안 화물에 (K3[Fe(CN)6]3/4-) 활성 표면적, 전기 화학 임피던스 분광학, 반복성, 측정 하 재현성, 고 안정성30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발
<ol><li>
조사 준비 참고: ssDNA 프로브 및 보완 DNA 시퀀스는 생물 공학 정보 (NCBI) 데이터베이스에 대 한 국립 센터에서 정보에 따라 선정 됐다.<ol>
<li>다음 시퀀스에 따라 상업 실험실에서 동결 건조 된 분말 합성 oligonucleotides (20-메 르 ssDNA 프로브, 20-메 르 보완 DNA, 20-메 르 일치 하지 않는 DNA와 21-메 르 비 보완 DNA)를 구입: thiolated ssDNA 프로브: 5 '-/ 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG-3 보완 DNA: 5 '-CAGTGCTTCTGCATAATCCG-3 한 기반 일치 하지 않는 DNA: 5-CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG-' 3 ' 3 자료 일치 하지 않는 DNA: 5-CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG-' 3 ' 비 보완 DNA: 5 '-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-3</li>
		<li>솔루션을 사용 하는 살 균 테 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), 분석 부분으로 나누어 모든 oligonucleotides (100 µ M)의 재고 솔루션을 준비 합니다. -4 ° C에 보관 한 다음 적절 한 희석 그냥 사용 하기 전에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
동원 정지 및 교 잡의 최적화 참고:는 SPCE PLA AuNPs, SPCE/PLA-AuNPs로 표시로이 연구를 위해 사용 되었다 고 드롭 주조 방법은 DNA 동원 정지 및 교 잡에 대 한 사용 되었다.<ol>
<li>첫째, SPCE/PLA-AuNPs에 thiolated ssDNA 조사의 25 µ L를 무력화 하 고 공기 건조 실 온에서 24 h 이후 그것은 것입니다 수 마지막으로로 표시 SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. 세 가지 요소를 사용 하 여 동원 정지 조건의 최적화를 결정: ssDNA (0.2에서 1.4 µ M에 배열 되는), (에서 30 210 분), 시간 및 온도 (25에서 75 ° C에 배열 되는)의 농도.</li>
		<li>SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 후 그것은 수 수 마지막으로로 표시 SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA 교 잡 이벤트 수행의 표면에 보완 DNA의 25 µ L 플라스틱 (5에서 30 분에 배열 되는) 시간 및 온도 (25에서 75 ° C에 배열 되는)의 두 요소를 통해 교 잡 조건의 최적화를 결정 합니다.</li>
		<li>담가 고정 30 분에 대 한 20 µ M MB에에서 교배 전극을 제거 0.5 m ABS 세척 하 여 비 특히 흡착된 DNA와 초과 MB/20 mM NaCl (pH 4.5)과 다음으로 rinsing 저온. 측정 피크 전류 DPV 기술을 사용 하 여 MB 감소 합니다. DPV 측정 0.1 M PBS (pH 7)를 사용 하 여 실행 없음 표시기를 포함 하.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조작된 DNA 바이오 센서의 특성
	<ol>
<li>30 분 동안 20 µ M MB에에서 SPCE/PLA AuNPs를 담가, 0.5 M ABS/20 m m NaCl (pH 4.5), 세척 하 고 이전에 측정 이온을 제거 된 물으로 씻어. 프로브 DNA, 보완 DNA, 일치 하지 않는 DNA 및 비 보완 DNA 샘플을 포함 하 여 모든 상호 작용에 대 한 비슷한 절차를 따릅니다.</li>
		<li>전기 화학 감소를 측정 합니다. 참고: DPV 인터페이스 소프트웨어와 상업적으로 제조 된 Autolab를 사용 하 여 측정 했습니다. 0.005 V, 0.05 V의 진폭을 변조 하 고 0.1 M PBS (pH 7)에서 7.73 mVs-1 의 스캔 속도의 잠재적인 단계 V, 0.25-0.5 V에서에서 배열 하는 잠재력에서 MB 전기 화학 감소의 DPV 측정 없음 표시기 포함. 선택도, 감도, 재현성, 및 조작된 DNA 바이오 센서의 열 안정성 더 공부 했다. 보고 결과 3 개의 복제에으로 평균 값 측정을 제시 했다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 실제 샘플을 사용 하 여 조작된 DNA 바이오 센서의 유효성 검사
<ol><li>세균성 긴장의 준비
	<ol>
<li>해산물31,32 의 그들의 중요 한 오염에 따라 세균 샘플을 선택 합니다. 참고: parahaemolyticus V. 참조 긴장 및 다른 8 세균성 긴장 (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, 살 모 넬 라 typhimurium, 살 모 넬 라 장 염, Klebsiella 폐 렴으로 병원 성 대장균 O157:H7, 균 cereus및 비 브리 오 alginolyticus) 일반적인 식중독의 병원 체는이 연구에서 전기 화학 DNA 바이오 센서 유효성 검사에 대 한 고용 했다.</li>
		<li>문화 조건에 대 한 표 1 을 참조 하십시오 그들의 생존을 유지 그들의 각각 agar에 세균성 긴장의 일상적인 하위 문화 2 주마다를 수행 합니다.</li>
		<li>글리세롤 동결 과정에서 그들을 손상 시킬 수 있는 얼음 결정의 형성을 방지 하 여 박테리아를 보호-80 ° C에서 20% (v/v) 글리세롤에 포함 된 그들의 각각 성장 broths에 세균성 긴장의 장기 보존을 유지 합니다. 다음으로, 각각 broths로 글리세롤 주식에 보존 된 세균성 세포 배양의 루프를 예방. 박테리아를 부활 해야 하는 때 그들의 각각 성장 시간과 온도 따라 broths을 품 어.</li>
		<li>희석의 시리즈에서 파생 된 미생물을 열거 하기 위한 확산 플레이트 기술33, 표준 및 잘 알려진 방법을 사용 하 여 parahaemolyticus 대 셀의 수량을 결정 합니다.<ol>
<li>Parahaemolyticus V. Trypticase 간장 국물에 문화 (TSB + 3 %NaCl) 140 rpm 진동 상태에서 37 ° C에서. 다음, TSB + 3%의 9 mL에 박테리아 세포 배양의 1ml를 전송 NaCl 10-1 희석 비율을 얻을.</li>
		</ol>
</li>
		<li>9 번 10-10 희석 비율의 전체 시리즈를이 단계를 반복 합니다. 다음으로, 식민지 세 고, 각각에 대 한 브리의 선택적 천 배지에 0.1 mL (10-1 에서 10-10에 시작 되는) 각 희석 비율의 확산. 24 h에 대 한 37 ° C에서 incubated 접시를 품 어.</li>
		<li>식민지 카운터를 사용 하 여 개별 식민지를 계산 하 고 다음 다시-수를 계산 (CFU/pipetted 양 희석 요인 x) 밀리 밀도 (CFU mL-1) 당 콜로 니 형성 단위를 얻을 수 있습니다. CFU mL-1 흡 광도 대 한 교정 줄거리에서 박테리아 세포 정지에서 단위 (CFUs)를 형성 하는 식민지의 농도 파생 시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR 분석 실험의 준비
	<ol>
<li>삶은 세포 절차34다음 변경 된 게놈 DNA 추출 합니다. 첫 번째, 행진 개별 박테리아 스트레인 agar 미디어에 고 국물 미디어, 그것의 상대 성장 상태, 상태를 떨고 140 rpm에서 잠복기 뒤에 접종</li>
		<li>마이크로 원심 튜브로 국물의 1 mL 문화를 플라스틱. 4830 x g와 펠 릿을 얻기 위해 1 분에 4 ° C에서 원심이. 무 균 테 버퍼의 약 500 µ L를 사용 하 여 펠 릿으로 다시 중단. 98 ± 2 ° C가 열 블록에서에 10 분에 대 한 결과 정지를 누른 즉시 lyse 세포와 DNA를 풀어 10 분-18 ° C에서 그것을 진정.</li>
		<li>4830 x g와 명확한 정지는 상쾌한 추가 사용 하기 위해-20 ° C에서 유지 하는 3 분 4 ° C에서 게놈 DNA를 원심. Biophotometer 측정을 사용 하 여 260의 파장에서 자외선 흡수와 (빛의 파장을 흡수 하는 핵 산)으로 nm 및 280의 파장에 또한 nm (단백질 흡수 하는 빛의 파장)으로 농도 추출의 순도 결정 하 게놈 DNA 다음 표준 생 화 확 적인 분석 실험35 를 사용 하 여 그리고 16S rRNA 유전자 시퀀싱36여 확인 모든 긴장을 식별. 마지막으로 2 분 동안 92 ° C에서 게놈 DNA를 변성 하 고는 바이오 센서에 응용 프로그램 전에 얼음 물에 급속 하 게 냉각.</li>
		<li>더 parahaemolyticus 대 존재 확인 toxR 유전자를 타겟으로 PCR를 사용 하 여. Thermocycler 뇌관 쌍 (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3'와 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3')를 사용 하 여이 절차를 수행 합니다. 메 마른 물 (15.5 µ L), 버퍼 (5 µ L), 뇌관 (1 µ L, 10 µ M), dNTP 믹스 (1 µ L), DNA 템플렛 (2 µ L), 및 Taq DNA 중 합 효소 (0.2 µ L, 10 x)으로 구성 된 25 µ L 양의 총 반응에서 PCR 증폭을 최적화 합니다.</li>
		<li>구성 요소를 잘 믹스 하 고 증폭의 30 주기 위한 프로그램 thermocycler에 대상 시퀀스의 PCR 증폭을 정렬. 우리의 연구에서 각 주기 구성 3 단계 반응 , 즉., 변성 (94 ° C, 1 분), 어 닐 링 (63 ° C, 1.5 분) 및 확장 (72 ° C, 1.5 분), 최종 확장 (72 ° C, 7 분) 뒤의 30 사이클 이어서 초기 변성 (94 ° C, 3 분).</li>
		<li>증폭된 제품 및 그들의 크기에 1.5 %agarose 젤 전기 이동 법을 통해 확인 합니다. 상업적으로 생산된 젤-문서 시스템 젤 이미지를 캡처하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>코 클 샘플의 준비
	<ol>
<li>신선한 샘플을 얻습니다. 참고: 우리의 신선한 새 조개 (Anadara granosa) Serdang, Selangor, 젖은 시장에서 얻은 고 신속 하 게 분석을 위한 아이스 쿨러 상자에 실험실에 가져온. 2 그룹, 즉 치료 및 치료 그룹을 cockles 수확 했다 균일 하 게 추수의 시작에서 냉장으로 배치까지 가정으로 샘플을 나눕니다.</li>
		<li>사전-20 ° C 24 h, 20 ° C 4 h 이전 DNA 추출에서 UV 빛에 노출에 의해 뒤에서 그들을 저장 하 여 대우 그룹 cockles 취급. 참고: 동결 온도 자외선 노출을 사용 하는 제어에 대 한 그룹 죽이기 또는 적어도 자연스럽 게 축적 parahaemolyticus 대 cockles에 제한. 이 연구에서 제어 상태의 목표 신선한 새 조개의 실제 상황을 모방 하는 70 ° C의 높은 저온 살 균 법 체제를 적용 되지 않습니다. 한편, 그들은 실험실에 도착 하자마자 사전 치료 없이 치료 그룹에서 직접 샘플을 분석 합니다.</li>
		<li>Subculture parahaemolyticus 대 17802 TSB에 ATCC의 변형 (3 %NaCl). TSB의 적절 한 희석의 도금을 통해 inoculum 가능한 셀의 수준을 결정 (3 %NaCl) 104 CFU mL-1 parahaemolyticus 대의 inoculum을 얻으려면 CA에. 증류수에 각 코 클 워시와 껍질에서 조직 제거를 층 류 캐비닛에 소독 집게를 사용 하기 전에 흙의 무료 잡 목.</li>
		<li>살 균 TSB의 90 mL에 균질 화기와 약 10 g 코 클 조직 샘플의 균질 (3 %NaCl) 60에 대 한 s. 추가 아군된 샘플에 대 한 무 균된 샘플 국물의 9 ml parahaemolyticus 대 의 알려진된 금액. Unspiked 샘플을 사용 하 여 부정적인 컨트롤. Parahaemolyticus 대 CA에 샘플의 0.1 mL를 도금 하 여 코 클 샘플에 아군의 셀 개수를 추정 고 이후, microcentrifuge 튜브에 dna 샘플의 1 mL를 pipetting 추출, 바이오 센서 및 PCR 분석 실험에 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>변경 된 다음 아군 및 unspiked 샘플에서는 parahaemolyticus 대 의 게놈 DNA 추출 삶은 세포 절차36. DNA 농도 및 순도 바이오 광도 측정을 사용 하 여 260의 파장에서 자외선 흡수와 마지막으로, 결정 (빛의 파장을 흡수 하는 핵 산)으로 nm 및 280의 파장에 또한 nm (단백질 흡수 하는 빛의 파장)으로.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 없다.

전기 화학 바이오 센서의이 종류의 성공적인 개발을 위한 프레임 워크의 중요 한 단계는 핵 산 (DNA 여기); 변환기에 대 한 적절 한 생물학적 인식 요소 선택 트랜스듀서;의 감지 레이어를 생성 하기 위한 화학 접근 변환 자료; 최적화 DNA 동원 정지 및 교 잡; 그리고 실제 예제를 사용 하 여 개발 된 바이오 센서의 유효성 검사.
민감하고 선택적 전기 화학 DNA 바이오 센서의 성공적인 개발을 코어, immobilization와 교 잡 조건의 최적화입니다. 이 작품에서는, 우리는 복잡 한 산화로 MB를 사용. MB-DNA 상호 작용의 다양 한 원리는: (i) ssDNA와 dsDNA;의 인산 염 등뼈 음이온 혐의로 MB 양이온 책임의 정전기 상호 작용에 의해 (ii)에 의해 번갈아 dsDNA;에 G-C 기본 쌍 사이의 MB의 성공적인 삽입을 통해 MB 윤 (iii)에 의해 대상 ssDNA의 끝에 공유 결합, 생성 낮은 레이블 밀도 (하나 또는 두 개의 메가바이트 분자 DNA 가...

최근 몇 년 동안에서 공공 및 과학적인 논쟁의 주요 주제, 식중독은 주로 3 에이전트와 관련 된: 미생물1, 화학2및 기생충3. 오염 된 음식 인간, 약한 면역 체계, 노인, 임신 여성, 아기, 그리고 어린 아이4에 그들의 더 높은 위험 그룹에서 특히 심각한 건강 결과 일으킬 수 있습니다. 아프리카, 아시아 및 라틴 아메리카에서 5 세 미만의 어린이에서 매년 발생 하는 급성 설사의 경우에 이상 백만, 식중독 주요 글로벌 질병5,6 와 세계 보건 기구 설립 7가장 중요 한 기여자 서의 미생물 비 브리 오 parahaemolyticus 가장 널리 인정 된 악성 종자 들 눈에 띈다. 그램 음성 박테리아는 높은 소금 환경에서 활성화 되 고 부적당 하 게 요리, 분실 또는 원시 해양에 먹을 때 심각한 인간의 위장염은 일반적으로 해안, 강어귀, 및 해양 환경8에서 발견, 제품9. 또한, 기존의 의료 조건을 어떤 사람들 그들을 상처 감염, 패 혈 증 또는 귀 감염 parahaemolyticus 대10에서 발생 하는 경향이 확인. Parahaemolyticus 대 hemolysins의 독성 요인 질병 병 인에 기여 하는 2 가지의 유형으로 분할 된다: 내 직접 hemolysin (TDH) tdh 유전자에 의해 코딩 및 TDH 관련 hemolysin trh 유전자11에 의해. V. parahaemolyticus 의 독성 마커 (tdh와 trh 유전자)는 주로 환경 표본 보다 임상 표본에서 발견 됩니다.
Parahaemolyticus 대 보유 하 고 광범위 한 조건에서 살아남을 수 신속 하 게 환경 변화12응답. 그것의 확산 메커니즘의 독성 세포 대량13와 병렬로 증가 위험 잠재력을 에스컬레이션 합니다. 심지어 최악의 경우, 기후 변화 이러한 박테리아 그들의 세포 인구 성장14를 가속 화 하기 위해 충분 한 조건을 제공 합니다. 그것의 높은 주파수로 인해 parahaemolyticus 대 감시 될 필요가 식품 공급망의 무역 및 해산물 제품 이기 때문에 그들은 거 대 한 수량15,16 에서 발견의 생산에서 특히 따라 통해 세계. 현재 박테리아 식별 및 생화학 테스트, 농축 및 선택적 미디어17, 매 효소 연결 된 immunomagnetic를 포함 하 여 방법의 범위를 사용 하 여 절연 시험 (ELISA)18, 펄스 분야 젤 전기 이동 법 (PFGE) 19, 라텍스 교착 테스트, 그리고 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 시험20. 이러한 메서드는 일반적으로 자격 갖춘된 직원, 정교한 계기 및 힘 드는 기법을 즉시에 오염에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다 필요 합니다. 이 심각 하 게 유해한 오염 및 현장 응용 프로그램을 신속 하 게 감지 가능성을 제한 합니다. 빠른 검색 도구는 뛰어난 도전 남아 있습니다.
시간 절약, 비용 효과적인, 실용적인, 그리고 실시간 분석 방법21,,2223,24 제공 하기 때문에 바이오 센 싱은 foodborne 병원 체의 검출을 위한 유망 옵션으로 나오고 . 그러나, 비록 아군된 샘플 및 바이오 센서를 사용 하 여 표준 솔루션 분석 탐지의 많은 긍정적인 결과 왔다, 있다 아직 수성 혼합물 또는 유기농 추출 물25실제 샘플에 적용 하는 연구의 부족. 최근에, 직접 및 간접 deoxyribonucleic 산 (DNA) 탐지를 사용 하 여 전기 화학 바이오 센서 교 잡 이벤트26 를 통해 보완 대상의 그들의 특정 탐지 때문에 과학자 들 사이에서 증가 관심 받은 , 27 , 28 , 29. 이러한 독특한 접근은 소형화 및 상용화 유망 기술에 따라서 제공 하 고, 효소 기반 바이오 센서에 비해 더 안정. 연구의 대상 보고 여기 parahaemolyticus 대 높은 선택도, 민감도, 실용성, 교 잡 동안 DNA 순서 특이성에 따라 검색할 수 있는 빠른 도구를 생성 하는. 식별 전략 교 잡 표시기, 메 틸 렌 블루 (MB)의 존재 polylactic 산 안정 금 나노 입자 (PLA-AuNPs)30 및 모티브로 탄소 전극 (SPCEs)의 조합을 포함 한다. 개발 된 탐지 구성의 잠재력 추가 박테리아 DNA lysate와 신선한 코 클 샘플을 사용 하 여 탐구 된다.

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>Merck</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Diaminoethane tetraacetic acid</td><td>Promega</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>이염기성 인산나트륨&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>디소듐 수소 인산</td>염 <td>Sigma-Aldrich</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>에탄올&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Gold(III) chloride trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>폴리(젖산) 수지, 상업용 4042D</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>R& M Chemicals</td><td>59435</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소</td>칼륨 <td>시그마-알드리치</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>헥사시아노페레이트 칼륨 III</td><td>R& M 화학 물질</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 무수 염</td><td>시그마 -알드리치</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>염화</td><td>나트륨 시그마 알드리치</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>구연산 트리소듐</td><td>시그마-알드리치</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>트리스 (하이드 록시 메틸) 아미노 메탄</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>이중 염료가 포함된 2X PCR 마스터 믹스</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 젤</td><td>Merck</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Agar</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Broth</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Vibrio</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>Eosin 메틸렌 블루 한천&nbsp;</td><td>Merck</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Merck</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq 버퍼</td><td>Promega</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>로딩 염료 100 bp DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>로딩 염료 1kb DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>Promega</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>만니톨 달걀 노른자 폴리믹신 한천</td><td>머크</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>맥콩키 한천</td><td>머크</td><td>105465</td><td></td></tr><tr><td>영양 육수</td><td>머크</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>타크 중합효소</td><td>머크</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>트립티케이스 소이 육수</td><td>머크</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>트립티케이스 소이 한천</td><td>머크</td><td>105458</td><td></td></tr></tbody></table>

foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 dna 바이오 센서의 개발

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

(대 parahaemolyticus) 브리 parahaemolyticus 크게 인간의 사망률과 질병 률의 속도 영향을 미치는 보건 문제의 큰 비율에 세계적으로, 기여 일반적인 foodborne 병원 체 이다. 문화 기반 방법, 면역학 분석 실험, 분자 기반 방법 등 parahaemolyticus 대 의 검출을 위한 일반적인 방법 복잡 한 샘플 처리를 요구 하 고, 지루한, 시간과 비용이 많이 드는 있습니다. 최근, 바이오 센서는 빠른 검색, 비용 효율성, 실용성의 장점으로 유망 하 고 포괄적인 탐지 방법으로 입증 했습니다. 이 연구는 높은 선택도 및 DNA 교 잡의 원리를 사용 하 여 감도 parahaemolyticus 대 감지 하는 빠른 방법 개발에 중점을 둡니다. 작업, 합성된 polylactic 산 안정 금 나노 입자 (PLA-AuNPs)의 x 선 회절 (XRD), 자외선 보이는 분광학 (UV-Vi), 전송 전자 현미경 (TEM), 필드-방출을 사용 하 여 달성 되었다 스캐닝 전자 현미경 검사 법 (FESEM), 그리고 주기적 Voltammetry (CV). 우리는 또한 추가 안정성, 감도, 및 PLA AuNPs의 재현성의 테스트 실시. 우리는 PLA AuNPs 수성 해결책에서 안정 된 나노 입자의 소리 구조 형성을 발견. 우리는 또한 감도 작은 충전 전송 저항 (Rct) 값과 활성 표면적 (0.41 c m2)의 증가 결과로 향상 된 관찰. 우리의 DNA 바이오 센서의 개발은 PLA AuNPs와 redox 표시기로 메 틸 렌 블루 (MB)를 사용 하 여 모티브로 탄소 전극 (SPCE)의 수정에 근거 했다. 우리는 차동 펄스 voltammetry (DPV)에 의해 동원 정지 및 교 잡 이벤트를 평가. 보완, 보완, 우리 그를 발견 하 고 일치 하지 않는 oligonucleotides 특별히 조작된 바이오 센서에 의해 수훈이 있었다. 그것은 또한 다양 한 식품을 매개로 병원 체에 대 한 분 연구 하 고 신선한 cockles parahaemolyticus 대 의 식별에 안정적으로 민감한 탐지를 보여주었다.

AuNPs의 형성 나트륨 시트르산 존재와 용액의 색깔에서 변화를 통해 밝혀졌다. 이 깊은 루비 레드 빛 노란색에서 변경 하려면 색상을 발생 합니다. PLA AuNPs의 세대 표면 플라스몬 공명 (SPR) 피크의 성장 약 540에서 발견 됐다 대 한 UV 스펙트럼 (그림 1)에서 확인 되었다 nm. 형성 및 PLA AuNPs의 존재는 입자 크기37에 따라 500-600 nm 파장 범위에 표시 했다. AuNPs 및 PLA AuNPs의 XRD 패턴은 그림 2에 표시 됩니다. 모든 crystallite 봉우리 31.7, 38.2, 44.4, 64.7, 77.7 °의 2θ에서 관찰 되었다. 그들은 (100) (111) (200) (220)에 기인 했다 입방 FCC (얼굴 중심 입방) 금 (311) 결정학 비행기 (금속) nanost...

브리 parahaemolyticus 감지 polylactic 산 안정, 금 나노 입자 수정, 모티브로 탄소 전극으로 구성 된 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

Foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

식품 매개 병원체는 전 세계적으로 공중 보건 문제의 많은 부분을 차지하며, 이는 인간의 사망률과 이환율에 큰 영향을 미칩니다. 식품 매개 병원균을 검출하기 위한 기존의 방법은 복잡한 시료 처리가 필요하고 시간이 많이 걸립니다. 최근 바이오센서는 빠른 검출과 실용성의 장점을 갖춘 유망하고 포괄적인 검출 방법으로 입증되었습니다.바이오센서의 개발은 폴리락트산 안정화 금 나노입자를 사용한 변형된 전극을 기반으로 합니다. 스크린 인쇄 된 탄소 전극은 작동 전극 활성 표면적을 증가시키기 위해 수정되었습니다. 산화 환원 복합체로 사용되는 메틸렌 블루는 고정된 프로브 DNA의 단일 가닥 DNA와 강한 결합을 가지고 있습니다.이러한 높은 친화력의 관계는 높은 피크 전류로 표현됩니다. 단일 가닥 DNA와 상보적 서열의 혼성화는 결합된 메틸렌 블루 분자를 대체하여 차동 펄스 전압전류계의 전류를 감소시킵니다. 이는 상보적인 이중 가닥 DNA가 있는 변형된 전극의 표면에 더 적은 양의 메틸렌 블루가 모였기 때문일 수 있으며, 이는 구아닌 염기 간의 도달할 수 없는 상호 작용으로 인해 발생했습니다.준비된 용액의 색상은 노란색에서 거무스름한 색으로, 마지막으로 짙은 루비 레드로 바뀝니다. 이것은 금 염이 구연산염 이온에 의해 감소되었음을 나타냅니다. 용해된 폴리락트산을 미리 제조된 금 나노입자 용액과 혼합한 후 실온에서 균일하게 교반한 후 폴리락트산 안정화 금 나노입자로 표시하였다.자외선 가시 분광법, X선 회절, 투과 전자 현미경 및 에너지 분산 X선 분광법을 사용한 전계 방출 주사 전자 현미경을 사용하여 폴리락트산 안정화 금 나노 입자를 특성화했습니다. 약 25 마이크로 리터의 폴리 락트산 안정화 금 나노 입자의 균질 한 용액을 스크린 인쇄 탄소 전극에 신속하게 피펫으로 넣고 사용하기 전에 24 시간 동안 공기 건조시켰다. 그런 다음 변형된 전극을 페로시아나이드칼륨에서 전기화학적으로 특성화하여 활성 표면적, 전기화학적 임피던스 분광법, 반복성, 재현성 및 안정성을 측정했습니다.고정 상태의 최적화는 0.2 - 1.4 마이크로몰 범위의 단일 가닥 DNA의 농도, 30 - 220분 범위의 시간, 섭씨 25 - 75도 범위의 온도의 세 가지 요소를 사용하여 결정되었습니다. 한편, 혼성화 조건의 최적화는 5분에서 35분 사이의 시간과 섭씨 25도에서 75도 범위의 온도라는 두 가지 요소를 통해 결정되었습니다. 처리된 변형된 전극을 이어서 20

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

경쟁력있는 immunochemical 방법과 최종 전기 감지 기능을 기반으로 새로 개발된 검사 방법을 사용하여 trichothecenes을 (인간의 건강에 대한 우려의 mycotoxins) 감지하는 프로토콜이 증명됩니다.

진균 독소의 검출을위한 ELIME (효소가 단백질 자기 전기를 연결) 방법

"E - DNA"센서는 reagentless, 혈액 및 기타 복잡한 매트릭스에서 직접 도전 경우에도 실적이 전기 biosensors은 핵산, 단백질과 작은 분자 analytes 다양한 범위의 감지 적응되었습니다. 여기에는 센서의 제조 및 사용에 대한 일반적인 절차를 제시한다.

핵산, 단백질과 작은 분자의 Reagentless 감지를위한 전기 -의 DNA Biosensors의 제작

Google은 최근은 간단 세균 검출을위한 형광 분석 "을 믹스 앤 읽기"를 설정하는 데 적용할 수있는 형광 DNAzyme 프로브를 생성하기위한 새로운 접근 방식을보고했습니다. 이러한 특별한 유전자 프로브는이를 형광 신호 생성에 세균 검출을 번역 특정 세균에 의해 생산되는 원유 세포외 혼합물 (CEM)의 앞에서 발색단 - 수정의 DNA-RNA 키메라 기판의 절단을 catalyze. 이 보고서에서 우리는 "RFD-EC1"표시된 특정 DNAzyme 프로브는 모델 박테리아의 탐지를 위해 고용되는 핵심 실험 절차를...

형광 DNAzymes을 사용하여 박테리아의 탐지

우리는 빠른 세균 검출 및 식별을 위해 전기 센서 분석 방법을 설명합니다. 분석은 리보솜 RNA (rRNA의) 종의 특정 시퀀스 DNA 올리고 뉴클레오타이드 캡처 프로브 작용 센서 어레이를 포함한다. 캡처 프로브와 고추 냉이 과산화 효소 연결된 DNA 올리고 뉴클레오타이드 검출기 프로브 대상 rRNA의의 샌드위치 하이브리드는 측정 전류 측정 전류를 생성합니다.

전기 화학 센서를 사용하여 세균의 검출 및 식별

출처: Barber, AE, et al. 총상 잔류물의 추정 검출을 위한 새로운 박테리아 바이오센서의 준비 및 적용. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오는 박테리아 바이오센서를 사용하여 특정 분석물을 검출하는 방법을 보여줍니다. 분석물에 민감한 프로모터 아래에 적색 형광 단백질(RFP) 유전자가 있는 플라스미드를 운반하는 박테리아 배양물을 채취합니다. 테스트 표면을 철저히 닦은 후 물티슈의 작은 부분을 배양액에 담그고 배양합니다. 프로모터와의 분석물 상호 작용은 RFP 발현을 활성화하여 표적 분석물의 존재를 확인합니다.

박테리아 바이오센서를 사용한 표적 분석물 검출

이 비디오는 나노 센서를 사용하여 식품 및 물 샘플에서 박테리아 오염 물질을 감지하는 기술을 보여줍니다. 표적 병원성 박테리아는 자기 이완(magnetic relaxation)과 형광 방출 방식(fluorescence emission modalities)의 조합을 통해 검출됩니다.

자기 형광 나노센서를 사용한 박테리아 오염 검출

급속한 균 검출 용 라벨없는 광 바이오 센서가 도입된다. 바이오 센서의 표면에 직접 표적 균 세포를 포착하기 위해 디자인 된 나노 다공성 실리콘에 기반하고있다. 우리는 포획 프로브로서, 다공질 변환기에 고정화 된 모노클로 날 항체를 사용한다. 우리의 연구는 (같은 세포 용해와 같은) 더 이전의 샘플 처리와 분 이내에 낮은 세균 농도의 검출에 대해 이러한 바이오 센서의 적용 가능성을 보여줍니다.

의 광학 검출 E. 대장균 박테리아

RNA 절단 DNAzyme, urease 및 마그네틱 비드를 활용하는 변형 리트머스 테스트를 사용하여 E. coli의 비색 검출 프로토콜을 설명합니다.

리트머스 테스트를 사용하여 박테리아의 비색 검출

이 프로토콜의 전반적인 목표는 비용 효율적인, 노트북에 대 한 기능 nanosensors을 합성 하 고의 급속 한 탐지는 자석 및 형광 방출 modalities의 결합을 통해 병원 성 박테리아에 특히 표적으로.

E. 콜라이 O157:H7의 Foodborne 병원 체 검사를 사용 하 여 자기 형광 Nanosensor: 신속한 감지

살 모 넬 라 종 /Shigella 종 설사에 기인 하는 일반적인 병원 체. 여기, 우리는 살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼을설명/Shigella 종 실시간 PCR를 사용 하 여 결합 가이드 문화.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

전기 습윤 기반 디지털 미세 유체는 마이크로 리터 볼륨 액적의 명백한 접촉 각도에서 전압 구동 변화를 활용하여 조작을 용이하게하는 기술입니다. 이를 기능화된 자기 비드와 결합하면 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 병원균의 시료 준비 및 식별을 위한 여러 실험실 단위 작업의 통합이 가능합니다.

자동화된 효소 연계 면역흡착제 분석기용 전기습식 기반 디지털 미세유체 분석 플랫폼

배우세요 전기화학 DNA 바이오센서를 개발하여 Vibrio parahaemolyticus 식품 매개 병원체를 신속하게 검출하는 방법을 익히세요. 금 나노입자와 폴리락틱산을 활용한 전극 개질 기술로 식품 안전 분야의 민감도와 선택성을 향상시킵니다.

Foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발

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