세포질 구성 요소를 식별 하는 간단한 형광 기반 기자 분석 결과 리 독 소에 필요한 체인 (RTA) 효 모에 인신 매매

이 간단한 형광 기반 리포터 분석의 전반적인 목표는 효모 모델 유기체에서 리신 독소 A 또는 RTA 사슬의 적절한 이동에 필요한 세포 구성 요소를 스크리닝하는 것입니다. 이 방법은 B 독소를 활성화할 때 리보솜의 세포 간 수송에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리의 경우, 일반 독소 리신의 세포 독성 소단위체는 원형질막에서 세포솜으로 들어갑니다.

이 분석의 주요 장점은 빠르고 저렴한 방법으로 RTA 수송에 대한 개별 효모 유전자의 영향을 분석할 수 있다는 것입니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 세포 변환으로 이 프로토콜을 시작합니다. 5ml의 LB kanamycin 배지에 RTA 발현 플라스미드 또는 빈 벡터를 포함하는 세포를 접종합니다.

세포를 섭씨 37도 및 220rpm에서 24시간 동안 배양합니다. 1리터의 LB 카나마이신 배지에 5ml의 배양 전작물을 보충합니다. 그런 다음 세포가 600 나노 미터에서 0.8에서 1.0의 광학 밀도에 도달 할 때까지 섭씨 37도 및 220RPM에서 세포를 배양합니다.

그 후 배양 온도를 섭씨 28도로 낮추십시오. 최종 농도인 1밀리몰에 IPTG를 첨가하여 E.Coli의 RTA 발현을 유도합니다. 28 섭씨 온도와 220 분당 회전수에 3.5 시간 후에, 10 분 동안 10, 000 g 및 4 섭씨 온도에 원심 분리에 의하여 세포를 가을걷이하십시오.

그런 다음 5 밀리리터의 바인딩 버퍼와 펠릿을 10, 000g 및 4 °C에서 10 분 동안 세척합니다. 세척을 한 번 반복한 후 펠릿을 5ml의 결합 완충액에 다시 현탁시킵니다. 얼음 위에서 15초 펄스와 30초 멈춤의 5회 사이클을 사용하여 세포를 초음파 처리합니다.

세포 licate를 21, 000g 및 섭씨 4도에서 15 분 동안 원심 분리 한 후 멸균 주사기 필터 시스템을 사용하여 상층액을 여과합니다. 5밀리리터 니켈 기반 친화성 컬럼이 장착된 자동 정제 시스템을 사용하여 멸균 여과된 E.Coli 상등액에서 HIS 태그가 지정된 RTA 분획을 정제합니다. 일반적으로 분당 1 밀리리터의 암시 속도를 사용하고 전체 정화 시스템을 냉각시켜 비효율적인 독소 결합 및 독소 활성 손실을 방지하십시오.

친화도 컬럼을 20ml의 결합 버퍼로 잠시 평형을 이루어 스토리지 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 주사기를 사용하여 여과된 멸균 상층액을 친화성 컬럼에 도포합니다. 25-35ml의 결합 완충액으로 컬럼을 세척하여 컬럼에서 결합되지 않은 단백질을 제거합니다.

280나노미터의 UV 흡수제가 초기 UV 값에 가까워질 때까지 세척 단계를 수행합니다. 그런 다음 결합된 RTA 분획을 20-35ml의 용리 완충액으로 용리하고 샘플을 얼음 위에 보관합니다. UV, 280 값이 증가한 직후 RTA 분획 샘플링을 시작하고 원래 기준선에 다시 도달하면 RTA 분획 샘플링을 중지하는 것이 중요합니다.

탈피된 RTA 분획을 탈염하려면 정제 시스템의 친화성 컬럼을 탈염 컬럼으로 교체하고 컬럼을 20ml의 0.8몰 소르비톨로 평형을 이룹니다. 주사기를 통해 회피된 RTA 분획을 컬럼에 적용합니다. 100ml의 0.8몰 소르비톨로 컬럼을 세척하고 UV 흡수가 증가하기 시작하는 즉시 탈염된 RTA 분획을 15ml 튜브에 희석합니다.

염 오염을 방지하려면 전도도가 증가할 때 직접 분획 샘플링을 중단하십시오. Eluded RTA fraction을 섭씨 4도에서 보관합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 효모를 형질전환한 후 각 플레이트에서 3개의 다른 효모 클론을 선택합니다.

220 RPM 및 30 °C에서 100 밀리리터의 루신 드롭아웃 라피노스 배지에 클론을 600 나노미터의 광학 밀도로 1.0 - 2.0의 광학 밀도로 접종합니다. 25 섭씨 온도에 10, 000 g에 5 분 동안 세포를 원심 분리하십시오. 5ml의 멸균수로 세포를 두 번 세척한 후 50ml의 스페로플라스팅 완충액에 세포를 다시 현탁시킵니다.

50ml 배양을 100RPM 및 30°C에서 90분 동안 배양합니다. 400g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리한 후 5ml의 안정화된 루신 드롭아웃 라피노스 배지로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 동일한 배지의 5 밀리리터에 세포를 다시 현탁시켜 GFP 리포터 분석 측정에 세포를 직접 사용합니다.

효모 세포 spheroplast를 96개의 웰 플레이트로 파종합니다. 각 웰에 음성 대조군을 포함하는 70마이크로리터의 안정화된 루신 드롭아웃 라피노스 배지를 첨가하여 빈 벡터 또는 정제된 RTA를 5마이크로몰의 최종 RTA 농도로 발현합니다. 나머지 웰 각각에 70마이크로리터의 안정화된 루신 드롭아웃 매체를 추가하여 총 부피를 270마이크로리터로 만듭니다.

단백질 억제에 대한 양성 대조군을 위해 G418이 효모에서 GFP 발현을 방지하므로 70 마이크로 리터의 0.8 몰 소르비톨 안정화 G418 용액을 첨가하십시오. GFP 발현을 유도하기 위해 30마이크로리터의 안정화된 갈락토오스 용액을 즉시 첨가합니다. 30%갈락토오스 대신 30마이크로리터의 안정화된 루신 드롭아웃 라피노스 배지를 추가하여 추가 음성 대조군을 준비합니다.

시료 전처리를 마친 후 96웰 플레이트를 형광 리더기에 넣고 GFP 형광 검출에 필요한 475, 509 나노미터 필터 세트를 사용하여 측정을 준비합니다. 섭씨 30도, 120RPM 및 1mm의 흔들림 직경에서 20시간의 시간 창에 걸쳐 10분의 측정 간격으로 측정을 수행합니다. 여기에 표시된 것은 RTA의 친화성 크로마토그래피와 빈 벡터 대조군의 대표적인 정제 그래프입니다.

검은색 상자의 파란색 피크는 바운드 RTA 분수를 나타냅니다. 블랙 박스에서 볼 수 있듯이 음성 대조군의 열에서 단백질이 빠져나가지 않습니다. 여기에 표시된 것은 친화성 정제 RTA 분획의 탈염 다이어그램입니다.

다이어그램은 RTA 단백질 분획과 염 분획의 분리를 보여줍니다. 성공적인 정제 및 탈염 후 쿠마시 염색 결과는 다양한 RTA 변형체의 세포 용해물 또는 정제된 샘플을 보여줍니다. 이 연구에서는 수정되지 않은 RTA가 사용되었습니다.

형광 간격 리포터 분석을 검증하기 위해 야생형 효모 스페로플라스트의 상대적 GFP 형광을 GFP 유도 20시간 후 유도 및 비유도 조건에서 측정했습니다. 상대 GFP 형광은 RTA, G418 또는 음성 대조군의 존재 하에서도 분석되었습니다. 상대 GFP 형광은 또한 해당 단백질이 효모의 RTA 운송에 관여하고 관여하지 않는 것으로 알려진 선택된 돌연변이에 대해 측정되었습니다.

점선은 유의성 임계값을 나타냅니다. RTA 발현 및 정제가 마스터되면 형광 보고서 분석 결과를 하루 만에 받을 수 있습니다. 또한, 이 방법은 B 독소의 리보솜 비활성화 분야의 연구자들이 진핵 모델 유기체 효모에서 B 독소의 중독 뿌리를 연구할 수 있는 길을 열어줍니다.