Name: 세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 형광 기반 기자 분석 결과 리 독 소에 필요한 체인 (RTA) 효 모에 인신 매매 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 학습하세요 리신 독소 A(RTA) 운반에 필요한 세포 구성 요소를 식별하는 형광 기자 분석법을 효모 모델에서 사용하는 방법을. 이 기법은 개별 유전자 효과를 빠르고 경제적으로 분석하여 리신 독소의 세포 내 작용 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

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이 연구의 부분을 친절 하 게 도이치 가운데 (SFB 1027, A6)에서 교부 금에 의해 지원 했다.

참고: 일반 실험 작업 과정에 대 한 개요는 그림 1에 묘사 된다.
주의: RTA 인 간에 대 한 매우 독성이 있다. 안전 연구소 권한 S2 (biosafety 수준 2에 해당)이 필요 합니다. 전체 실험 동안 장갑을 착용 합니다.
1. 분리 표현의 대장균 에서 RTA의 태그
<ol>
	<li>대장균 세포 식 플라스 미드 pET24-RTA(그의) 6 또는 표준 electroporation 프로토콜9,10를 사용 하 여 빈 벡터 pET24a(+) 로 변환 합니다. 셀 빈 플라스 미드를 포함 하는 부정적인 컨트롤 역할을 합니다.</li>
	<li>대 포함 (µ g/100ml) 파운드 플레이트에 긍정적인 클론의 선택, RTA 식 플라스 미드 또는 5 mL 파운드칸 매체 (파운드 매체 대의 100 µ g/mL와 함께)에 빈 벡터를 포함 하는 세포를 접종 하 고 37 ° C와 24 h에 대 한 220 rpm에서 품 어.</li>
	<li>5 mL 사전 문화 1 L 파운드칸 매체를 보충 하 고 셀에는 0.8-1.0 (대략 3-4 h)의 OD600 에 도달 했습니다 때까지 37 ° C 그리고 220 rpm에서 세포를 품 어. 그 후, 문화 온도 28 ° C를 줄이고 1 M H2o. 이소프로필-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 재고 솔루션의 준비</li>
	<li>1 m m의 최종 농도에 IPTG을 추가 하 여 대장균 의 RTA 식 유도.</li>
	<li>3.5 h 28 ° C 그리고 220 rpm 10000 x g와 10 분, 4 ° C에서 원심 분리 하 여 수확 셀 후 씻어 두 번 바인딩 버퍼 (500 mM NaCl, 10mm 이미, 및 20 m m KH2포4 의 5 mL와 펠 릿 pH = 7.4) 10000 x g와 10 분, 및 5 mL 바인딩 버퍼 펠 릿 resuspend 4 ° C에서. 참고: 프로토콜이이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다 고 셀 몇 일 동안 80 ° C에 저장 될 수 있습니다.</li>
</ol>
2. 정화 친화성 크로마토그래피를 통해 그의 태그 RTA의
<ol>
	<li>얼음 다음 프로토콜을 사용 하 여 셀 sonicate: 15 s 펄스 (20 미크론), 30 s 일시 중지. 5 번이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>세포 lysate 21000 x g와 15 분 동안 4 ° C에서 원심 고 상쾌한 멸 균 주사기 필터 시스템 (0.2 µ m 기 공 크기)를 사용 하 여 필터링 합니다. 참고: 성공적으로 sonicated 샘플의 펠 릿 셀 투명 한 테두리를 표시합니다.</li>
	<li>Ni2 +5 mL를 갖춘 자동된 정화 시스템을 사용 하 여-는 살 균 필터링 대장균 표면에 뜨는에서 그의 태그 RTA 분수 정화 선호도 열을 기반으로. 일반적으로, 1 mL/min의 속도 차입 사용 하 고 효율적인 비 독 소 바인딩 및 독 소 활동의 손실을 방지 하기 위해 전체 정화 시스템을 냉각. 참고: 효율적인 RTA 정화에 대 한 매개 변수는 표 1에 나열 됩니다. 베 커 외를 참조 하십시오. 대 한 자세한 내용은9.<ol>
		<li>간단히, 바인딩 버퍼 저장소 버퍼 제거의 20 mL와 선호도 열 equilibrate. 주사기를 사용 하 여 선호도 열에 상쾌한 살 균 필터링을 적용 합니다.</li>
		<li>열 바인딩 버퍼 열에서 언바운드 단백질 제거 하의 25-35 mL 씻으십시오. 세척 단계를 수행 하는 280에서 UV 흡 광도까지 nm 초기 UV 값은.</li>
		<li>20-35 ml 차입 버퍼의 바운드 RTA 분수 elute (이미 500 m m, 500 m m NaCl, 20mm KH2포4, pH = 7.2) 얼음 (그림 2A , 그림 2B)에 샘플을 계속 하 고. 참고: RTA 분수의 차입 증가 UV 흡수에 의해 표시 된다. 일반적인 바인딩 단백질 오염을 방지 하기 위해이 분수를 독점적으로 수집을 note 하십시오.</li>
		<li>Eluted 샘플 20 µ L를 사용 하 여 수행 Coomassie 파란 얼룩이11 또는 서쪽 오 점 분석12,13 (선택 사항). 사용 하 여 기본 반 그의 항 체 (1:1, 000) 보조 안티-mouse-IgG-HRP (1:10, 000) RTA를 감지 하 여 샘플 순도 (그림 3)를 확인 합니다.</li>
		<li>5 mL 염 열에 eluted RTA 분수 desalt 고 0.8 M 톨에 샘플을 equilibrate.<ol>
			<li>염 열에 의해 정화 시스템의 선호도 열을 장착 하 고 처음 0.8 M sorbitol의 20 mL와 함께 열을 equilibrate.</li>
			<li>주사기를 통해 열에 eluted RTA 분수를 적용 합니다. 0.8 M sorbitol의 100 mL와 열 세척 하 고 즉시 UV 흡수 증가 (그림 2C)를 시작으로 15 mL 튜브에 desalted RTA 분수 elute.</li>
			<li>4 ° c.에 eluted RTA 분수를 저장 참고: 직접 전도도 증가 소금 오염을 피하기 위하여 때 RTA 분수 샘플링을 중지 합니다. 염 절차에 대 한 매개 변수는 표 1에 나열 됩니다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>10000 x g와 4 ° C 10 kDa 컷오프 스핀 열 1-2 mL의 최종 볼륨을 사용 하 여 30-180 분 eluted RTA 분수를 집중 하 고 3-4 주 4 ° C에서 샘플을 저장할. 주의: RTA 활동의 완전 한 손실에 대 한 단서를 동결 이후 샘플을 동결 하지 않습니다.</li>
	<li>단백질 농도 기존의 단백질 결정 키트를 사용 하 여 결정 합니다. 단백질 농도 1-1.5 mg/mL의 범위에 있어야 합니다. 참고: RTA 단백질 농도가 너무 높은 경우를 침전 하는 경향이 있다 (&gt; 5 mg/mL).</li>
</ol>
3. 효 모 세포 벽 제거 및 변환
<ol>
	<li>야생-타입 또는 선택 된 효 모 삭제 돌연변이는 GFP 기자 플라스 미드 pRS315-K28SP-GFP6 표준 리튬 아세테이트 변환 방법14를 사용 하 여 변환. 셀 신 드롭 아웃 (d/o)를 품 어 긍정적인 클론 선택에 대 한 2-3 일 동안 30 ° C에서 포도 당 플레이트 (2% 포도 당, 한 천 1.5%, 0.5% 염화 황산 염, 0.17% 효 모 질소 기지 (YNB), 및 0.087 %d / o 혼합 신 없이).</li>
	<li>각 접시에서 3 다른 효 모 클론을 선택 하 고 220 rpm 및 30 ° C OD600 ~ 신 d/o 유 매체 (2% 유, 황산 암모늄 0.5%, 0.17 %YNB, 0.087 %d / o 신 없이 혼합) 100 mL에 클론을 접종 = 1.0-2.0 (2-4 x 107 셀/mL)입니다. 참고: 다른 효 모 삭제 긴장의 세포 성장이 다르다. 모니터 세600 는 분 광 광도 계를 통해입니다.</li>
	<li>OD600 값을 계산 하려면 OD600 샘플 희석 0.1-0.3 = (1:5 1:10 희석) OD600 는 분 광 광도 계에서 측정. 참고로, H2O 신 d/o raffionose 매체의 해당 금액으로 보완을 사용 합니다.</li></ol>마지막으로, resuspend OD600 = 살 균 물 (5 x 108 셀/mL) 5 mL에 125.
	<li>10000 x g에 5 분 동안 25 ° C에서 세포를 원심, 세척, 살 균 물 5 mL로 두 번 셀 및 셀 50 mL spheroplasting 버퍼에 resuspend (0.8 M sorbitol, 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 10 m m CaCl2, 2 m m dithiothreitol (DTT), 그리고 200 µ g/mL 용균성 효소).</li>
	<li>50 mL 문화 100 rpm 및 90 분 선택 사항에 대 한 30 ° C를 품 어: 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 spheroplast 형성 15 분 마다 모니터링. 현미경, 어두운 반투명 회색 셀에 있어야 합니다. 브라이트 (refractile) 세포는 충분히 소화 하지, 반면 귀신 (창백한 회색, 있으면, 내부 구조와 셀) 소화 이상.</li>
	<li>각 샘플에 대 한 spheroplast 준비 효능을 확인 하십시오.
	<ol>
		<li>마무리 단계 3.5, 496 µ L spheroplasting 버퍼 (약 2 × 106 spheroplasts) spheroplasted 50ml 문화 4 µ L를 혼합 하 고 400 x g에서 10 분 원심 후.</li>
		<li>Resuspend 펠 릿 10 mL H2O에서에서 증 류, 소용돌이 샘플 30 s, 및 10 µ L 신 d/o 포도 접시 (2% 포도 당, 한 천 1.5%, 0.5% 염화 황산, 0.17 %YNB, 및 신 없이 0.087 %d / o 혼합)에 샘플의 밖으로 접시.</li>
		<li>30 ° c.에 3 일에 대 한 셀을 품 어 접시에 성장된 셀 식민지의 총 수를 계산 합니다. 데이터 평가 사용 하 여 샘플만 효율 98% 이상 (총 셀 식민지 수 &lt; 40 식민지/접시).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>원심 분리기 안정화 단계 400 g x 5 mL로 두 번 10 분 및 세척 셀 4 ° C에서 3.5에서에서 셀 신 d/o 유 미디어 (0.8 M sorbitol, 2% 유, 황산 암모늄 0.5%, 0.17 %YNB과 신 없이 0.087% 탈락 믹스). 5 mL 안정된 신 d/o 유 매체 (1 x 108 셀/mL)에 셀 resuspend 고 직접 GFP 기자 분석 결과 측정 (제 4)에 대 한 셀을 사용 합니다.</li>

4. GFP 96 잘 접시에 기자 시험 측정
<ol>
	<li>효 모 세포 spheroplasts 96 잘 접시 (200 µ L/잘)로 3.7 단계에서 얻은 개 씨.</li>
	<li>70 µ L 안정된 신 d/o 유 매체 부정적인 컨트롤 포함을 추가 (eluate의 Ni2 +-선호도 순화 된 세포 lysate 빈 벡터 표현 IPTG 유발 대장균 세포에서) 또는 5 µ M (최종 RTA 농도에 RTA를 정화 RTA 160 g/l에 해당)에 각 잘.</li>
	<li>30 µ L 안정 갈 락 토스 솔루션 (30% 갈 락 토스, 0.8 M sorbitol) GFP 식 유도 이후에 측정을 시작 하는 즉시 추가 합니다. 참고: 실험 당 적어도 3 기술 복제를 수행 하 고 효 모 스트레인 당 3 생물 복제 합니다.</li>
	<li>마무리 샘플 준비 (단계 4.1 4.3), 후 형광 판독기에 96 잘 접시를 넣어 하 고 측정을 시작 합니다. GFP 형광 검출에 필요한 설정 475/509 nm 필터를 사용 합니다. 30 ° C, 120 rpm에서 20 h (10 분 간격으로 측정)의 시간 창에 1mm의 동요 직경 측정을 수행 합니다. 참고: GFP 필터 집합은 일반적으로 모든 리더 시스템에서 사용할 수 있는. 온도, 시간 창, 간격, 및 RTA 농도 측정 자신의 필요를 위해 조정할 수 있습니다. 대표 결과 그림 4에 나와 있습니다.</li>
	<li>선택 사항: 측정에 추가 내부 컨트롤을 사용 하 여 품질 관리에 대 한. 30% 갈 락 토스 (GFP 유도 없음) 대신 30 µ L 안정된 신 d/o 유 매체를 추가 하 여 부정적인 제어를 준비 합니다. 또한, 0.8 M sorbitol 안정 G418 솔루션 (300 µ g/mL)의 70 µ L를 추가 합니다. 그것은 효 모에 GFP 식 방지 단백질 번역 억제제 G418 단백질 억제에 대 한 긍정적인 제어로 제공 합니다.</li>
	<li>다음 방정식에 따르면 h는 20 시간 포인트에 대 한 % 상대 GFP 형광 계산 ( 그림 4A참조): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56588/56588eq1.jpg"> 어디 NC는 부정적인 컨트롤
	<ol>
		<li>각 측정 지점에 대 한 상대적인 GFP 형광 또는 결정 (이 경우 10 분에서 참고 단계 4.4) 위의 수식을 사용 하 여. 그림 4B같이 시간 (x 축)에 GFP 형광 강렬 (y 축)를 blotting으로 그래프를 만듭니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-competent+and+folding-defective+forms+of+ricin+A+chain+have+different+fates+after+retrotranslocation+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum.</a> Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

위의 프로토콜을 수행할 때 실험의 성공적인 결과 달성 하기 위해 다음 제안 사항을 권장 합니다.
분리 단백질 식, 1 mM의 IPTG 농도 초과 하지 중요 하다. IPTG 농도 &#62; 1mm 억제 발기인 유도 RTA 표현과 독 수익률 낮은 리드. 또한, 셀 수 없습니다 재배 포함 체 형성, 비효율적인 폴딩, 및 독 소 비활성화를 방지 하기 위해 28 ° C 보다 높은 온도에서. RTA 식 (예를 들어, 20-28 ° C) 낮은 온도에서 가능 하 고 또한 생물 학적 활성 독 소의 생산 리드. 그러나, 추가 온도 감소 RTA 활동/접이식 크게 개선 되지 않습니다와 28 ° C (데이터 표시 되지 않음)에 비해 낮은 총 독 소 수율 결과.
친화성 크로마토그래피 (표 1)의 정화 매개 변수 자동된 정화 시스템의 사용에 대 한 5 mL Ni2 + 선호도 열을 갖춘 경우 ...

독 소를 생산 하는 박테리아에 의해 감염에서 고통 받는 환자 효율적인 치료 치료는 여전히 크게 실종 이후 특히 각 사회 의료 시스템에 대 한 심각한 의료 및 금융 부담을 나타냅니다. 새로운 치료 전략, 의학 관련 A의 복잡 한 중독 메커니즘 개발 / B 독 소 콜레라 독 소, 시가 독 소, 또는 리 등 완벽 하 게 구현할 수 있는 새로운 강력한 분석 실험에 따라 분자 수준에서 이해 될 필요가.
최근 몇 년 동안 여러 연구 A를 분석 하려고 / 효 모 및 방사성 독 소 같은 시간이 소요 되 고 비용 집약적인 메서드를 사용 하 여 포유류 세포에서 B 독 소 운송 라벨 siRNA 기반 심사로1,2 3을접근 한다. 경우에 따라 독 소 매매 시각 있다 vivo에서 형광 현미경 검사 법에 의해 fluorophores, 양자 점, 또는 형광 단백질4,5소 단위 개별 독 소의 화학 그리고/또한 유전 결합 후. 불행히도, 이러한 수정 종종 비활성 또는 변경 된 독 소의 자연 속성으로 이어질. 다양 한 과학적인 질문에 직접 답변을 또 다른 우아한 방법은 이다 lacZ, luciferase 등 형광 단백질 효소에 따라 기자 시스템의 사용 (예: GFP 또는 Discosoma sp. 빨간 형광 성 단백질 ( dsRed))입니다.
이 원고는 S. cerevisiae에 extracellularly 적용된 RTA의 세포내 수송에 필요한 세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 프로토콜 설명 합니다. 따라서, GFP 뒤 응급실 가져오기 N 맨끝 신호를 포함 하는 형광 기자 플라스 미드 GFP 형광 방출 후에 vivo에서 RTA 중재 단백질 번역 억제를 직접적으로 측정 하는 단백질 생 합성 센서 역 번역6. 경우는 RTA endocytosis 및 세포내 매매 부정적인 (또는 긍정적인) 영향을 야생-타입에 비해 특정 효 모 삭제 돌연변이에이 GFP 형광 방출6증가 (또는 감소)를 통해 감지할 수 있습니다.
지금까지, 모든 방법을 분석 하는 효 모 세포에서 RTA 전송 RTA의 응급실 cytosol 복고풍 전 프로세스에 제한 되었습니다. 이러한 인공 시스템에서 RTA는 응급실 가져오기 신호를 포함 하는 자살 형1,7에 결과 유도할 수 있는 발기인에서 표현 된다. 셀 리의 B 소 단위 바인딩 마찬가지로이 원고에 설명 된 실험 설정에서 누락 된 고, 따라서, 완전히 나타내지 않는 신은 holotoxin 중독8의 자연 상황, 독 소 전송 플라즈마에서 응급실에 Golgi 기구 통해 막이 소설 분석 결과와 밀접 하 게 유사 될 수 있습니다. 흥미롭게도, 파일럿 연구에서 얻은 예비 결과 RTA에서 사용 하는 밀매 경로 신은 holotoxin의 중독 경로와 눈에 띄는 유사성을 공개를 나타냅니다.
요약, 설명된 방법 RTA endocytosis에 선택한 세포 단백질 및 효 모에 인신 매매의 특정 역할을 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한,이 실험적인 체제 생산과 다양 한 효 모와 세균 종 zymocin 또는 시가 독 소를 분 비 하는 독 소를 비활성화 다른 리보솜에 쉽게 적응 될 수도 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Bacterial and yeast strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21 DE3(Gold)</td><td>Aligent Technologies</td><td>230130</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae BY4742</td><td>Euroscarf</td><td>Y10000</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae BY4742 삭제 돌연변이</td><td>Dharmacon</td><td></td><td>YSC1054 전체 컬렉션</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids used in this protocol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET24a(+) (Novagen)</td><td>Millipore</td><td>69772-3</td><td></td></tr><tr><td>pET-RTA(His6)</td><td>Becker et al. (2016)3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 20T</td><td>USBio</td><td>Z1000.250</td><td>세포벽용 용해 효소 제거</td></tr><tr>플레이트 생산을 위해<td>LB 육수 매체</td><td>Thermo Scientific</td><td>10855021</td><td>15g 한천이 추가되었습니다</td></tr>. <tr><td>YNB</td><td>Thermo Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>황산암모늄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>류신이 없는 효모 드롭아웃 믹스 supplemts Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Y1376-20G</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마-알드리치</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>D-라피노스</td><td>시그마-알드리치</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>D-소르비톨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S1876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-갈락토스</td><td>시그마-알드리치</td><td>G0750-10MG</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>써모티픽</td><td></td><td></td>11811031</tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Roth</td><td>3899.1</td><td></td></tr><tr><td>PAGE 눈금자 사전 염색</td><td>발효</td><td>26616</td><td>단백질 사다리 서양 분석에 사용</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</ 강력한</td></tr><tr><td>>RTA 정제, 탈염 및 리더 측정용 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광도계 Ultrospec 2100 pro</td><td>Amersham</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>구형 모델, 다른 모델 사용 가능</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210470</td><td>구형 모델, 더 이상 사용할 수 없음</td></tr><tr><td>& 오믈; KTAPurifier</td><td>Thermo Scientific</td><td>28406266</td><td>제품은 단종되었으며 대체</td></tr>되었습니다. <tr><td>HisTRAP HP 칼럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>HiTRAP 탈염 칼럼</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0003-29</td><td></td></tr><tr><td>Midisart 멸균 필터</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td>0.2 &micro; m 기공 크기</td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>660nm 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>260860</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>항체 (선택적)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tetra-His</td><td>Qiagen</td><td>34670</td><td>1차 항체; 1:1,000 희석</td></tr><tr><td>Anti-mouse-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9044-2ML</td><td>2차 항체, 1:10,000 희석</td></tr></tbody></table>

세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 형광 기반 기자 분석 결과 리 독 소에 필요한 체인 (rta) 효 모에 인신 매매

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

박테리아 및 식물 A B 독 소는 cytosol에서 그들의 세포내 별로 도달 하 고 궁극적으로 죽 진 핵 세포에서 자연 밀매 경로 악용 /. 이러한 A / B 독 소는 효소 활성의 Asubunit (예를 들어, 신은 독 소 (RTA)) 및 하나 이상의 셀 바인딩 Bsubunit(s) 독 소에 특정 바인딩 세포 표면 수용 체에 대 한 책임은 일반적으로 구성. 어떻게 우리의 현재 지식 A / B 독 소 효율적으로 endocytosis 및 세포내 단백질 높은 진 핵 세포에서 정렬 같은 기본적인 세포질 기계 장치를 이해 하기 도움이 셀 과학자를 취하게 할 수 있다. 의료의 관점에서 그것은 마찬가지로 환자에 대 한 적절 한 치료 솔루션을 찾을 수 또는 결국 암 치료에 대 한 치료 독 소-기반 응용 프로그램 개발에 주요 독 소 밀매 경로 식별 하는 것이 중요.
A의 게놈 넓은 분석 이후 / B 독 소 포유류 세포에서 인신 매매는, 시간이 걸리는, 복잡 하 고 비싼, A에 여러 연구 / B 독 소 전송 효 모 모델 유기 체 Saccharomyces cerevisiae에서 수행 되었습니다. 효 모와 더 높은 진 핵 세포에서 덜 복잡 하 고, 기본적인 세포질 과정 임에도 불구 하 고 비슷한과 효 모에 얻은 결과 매우 자주 포유류 상황에 전송할 수 있습니다.
여기, 우리 누 룩에서 RTA의 세포내 매매 분석을 신속 하 고 사용 하기 쉬운 기자 분석 결과 설명 합니다. 새로운 분석 결과의 필수적인 이점을 cytosol에 뿐만 아니라 RTA 복고풍-전 바인딩과 그물 (응급실)에서 조사를 기회 이지만 오히려 endocytosis 퇴행 성 독 소 수송 원형질 막에서 응급실에. 분석 결과 vivo에서 번역 후 녹색 형광 단백질 (GFP)의 형광 방출 통해 RTA 독성의 간접 측정을 허용 하는 기자 플라스 미드의 사용. RTA 28S rRNA depurination에 의해 효율적으로 단백질 생 합성의 개시를 방지, 이후이 분석 결과에서 수 있습니다 호스트 세포 단백질의 식별을 변경의 검색을 통해 세포내 RTA 전송에 관련 된 형광 방출.

이 원고에 설명 된 프로토콜의 일반적인 워크플로 그림 1, 대략 성공적인 RTA 정화 및 후속 GFP 기자 분석 결과 실험에 대 한 단일 단계 요약에 나와 있습니다. 각 개별 단계에 대 한 더 자세한 설명은 프로토콜에서 찾을 수 있습니다. 그림 2 는 친화성 크로마토그래피 (그림 2A)와 빈 벡터 제어 (그림 2B)에 의해 성공적인 RTA 정화의 예상된 결과를 보여 줍니다. 그림 2C 단백질 피크 (파란색)와 소금 eluted 피크 (갈색)의 이상적인 분리를 보여주는 염 실험의 대표적인 결과 보여 줍니다. 효과적인 RTA 정화 Coomassie 스테인드 SDS-젤 그림<...

원고, 우리는 밀매에 관여 하 고 식물 독 소 리 (RTA)의 소 단위는 세포 독성의 프로세스를 죽이고 세포 구성 요소를 식별 하는 효 모 기반 형광 기자 분석 결과 사용 하 여를 설명 합니다.

세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 형광 기반 기자 분석 결과 리 독 소에 필요한 체인 (RTA) 효 모에 인신 매매

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

이 간단한 형광 기반 리포터 분석의 전반적인 목표는 효모 모델 유기체에서 리신 독소 A 또는 RTA 사슬의 적절한 이동에 필요한 세포 구성 요소를 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 B 독소를 활성화할 때 리보솜의 세포 간 수송에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리의 경우, 일반 독소 리신의 세포 독성 소단위체는 원형질막에서 세포솜으로 들어갑니다.이 분석의 주요 장점은 빠르고 저렴한 방법으로 RTA 수송에 대한 개별 효모 유전자의 영향을 분석할 수 있다는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 세포 변환으로 이 프로토콜을 시작합니다. 5ml의 LB kanamycin 배지에 RTA 발현 플라스미드 또는 빈 벡터를 포함하는 세포를 접종합니다.세포를 섭씨 37도 및 220rpm에서 24시간 동안 배양합니다. 1리터의 LB 카나마이신 배지에 5ml의 배양 전작물을 보충합니다. 그런 다음 세포가 600 나노 미터에서 0.8에서 1.0의 광학 밀도에 도달 할 때까지 섭씨 37도 및 220RPM에서 세포를 배양합니다.그 후 배양 온도를 섭씨 28도로 낮추십시오. 최종 농도인 1밀리몰에 IPTG를 첨가하여 E.Coli의 RTA 발현을 유도합니다. 28 섭씨 온도와 220 분당 회전수에 3.5 시간 후에, 10 분 동안 10, 000 g 및 4 섭씨 온도에 원심 분리에 의하여 세포를 가을걷이하십시오.그런 다음 5 밀리리터의 바인딩 버퍼와 펠릿을 10, 000g 및 4 °C에서 10 분 동안 세척합니다. 세척을 한 번 반복한 후 펠릿을 5ml의 결합 완충액에 다시 현탁시킵니다. 얼음 위에서 15초 펄스와 30초 멈춤의 5회 사이클을 사용하여 세포를 초음파 처리합니다.세포 licate를 21, 000g 및 섭씨 4도에서 15 분 동안 원심 분리 한 후 멸균 주사기 필터 시스템을 사용하여 상층액을 여과합니다. 5밀리리터 니켈 기반 친화성 컬럼이 장착된 자동 정제 시스템을 사용하여 멸균 여과된 E.Coli 상등액에서 HIS 태그가 지정된 RTA 분획을 정제합니다. 일반적으로 분당 1 밀리리터의 암시 속도를 사용하고 전체 정화 시스템을 냉각시켜 비효율적인 독소 결합 및 독소 활성 손실을 방지하십시오.친화도 컬럼을 20ml의 결합 버퍼로 잠시 평형을 이루어 스토리지 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 주사기를 사용하여 여과된 멸균 상층액을 친화성 컬럼에 도포합니다. 25-35ml의 결합 완충액으로 컬럼을 세척하여 컬럼에서 결합되지 않은 단백질을 제거합니다.280나노미터의 UV 흡수제가 초기 UV 값에 가까워질 때까지 세척 단계를 수행합니다. 그런 다음 결합된 RTA 분획을 20-35ml의 용리 완충액으로 용리하고 샘플을 얼음 위에 보관합니다. UV, 280 값이 증가한 직후 RTA 분획 샘플링을 시작하고 원래 기준선에 다시 도달하면 RTA 분획 샘플링을 중지하는 것이 중요합니다.탈피된 RTA 분획을 탈염하려면 정제 시스템의 친화성 컬럼을 탈염 컬럼으로 교체하고 컬럼을 20ml의 0.8몰 소르비톨로 평형을 이룹니다. 주사기를 통해 회피된 RTA 분획을 컬럼에 적용합니다. 100ml의 0.8몰 소르비톨로 컬럼을 세척하고 UV 흡수가 증가하기 시작하는 즉시 탈염된 RTA 분획을 15ml 튜브에 희석합니다.염 오염을 방지하려면 전도도가 증가할 때 직접 분획 샘플링을 중단하십시오. Eluded RTA fraction을 섭씨 4도에서 보관합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 효모를 형질전환한 후 각 플레이트에서 3개의 다른 효모 클론을 선택합니다.220 RPM 및 30 °C에서 100 밀리리터의 루신 드롭아웃 라피노스 배지에 클론을 600 나노미터의 광학 밀도로 1.0 - 2.0의 광학 밀도로 접종합니다. 25 섭씨 온도에 10, 000 g에 5 분 동안 세포를 원심 분리하십시오. 5ml의 멸균수로 세포를 두 번 세척한 후 50ml의 스페로플라스팅 완충액에 세포를 다시 현탁시킵니다.50ml 배양을 100RPM 및 30°C에서 90분 동안 배양합니다. 400g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리한 후 5ml의 안정화된 루신 드롭아웃 라피노스 배지로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 동일한 배지의 5 밀리리터에 세포를 다시 현탁시켜 GFP 리포터 분석 측정에 세포를 직접 사용합니다.효모 세포 spheroplast를 96개의 웰 플레이트로 파종합니다. 각 웰에 음성 대조군을 포함하는 70마이크로리터의 안정화된 루신 드롭아웃 라피노스 배지를 첨가하여 빈 벡터 또는 정제된 RTA를 5마이크로몰의 최종 RTA 농도로 발현합니다. 나머지 웰 각각에 70마이크로리터의 안정화된 루신 드롭아웃 매체를 추가하여 총 부피를 270마이크로리터로 만듭니다.단백질 억제에 대한 양성 대조군을 위해 G418이 효모에서 GFP 발현을 방지하므로 70 마이크로 리터의 0.8 몰 소르비톨 안정화 G418 용액을 첨가하십시오. GFP 발현을 유도하기 위해 30마이크로리터의 안정화된 갈락토오스 용액을 즉시 첨가합니다. 30%갈락토오스 대신 30마이크로리터의 안정화된 루신 드롭아웃 라피노스 배지를 추가하여 추가 음성 대조군을 준비합니다.시료 전처리를 마친 후 96웰 플레이트를 형광 리더기에 넣고 GFP 형광 검출에 필요한 475, 509 나노미터 필터 세트를 사용하여 측정을 준비합니다. 섭씨 30도, 120RPM 및 1mm의 흔들림 직경에서 20시간의 시간 창에 걸쳐 10분의 측정 간격으로 측정을 수행합니다. 여기에 표시된 것은 RTA의 친화성 크로마토그래피와 빈 벡터 대조군의 대표적인 정제 그래프입니다.검은색 상자의 파란색 피크는 바운드 RTA 분수를 나타냅니다. 블랙 박스에서 볼 수 있듯이 음성 대조군의 열에서 단백질이 빠져나가지 않습니다. 여기에 표시된 것은 친화성 정제 RTA 분획의 탈염 다이어그램입니다.다이어그램은 RTA 단백질 분획과 염 분획의 분리를 보여줍니다. 성공적인 정제 및 탈염 후 쿠마시 염색 결과는 다양한 RTA 변형체의 세포 용해물 또는 정제된 샘플을 보여줍니다. 이 연구에서는 수정되지 않은 RTA가 사용되었습니다.형광 간격 리포터 분석을 검증하기 위해 야생형 효모 스페로플라스트의 상대적 GFP 형광을 GFP 유도 20시간 후 유도 및 비유도 조건에서 측정했습니다. 상대 GFP 형광은 RTA, G418 또는 음성 대조군의 존재 하에서도 분석되었습니다. 상대 GFP 형광은 또한 해당 단백질이 효모의 RTA 운송에 관여하고 관여하지 않는 것으로 알려진 선택된 돌연변이에 대해 측정되었습니다.점선은 유의성 임계값을 나타냅니다. RTA 발현 및 정제가 마스터되면 형광 보고서 분석 결과를 하루 만에 받을 수 있습니다. 또한, 이 방법은 B 독소의 리보솜 비활성화 분야의 연구자들이 진핵 모델 유기체 효모에서 B 독소의 중독 뿌리를 연구할 수 있는 길을 열어줍니다.

a-simple-fluorescence-based-reporter-assay-to-identify-cellular

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

저하 및 재활용을위한 효모 공포의 산성 루멘에 organelles의 전달을 모니터링하는 강력한 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 인코딩 듀얼 발광 형광 산도 - 바이오 센서 및 형광 현미경을 사용하여 개별 세포의 시각화와 대상 organelles의 특정 상표에 의존합니다.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

출처: Becker, B. 외 효모에서 리신 독소 A 사슬(RTA) 수송에 필요한 세포 구성 요소를 규명하기 위한 간단한 형광 기반 리포터 검사법. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 대 장균 에서 His 표지 리신 독소 A 사슬(RTA)의 유도 발현을 보여줍니다. 재조합 발현 플라스미드로 형질전환된 박테리아의 선택적 배양, His 표지 RTA 발현 유도, 그리고 박테리아의 추가 분석을 위한 준비 과정을 개괄합니다.

히스티딘 태그된 리신 독소의 유도 발현 대장균 내 A 사슬

유동 세포 계측법 및 현미경에 따라 두 개의 보완적인 방법은 효모에서 MAPK 경로의 활성화에 의해 유도되는 유전자 발현의 역학의 단일 세포 수준에서 정량을, 가능하게하는 표시됩니다.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

이 프로토콜은 동족 GFP 기자 및 유동 세포 계측법을 통해 GFP 발현을 자극하는 ATFs 능력의 정량화 인공 전사 인자 (ATFs)의 신속한 건설을위한 실험 절차를 설명합니다.

빠른 합성 및 GFP 기반 기자들과 화학적으로 활성화 된 전사 인자의 상영

이 기사는 단백질 분해에 대한 유전적 요구 사항을 결정하기 위한 효모 성장 기반 분석에 대해 설명합니다. 또한 효모 단백질을 신속하게 추출하는 방법을 보여주며, 이는 분해 요구 사항을 생화학적으로 확인하기 위한 웨스턴 블로팅(western blotting)에 적합합니다. 이러한 기술은 다양한 단백질의 분해를 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

III형 분비 시스템을 통해 숙주 세포로 이펙터 전좌는 그람 음성 박테리아 사이에서 일반적인 독성 전략입니다. 전좌의 정량 분석을 위한 beta-lactamase effector fusion 기반 분석법을 적용했습니다. Yersinia에 감염된 세포에서 베타-락타마제에 의한 FRET 리포터의 전환은 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 모니터링됩니다.

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

소포 수송 이벤트의 정확한 정량화는 종종 특정 단백질의 역할과 돌연변이의 영향에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 본 논문은 정량적 형광 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 세포내 이벤트를 정량화하기 위한 도구로 pH에 민감한 GFP 변이체인 초황도 pHluorin을 사용하는 방법을 제시합니다.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

이 프로토콜에는 포스터 공명 에너지 전달, 및 현미경 이미징 형광 수명에 따라 무 단백질의 복잡 한 형성의 양적 시각화에 대 한 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다.

형광 일생 화상 현미경 검사 법에 의해 인신 매매 세포내 올 무를 떠 올 리

본 문서는 S. 세레비시아 및 HEK293T 세포 모두에서 단백질 자가 조립을 정량화하는 FRET 기반 유동 세포 분석 프로토콜에 대해 설명합니다.

유세포분석으로 생체내 단백질 자가 조립 검출 및 특성화

개별 번역 이벤트를 추적하면 캡 종속 번역 메커니즘에 대한 고해상도 운동 연구를 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표지된 항체와 에피토프 태그가 달린 초기 성 펩티드 사이의 화상 진찰 상호 작용에 근거를 둔 체외 단일 분자 분석체를 보여줍니다. 이 방법은 활성 체외 캡 의존 변환 동안 개시 및 펩티드 신장 운동의 단일 분자 특성화를 가능하게한다.

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

학습하세요 리신 독소 A(RTA) 운반에 필요한 세포 구성 요소를 식별하는 형광 기자 분석법을 효모 모델에서 사용하는 방법을. 이 기법은 개별 유전자 효과를 빠르고 경제적으로 분석하여 리신 독소의 세포 내 작용 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.

세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 형광 기반 기자 분석 결과 리 독 소에 필요한 체인 (RTA) 효 모에 인신 매매

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