Foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발

식품 매개 병원체는 전 세계적으로 공중 보건 문제의 많은 부분을 차지하며, 이는 인간의 사망률과 이환율에 큰 영향을 미칩니다. 식품 매개 병원균을 검출하기 위한 기존의 방법은 복잡한 시료 처리가 필요하고 시간이 많이 걸립니다. 최근 바이오센서는 빠른 검출과 실용성의 장점을 갖춘 유망하고 포괄적인 검출 방법으로 입증되었습니다.

바이오센서의 개발은 폴리락트산 안정화 금 나노입자를 사용한 변형된 전극을 기반으로 합니다. 스크린 인쇄 된 탄소 전극은 작동 전극 활성 표면적을 증가시키기 위해 수정되었습니다. 산화 환원 복합체로 사용되는 메틸렌 블루는 고정된 프로브 DNA의 단일 가닥 DNA와 강한 결합을 가지고 있습니다.

이러한 높은 친화력의 관계는 높은 피크 전류로 표현됩니다. 단일 가닥 DNA와 상보적 서열의 혼성화는 결합된 메틸렌 블루 분자를 대체하여 차동 펄스 전압전류계의 전류를 감소시킵니다. 이는 상보적인 이중 가닥 DNA가 있는 변형된 전극의 표면에 더 적은 양의 메틸렌 블루가 모였기 때문일 수 있으며, 이는 구아닌 염기 간의 도달할 수 없는 상호 작용으로 인해 발생했습니다.

준비된 용액의 색상은 노란색에서 거무스름한 색으로, 마지막으로 짙은 루비 레드로 바뀝니다. 이것은 금 염이 구연산염 이온에 의해 감소되었음을 나타냅니다. 용해된 폴리락트산을 미리 제조된 금 나노입자 용액과 혼합한 후 실온에서 균일하게 교반한 후 폴리락트산 안정화 금 나노입자로 표시하였다.

자외선 가시 분광법, X선 회절, 투과 전자 현미경 및 에너지 분산 X선 분광법을 사용한 전계 방출 주사 전자 현미경을 사용하여 폴리락트산 안정화 금 나노 입자를 특성화했습니다. 약 25 마이크로 리터의 폴리 락트산 안정화 금 나노 입자의 균질 한 용액을 스크린 인쇄 탄소 전극에 신속하게 피펫으로 넣고 사용하기 전에 24 시간 동안 공기 건조시켰다. 그런 다음 변형된 전극을 페로시아나이드칼륨에서 전기화학적으로 특성화하여 활성 표면적, 전기화학적 임피던스 분광법, 반복성, 재현성 및 안정성을 측정했습니다.

고정 상태의 최적화는 0.2 - 1.4 마이크로몰 범위의 단일 가닥 DNA의 농도, 30 - 220분 범위의 시간, 섭씨 25 - 75도 범위의 온도의 세 가지 요소를 사용하여 결정되었습니다. 한편, 혼성화 조건의 최적화는 5분에서 35분 사이의 시간과 섭씨 25도에서 75도 범위의 온도라는 두 가지 요소를 통해 결정되었습니다. 처리된 변형된 전극을 이어서 20마이크로몰 메틸렌 블루에 30분 동안 침지시켰다.

비특이적으로 흡수된 DNA와 과량의 메틸렌 블루를 pH 4.5의 식염수 아세테이트 완충액으로 세척하여 제거한 후 탈이온수로 헹궈냈다. 메틸렌 블루 환원의 피크 전류는 차동 펄스 전압 주사법 기술을 사용하여 측정되었습니다. 차동 펄스 전압주사법 측정은 지표가 없는 인산염 완충액 식염수 pH 7.0을 사용하여 실행되었습니다.

모든 상호 작용에 대해 유사한 절차가 수행되었습니다. 본 연구에서는 Vibrio parahaemolyticus를 참조 균주로 사용하고 8개의 다른 박테리아 균주, 즉 캄필로박터 제주니, 리스테리아 모노사이토제네스, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 장염, 폐렴간균, 대장균 O157:H7, 바실러스 세레우스 및 비브리오 알기놀리티쿠스를 사용하여 일반적인 식품 매개 병원체를 전기화학적 DNA 바이오센서 검증에 사용했습니다. 각각의 한천에 대한 박테리아 균주의 일상적인 하위 배양은 생존력을 유지하기 위해 2주마다 수행되었습니다.

Vibrio parahaemolyticus 세포의 수량은 스프레드 플레이트 기법을 사용하여 측정되었습니다. 1mm의 박테리아 세포 배양을 3%염화나트륨을 함유한 9mm의 트립티아제 콩 육수에 옮겨 10의 희석 계수를 얻었습니다. 다음으로, 10 배 희석 계수에서 10 배 희석 계수로 시작하는 각 희석 계수 0.1 ml를 각각 CHROMagar Vibrio의 플레이트에 펴서 콜로니 계수를 수행하였다.

새조개는 재래시장에서 얻은 다음 분석을 위해 얼음 냉각기 상자에 담아 실험실로 신속하게 가져왔습니다. 새조개는 두 그룹으로 나뉘었는데, 하나는 새조개가 수확 시작부터 시장의 냉장 보관실에 보관될 때까지 균일하게 수확되었다는 가정하에 처리된 그룹과 처리되지 않은 그룹이었습니다. 투여군의 새조개는 영하 20도에서 24시간 동안 보관한 후 DNA 추출 전 4시간 동안 섭씨 영하 20도의 자외선에 노출시켜 전처리했습니다.

대조군에 사용된 영하의 온도와 자외선 노출은 새조개에 자연적으로 축적되는 식인성 병원체를 죽이거나 최소한 제한할 것으로 예상되었습니다. 섭씨 70도의 더 높은 저온 살균 요법은 적용되지 않았는데, 이 연구에서 통제된 조건의 목적은 신선한 새조개의 실제 상황을 모방하는 것이었기 때문입니다. 한편, 처리되지 않은 그룹의 샘플은 실험실에 도착하자마자 전처리 없이 직접 분석했습니다.

새조개는 증류수로 세척하고 먼지를 제거한 후 멸균 집게와 층류 캐비닛을 사용하여 껍질에서 조직을 제거했습니다. 약 10g의 새조개 조직 샘플을 3% 염화나트륨을 함유한 19ml의 멸균 트립티케이스 대두 육수에 균질기로 60초 동안 균질화했습니다. 그런 다음 스파이크된 샘플을 위해 균질화된 샘플 배지 9mm에 알려진 양의 식품 매개 병원체를 첨가했습니다.

스파이크가 없는 샘플은 음성 대조군으로 사용되었습니다. DNA 시료 추출을 위해 약 1ml의 시료를 Eppendorf 튜브에 피펫으로 주입했으며, 이는 바이오센서 및 중합효소 연쇄 반응 분석에 사용됩니다. 그런 다음 스파이크가 있는 샘플과 스파이크가 없는 샘플에서 식품 매개 병원체의 게놈 DNA를 추출했습니다.

게놈 DNA는 변형된 끓인 용해 절차에 따라 추출되었습니다. 게놈 DNA는 명확한 현탁액을 얻기 위하여 12, 4 섭씨 온도에 3 분 동안 분 당 000 교체에 원심 분리되고 상등액은 더 사용을 위한 영하 20 도에 유지되었다. 추출된 게놈 DNA의 농도와 순도를 결정하기 위해 생체 광도계를 사용했습니다.

그런 다음 표준 생화학 분석을 사용하여 모든 균주의 식별을 결정하고 16 SR RNA 유전자 염기서열 분석을 통해 검증했습니다. 마지막으로, 게놈 DNA를 섭씨 92도에서 2분 동안 변성시키고 바이오센서를 적용하기 전에 얼음물에서 급속 냉각시켰습니다. 식품 매개 병원체에 대한 추가 확인은 해당 유전자를 표적으로 하는 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 수행되었습니다.

증폭된 산물과 그 크기는 1.5% 아가로스 겔에 대한 전기영동을 통해 결정되었습니다. 겔 이미지는 겔 문서화 시스템을 사용하여 캡처했습니다. 폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 생성은 자외선 가시 스펙트럼에서 확인되었으며, 표면 플라즈마 및 공명 피크의 성장은 약 540 나노 미터에서 발견되었습니다.

폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 형성 및 존재는 입자 크기에 따라 500-600 나노 미터 파장 범위에서 표시되었습니다. 폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 모든 결정립 피크는 31.7, 38.2, 44.4, 64.7 및 77.7도의 두 극장에서 관찰되었습니다. 더 넓은 회절 피크가 31.7도에 진입함에 따라 결정립 피크 강도도 증가했는데, 이는 차가운 나노 입자가 폴리락트산에 내장되어 있음을 암시하고 다상 금 나노 구조의 형성을 암시합니다.

투과 전자 현미경 입자 분포 곡선과 폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 이미지에서 금 나노 입자가 거의 구형임을 알 수 있습니다. 나노 입자의 크기는 약 37 나노 미터 범위였으며, 이는 Scherrer의 공식에서 얻은 것보다 약간 더 크며, 합성된 나노 입자의 다결정 특성을 시사합니다. 폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 주요 크기는 100 Bragg의 반사 너비를 결정하여 Sherrer 방정식을 사용하여 계산되었습니다.

표에서 폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 결정립 크기는 27나노미터로 계산되었습니다. 전계 방출 주사 전자 현미경 이미지와 에너지 분산 X선 스펙트럼을 사용하여 수정된 스크린 인쇄 탄소 전극은 금의 중량 비율이 가장 높고 밀도가 가장 높으며 나노 입자 적용 범위가 가장 컸습니다. 에너지 분산 형 X 선 스펙트럼은 생성 된 폴리 락트산 안정화 금 나노 입자가 금으로만 구성되어 있으며 탄소와 산소에 해당하는 피크를 제외하고는 다른 원소가 없음을 확인했다.

양극 및 음극 피크 전위는 서로 다른 스캔 속도에서 일관되었으며, 이는 전기화학 반응이 피크 분리를 기반으로 가역적임을 시사합니다. 변형된 전극의 활성 표면적은 베어 전극과 변형된 전극에 대해 각각 0.26cm 제곱 및 0.41cm 제곱으로 계산되었습니다. 이 결과는 활성 표면적에서 폴리락트산 안정화 금 나노 입자에 의해 제공되는 개선이 베어 전극에 비해 상대적으로 더 높다는 것을 확인했습니다.

베어 전극의 전하 전달 저항 값은 1, 932 옴 인 반면 수정 된 전극은 1, 444 옴으로 감소했습니다. 개질된 전극에서 전하 전달 저항 값의 감소는 국소 유전 상수의 감소 및/또는 전기 이중층의 두께 증가로 인해 발생했을 수 있으며, 이는 칼륨 페로시안화물이 금속 또는 용액 계면에서 흡수에 의해 기능했음을 시사합니다. 피크 전류는 폴리락트산 안정화 금 나노 입자를 사용하여 베어 전극을 수정함에 따라 점진적으로 증가했으며, 이는 더 높은 감도가 더 낮은 전하 전달 저항의 반대임을 보여주었습니다.

변형 전극의 상대 표준 편차는 4.26%로 도출되었으며, 폴리락트산 안정화 금 나노 입자 변형이 있는 전극은 여러 측정 후에 더 나은 상대 표준 편차를 제공했습니다. 변형된 전극에 대한 상대 표준 편차 값은 4.05%이며, 이는 폴리락트산 안정화 금 나노 입자에 대한 전극 제조의 더 나은 재현성을 나타냅니다. DNA의 최적 농도는 1.2 마이크로몰 단일 가닥 DNA였습니다.

단일 가닥 DNA의 최적 고정 시간은 180분으로 선택되었습니다. 단일 가닥 DNA의 최적 고정 온도는 섭씨 55도로 선택되었습니다. 이중 가닥 DNA의 최적 혼성화 시간은 10분으로 선택되었습니다.

이중 가닥 DNA의 최적 혼성화 온도는 섭씨 35도로 선택되었습니다. 상보적 DNA는 프로브된 DNA, 비상보적 DNA, 3개의 염기 불일치 DNA 및 1개의 염기 불일치 DNA 중에서 0.73마이크로암페어의 가장 낮은 피크 전류를 나타냈습니다. 표적이 된 DNA의 높은 전류가 올리고뉴클레오티드의 다른 염기서열의 전류보다 작다는 것은 명백합니다.

이 결과는 바이오센서를 사용하여 높은 민감도와 특이도로 구별할 수 있음을 나타냅니다. 구성된 DNA 바이오센서는 변형된 전극 표면의 고정된 프로브 DNA를 통해 혼성화 검출의 선택성을 가졌습니다. 수정된 전극에서 메틸렌 블루의 차동 펄스 전압전류, 피크 전류의 지속적인 감소는 상보적 DNA의 농도 증가의 결과로 유발되었습니다.

다양한 타겟 DNA 농도 0.2 피코몰 - 0.02 밀리몰의 로그와 메틸렌 블루 환원 피크 전류의 로그 사이의 선형 상관관계는 0.96의 선형 회귀 계수로 표시됩니다. 제작된 DNA 바이오센서의 회수율은 6개월간의 저장 후 초기 신호의 80% 이상으로 서서히 감소하여 변형된 전극 표면의 단일 가닥 DNA 프로브가 매우 안정적임을 나타냅니다. 섭씨 45도 이하의 온도에서 우수한 장기 안정성은 폴리락트산 안정화 금 나노 입자와 단일 가닥 DNA 사이의 강한 반응의 원인일 수 있습니다.

바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 대장균(Escherichia coli), 비브리오 알지놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 장염(Salmonella enteritis), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 등 9종의 박테리아에 대한 중합효소 연쇄 반응 증폭 산물을 스크리닝했습니다. 교차 반응성 평가 후 얻은 차동 펄스 전압주사법 피크 전류는 다른 박테리아 종과 비교하여 Vibrio parahaemolyticus의 매우 명확한 검출을 보여줍니다. 염기쌍의 수를 줄임으로써 관찰된 차동 펄스 전압주사법 신호가 증가하는 것을 볼 수 있습니다.

이것은 프로브까지 더 많은 양의 메틸렌 블루 분자와 관련이 있습니다. 중합효소 연쇄 반응 분석에서 Vibrio parahaemolyticus는 7, 8, 9, 10, 11 및 12열에서 볼 수 있듯이 처리된 샘플과 처리되지 않은 스파이크 샘플 모두에서 발견되었습니다. 반면, 1번, 2번, 3번, 4번, 5번, 6번 레인에서 처리된 샘플과 처리되지 않은 스파이크가 없는 샘플에는 Vibrio parahaemolyticus가 없었습니다.

검출 결과는 개발된 DNA 바이오센서를 사용하여 스파이크가 있는 샘플과 스파이크되지 않은 샘플로 구성된 치료군에서 Vibrio parahaemolyticus의 존재를 성공적으로 측정했습니다. 이러한 결과는 이전에 논의된 중합효소 연쇄 반응 결과와 긍정적인 상관관계가 있습니다. 폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 응용은 제조 감각을 더욱 높이기 위한 수정으로 적용할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

산화 환원 복합체가 혼성화되지 않은 생물 인식 분자와 더 강하게 결합할 때 높은 선택성을 달성할 수 있으며, 이는 후속 조치를 취할 가치가 있는 혁신일 수 있습니다.