(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

이 프로토콜의 전반적인 목표는 3차원 공동 배양 시스템에서 원발성 유방암 세포와 단핵구 간의 직간접적인 통신을 연구하는 것입니다. 이 방법은 면역 세포가 어떻게 재등급화되고 활성화되는지, 이러한 세포가 종양 염증성 미세환경을 유지하는 데 어떻게 도움이 되는지, 이러한 미세환경이 종양 세포 침입을 어떻게 촉진하는지와 같은 유방암 분야의 염증성 미세환경에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 종양 내 커뮤니케이션을 연구할 수 있는 저렴한 대안을 제공하고 종양 생물학의 특정 특징을 조사하기 위한 체외 3D 세포 시스템의 잠재력을 보여준다는 것입니다.

특히 종양 공격성과 관련된 증상이 있습니다. 우선, 10 % FBS와 1 % 항생제 항진균제로 보충 된 10 밀리리터의 RPMI1640 배지에서 여섯 번째 U937 및 THP1 단핵구를 두 번 배양하십시오. 또한 보충된 DMEMF12 배지에서 신선한 PM을 배양하십시오.

세포를 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 환경에서 배양합니다. 플레이트 4 시간 10에서 5 번째 단핵구를 해당 배지의 웰 당 1 밀리리터로 만듭니다. 각 웰에 삽입물을 배치하고 해당 배지의 다섯 번째 BrC 세포 현탁액에 4 곱하기 10의 900 마이크로 리터를 추가합니다.

배양액을 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 환경에서 5일 동안 배양하고 상층액을 회수합니다. 후속 분석이 수행되는 경우 트립신화(trypsinization)를 통해 세포를 회수합니다. 각 배지와 함께 개별 세포 배양의 대조군을 포함합니다.

세포 배양 전에 BrC 세포 및 단핵구를 시판되는 쿠메린(cumerine) 및 로다민(rhodamine)으로 라벨링하려면 관심 세포의 2배인 10에서 6번째 BrC 세포의 단층을 준비하고 표준 배지를 형광 염료의 충분히 예열된 작업 용액으로 교체합니다. 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 환경에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 염료 용액을 흡인하고 충분한 XPBS를 사용하여 세포를 부드럽게 헹굽니다.

PBS를 흡입하고 표준 매체를 추가합니다. 세포를 트립신화하려면 플라스크에 05% 트립신 2밀리리터와 0.48밀리몰 EDTA를 넣고 섭씨 37도에서 5-10분 동안 세포를 배양합니다. 트립신화를 중지하기 위해 200마이크로리터의 FBS를 추가하고 보충제 없이 해당 배지 7ml를 추가합니다.

피펫팅으로 세포를 다시 현탁시킨 다음 10마이크로리터의 세포를 Nuebauer 챔버로 옮기고 계수합니다. 다음으로, 세포를 430 배 g과 실온에서 5 분 동안 펠릿 화 한 다음 상등액을 버리고 3 밀리리터의 예열 형광 염료 작업 용액을 사용하여 세포를 다시 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 환경에서 30분 동안 배양합니다.

세포를 다시 펠릿화한 후 염료 작업 용액을 버리고 1개의 XPBS를 5-7밀리리터로 사용하여 세포를 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 세포를 한 번 더 펠릿화하고 PBS를 폐기한 후 5-7밀리리터의 표준 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 세포 현탁액 10마이크로리터를 세십시오.

4개의 웰 챔버 슬라이드 시스템의 각 웰에 균일한 층을 형성하기 위해 웰 바닥에 충분한 ECME를 퍼뜨려 공동 배양을 설정합니다. 플레이트: 웰당 5개의 시간, 10 내지 5번째 라벨링된 BrC 세포를 포함하는 단일 세포 현탁액의 20마이크로리터. 섭씨 37도에서 15-20분 후, 60% ECME가 보충된 80마이크로리터의 분석 배지에 있는 5번째 표지된 단핵구에 2.5 곱하기 10의 현탁액을 추가합니다.

ECME가 섭씨 37도에서 15-20분 동안 응고되도록 합니다. 이제 BrC 세포와 단핵구 배양 배지의 1:1 혼합물 1ml를 추가합니다. 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 환경에서 24시간, 48시간 또는 5일 동안 공동 배양을 배양하여 다른 시점의 변화를 추적합니다.

ECM 단백질을 분해하고 배양물에서 세포를 회수하려면 배지를 흡인 및 폐기한 다음 0.1% 트립신 및 0.25% EDTA가 포함된 0.5밀리리터의 XPBS를 배양액에 추가합니다. 세포를 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 배양 후 10% FBS가 포함된 1개의 XPBS 0.5ml를 첨가하여 트립신을 중화하고 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 격렬하게 피펫팅하여 세포를 다시 현탁시킵니다.

세포를 펠릿화한 후, 상등액을 버리고 10% FBS를 가진 1개의 XPBS의 5 밀리리터에 있는 세포를 다시 현탁시키. 이 단계를 한 번 반복합니다. 세포 현탁액을 적절한 기기와 함께 팩스로 보냅니다.

최종 개체군이 95% 이상 순수한지 확인합니다. 8개의 웰 챔버 슬라이드 시스템의 각 웰에 40마이크로리터의 ECME 베이스를 펴고 섭씨 37도에서 30분 동안 응고시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 400마이크로리터의 보충된 DMEM F12 배양 배지에 웰당 800개의 MCF10 A 세포를 파종합니다.

그런 다음 400마이크로리터의 컨디셔닝 배지 또는 보충된 DMEM F12 배양 배지에 인간 재조합 IL1 베타 20나노그램을 추가합니다. 챔버 슬라이드를 PBS 2밀리리터로 채워진 35밀리리터 페트리 접시가 들어 있는 유리 페트리 접시에 놓습니다. MCF 10A 세포는 ECME 베이스의 손상을 방지하고 세포가 침전되어 단일체를 형성하는 것을 방지하기 위해 각 웰에 매우 천천히 파종해야 합니다.

광학 현미경을 사용하여 14일 동안 24시간마다 선상 아시니 형성을 기록합니다. 14일간의 배양 후 XPBS 1개에 100마이크로리터의 100나노몰 다피를 첨가하고 25분 동안 계속 교반하면서 실온에서 샘플을 배양합니다. 실온에서 하나의 XPBS로 샘플을 헹굽니다., 일정한 교반을 하면서 각각 5분씩 3회

형광 염색에 특정한 장착 매체를 사용하여 준비물을 장착합니다. 그런 다음 장착된 샘플을 투명 광택제로 밀봉하고 섭씨 4도에서 빛으로부터 보호된 슬라이드를 유지합니다. 컨포칼 현미경에서 절차를 시연하는 것은 국립 고급 현미경 연구소(National Laboratory of Advanced Microscoping)의 연구원인 Vadim Perez

컨포칼 현미경으로 아시니를 분석하여 아시니의 다양한 깊이에서 횡단 스택의 이미지를 촬영합니다. 적절한 염색 프로토콜로 아시니(acini)의 다양한 세포 단백질을 시각화합니다. 예를 들어, caheren은 세포 대 세포 접착력, 세포 극성 및 구강 형성을 평가하기 위해 여기에 염색되었습니다.

저밀도 및 고밀도의 3D 배양에서 성장하는 1차 BrC 세포의 형태를 5일에 걸쳐 연구했습니다. 처음 48시간 동안 세포는 길쭉한 방추체 모양으로 ECME에 부착되고 5일 후에 니트와 같은 구조를 형성합니다. 3D 공동 배양에서 5일 후, MCF7 및 MDA-MB-231 상용 BrC 세포는 모두 무질서한 응집체를 형성했습니다.

그러나 공격적인 MDA-MB-231 셀은 길쭉한 형태의 응집체를 위한 반면, 비공격적인 MCF7 셀은 MDA-MB-231 셀보다 더 조밀하게 압축된 둥근 모양의 응집체를 위한 것입니다. 간접 상호 작용 3D 1차 BrC 배양 및 1차 단핵구와의 5일 공동 배양에서 얻은 상층액을 수확했습니다. IL1 베타 및 IL8의 현저한 증가는 1차 BrC 세포 단핵구 공동 배양에서 관찰되었습니다.

결정적 사이토카인과 염증성 사이토카인 모두 이전에 악성 진행과 관련이 있었습니다. MCF10A 세포는 anoykis에 대한 내성의 척도로서 루멘 형성을 관찰하기 위해 두 개의 주요 BrC 세포주에서 두 개의 서로 다른 상등액으로 배양되었습니다. 표준 조건에서 성장한 MCF10A 세포와 달리 14일째에 이중 컨포칼 현미경 검사, 스페로이드의 횡단 절단은 MCF10A 세포가 아시니의 중심 세포 수를 계수하여 측정된 anoykis를 회피했음을 보여줍니다.

이 절차에 따라 추가 질문에 답하기 위해 의료 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 두 암 이동에서 신호 전달 경로를 테스트합니다. 개발 후 이 기술은 종양 미세환경 분야의 연구자들이 3D 공동 배양 시스템에서 유방암 세포와 질량 세포, 섬유아세포, 호성영양 또는 종양 세포의 다른 클론과 소통하는 방법을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 종양 미세환경을 모델링하기 위해 3D 배양 시스템을 구축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.