Name: Foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 16 s
Description: 배우세요 전기화학 DNA 바이오센서를 개발하여 Vibrio parahaemolyticus 식품 매개 병원체를 신속하게 검출하는 방법을 익히세요. 금 나노입자와 폴리락틱산을 활용한 전극 개질 기술로 식품 안전 분야의 민감도와 선택성을 향상시킵니다.

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저자는 Universiti 푸 트 라 말레이시아의 지원을 하 고 싶습니다.

참고: 모든는 화학과 생 화 확 적인 시 약 사용 될 분석 등급의 고 추가 정화 없이 사용. 살 균 이온된 수를 사용 하 여 모든 솔루션을 준비 합니다. 오토 클레이 브 살 균 전에 모든 유리.
주의: 사용 하십시오 모든 적절 한 안전 관행 공학적 통제 (연기 후드, 글러브)의 사용을 포함 하 여 실험실 활동을 수행할 때 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 외 투, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발)입니다.
1. 제조 및 특성의 수정 전극 PLA AuNPs를 사용 하 여
<ol><li>
준비 및 PLA AuNPs의 특성화
	<ol>
<li>빨리 끓는 수성 chloroauric 산 성 솔루션 (1 mM) 100 mL를 나트륨 구 연산 염 해결책 (38.8 m m)의 10 mL를 추가 하 고 주위 온도 아래로 냉각. 준비 된 AuNPs 솔루션는 노란색, 거 무스 름 한 변경으로 시작 되 고 마지막으로 어두운 루비 빨간색으로 끝나는 색상의 변화를 관찰 합니다.</li>
		<li>PLA 펠 릿 용 해 공정에 대 한 스테인레스 스틸 몰드에 놓고 10 분 따라 눌러 절차와 190 ° C의 온도에 그들을 예 열: PLA 시트 준비의 일환으로 1 분에 대 한 2.2 MPa의 압력에서 그들을 넣어. PLA 시트는 약 3 시간 냉각 후 사용 하기 위해 준비가 될 것입니다.</li>
		<li>적극적으로 교 반, 실 온에서 클로 프롬의 5 mL에 PLA 시트의 0.68 mg 분해. 이전 준비 AuNPs 솔루션의 10 mL와 함께 녹아 PLA를 혼합 하 고 균질 실내 온도에 그것을 저 어. 균질 혼합물 다음 PLA AuNPs로 표시 될 수 있습니다 하 고 UV-마주, XRD, TEM, 및 FESEM EDX에 사용 특징.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
준비 및 수정된 모티브로 탄소 전극의 특성 참고:이 연구에 사용 된 SPCE 구성 3 전극 시스템: 카운터 전극, 탄소 작업 전극과 Ag/AgCl 기준 전극.<ol>
<li>빠르게 SPCE 그리고 공기에 PLA AuNPs의 동질적인 솔루션의 피 펫 25 µ L 24 h 사용 전에 건조.</li>
		<li>수정 된 전극의 화학적 특성 SPCE/PLA-AuNPs, 칼륨 페로 시안 화물에 (K3[Fe(CN)6]3/4-) 활성 표면적, 전기 화학 임피던스 분광학, 반복성, 측정 하 재현성, 고 안정성30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발
<ol><li>
조사 준비 참고: ssDNA 프로브 및 보완 DNA 시퀀스는 생물 공학 정보 (NCBI) 데이터베이스에 대 한 국립 센터에서 정보에 따라 선정 됐다.<ol>
<li>다음 시퀀스에 따라 상업 실험실에서 동결 건조 된 분말 합성 oligonucleotides (20-메 르 ssDNA 프로브, 20-메 르 보완 DNA, 20-메 르 일치 하지 않는 DNA와 21-메 르 비 보완 DNA)를 구입: thiolated ssDNA 프로브: 5 '-/ 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG-3 보완 DNA: 5 '-CAGTGCTTCTGCATAATCCG-3 한 기반 일치 하지 않는 DNA: 5-CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG-' 3 ' 3 자료 일치 하지 않는 DNA: 5-CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG-' 3 ' 비 보완 DNA: 5 '-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-3</li>
		<li>솔루션을 사용 하는 살 균 테 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), 분석 부분으로 나누어 모든 oligonucleotides (100 µ M)의 재고 솔루션을 준비 합니다. -4 ° C에 보관 한 다음 적절 한 희석 그냥 사용 하기 전에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
동원 정지 및 교 잡의 최적화 참고:는 SPCE PLA AuNPs, SPCE/PLA-AuNPs로 표시로이 연구를 위해 사용 되었다 고 드롭 주조 방법은 DNA 동원 정지 및 교 잡에 대 한 사용 되었다.<ol>
<li>첫째, SPCE/PLA-AuNPs에 thiolated ssDNA 조사의 25 µ L를 무력화 하 고 공기 건조 실 온에서 24 h 이후 그것은 것입니다 수 마지막으로로 표시 SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. 세 가지 요소를 사용 하 여 동원 정지 조건의 최적화를 결정: ssDNA (0.2에서 1.4 µ M에 배열 되는), (에서 30 210 분), 시간 및 온도 (25에서 75 ° C에 배열 되는)의 농도.</li>
		<li>SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 후 그것은 수 수 마지막으로로 표시 SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA 교 잡 이벤트 수행의 표면에 보완 DNA의 25 µ L 플라스틱 (5에서 30 분에 배열 되는) 시간 및 온도 (25에서 75 ° C에 배열 되는)의 두 요소를 통해 교 잡 조건의 최적화를 결정 합니다.</li>
		<li>담가 고정 30 분에 대 한 20 µ M MB에에서 교배 전극을 제거 0.5 m ABS 세척 하 여 비 특히 흡착된 DNA와 초과 MB/20 mM NaCl (pH 4.5)과 다음으로 rinsing 저온. 측정 피크 전류 DPV 기술을 사용 하 여 MB 감소 합니다. DPV 측정 0.1 M PBS (pH 7)를 사용 하 여 실행 없음 표시기를 포함 하.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
조작된 DNA 바이오 센서의 특성
	<ol>
<li>30 분 동안 20 µ M MB에에서 SPCE/PLA AuNPs를 담가, 0.5 M ABS/20 m m NaCl (pH 4.5), 세척 하 고 이전에 측정 이온을 제거 된 물으로 씻어. 프로브 DNA, 보완 DNA, 일치 하지 않는 DNA 및 비 보완 DNA 샘플을 포함 하 여 모든 상호 작용에 대 한 비슷한 절차를 따릅니다.</li>
		<li>전기 화학 감소를 측정 합니다. 참고: DPV 인터페이스 소프트웨어와 상업적으로 제조 된 Autolab를 사용 하 여 측정 했습니다. 0.005 V, 0.05 V의 진폭을 변조 하 고 0.1 M PBS (pH 7)에서 7.73 mVs-1 의 스캔 속도의 잠재적인 단계 V, 0.25-0.5 V에서에서 배열 하는 잠재력에서 MB 전기 화학 감소의 DPV 측정 없음 표시기 포함. 선택도, 감도, 재현성, 및 조작된 DNA 바이오 센서의 열 안정성 더 공부 했다. 보고 결과 3 개의 복제에으로 평균 값 측정을 제시 했다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 실제 샘플을 사용 하 여 조작된 DNA 바이오 센서의 유효성 검사
<ol><li>세균성 긴장의 준비
	<ol>
<li>해산물31,32 의 그들의 중요 한 오염에 따라 세균 샘플을 선택 합니다. 참고: parahaemolyticus V. 참조 긴장 및 다른 8 세균성 긴장 (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, 살 모 넬 라 typhimurium, 살 모 넬 라 장 염, Klebsiella 폐 렴으로 병원 성 대장균 O157:H7, 균 cereus및 비 브리 오 alginolyticus) 일반적인 식중독의 병원 체는이 연구에서 전기 화학 DNA 바이오 센서 유효성 검사에 대 한 고용 했다.</li>
		<li>문화 조건에 대 한 표 1 을 참조 하십시오 그들의 생존을 유지 그들의 각각 agar에 세균성 긴장의 일상적인 하위 문화 2 주마다를 수행 합니다.</li>
		<li>글리세롤 동결 과정에서 그들을 손상 시킬 수 있는 얼음 결정의 형성을 방지 하 여 박테리아를 보호-80 ° C에서 20% (v/v) 글리세롤에 포함 된 그들의 각각 성장 broths에 세균성 긴장의 장기 보존을 유지 합니다. 다음으로, 각각 broths로 글리세롤 주식에 보존 된 세균성 세포 배양의 루프를 예방. 박테리아를 부활 해야 하는 때 그들의 각각 성장 시간과 온도 따라 broths을 품 어.</li>
		<li>희석의 시리즈에서 파생 된 미생물을 열거 하기 위한 확산 플레이트 기술33, 표준 및 잘 알려진 방법을 사용 하 여 parahaemolyticus 대 셀의 수량을 결정 합니다.<ol>
<li>Parahaemolyticus V. Trypticase 간장 국물에 문화 (TSB + 3 %NaCl) 140 rpm 진동 상태에서 37 ° C에서. 다음, TSB + 3%의 9 mL에 박테리아 세포 배양의 1ml를 전송 NaCl 10-1 희석 비율을 얻을.</li>
		</ol>
</li>
		<li>9 번 10-10 희석 비율의 전체 시리즈를이 단계를 반복 합니다. 다음으로, 식민지 세 고, 각각에 대 한 브리의 선택적 천 배지에 0.1 mL (10-1 에서 10-10에 시작 되는) 각 희석 비율의 확산. 24 h에 대 한 37 ° C에서 incubated 접시를 품 어.</li>
		<li>식민지 카운터를 사용 하 여 개별 식민지를 계산 하 고 다음 다시-수를 계산 (CFU/pipetted 양 희석 요인 x) 밀리 밀도 (CFU mL-1) 당 콜로 니 형성 단위를 얻을 수 있습니다. CFU mL-1 흡 광도 대 한 교정 줄거리에서 박테리아 세포 정지에서 단위 (CFUs)를 형성 하는 식민지의 농도 파생 시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR 분석 실험의 준비
	<ol>
<li>삶은 세포 절차34다음 변경 된 게놈 DNA 추출 합니다. 첫 번째, 행진 개별 박테리아 스트레인 agar 미디어에 고 국물 미디어, 그것의 상대 성장 상태, 상태를 떨고 140 rpm에서 잠복기 뒤에 접종</li>
		<li>마이크로 원심 튜브로 국물의 1 mL 문화를 플라스틱. 4830 x g와 펠 릿을 얻기 위해 1 분에 4 ° C에서 원심이. 무 균 테 버퍼의 약 500 µ L를 사용 하 여 펠 릿으로 다시 중단. 98 ± 2 ° C가 열 블록에서에 10 분에 대 한 결과 정지를 누른 즉시 lyse 세포와 DNA를 풀어 10 분-18 ° C에서 그것을 진정.</li>
		<li>4830 x g와 명확한 정지는 상쾌한 추가 사용 하기 위해-20 ° C에서 유지 하는 3 분 4 ° C에서 게놈 DNA를 원심. Biophotometer 측정을 사용 하 여 260의 파장에서 자외선 흡수와 (빛의 파장을 흡수 하는 핵 산)으로 nm 및 280의 파장에 또한 nm (단백질 흡수 하는 빛의 파장)으로 농도 추출의 순도 결정 하 게놈 DNA 다음 표준 생 화 확 적인 분석 실험35 를 사용 하 여 그리고 16S rRNA 유전자 시퀀싱36여 확인 모든 긴장을 식별. 마지막으로 2 분 동안 92 ° C에서 게놈 DNA를 변성 하 고는 바이오 센서에 응용 프로그램 전에 얼음 물에 급속 하 게 냉각.</li>
		<li>더 parahaemolyticus 대 존재 확인 toxR 유전자를 타겟으로 PCR를 사용 하 여. Thermocycler 뇌관 쌍 (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3'와 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3')를 사용 하 여이 절차를 수행 합니다. 메 마른 물 (15.5 µ L), 버퍼 (5 µ L), 뇌관 (1 µ L, 10 µ M), dNTP 믹스 (1 µ L), DNA 템플렛 (2 µ L), 및 Taq DNA 중 합 효소 (0.2 µ L, 10 x)으로 구성 된 25 µ L 양의 총 반응에서 PCR 증폭을 최적화 합니다.</li>
		<li>구성 요소를 잘 믹스 하 고 증폭의 30 주기 위한 프로그램 thermocycler에 대상 시퀀스의 PCR 증폭을 정렬. 우리의 연구에서 각 주기 구성 3 단계 반응 , 즉., 변성 (94 ° C, 1 분), 어 닐 링 (63 ° C, 1.5 분) 및 확장 (72 ° C, 1.5 분), 최종 확장 (72 ° C, 7 분) 뒤의 30 사이클 이어서 초기 변성 (94 ° C, 3 분).</li>
		<li>증폭된 제품 및 그들의 크기에 1.5 %agarose 젤 전기 이동 법을 통해 확인 합니다. 상업적으로 생산된 젤-문서 시스템 젤 이미지를 캡처하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>코 클 샘플의 준비
	<ol>
<li>신선한 샘플을 얻습니다. 참고: 우리의 신선한 새 조개 (Anadara granosa) Serdang, Selangor, 젖은 시장에서 얻은 고 신속 하 게 분석을 위한 아이스 쿨러 상자에 실험실에 가져온. 2 그룹, 즉 치료 및 치료 그룹을 cockles 수확 했다 균일 하 게 추수의 시작에서 냉장으로 배치까지 가정으로 샘플을 나눕니다.</li>
		<li>사전-20 ° C 24 h, 20 ° C 4 h 이전 DNA 추출에서 UV 빛에 노출에 의해 뒤에서 그들을 저장 하 여 대우 그룹 cockles 취급. 참고: 동결 온도 자외선 노출을 사용 하는 제어에 대 한 그룹 죽이기 또는 적어도 자연스럽 게 축적 parahaemolyticus 대 cockles에 제한. 이 연구에서 제어 상태의 목표 신선한 새 조개의 실제 상황을 모방 하는 70 ° C의 높은 저온 살 균 법 체제를 적용 되지 않습니다. 한편, 그들은 실험실에 도착 하자마자 사전 치료 없이 치료 그룹에서 직접 샘플을 분석 합니다.</li>
		<li>Subculture parahaemolyticus 대 17802 TSB에 ATCC의 변형 (3 %NaCl). TSB의 적절 한 희석의 도금을 통해 inoculum 가능한 셀의 수준을 결정 (3 %NaCl) 104 CFU mL-1 parahaemolyticus 대의 inoculum을 얻으려면 CA에. 증류수에 각 코 클 워시와 껍질에서 조직 제거를 층 류 캐비닛에 소독 집게를 사용 하기 전에 흙의 무료 잡 목.</li>
		<li>살 균 TSB의 90 mL에 균질 화기와 약 10 g 코 클 조직 샘플의 균질 (3 %NaCl) 60에 대 한 s. 추가 아군된 샘플에 대 한 무 균된 샘플 국물의 9 ml parahaemolyticus 대 의 알려진된 금액. Unspiked 샘플을 사용 하 여 부정적인 컨트롤. Parahaemolyticus 대 CA에 샘플의 0.1 mL를 도금 하 여 코 클 샘플에 아군의 셀 개수를 추정 고 이후, microcentrifuge 튜브에 dna 샘플의 1 mL를 pipetting 추출, 바이오 센서 및 PCR 분석 실험에 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>변경 된 다음 아군 및 unspiked 샘플에서는 parahaemolyticus 대 의 게놈 DNA 추출 삶은 세포 절차36. DNA 농도 및 순도 바이오 광도 측정을 사용 하 여 260의 파장에서 자외선 흡수와 마지막으로, 결정 (빛의 파장을 흡수 하는 핵 산)으로 nm 및 280의 파장에 또한 nm (단백질 흡수 하는 빛의 파장)으로.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 없다.

전기 화학 바이오 센서의이 종류의 성공적인 개발을 위한 프레임 워크의 중요 한 단계는 핵 산 (DNA 여기); 변환기에 대 한 적절 한 생물학적 인식 요소 선택 트랜스듀서;의 감지 레이어를 생성 하기 위한 화학 접근 변환 자료; 최적화 DNA 동원 정지 및 교 잡; 그리고 실제 예제를 사용 하 여 개발 된 바이오 센서의 유효성 검사.
민감하고 선택적 전기 화학 DNA 바이오 센서의 성공적인 개발을 코어, immobilization와 교 잡 조건의 최적화입니다. 이 작품에서는, 우리는 복잡 한 산화로 MB를 사용. MB-DNA 상호 작용의 다양 한 원리는: (i) ssDNA와 dsDNA;의 인산 염 등뼈 음이온 혐의로 MB 양이온 책임의 정전기 상호 작용에 의해 (ii)에 의해 번갈아 dsDNA;에 G-C 기본 쌍 사이의 MB의 성공적인 삽입을 통해 MB 윤 (iii)에 의해 대상 ssDNA의 끝에 공유 결합, 생성 낮은 레이블 밀도 (하나 또는 두 개의 메가바이트 분자 DNA 가...

최근 몇 년 동안에서 공공 및 과학적인 논쟁의 주요 주제, 식중독은 주로 3 에이전트와 관련 된: 미생물1, 화학2및 기생충3. 오염 된 음식 인간, 약한 면역 체계, 노인, 임신 여성, 아기, 그리고 어린 아이4에 그들의 더 높은 위험 그룹에서 특히 심각한 건강 결과 일으킬 수 있습니다. 아프리카, 아시아 및 라틴 아메리카에서 5 세 미만의 어린이에서 매년 발생 하는 급성 설사의 경우에 이상 백만, 식중독 주요 글로벌 질병5,6 와 세계 보건 기구 설립 7가장 중요 한 기여자 서의 미생물 비 브리 오 parahaemolyticus 가장 널리 인정 된 악성 종자 들 눈에 띈다. 그램 음성 박테리아는 높은 소금 환경에서 활성화 되 고 부적당 하 게 요리, 분실 또는 원시 해양에 먹을 때 심각한 인간의 위장염은 일반적으로 해안, 강어귀, 및 해양 환경8에서 발견, 제품9. 또한, 기존의 의료 조건을 어떤 사람들 그들을 상처 감염, 패 혈 증 또는 귀 감염 parahaemolyticus 대10에서 발생 하는 경향이 확인. Parahaemolyticus 대 hemolysins의 독성 요인 질병 병 인에 기여 하는 2 가지의 유형으로 분할 된다: 내 직접 hemolysin (TDH) tdh 유전자에 의해 코딩 및 TDH 관련 hemolysin trh 유전자11에 의해. V. parahaemolyticus 의 독성 마커 (tdh와 trh 유전자)는 주로 환경 표본 보다 임상 표본에서 발견 됩니다.
Parahaemolyticus 대 보유 하 고 광범위 한 조건에서 살아남을 수 신속 하 게 환경 변화12응답. 그것의 확산 메커니즘의 독성 세포 대량13와 병렬로 증가 위험 잠재력을 에스컬레이션 합니다. 심지어 최악의 경우, 기후 변화 이러한 박테리아 그들의 세포 인구 성장14를 가속 화 하기 위해 충분 한 조건을 제공 합니다. 그것의 높은 주파수로 인해 parahaemolyticus 대 감시 될 필요가 식품 공급망의 무역 및 해산물 제품 이기 때문에 그들은 거 대 한 수량15,16 에서 발견의 생산에서 특히 따라 통해 세계. 현재 박테리아 식별 및 생화학 테스트, 농축 및 선택적 미디어17, 매 효소 연결 된 immunomagnetic를 포함 하 여 방법의 범위를 사용 하 여 절연 시험 (ELISA)18, 펄스 분야 젤 전기 이동 법 (PFGE) 19, 라텍스 교착 테스트, 그리고 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 시험20. 이러한 메서드는 일반적으로 자격 갖춘된 직원, 정교한 계기 및 힘 드는 기법을 즉시에 오염에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다 필요 합니다. 이 심각 하 게 유해한 오염 및 현장 응용 프로그램을 신속 하 게 감지 가능성을 제한 합니다. 빠른 검색 도구는 뛰어난 도전 남아 있습니다.
시간 절약, 비용 효과적인, 실용적인, 그리고 실시간 분석 방법21,,2223,24 제공 하기 때문에 바이오 센 싱은 foodborne 병원 체의 검출을 위한 유망 옵션으로 나오고 . 그러나, 비록 아군된 샘플 및 바이오 센서를 사용 하 여 표준 솔루션 분석 탐지의 많은 긍정적인 결과 왔다, 있다 아직 수성 혼합물 또는 유기농 추출 물25실제 샘플에 적용 하는 연구의 부족. 최근에, 직접 및 간접 deoxyribonucleic 산 (DNA) 탐지를 사용 하 여 전기 화학 바이오 센서 교 잡 이벤트26 를 통해 보완 대상의 그들의 특정 탐지 때문에 과학자 들 사이에서 증가 관심 받은 , 27 , 28 , 29. 이러한 독특한 접근은 소형화 및 상용화 유망 기술에 따라서 제공 하 고, 효소 기반 바이오 센서에 비해 더 안정. 연구의 대상 보고 여기 parahaemolyticus 대 높은 선택도, 민감도, 실용성, 교 잡 동안 DNA 순서 특이성에 따라 검색할 수 있는 빠른 도구를 생성 하는. 식별 전략 교 잡 표시기, 메 틸 렌 블루 (MB)의 존재 polylactic 산 안정 금 나노 입자 (PLA-AuNPs)30 및 모티브로 탄소 전극 (SPCEs)의 조합을 포함 한다. 개발 된 탐지 구성의 잠재력 추가 박테리아 DNA lysate와 신선한 코 클 샘플을 사용 하 여 탐구 된다.

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>Merck</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Diaminoethane tetraacetic acid</td><td>Promega</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>이염기성 인산나트륨&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>디소듐 수소 인산</td>염 <td>Sigma-Aldrich</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>에탄올&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Gold(III) chloride trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>Monobasic sodium phosphate, monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>폴리(젖산) 수지, 상업용 4042D</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>R& M Chemicals</td><td>59435</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소</td>칼륨 <td>시그마-알드리치</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>헥사시아노페레이트 칼륨 III</td><td>R& M 화학 물질</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨 무수 염</td><td>시그마 -알드리치</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>염화</td><td>나트륨 시그마 알드리치</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>구연산 트리소듐</td><td>시그마-알드리치</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>트리스 (하이드 록시 메틸) 아미노 메탄</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>이중 염료가 포함된 2X PCR 마스터 믹스</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>아가로스 젤</td><td>Merck</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Agar</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Broth</td><td>Merck</td><td>100079</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Vibrio</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>Eosin 메틸렌 블루 한천&nbsp;</td><td>Merck</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Merck</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq 버퍼</td><td>Promega</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>로딩 염료 100 bp DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>로딩 염료 1kb DNA ladder</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>Promega</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>만니톨 달걀 노른자 폴리믹신 한천</td><td>머크</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>맥콩키 한천</td><td>머크</td><td>105465</td><td></td></tr><tr><td>영양 육수</td><td>머크</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>타크 중합효소</td><td>머크</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>트립티케이스 소이 육수</td><td>머크</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>트립티케이스 소이 한천</td><td>머크</td><td>105458</td><td></td></tr></tbody></table>

foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 dna 바이오 센서의 개발

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

(대 parahaemolyticus) 브리 parahaemolyticus 크게 인간의 사망률과 질병 률의 속도 영향을 미치는 보건 문제의 큰 비율에 세계적으로, 기여 일반적인 foodborne 병원 체 이다. 문화 기반 방법, 면역학 분석 실험, 분자 기반 방법 등 parahaemolyticus 대 의 검출을 위한 일반적인 방법 복잡 한 샘플 처리를 요구 하 고, 지루한, 시간과 비용이 많이 드는 있습니다. 최근, 바이오 센서는 빠른 검색, 비용 효율성, 실용성의 장점으로 유망 하 고 포괄적인 탐지 방법으로 입증 했습니다. 이 연구는 높은 선택도 및 DNA 교 잡의 원리를 사용 하 여 감도 parahaemolyticus 대 감지 하는 빠른 방법 개발에 중점을 둡니다. 작업, 합성된 polylactic 산 안정 금 나노 입자 (PLA-AuNPs)의 x 선 회절 (XRD), 자외선 보이는 분광학 (UV-Vi), 전송 전자 현미경 (TEM), 필드-방출을 사용 하 여 달성 되었다 스캐닝 전자 현미경 검사 법 (FESEM), 그리고 주기적 Voltammetry (CV). 우리는 또한 추가 안정성, 감도, 및 PLA AuNPs의 재현성의 테스트 실시. 우리는 PLA AuNPs 수성 해결책에서 안정 된 나노 입자의 소리 구조 형성을 발견. 우리는 또한 감도 작은 충전 전송 저항 (Rct) 값과 활성 표면적 (0.41 c m2)의 증가 결과로 향상 된 관찰. 우리의 DNA 바이오 센서의 개발은 PLA AuNPs와 redox 표시기로 메 틸 렌 블루 (MB)를 사용 하 여 모티브로 탄소 전극 (SPCE)의 수정에 근거 했다. 우리는 차동 펄스 voltammetry (DPV)에 의해 동원 정지 및 교 잡 이벤트를 평가. 보완, 보완, 우리 그를 발견 하 고 일치 하지 않는 oligonucleotides 특별히 조작된 바이오 센서에 의해 수훈이 있었다. 그것은 또한 다양 한 식품을 매개로 병원 체에 대 한 분 연구 하 고 신선한 cockles parahaemolyticus 대 의 식별에 안정적으로 민감한 탐지를 보여주었다.

AuNPs의 형성 나트륨 시트르산 존재와 용액의 색깔에서 변화를 통해 밝혀졌다. 이 깊은 루비 레드 빛 노란색에서 변경 하려면 색상을 발생 합니다. PLA AuNPs의 세대 표면 플라스몬 공명 (SPR) 피크의 성장 약 540에서 발견 됐다 대 한 UV 스펙트럼 (그림 1)에서 확인 되었다 nm. 형성 및 PLA AuNPs의 존재는 입자 크기37에 따라 500-600 nm 파장 범위에 표시 했다. AuNPs 및 PLA AuNPs의 XRD 패턴은 그림 2에 표시 됩니다. 모든 crystallite 봉우리 31.7, 38.2, 44.4, 64.7, 77.7 °의 2θ에서 관찰 되었다. 그들은 (100) (111) (200) (220)에 기인 했다 입방 FCC (얼굴 중심 입방) 금 (311) 결정학 비행기 (금속) nanost...

브리 parahaemolyticus 감지 polylactic 산 안정, 금 나노 입자 수정, 모티브로 탄소 전극으로 구성 된 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

Foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

식품 매개 병원체는 전 세계적으로 공중 보건 문제의 많은 부분을 차지하며, 이는 인간의 사망률과 이환율에 큰 영향을 미칩니다. 식품 매개 병원균을 검출하기 위한 기존의 방법은 복잡한 시료 처리가 필요하고 시간이 많이 걸립니다. 최근 바이오센서는 빠른 검출과 실용성의 장점을 갖춘 유망하고 포괄적인 검출 방법으로 입증되었습니다.바이오센서의 개발은 폴리락트산 안정화 금 나노입자를 사용한 변형된 전극을 기반으로 합니다. 스크린 인쇄 된 탄소 전극은 작동 전극 활성 표면적을 증가시키기 위해 수정되었습니다. 산화 환원 복합체로 사용되는 메틸렌 블루는 고정된 프로브 DNA의 단일 가닥 DNA와 강한 결합을 가지고 있습니다.이러한 높은 친화력의 관계는 높은 피크 전류로 표현됩니다. 단일 가닥 DNA와 상보적 서열의 혼성화는 결합된 메틸렌 블루 분자를 대체하여 차동 펄스 전압전류계의 전류를 감소시킵니다. 이는 상보적인 이중 가닥 DNA가 있는 변형된 전극의 표면에 더 적은 양의 메틸렌 블루가 모였기 때문일 수 있으며, 이는 구아닌 염기 간의 도달할 수 없는 상호 작용으로 인해 발생했습니다.준비된 용액의 색상은 노란색에서 거무스름한 색으로, 마지막으로 짙은 루비 레드로 바뀝니다. 이것은 금 염이 구연산염 이온에 의해 감소되었음을 나타냅니다. 용해된 폴리락트산을 미리 제조된 금 나노입자 용액과 혼합한 후 실온에서 균일하게 교반한 후 폴리락트산 안정화 금 나노입자로 표시하였다.자외선 가시 분광법, X선 회절, 투과 전자 현미경 및 에너지 분산 X선 분광법을 사용한 전계 방출 주사 전자 현미경을 사용하여 폴리락트산 안정화 금 나노 입자를 특성화했습니다. 약 25 마이크로 리터의 폴리 락트산 안정화 금 나노 입자의 균질 한 용액을 스크린 인쇄 탄소 전극에 신속하게 피펫으로 넣고 사용하기 전에 24 시간 동안 공기 건조시켰다. 그런 다음 변형된 전극을 페로시아나이드칼륨에서 전기화학적으로 특성화하여 활성 표면적, 전기화학적 임피던스 분광법, 반복성, 재현성 및 안정성을 측정했습니다.고정 상태의 최적화는 0.2 - 1.4 마이크로몰 범위의 단일 가닥 DNA의 농도, 30 - 220분 범위의 시간, 섭씨 25 - 75도 범위의 온도의 세 가지 요소를 사용하여 결정되었습니다. 한편, 혼성화 조건의 최적화는 5분에서 35분 사이의 시간과 섭씨 25도에서 75도 범위의 온도라는 두 가지 요소를 통해 결정되었습니다. 처리된 변형된 전극을 이어서 20마이크로몰 메틸렌 블루에 30분 동안 침지시켰다.비특이적으로 흡수된 DNA와 과량의 메틸렌 블루를 pH 4.5의 식염수 아세테이트 완충액으로 세척하여 제거한 후 탈이온수로 헹궈냈다. 메틸렌 블루 환원의 피크 전류는 차동 펄스 전압 주사법 기술을 사용하여 측정되었습니다. 차동 펄스 전압주사법 측정은 지표가 없는 인산염 완충액 식염수 pH 7.0을 사용하여 실행되었습니다.모든 상호 작용에 대해 유사한 절차가 수행되었습니다. 본 연구에서는 Vibrio parahaemolyticus를 참조 균주로 사용하고 8개의 다른 박테리아 균주, 즉 캄필로박터 제주니, 리스테리아 모노사이토제네스, 살모넬라 티피무리움, 살모넬라 장염, 폐렴간균, 대장균 O157:H7, 바실러스 세레우스 및 비브리오 알기놀리티쿠스를 사용하여 일반적인 식품 매개 병원체를 전기화학적 DNA 바이오센서 검증에 사용했습니다. 각각의 한천에 대한 박테리아 균주의 일상적인 하위 배양은 생존력을 유지하기 위해 2주마다 수행되었습니다.Vibrio parahaemolyticus 세포의 수량은 스프레드 플레이트 기법을 사용하여 측정되었습니다. 1mm의 박테리아 세포 배양을 3%염화나트륨을 함유한 9mm의 트립티아제 콩 육수에 옮겨 10의 희석 계수를 얻었습니다. 다음으로, 10 배 희석 계수에서 10 배 희석 계수로 시작하는 각 희석 계수 0.1 ml를 각각 CHROMagar Vibrio의 플레이트에 펴서 콜로니 계수를 수행하였다.새조개는 재래시장에서 얻은 다음 분석을 위해 얼음 냉각기 상자에 담아 실험실로 신속하게 가져왔습니다. 새조개는 두 그룹으로 나뉘었는데, 하나는 새조개가 수확 시작부터 시장의 냉장 보관실에 보관될 때까지 균일하게 수확되었다는 가정하에 처리된 그룹과 처리되지 않은 그룹이었습니다. 투여군의 새조개는 영하 20도에서 24시간 동안 보관한 후 DNA 추출 전 4시간 동안 섭씨 영하 20도의 자외선에 노출시켜 전처리했습니다.대조군에 사용된 영하의 온도와 자외선 노출은 새조개에 자연적으로 축적되는 식인성 병원체를 죽이거나 최소한 제한할 것으로 예상되었습니다. 섭씨 70도의 더 높은 저온 살균 요법은 적용되지 않았는데, 이 연구에서 통제된 조건의 목적은 신선한 새조개의 실제 상황을 모방하는 것이었기 때문입니다. 한편, 처리되지 않은 그룹의 샘플은 실험실에 도착하자마자 전처리 없이 직접 분석했습니다.새조개는 증류수로 세척하고 먼지를 제거한 후 멸균 집게와 층류 캐비닛을 사용하여 껍질에서 조직을 제거했습니다. 약 10g의 새조개 조직 샘플을 3% 염화나트륨을 함유한 19ml의 멸균 트립티케이스 대두 육수에 균질기로 60초 동안 균질화했습니다. 그런 다음 스파이크된 샘플을 위해 균질화된 샘플 배지 9mm에 알려진 양의 식품 매개 병원체를 첨가했습니다.스파이크가 없는 샘플은 음성 대조군으로 사용되었습니다. DNA 시료 추출을 위해 약 1ml의 시료를 Eppendorf 튜브에 피펫으로 주입했으며, 이는 바이오센서 및 중합효소 연쇄 반응 분석에 사용됩니다. 그런 다음 스파이크가 있는 샘플과 스파이크가 없는 샘플에서 식품 매개 병원체의 게놈 DNA를 추출했습니다.게놈 DNA는 변형된 끓인 용해 절차에 따라 추출되었습니다. 게놈 DNA는 명확한 현탁액을 얻기 위하여 12, 4 섭씨 온도에 3 분 동안 분 당 000 교체에 원심 분리되고 상등액은 더 사용을 위한 영하 20 도에 유지되었다. 추출된 게놈 DNA의 농도와 순도를 결정하기 위해 생체 광도계를 사용했습니다.그런 다음 표준 생화학 분석을 사용하여 모든 균주의 식별을 결정하고 16 SR RNA 유전자 염기서열 분석을 통해 검증했습니다. 마지막으로, 게놈 DNA를 섭씨 92도에서 2분 동안 변성시키고 바이오센서를 적용하기 전에 얼음물에서 급속 냉각시켰습니다. 식품 매개 병원체에 대한 추가 확인은 해당 유전자를 표적으로 하는 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 수행되었습니다.증폭된 산물과 그 크기는 1.5% 아가로스 겔에 대한 전기영동을 통해 결정되었습니다. 겔 이미지는 겔 문서화 시스템을 사용하여 캡처했습니다. 폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 생성은 자외선 가시 스펙트럼에서 확인되었으며, 표면 플라즈마 및 공명 피크의 성장은 약 540 나노 미터에서 발견되었습니다.폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 형성 및 존재는 입자 크기에 따라 500-600 나노 미터 파장 범위에서 표시되었습니다. 폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 모든 결정립 피크는 31.7, 38.2, 44.4, 64.7 및 77.7도의 두 극장에서 관찰되었습니다. 더 넓은 회절 피크가 31.7도에 진입함에 따라 결정립 피크 강도도 증가했는데, 이는 차가운 나노 입자가 폴리락트산에 내장되어 있음을 암시하고 다상 금 나노 구조의 형성을 암시합니다.투과 전자 현미경 입자 분포 곡선과 폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 이미지에서 금 나노 입자가 거의 구형임을 알 수 있습니다. 나노 입자의 크기는 약 37 나노 미터 범위였으며, 이는 Scherrer의 공식에서 얻은 것보다 약간 더 크며, 합성된 나노 입자의 다결정 특성을 시사합니다. 폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 주요 크기는 100 Bragg의 반사 너비를 결정하여 Sherrer 방정식을 사용하여 계산되었습니다.표에서 폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 결정립 크기는 27나노미터로 계산되었습니다. 전계 방출 주사 전자 현미경 이미지와 에너지 분산 X선 스펙트럼을 사용하여 수정된 스크린 인쇄 탄소 전극은 금의 중량 비율이 가장 높고 밀도가 가장 높으며 나노 입자 적용 범위가 가장 컸습니다. 에너지 분산 형 X 선 스펙트럼은 생성 된 폴리 락트산 안정화 금 나노 입자가 금으로만 구성되어 있으며 탄소와 산소에 해당하는 피크를 제외하고는 다른 원소가 없음을 확인했다.양극 및 음극 피크 전위는 서로 다른 스캔 속도에서 일관되었으며, 이는 전기화학 반응이 피크 분리를 기반으로 가역적임을 시사합니다. 변형된 전극의 활성 표면적은 베어 전극과 변형된 전극에 대해 각각 0.26cm 제곱 및 0.41cm 제곱으로 계산되었습니다. 이 결과는 활성 표면적에서 폴리락트산 안정화 금 나노 입자에 의해 제공되는 개선이 베어 전극에 비해 상대적으로 더 높다는 것을 확인했습니다.베어 전극의 전하 전달 저항 값은 1, 932 옴 인 반면 수정 된 전극은 1, 444 옴으로 감소했습니다. 개질된 전극에서 전하 전달 저항 값의 감소는 국소 유전 상수의 감소 및/또는 전기 이중층의 두께 증가로 인해 발생했을 수 있으며, 이는 칼륨 페로시안화물이 금속 또는 용액 계면에서 흡수에 의해 기능했음을 시사합니다. 피크 전류는 폴리락트산 안정화 금 나노 입자를 사용하여 베어 전극을 수정함에 따라 점진적으로 증가했으며, 이는 더 높은 감도가 더 낮은 전하 전달 저항의 반대임을 보여주었습니다.변형 전극의 상대 표준 편차는 4.26%로 도출되었으며, 폴리락트산 안정화 금 나노 입자 변형이 있는 전극은 여러 측정 후에 더 나은 상대 표준 편차를 제공했습니다. 변형된 전극에 대한 상대 표준 편차 값은 4.05%이며, 이는 폴리락트산 안정화 금 나노 입자에 대한 전극 제조의 더 나은 재현성을 나타냅니다. DNA의 최적 농도는 1.2 마이크로몰 단일 가닥 DNA였습니다.단일 가닥 DNA의 최적 고정 시간은 180분으로 선택되었습니다. 단일 가닥 DNA의 최적 고정 온도는 섭씨 55도로 선택되었습니다. 이중 가닥 DNA의 최적 혼성화 시간은 10분으로 선택되었습니다.이중 가닥 DNA의 최적 혼성화 온도는 섭씨 35도로 선택되었습니다. 상보적 DNA는 프로브된 DNA, 비상보적 DNA, 3개의 염기 불일치 DNA 및 1개의 염기 불일치 DNA 중에서 0.73마이크로암페어의 가장 낮은 피크 전류를 나타냈습니다. 표적이 된 DNA의 높은 전류가 올리고뉴클레오티드의 다른 염기서열의 전류보다 작다는 것은 명백합니다.이 결과는 바이오센서를 사용하여 높은 민감도와 특이도로 구별할 수 있음을 나타냅니다. 구성된 DNA 바이오센서는 변형된 전극 표면의 고정된 프로브 DNA를 통해 혼성화 검출의 선택성을 가졌습니다. 수정된 전극에서 메틸렌 블루의 차동 펄스 전압전류, 피크 전류의 지속적인 감소는 상보적 DNA의 농도 증가의 결과로 유발되었습니다.다양한 타겟 DNA 농도 0.2 피코몰 - 0.02 밀리몰의 로그와 메틸렌 블루 환원 피크 전류의 로그 사이의 선형 상관관계는 0.96의 선형 회귀 계수로 표시됩니다. 제작된 DNA 바이오센서의 회수율은 6개월간의 저장 후 초기 신호의 80% 이상으로 서서히 감소하여 변형된 전극 표면의 단일 가닥 DNA 프로브가 매우 안정적임을 나타냅니다. 섭씨 45도 이하의 온도에서 우수한 장기 안정성은 폴리락트산 안정화 금 나노 입자와 단일 가닥 DNA 사이의 강한 반응의 원인일 수 있습니다.바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 대장균(Escherichia coli), 비브리오 알지놀리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 장염(Salmonella enteritis), 폐렴간균(Klebsiella pneumoniae), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 등 9종의 박테리아에 대한 중합효소 연쇄 반응 증폭 산물을 스크리닝했습니다. 교차 반응성 평가 후 얻은 차동 펄스 전압주사법 피크 전류는 다른 박테리아 종과 비교하여 Vibrio parahaemolyticus의 매우 명확한 검출을 보여줍니다. 염기쌍의 수를 줄임으로써 관찰된 차동 펄스 전압주사법 신호가 증가하는 것을 볼 수 있습니다.이것은 프로브까지 더 많은 양의 메틸렌 블루 분자와 관련이 있습니다. 중합효소 연쇄 반응 분석에서 Vibrio parahaemolyticus는 7, 8, 9, 10, 11 및 12열에서 볼 수 있듯이 처리된 샘플과 처리되지 않은 스파이크 샘플 모두에서 발견되었습니다. 반면, 1번, 2번, 3번, 4번, 5번, 6번 레인에서 처리된 샘플과 처리되지 않은 스파이크가 없는 샘플에는 Vibrio parahaemolyticus가 없었습니다.검출 결과는 개발된 DNA 바이오센서를 사용하여 스파이크가 있는 샘플과 스파이크되지 않은 샘플로 구성된 치료군에서 Vibrio parahaemolyticus의 존재를 성공적으로 측정했습니다. 이러한 결과는 이전에 논의된 중합효소 연쇄 반응 결과와 긍정적인 상관관계가 있습니다. 폴리락트산 안정화 금 나노 입자의 응용은 제조 감각을 더욱 높이기 위한 수정으로 적용할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.산화 환원 복합체가 혼성화되지 않은 생물 인식 분자와 더 강하게 결합할 때 높은 선택성을 달성할 수 있으며, 이는 후속 조치를 취할 가치가 있는 혁신일 수 있습니다.

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라벨없는 DNA의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩

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살 모 넬 라 종 /Shigella 종 설사에 기인 하는 일반적인 병원 체. 여기, 우리는 살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼을설명/Shigella 종 실시간 PCR를 사용 하 여 결합 가이드 문화.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

배우세요 전기화학 DNA 바이오센서를 개발하여 Vibrio parahaemolyticus 식품 매개 병원체를 신속하게 검출하는 방법을 익히세요. 금 나노입자와 폴리락틱산을 활용한 전극 개질 기술로 식품 안전 분야의 민감도와 선택성을 향상시킵니다.

Foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발

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