Name: (ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 배우세요 3차원 공배양 시스템을 이용한 유방암 세포와 단핵구 간 직접 및 간접 소통 분석 방법을. 이 기법은 종양 염증 미세환경과 면역 세포 활성화 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 Fondo de Apoyo Investigación, 병원 Infantil 드 멕시코 페데리코 고메스 (프로젝트 번호 그-2014-053) 라와 CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE 프로젝트 번호 233061 Ezequiel M. 푸 엔 테 스-Pananá에 의해 지원 되었다. 프란 산체스 나 프로그램이 드 Doctorado en Ciencias Biomédicas, 대학 나시오날 Autónoma 드 멕시코 (UNAM)과 수신된 친목 231663 CONACYT에서에서 박사 학생입니다. E-S 나, 사회 보장 (IMSS)의 멕시코 연구소에서 제공 하는 금융 지원 인정.

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</ol>

저자는 그들이 하지 않아도 어떤 상충 선언 합니다.

3D 공간 구조에서 상피 세포 성장 그리고 ECM 단백질의 상호 작용은 조직 항상성에 대 한. Monolayers (2D)에서 성장 하는 세포에 많은 암 연구 기반으로 되어, 비록 그들은 종양 형성 및 진행의 여러 측면을 이해 하는 데 중요 한 되어, monolayers ECM에 대 한 셀에 부과 하는 특징을 정리 하지 않습니다. 인스턴스: 확산, 접착 종속 세포 생존, 꼭대기 basolateral 극성, 개장 하는 ECM, 세포 분화, 등 제한 중요 한 것은, 뿐만 아니라 종양 세포와 ECM 사이 상호 작용은 암의 진행을 위한 필수 하지만 종양 및 비 종양 세포, 면역 세포 등 사이 통신 설립. 제공 하는 ECM에 의해 염증 반응을 이러한 상호 작용에 의해 추진 하 고이 염증 성 조건 만드는 방법 여기에 제공 된 프로토콜 환경 내에서 암 세포와 면역 세포 사이 상호 작용의 이해를 촉진 한 긍정적인 루프 monocytes의 chemoattraction과 암 세포의 더 많은 침략을 육성.
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종양 생물학은 이전에 생각 보다 훨씬 더 복잡 한. 종양 세포는 억제 되지 않는 확산 셀;의 단순한 대량 보다 더 많은 보여주는 증거를 장착 오히려, 다른 종양 약 세포 높은 조직과 종양1내에서 계층 구조를 표시 하는 다른 기능을 수행 같다. 종양 세포는 또한 비 변형 세포와의 친밀 한 커뮤니케이션에서: 대 식 세포, 섬유 아 세포, 림프 톨, adipocytes, 내 피 세포, 다른 셀 들 모두에 몰입 하는 비 계 단백질 및 다 당 류는 ECM을 구성 하는. 수많은 직접 및 간접적인 상호 작용 변환 및 비 변형 세포 사이 및 질병 결과2,3에 강력한 영향을 미치는 ECM으로 설정 됩니다. BrC의 특정 한 경우에 그것은 특히 Tam, 고려는 Tam 발견 되었습니다는 종양의 진화에 중요 한 역할을 증가 하는 전이의 위험과 질병 재발4의 BrC 셀의 통신을 해 부하는 것이 중요 ,5.
내부 종양 상호 작용 및 그들의 가능한 결과 분석, 새로운 3D 생체 외에서 방법을 개발 되었으며, 훨씬 더 복잡 한 microenvironment를 제공 하는 ECM 추출 물의 사용에 따라 종양 생물학, 비교에서의 현실에 가까운 기존의 단층 세포 배양 세포 성장 플라스틱에 첨부. 피터슨와 Bissell6 아의 첫 번째 모델을 제공 하 고 악성 유 방 상피 세포 laminin 풍부한 지하실 멤브레인에 교양 아 인간을 차별 하는 3D organotypic 구조를 설명 하는 첫번째 이었다 그들의 악성에서 유 방 상피 세포입니다. 10 년 뒤, 모델 Debnath, Muthuswamy에 의해 개발 및 브루 게7,,89 선의 acini의 악성 변환 하는 동안 손상 하는 생물 학적 경로 명료 하 게 하는 귀중 한 도구 제공 등 통제 확산, 장애인된 셀 분극의 증거 및 anoikis, 셀 저항 결과로 acini 루멘으로 꽉 접합 단백질의 delocalization 인해 큰 acini 형성으로 프로그램 된 세포 죽음의 종류를 발생 앵커리지-종속 셀 때 그들은 주변 ECM에서 분리. Sameni, Jedeszko, 및 슬론의 모델은 밀접 하 게 침입, 종양 암10,,1112의 또 다른 중요 한 특성에 관련 된 세포에 의해 이미징 분해 활동에 집중 했다. 섞인 다른 형광 침묵 단백질 기질 단백질 행렬에 의존 하는이 모델 (DQ 젤라틴, DQ-콜라겐, 그리고 DQ 콜라겐 IV), 어떤 형광 신호에는 콜라겐의 분해 저하의 지표. 3D 모델 변형 비 둘 다의 줄기 세포 속성과 셀의 집계, spheroids 라고 하는 종양 세포를 공부 하는 데도 사용, ECM 같은 단백질 세포 분화, 비대칭의 메커니즘에 대 한 질문 또는 정지에 경작 될 수 있습니다. 세포 분열, 세포 준수, 및 세포 운동 성13,14. 침공 분석 실험 종양의 본질적인 공격 성과 침략 과정15중 chemoattractants로 봉사 하는 분자의 식별의 테스트 수 있습니다. 전반적으로, 3D 모델의 체 외에서 세포 배양 정상 및 종양 조직 morphogenesis 더 밀접 하 게 반영 하는 저렴 한 다양화를 나타냅니다.
우리 인간의 상업 BrC 셀 라인 알려진된 공격적 잠재력 (luminal 및 트리플-네거티브 형식) 및 기본을 사용 하 여 상기 모델7,,1011에 따라 3D 셀 공동 문화 시스템 설계 셀 explanted BrC 환자에서. 우리가 먼저 적극적인 비 (MCF-7) 또는 공격적 (MDA-MB-231) BrC 셀 U937 monocytes 기질 추출 (ECME)와 공동 경작 했다 모델 개발-직접 셀 상호 작용을 허용 하는 3D 시스템을 기반으로. 이러한 공동 문화 어떻게이 두 세포 계보 간 통신 암 공격적인 행동에 관련 된 유전자의 세트의 녹음 방송에 영향을 결정 하기 위해 사용 되었다. 2 cyclooxygenase (COX-2) 대 본의 상당한 증가 하는 제품 중 하나는, 스타 글란 딘 E2 (PGE2), 암 진행에서 염증의 역할을 강조 하는 발견의 생산 증가와 동시에 관찰 되었다. MMP의 증가 전사 또한 적극적인 MDA-MB-231 셀 U937 monocytes DQ 콜라겐 IV 포함 된 문화에 함께 공동 경작 했다 때 큰 콜라겐 베이스와 상관 하는 관찰 되었다. 메모의, 우리의 공동 문화는 세포 세포 상호 작용 메커니즘 콜라겐 저하에 필요한 가정을 지원 하지 않았다. 그것은 오히려 두 세포 계보 간 통신 분 비 분자에 의해 중재 했다 제안 했다. 또한, 이러한 공동 문화 분석 실험에서 수확 supernatants 선의 acini MCF 10A 세포 변형 비13에 의해 형성 된 무질서 수용 성 요소 포함. 그것은 발견 하는 적극적인 고 기본 BrC 세포 분 비 상승 monocyte 혈 분자 MCP-1 GM-CSF와 RANTES의 수준. 따라서, 우리는 세포 세포 세포 상호 작용을 방지 하기 위해 셀 문화 삽입에서 분리 되었다 3D 문화 설명. 이러한 문화는 BrC 세포, monocytes 사이 간접 통신을 해결 하기 위해 사용 되었다. 이 분석 실험, 비 공격적이 고 적극적인 상업 BrC 셀 라인 및 기본 BrC 셀, 인간 monocytes의 세 가지 유형: 상업 U937 및 THP-1 셀, 그리고 기본 monocytes (PMs) (모두 건강 한 기증자의 주변 혈액에서 분리 monocytes는 활성화 되지 않은 상태에서 사용 했다) 사용 되었다. 염증 성 cytokines 일리노이-1β 및 IL-8의 증가 농도 공동 문화에 농축 될 관찰 되었다. 마찬가지로, MMP-1, MMP-2, 및 MMP 10 BrC 셀 monocyte 공동 문화, 그리고 이렇게 강화 이전 결과14에 증가 또한 했다 발견 했다. 이 원고에서 기본 BrC 세포 격리 및 3D 문화에서 테스트 포인트 워크플로 대표적인 결과 함께 제공 됩니다. 이 작품 구성 종양 생물학의 특정 측면이 3D 셀 시스템 생체 외에서 제공 하는 중대 한 잠재력의 좋은 예.

<table><tbody><tr><td>U937</td><td>아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ATCC&nbsp;</td><td>CRL-1593.2</td><td>단핵세포주/조직구성 림프종&nbsp;</td></tr><tr><td>THP-1</td><td>아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ATCC&nbsp;</td><td>TIB-202</td><td>단핵세포주/급성 단핵구 백혈병&nbsp;</td></tr><tr><td>MCF-10A</td><td>아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ATCC&nbsp;</td><td>CRL-10317</td><td>비형질전환 유방 세포주</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>미국형 배양 컬렉션 ATCC&nbsp;</td><td>HTB-22</td><td>유방암 세포주</td></tr><tr><td>T47D</td><td>미국형 배양 컬렉션 ATCC&nbsp;</td><td>HTB-133</td><td>유방암 세포주</td></tr><tr><td>HS578T</td><td>아메리칸 타입 배양 컬렉션 ATCC&nbsp;</td><td>HTB-126</td><td>유방암 세포주</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>미국형 배양 컬렉션 ATCC&nbsp;</td><td>HTB-26</td><td>유방암 세포주</td></tr><tr><td>RPMI 1640 중간</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 고포도당&nbsp;</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11964-092</td><td>4.5 g/L 포도</td></tr>당 <tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>항생제/항진균제</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>100 U/mL 페니실린, 100 &마이크로; g/mL 스트렙토마이신 및 0.25 &마이크로; g/mL Fungizone</td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>말 세럼&nbsp;</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA 1X</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X (인산염 완충 식염수</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>표피 성장 인자(EGF)</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15 (1.00mg)</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I1882-100MG</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H088-5G</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 독소 Vibrio cholerae</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>Corning Inc</td><td>356237</td><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 쥐 육종, 세포외 기질 추출물, -20°C에서 보관; 4&deg에서 사용할 때까지 C; C</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>페프로테크</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>MCP-1</td><td>페프로테크</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>란테스</td><td>페프로테크</td><td>300-06</td><td></td></tr><tr><td>IL-8</td><td>페프로테크</td><td>200-08</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&베타;</td><td>PeproTech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈-바이올렛</td><td>Hycel M&eacute; xico</td><td>541</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>트랜스웰 투과성 지지체(인서트)</td><td>Corning Inc</td><td>3422</td><td>6.5mm 직경, 8 &마이크로; M 기공 크기/24웰 플레이트&nbsp;</td></tr><tr><td>Transwell 투과성 지지체(인서트)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>140620</td><td>6.5 mm 직경, 0.4 &마이크로; M 기공 크기/24웰 플레이트&nbsp;</td></tr><tr><td>단핵구 분리 키트 II 인간&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-153</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>인간 사이토카인/케모카인 마그네틱 비드 패널 키트 96 웰 플레이트 분석</td><td>EMD Millipore</td><td>HCYTOMAG-60K</td><td></td></tr><tr><td>Magpix with xPonent 소프트웨어 (레이저 기반 형광 분석 테스트 기기)</td><td>Luminex Corporation</td><td>40-072</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek 챔버 슬라이드 커버 포함 (8 글쎄요)</td> <td>Nalge Nunc International</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 마이크로웰 35mm 페트리&nbsp; 접시</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

(ecme) 추출 monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

세포 외 기질 (ECM)에 포함 된 정상 및 종양 약 상피 세포 속속들이 조 혈 및 비 조 혈 세포, 따라서 크게 영향을 미치는 정상 조직의 항상성 및 질병 결과와 통신 합니다. 유방암, 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam) 역할을 중요 한 질병의 진행과 전이, 재발; 따라서 질병을 제어 하는 것이 중요이 monocyte chemoattraction 종양 microenvironment 및 종양 세포와 그들의 상호 작용의 메커니즘을 이해. 여기, 우리는 인간 유방암 (BrC) 세포 및 인간 monocytes의 3 차원 (3D) 공동 문화 시스템에 대 한 자세한 설명을 제공합니다. BrC 셀 생산 활성화에 규제의 높은 기초 수준, 정상적인 T 세포 표현 (RANTES) 분 비, monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1), 그리고 granulocyte macrophage 식민지 자극 인자 (G-CSF), monocytes, 공동 문화에 프로 염증 성 cytokines 인터 루 킨 (IL)-1 베타 (IL 1β) 및 IL-8 매트릭스 metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, 및 MMP-10 풍성 하 게 했다. 이 종양 기질 microenvironment 승진 anoikis MCF 10A 3D acini 같은 구조, monocytes의 chemoattraction 그리고 적극적인 BrC 셀의 침공에 저항. 여기에 제시 된 프로토콜 내 종양 커뮤니케이션을 공부 하는 저렴 한 대안을 제공 하 고 3D 셀 시스템 생체 외에서 심문 종양 관련 종양 생물학의 특정 기능을 제공 하는 중대 한 잠재력의 예 침략입니다.

BrC 셀 3D 문화에서의 형태소 분석:
낮은 높은 밀도에서 3D 문화에서 성장 하는 기본 BrC 셀의 형태는 5 일 동안 연구 했다. 첫 번째 48 h 동안 세포는 ECME를 준수 하 고 낮은 밀도 유지. 이 시간이 시점에서 그것은 명확 하 게 감상할 수 있습니다 세포는 길쭉한 스핀 들-모양, 명백한 셀 연락처를 표시 하지 않고 두 개 이상의 긴 세포질 예측와 일부 제시. 5 일 후 문화, 세포는 그들의 초기 형태를 유지 하면서 확산. 또한, 그들은 특정 구조 조직 없이 그물을 닮은 구조를 형성 하 고 아무 접촉 금지와 위로 쌓여 나타납니다. MCF 10A 세포 변형 비 비교는 구형 구조 선의 acini 닮은 형성 되었다. 이러한 세포 동종 크기 (약 50 µ m)의 둥근 잘 구분 및 조직 구조의 특성 형태를 표시합니다. 반대로, ...

여기, 우리는 기본 유 방 암 세포 뿐만 monocytes 그리고 콜라겐 저하, 면역 세포 모집, 셀 결과 함께 그들의 직접/간접적인 상호 작용 연구로 형태를 분석 하는 3 차원 문화 방법 설명 침공, 그리고 암 관련 된 염증의 승진.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 3차원 공동 배양 시스템에서 원발성 유방암 세포와 단핵구 간의 직간접적인 통신을 연구하는 것입니다. 이 방법은 면역 세포가 어떻게 재등급화되고 활성화되는지, 이러한 세포가 종양 염증성 미세환경을 유지하는 데 어떻게 도움이 되는지, 이러한 미세환경이 종양 세포 침입을 어떻게 촉진하는지와 같은 유방암 분야의 염증성 미세환경에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 종양 내 커뮤니케이션을 연구할 수 있는 저렴한 대안을 제공하고 종양 생물학의 특정 특징을 조사하기 위한 체외 3D 세포 시스템의 잠재력을 보여준다는 것입니다.특히 종양 공격성과 관련된 증상이 있습니다. 우선, 10 % FBS와 1 % 항생제 항진균제로 보충 된 10 밀리리터의 RPMI1640 배지에서 여섯 번째 U937 및 THP1 단핵구를 두 번 배양하십시오. 또한 보충된 DMEMF12 배지에서 신선한 PM을 배양하십시오.세포를 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 환경에서 배양합니다. 플레이트 4 시간 10에서 5 번째 단핵구를 해당 배지의 웰 당 1 밀리리터로 만듭니다. 각 웰에 삽입물을 배치하고 해당 배지의 다섯 번째 BrC 세포 현탁액에 4 곱하기 10의 900 마이크로 리터를 추가합니다.배양액을 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 환경에서 5일 동안 배양하고 상층액을 회수합니다. 후속 분석이 수행되는 경우 트립신화(trypsinization)를 통해 세포를 회수합니다. 각 배지와 함께 개별 세포 배양의 대조군을 포함합니다.세포 배양 전에 BrC 세포 및 단핵구를 시판되는 쿠메린(cumerine) 및 로다민(rhodamine)으로 라벨링하려면 관심 세포의 2배인 10에서 6번째 BrC 세포의 단층을 준비하고 표준 배지를 형광 염료의 충분히 예열된 작업 용액으로 교체합니다. 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 환경에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 염료 용액을 흡인하고 충분한 XPBS를 사용하여 세포를 부드럽게 헹굽니다.PBS를 흡입하고 표준 매체를 추가합니다. 세포를 트립신화하려면 플라스크에 05% 트립신 2밀리리터와 0.48밀리몰 EDTA를 넣고 섭씨 37도에서 5-10분 동안 세포를 배양합니다. 트립신화를 중지하기 위해 200마이크로리터의 FBS를 추가하고 보충제 없이 해당 배지 7ml를 추가합니다.피펫팅으로 세포를 다시 현탁시킨 다음 10마이크로리터의 세포를 Nuebauer 챔버로 옮기고 계수합니다. 다음으로, 세포를 430 배 g과 실온에서 5 분 동안 펠릿 화 한 다음 상등액을 버리고 3 밀리리터의 예열 형광 염료 작업 용액을 사용하여 세포를 다시 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 환경에서 30분 동안 배양합니다.세포를 다시 펠릿화한 후 염료 작업 용액을 버리고 1개의 XPBS를 5-7밀리리터로 사용하여 세포를 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 한 번 더 펠릿화하고 PBS를 폐기한 후 5-7밀리리터의 표준 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 세포 현탁액 10마이크로리터를 세십시오.4개의 웰 챔버 슬라이드 시스템의 각 웰에 균일한 층을 형성하기 위해 웰 바닥에 충분한 ECME를 퍼뜨려 공동 배양을 설정합니다. 플레이트: 웰당 5개의 시간, 10 내지 5번째 라벨링된 BrC 세포를 포함하는 단일 세포 현탁액의 20마이크로리터. 섭씨 37도에서 15-20분 후, 60% ECME가 보충된 80마이크로리터의 분석 배지에 있는 5번째 표지된 단핵구에 2.5 곱하기 10의 현탁액을 추가합니다.ECME가 섭씨 37도에서 15-20분 동안 응고되도록 합니다. 이제 BrC 세포와 단핵구 배양 배지의 1:1 혼합물 1ml를 추가합니다. 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 환경에서 24시간, 48시간 또는 5일 동안 공동 배양을 배양하여 다른 시점의 변화를 추적합니다.ECM 단백질을 분해하고 배양물에서 세포를 회수하려면 배지를 흡인 및 폐기한 다음 0.1% 트립신 및 0.25% EDTA가 포함된 0.5밀리리터의 XPBS를 배양액에 추가합니다. 세포를 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 배양 후 10% FBS가 포함된 1개의 XPBS 0.5ml를 첨가하여 트립신을 중화하고 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 격렬하게 피펫팅하여 세포를 다시 현탁시킵니다.세포를 펠릿화한 후, 상등액을 버리고 10% FBS를 가진 1개의 XPBS의 5 밀리리터에 있는 세포를 다시 현탁시키. 이 단계를 한 번 반복합니다. 세포 현탁액을 적절한 기기와 함께 팩스로 보냅니다.최종 개체군이 95% 이상 순수한지 확인합니다. 8개의 웰 챔버 슬라이드 시스템의 각 웰에 40마이크로리터의 ECME 베이스를 펴고 섭씨 37도에서 30분 동안 응고시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 400마이크로리터의 보충된 DMEM F12 배양 배지에 웰당 800개의 MCF10 A 세포를 파종합니다.그런 다음 400마이크로리터의 컨디셔닝 배지 또는 보충된 DMEM F12 배양 배지에 인간 재조합 IL1 베타 20나노그램을 추가합니다. 챔버 슬라이드를 PBS 2밀리리터로 채워진 35밀리리터 페트리 접시가 들어 있는 유리 페트리 접시에 놓습니다. MCF 10A 세포는 ECME 베이스의 손상을 방지하고 세포가 침전되어 단일체를 형성하는 것을 방지하기 위해 각 웰에 매우 천천히 파종해야 합니다.광학 현미경을 사용하여 14일 동안 24시간마다 선상 아시니 형성을 기록합니다. 14일간의 배양 후 XPBS 1개에 100마이크로리터의 100나노몰 다피를 첨가하고 25분 동안 계속 교반하면서 실온에서 샘플을 배양합니다. 실온에서 하나의 XPBS로 샘플을 헹굽니다., 일정한 교반을 하면서 각각 5분씩 3회.형광 염색에 특정한 장착 매체를 사용하여 준비물을 장착합니다. 그런 다음 장착된 샘플을 투명 광택제로 밀봉하고 섭씨 4도에서 빛으로부터 보호된 슬라이드를 유지합니다. 컨포칼 현미경에서 절차를 시연하는 것은 국립 고급 현미경 연구소(National Laboratory of Advanced Microscoping)의 연구원인 Vadim Perez가 맡을 것입니다.컨포칼 현미경으로 아시니를 분석하여 아시니의 다양한 깊이에서 횡단 스택의 이미지를 촬영합니다. 적절한 염색 프로토콜로 아시니(acini)의 다양한 세포 단백질을 시각화합니다. 예를 들어, caheren은 세포 대 세포 접착력, 세포 극성 및 구강 형성을 평가하기 위해 여기에 염색되었습니다.저밀도 및 고밀도의 3D 배양에서 성장하는 1차 BrC 세포의 형태를 5일에 걸쳐 연구했습니다. 처음 48시간 동안 세포는 길쭉한 방추체 모양으로 ECME에 부착되고 5일 후에 니트와 같은 구조를 형성합니다. 3D 공동 배양에서 5일 후, MCF7 및 MDA-MB-231 상용 BrC 세포는 모두 무질서한 응집체를 형성했습니다.그러나 공격적인 MDA-MB-231 셀은 길쭉한 형태의 응집체를 위한 반면, 비공격적인 MCF7 셀은 MDA-MB-231 셀보다 더 조밀하게 압축된 둥근 모양의 응집체를 위한 것입니다. 간접 상호 작용 3D 1차 BrC 배양 및 1차 단핵구와의 5일 공동 배양에서 얻은 상층액을 수확했습니다. IL1 베타 및 IL8의 현저한 증가는 1차 BrC 세포 단핵구 공동 배양에서 관찰되었습니다.결정적 사이토카인과 염증성 사이토카인 모두 이전에 악성 진행과 관련이 있었습니다. MCF10A 세포는 anoykis에 대한 내성의 척도로서 루멘 형성을 관찰하기 위해 두 개의 주요 BrC 세포주에서 두 개의 서로 다른 상등액으로 배양되었습니다. 표준 조건에서 성장한 MCF10A 세포와 달리 14일째에 이중 컨포칼 현미경 검사, 스페로이드의 횡단 절단은 MCF10A 세포가 아시니의 중심 세포 수를 계수하여 측정된 anoykis를 회피했음을 보여줍니다.이 절차에 따라 추가 질문에 답하기 위해 의료 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 두 암 이동에서 신호 전달 경로를 테스트합니다. 개발 후 이 기술은 종양 미세환경 분야의 연구자들이 3D 공동 배양 시스템에서 유방암 세포와 질량 세포, 섬유아세포, 호성영양 또는 종양 세포의 다른 클론과 소통하는 방법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 종양 미세환경을 모델링하기 위해 3D 배양 시스템을 구축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

analyzing-communication-between-monocytes-primary-breast-cancer-cells

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

우리는 그들의 microenvironment에서 유방 종양 세포와 다른 세포 간의 상호 작용의 실시간 라이브 세포 이미징을위한 3D coculture 모델을 개발했습니다 그 침략적 표현형에 충격 진행. 이 모델들은 invasiveness에 연루 paracrine 유발 proteolytic, 케모카인 / 시토킨 및 키나제 경로를 타겟으로하는 의약품에 대한 잠복기 화면으로 사용할 수 있습니다.

종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

간단한 방법은 관련 상피 세포에서 조직 섬유아 세포의 효과를 분석하는 설명되어 있습니다. 이 방법과 3 차원 조직 배양의 결합 차원에서 고립 후 세포의 분석을 용이하게하실 수 있습니다. 기술은 종양 세포에서 종양 - 관련 기질의 효과를 체계적으로 연구를 허용, 악성 잠재력을 변화의 세포에 적용됩니다.

세 가지 차원 혼합 셀 회전 타원체 공동 문화에서 Mammary 상피 세포의 분리

이 비디오는 세포외 기질 추출물(ECME) 기반 환경에서 유방암 세포와 단핵구의 상호 작용을 연구하기 위한 3D 공동 배양에 대해 설명합니다. 이 방법은 콜라겐 분해, 면역 세포 동원 및 세포 침입과 같은 특정 기능을 연구하는 데 도움이 됩니다.

직접 상호작용을 통한 3D 공동 배양: 암세포와 단핵구의 상호작용을 연구하기 위한 공동 배양

표준 배양 방법에 세포 생리 학적 환경 꺼내하고 접시의 플라스틱 표면에 성장합니다. 일차 인간 골수 세포의 거동을 연구하기 위해, 우리는 세포가 조직의 미세 환경을 네이티브 recapitulating 조건에서 재배되는 3-D 배양 시스템을 만들었다.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

이 문서는 유방암 세포의 침입을 정량화하는 3 차원 (3D) 분석의 사용에 대한 자세한 방법을 제공합니다. 특히, 우리는 세포가 침입 할 때 발생하는 멤브레인 무결성의 손실을 검사하는 등의 분석을 설정하는 데 필요한 절차, 정량화 및 데이터 분석뿐만 아니라 방법에 대해 설명합니다.

3 차원 (3D) 모델을 사용하여 유방암 세포 침윤의 정량화

우리는 산소와 영양분을 전달하기 위해 관류 생물 반응기 시스템을 사용하여 배양할 수 있는 3D 유방암 대리모를 생성하는 방법을 시연합니다. 성장 후, 대리모는 관심 매개변수의 평가를 위해 고정되고 파라핀으로 처리됩니다. 이러한 매개 변수 중 하나 인 세포 밀도의 평가가 설명됩니다.

준비 및 분석<em&gt; 체외</em&gt; 3 차원 유방 암 서로 게이트

종양 미세환경(TME)을 모방하기 위해 투과성 미다공성 멤브레인 삽입물을 조정했습니다. 이 모델은 혼합 세포 배양으로 구성되며, 형광 태깅 또는 세포 분류를 사용하지 않고 고도로 농축된 개별 세포 집단을 간단하게 생성할 수 있으며, 정상 또는 스트레스 조건에서 TME 내 세포 간 통신을 연구할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

여기, 우리는 전체, 그대로 마우스의 격리에 대 한 프로토콜 세포 외 기질 (ECM) 식과 ductal 형태를 조사 하는 유 방 땀 샘을 제시. 마우스 #4 복 부 동맥은 8 10 주 오래 된 여성 미 쥐, 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정, 단면화 및 immunohistochemistry ECM 단백질에 대 한 사용 하 여 스테인드에서 추출 되었다.

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

여기에 제시된 방법의 목적은 미세 환경 마이크로어레이(MEMA)가 배양된 세포의 표현형에 대한 수천 개의 간단한 조합 미세 환경의 영향을 심문하기 위해 제조되고 사용될 수 있는 방법을 보여주는 것입니다.

마이크로어레이를 사용하여 암 세포 표현형에 대한 미세 환경적 영향을 심문

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미생물 시스템을 사용하여 인간 유방 조직에서 유방암 모델링

배우세요 3차원 공배양 시스템을 이용한 유방암 세포와 단핵구 간 직접 및 간접 소통 분석 방법을. 이 기법은 종양 염증 미세환경과 면역 세포 활성화 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

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