Name: 공장 실험실에서 측정 하는 표면에 박테리아의 부착 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 배우세요 식물 표면에 박테리아 부착을 측정하는 방법을. 뿌리와 새싹을 대상으로 한 이 기술은 식물 병리학과 식품 안전 연구에 활용됩니다. 현미경 관찰과 생존 세포 계수로 박테리아 결합을 분석합니다.

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저자는 실험의 일부 지원에 대 한 수치와 카밀 마틴과 힐러리 Samagaio의 준비에 대 한 수잔 윗 필드를 감사합니다.

<ol><li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li>
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<li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li>
<li>Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe-plant+interactions%3A+principles+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+Van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Microbe-plant interactions: principles and mechanisms.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).</li>
<li>Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+genomics+and+adaptation+to+life+on+plants%3A+implications+for+the+evolution+of+pathogenicity+and+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).</li>
<li>Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Plant+Growth-Promoting+Bacteria+for+Biocontrol+of+Plant+Diseases%3A+Principles%2C+Mechanisms+of+Action%2C+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).</li>
<li>Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+retention+of+pathogenic+Escherichia+coli.+O157+by+sprouts%2C+leaves+and+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits.</a> Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).</li>
<li>Fuqua, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+bacterial+biofilms+associated+with+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying bacterial biofilms associated with plants.</a> Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).</li>
<li>Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+Escherchia+coli.O157%3AH7+to+alfalfa%2C+human+epithelial+cells%2C+and+plastic+is+mediated+by+a+variety+of+surface+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+cellulose%2C+poly-beta-1%2C6-n-acetyl-D-glucosamine%2C+and+colanic+acid+are+required+for+optimal+binding+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+strains+to+alfalfa+sprouts+and+K-12+strains+to+plastic+but+not+for+binding+to+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).</li>
<li>Matthysse, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., Kijne, J. W. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9780792351801">The Rhizobiaceae</a>. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Kluwer Academic Press. 235-249 (1998).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01276821">Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells.</a> Protoplasma. 183, 131-136 (1994).</li>
<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+Agrobacterium+tumefaciens.+attR+mutation+on+attachment+and+root+colonization+differs+between+legumes+and+other+dicots%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).</li>
<li>Jeter, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+binding+of+diarrheagenic+strains+of+E.+coli.to+plant+surfaces+and+the+role+of+curli+in+the+interaction+of+the+bacteria+with+alfalfa+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+Agrobacterium+tumefaciens+is+reduced+in+cel%2C+attB%2C+attD%2C+and+attR+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analyses+of+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analyses of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 3 (2012).</li>
<li>Brandl, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+lesions+promote+the+rapid+multiplication+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+postharvest+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).</li>
<li>Franz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+contamination+of+lettuce+by+GFP-expressing+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 1 (2012).</li>
<li>Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+seed+and+root+exudate+sugars%3A+composition%2C+utilization+by+Pseudomonas+biocontrol+strains+and+role+in+rhizosphere+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization.</a> Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x/abstract">A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).</li>
<li>Danhorn, T., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+plant-associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by plant-associated bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15639628">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+microbial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li>
<li>Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+growth+of+Salmonella+enterica+and+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+alfalfa+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).</li>
<li>Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/240593829_Lognormal_Distribution_of_Bacterial_Populations_in_the_Rhizosphere">Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere.</a> Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, 252(2014).</li>
<li>Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+mutants+affected+in+attachment+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells.</a> J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).</li>
<li>Tomlinson, A. D., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+regulation+of+polar+surface+attachment+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 708-714 (2009).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, (2014).</li>
<li>Wright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endophytic+lifestyle+of+Escherichia+coli+O157%3AH7%3A+quantification+and+internal+localization+in+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots.</a> Phytopathology. 103, 333-340 (2013).</li>
<li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li>
<li>Erickson, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+and+Fate+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+Leafy+Green+Phyllosphere+Tissue+Using+Various+Spray+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions.</a> J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).</li>
<li>McKellar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+approaches+for+modeling+Escherichia+coli+O157%3AH7+survival+on+field+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce.</a> Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).</li>
<li>Wu, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+detection+and+enumeration+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+alfalfa+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds.</a> Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).</li>
</ol>

저자는 그녀는 아무 경쟁 금융 관심사가 선언 합니다.

그것은 모든 실험 기간 동안 박테리아 고착 수 표면에 자각 하는 것이 중요입니다. 따라서 유리에 바인딩 할 수 있다 박테리아 수 있습니다 과소 평가 될 가능한 셀 계산 한다면 유리 튜브와 펫을 사용 하 여. 경우 고 일부는 agar agar 또는 토양 식물 재배 또는 토양 식물에 남아 다음 박테리아 수 있습니다 바인딩 접착 소재 보다는 식물. 다른 한편으로, 식물 표면, 특히 뿌리의 경우 세척을 제거할 수 있습니다 자연 표면 코팅과 같은 점 막 따라서 준수 테스트의 결과 변경.
그것은 외피 혼합물에 추가 하는 박테리아 실험 기간 동안 살아 남아 특정 해야 합니다. 따라서 자유로 연결 된 박테리아의 가능한 셀 카운트 정기적으로 해야 한다. 일부 치료 또는 세균성 돌연변이 세균 성장 속도 감소 또는 실제로 세균성 인구의 일부분의 죽음의 원인이 있습니다. 라이브 하 고 죽은 박테리아 특별 한 얼룩 사용 하지 않으면 현미경에 구별할 수 있습니다. 라이브/죽은 박테리아의 유용한 얼룩 키트 살아있는 박테리아에서 염료의 배제에 달려 있다. 그러나, 세균성 종의 혼합된 인구는 존재 하는 경우 다음의 종의 가능한 셀 수 것입니다는 인큐베이션 세균성 죽음 귀착되 여부를 결정 하는 가장 쉬운 방법.
중간 구성 세균성 생존 및 성장을 좌우할 것 이다. 루트 exudate 및 자료 상처에서 나왔고 사이트 잘라 겸손 세균성 성장을 지원 하기 위해 기판을 제공할 것입니다. 인산 염, 질소, 그리고 철이이 조건에 제한 되 경향이 있다. Divalent 양이온 칼슘, 마그네슘 등 접착에 영향을 미칠 수 있습니다. 어떤 경우에 접착에 영향을 미칠 수 있는 탄소 소스. pH도 중요 하다. 일반적으로 rhizosphere의 pH는 5.5 및 6.5 사이입니다.
그것은 박테리아 항 생 저항으로 표시를 사용 하 여 조심 해야 합니다. 가장 자주 사용 하는 항생제는 리 팜 피신 및 nalidixic 산. 이러한 항생제에 저항 염색체 유전자에 있는 돌연변이 때문에 일반적으로 (RNA 중 합 효소와 gyrase, 각각) 이며 따라서 쉽게 전송할 수 없습니다 다른 긴장에는 부 화 하는 동안. 저항의이 유형은 또한 되지는지 않습니다 저하 또는 항생제의 수정. 플라스 미드 부담 유전자 표시와 함께 표시 하는 박테리아 플라스 미드는 다른 박테리아를 전송할 수 없습니다 않는 한 권장 하지 않습니다. 민감한 박테리아 항생제 내성 박테리아에 인접해 있다면 항생제 접시에 성장 수 다음으로 항생제 내성 때문에 항생제의 저하 또는 화학 수정 되지 않아야 합니다.
이 문서에서 설명 하는 방법은 샘플 (예: 인간 병원 체를 포함 하는 실험) 포함 될 필요가 작은 샘플 크기 및 실험에 대 한 유용 합니다. (위 재료 또는 50 개 이상의 식물의 100 g) 큰 샘플 크기에 대 한 다른 방법 또는이 방법의 과감 한 수정 것입니다 필요10,19,32,,1933, 34 , 35 , 36. 공부 되 고 종 이외의 미생물의 많은 수의 존재는 중요 한 문제를 초래할 수도 있습니다. 가능한 솔루션에는 형광 단백질 또는 항생제 저항 6.1.2-7.3 단계에 설명 된 대로 표시 된 박테리아를 사용 하 여 포함 됩니다. 그러나, 관심의 박테리아는 다른 미생물의 큰 인구에서 드문 개인 때 이러한 마커 공부 되는 박테리아의 수의 명확한 평가 수 있도록 적절 한 않을 수 있습니다.
여기에 설명 된 방법 중 모두 실험실 기반 방법. 작은 수정 온실 연구 필요할 것 이다. 더 많은 주요 수정 원생 동물, 곤충과 다른 동물 포식, 기후 변화 실험에 대 한 정의 된 조건의 규정을 복잡 분야 연구에 필요한 될 가능성이 있습니다. 미래에 이러한 방법은 식물 표면에 두 개 이상의 미생물의 상호 작용을 포함 하도록 확장할 수 있습니다.

식물의 표면에 세균성 바인딩의 측정 3 개의 서로 다른 상황에서 중요 한 되고있다. 첫 번째 상황은 식물 표면1,2,3에 인간 병원 체의 전송의 시험. 목표는 여기 세균성 바인딩 방지 제거 또는 바운드 박테리아를 죽 일 하는 것입니다 따라서 공장 설비 재료에 의해 질병의 전송을 줄이기 위해. 두 번째 상황은 표면4공장 식물 병원 체의 바인딩의 시험입니다. 다시 한번 목표 여기 바인딩 방지 제거 또는 바운드 박테리아를 죽 일 하는 것입니다 따라서 질병을 줄이기 위해. 세 번째 공생 또는 식물 성장을 승진 시키는 박테리아5,6의 바인딩의 시험 이다. 목표는 여기 세균성 바인딩 및 따라서 증가 식물 건강 및 작물을 홍보 하는 수익률.
이 문서에서 설명 하는 서피스 공장 세균성 바인딩 측정 기술을 저렴 하 고 비교적 수행 하기 쉬운 있습니다. 유일한 요구 사항은 현미경 및 세균 학 실험실에서 일반적으로 자료입니다. 몇 가지 기법에 대 한 목욕 sonicator 유용합니다. 설명 된 기술은 바인딩 상대적으로 작은 샘플 크기를 사용 하 여 실시 하는 실험을 위해 설계 되었습니다. 바인딩의 측정 분야 또는 온실에서 사용 하기 위해 이러한 기술 중 일부를 수정할 수 수 있지만, 실험실에서 만들어집니다.
이 기술은 세균성 바인딩 뿌리, 콩나물, 절단된 잎, 컷 과일과는 실험실7,,89,10,11, 체리 토마토를 그대로 측정 하 사용 되었습니다. 12,13,,1415. 그들은 또한 토양에서 성장 하는 식물의 뿌리 식민지를 측정 하거나 실험실16모래 사용 되었습니다. 기술은 많은 세균성 종 등 Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, 대장균, 살 모 넬 라 enterica, 슈 도모 나 스 fluorescens와 함께 사용 되었습니다. A. tumefaciens 의 표면 상호 작용을 평가 하기 위한 방법 중 유용한 설명 (2012 년)17모 튼 및 Fuqua에 찾을 수 있습니다. 모든 경우에 포함 된 샘플 크기 작은, 더 적은 일반적으로 25-50 식물 보다 했다. 설명 포함 된 실험 기간 동안 유지 될 필요가 있는 인간의 병원 체와 함께 사용을 위해 적당 하다.

<table><tbody><tr><td>광학 현미경</td><td></td>: <td>N/A</td><td>위상차 또는 Nomarski 광학 장치가 도움이 되며, 형광 마커를 사용하는 연구에는 형광 현미경이 필요합니다.</td></tr><tr><td>씨앗</td><td>어떤&nbsp;</td><td>N/A</td>, <td>씨앗 로트 번호와 품종</td></tr><tr><td>표백제를</td><td></td> 기록해 두십시오. <td>어떤 N/A</td><td></td></tr><tr><td>목욕 초음파 처리기</td>든지, <td>어떤 과학 공급 회사</td>든지, <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>영양 한천;</td><td>디프코&nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>소이톤</td><td>Difco&nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>모래</td><td>바다 모래 피셔 사이언티픽</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>모래</td><td>&nbsp; 시그마-알드리치</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>콘테이너</td><td>스투베 & 아들, Inc.</td><td>Ray-Leach 콘 테이너는</td><td>자라고자하는 식물의 유형에 맞게 다양한 크기를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>파라 필름</td><td>모든 과학 공급 회사</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>MS 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>파라 핀</td><td>모든</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td>모든 과학 회사</td><td>N / A</td><td>펠릿 대부분의 박테리 10,000 XG의 최대 힘을 가진 작은 원심 분리기 만 </td></tr><tr><td>필요한 와류 믹서</td><td>모든 과학 회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 미터</td><td>ACCU-SCOPE 액세서리</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Sedgwick-rafter 카운팅 셀</td><td>하우저 과학</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>프로브 클립 프레스 씰 인큐바틴 챔버</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>리팜피신</td><td>시그마 알드리치</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>날라딕산</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>생염색제/사염색</td>제<td>: In Vitrogen Molecular Bioprobes</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

공장 실험실에서 측정 하는 표면에 박테리아의 부착

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

이 원고는 가벼운 현미경에 사용 가능한 셀 카운트 axenic 식물 표면에 세균성 바인딩을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 사용 되는 식물 재료 뿌리, 콩나물, 잎를 포함 하 고 과일을 잘라. 설명 하는 메서드는 저렴, 쉽게, 그리고 작은 샘플 크기에 적합. 바인딩 실험실에서 측정 되 고 부 화 미디어의 다양 한 사용할 수 있습니다. 억제제의 효과 확인할 수 있습니다. 상황을 홍보 하 고 바인딩에 억제 평가 수 있습니다. 경우에 따라 다양 한 조건 변경 바인딩 주로 박테리아 나 식물에 그들의 효과 때문 인지 구별 가능 하다.

A. tumefaciens colonizes 루트 표면. 셀 루 로스 종합을 방지 하는 세균성 돌연변이의 효과 했다 셀 루 로스의 세균 생산 루트 식민에 역할 여부를 결정 하기 위해16을 검사 합니다. 1.3과 7.1 단계에 설명 된 기술은 사용 했다. 토마토 종자 표면 소독 및 살 균 물에서 출 아 했다 했다. 뿌리 길이 약 2 m 때 그들은 mL 당 105 박테리아의 현 탁 액에 담근 고 용기에 저온 살 균된 토양에 심어. 식물 빛/12 h 12 h 어두운 사이클에 25 ° C에서 14 일 동안 성장 했다. 식물 번 표시 된 후 컨테이너에서 제거 되었습니다. 뿌리를 씻어 고 바인딩된 박테리아를 제거 하는 목욕 sonicator에서 sonicated. 세균 숫자는 가능한 셀 수를 사용 하 여 결정 했다. 그림 2 는 토마토 뿌리를 식민지 화 하는 박테리아의 기능에 두 개의 다른 셀 룰 로스-마이너스 돌연변이의 효과 보여준다. 일부 측정의 표준 편차는 0.9 로그10 (측정의이 유형의 일반적인 문제) 높은 셀 룰 로스-마이너스 돌연변이의 바인딩 감소 명확 하 게 분명 하 고 우리가 결론 지을 수의 세균 생산 셀 루 로스는 토마토 뿌리의 식민지에서 박테리아를 에이즈.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> 그림 2 : 야생 유형 및 A. tumefaciens의 셀 룰 로스-마이너스 돌연변이 의해 식민 뿌리. 로그10 cm 루트 길이 토마토 뿌리에서 발견 한 박테리아의 총 수는 야생 타입 A. tumefaciens 스트레인 C58와 셀 루 로스-마이너스 돌연변이 C58:1와 C58:A60 주사. 표시 된 숫자는 최소 4 개의 별도 실험에서에서 수단. 막대의 표준 편차를 나타냅니다. 뿌리는 한 분 mL 당 105 박테리아의 정지에서 그들을 담거 서 주사 했다. 용기에 식물 재배 하 고 느슨하게 부착 박테리아 세척 유리 유리병에 버퍼에서 뿌리를 세척 하 여 제거 되었습니다. 단단히 부착 박테리아 목욕 sonicator 가능한 셀 계산16결정 하 도금 결과 현 탁 액을 사용 하 여 제거 되었습니다. 이 그림은 Matthysse와 McMahan에서 수정 되었습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
알 팔 파 콩나물을 다른 박테리아와 대장균 의 바인딩에서 exopolysaccharides의 역할은 시험 되었다. 대장균 O157:H7에의 한 설사 질병의 몇몇 발발 오염 된 알 팔 파 콩나물을 추적 했습니다. 야생-타입 박테리아와 다양 한 exopolysaccharides를 만들 수 없습니다 돌연변이의 바인딩 1.1, 5.1, 7.2 단계에 설명 된 방법을 사용 하 여 측정 했다. 알 팔 파 콩나물 표면 소독 하 고 어둠 속에서 25 ° C에서 살 균 물에 하루 동안 출 아 했다 했다. 연결 된 씨 외 투를 가진 4 개의 콩나물 무 균 플라스틱 요리 물 5 mL에에서 배치 했다. Luria 국물에서 성장 하는 박테리아는3 mL 당 약 5 x 10의 최종 농도에 추가 되었습니다. 접종된 콩나물 3 일 동안 어둠 속에서 25 ° C에서 인 큐베이 팅 했다. 콩나물 활발 한 전도 된 유리병에 메 마른 물 5 mL에 두 번 씻어 고는 모터 구동 테 플 론 유리 균질 화기를 사용 하 여 버퍼를 세척에 무 균. 박테리아를 사용 하 여 이전 실험 표면 박테리아는 쉽게 관찰 되었다 비록 아무 내 면된 박테리아를 보여주었다 GFP 유전자를 운반 하는 플라스 미드로 표시. 결과 표 1에 표시 됩니다. E. 콜라이 O157:H7의 2 개의 긴장 시험 되었다. 모두 긴장에서 폴 리-β-1, 6-glucuronic acid(PGA)의 생산 표면 식물 병원 성 대장균 의 바인딩에 가장 큰 기여를 할 것 처럼 보였다. 장 산도 바인딩에서 중요 한 역할을 했다. 바인딩 셀 룰 로스-마이너스 돌연변이에 감소는 중요 한 하는 동안 다른 두 류 대는 큰 했다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">콩나물과 오픈 시드 코트에 바인딩의 E. 대장균 O157:H7에 Exopolysaccharide 생산 유전자에 있는 돌연변이의 효과</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">세균성 긴장</td>
			<td rowspan="2">돌연변이 또는 유전자 (관련 형)</td>
			<td colspan="2">박테리아의 로그10 수 새싹 또는 씨 외 투 바운드</td>
		</tr>
<tr>
<td>알 팔 파 콩나물b
</td>
			<td>오픈 씨 코트</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>없음 (야생 타입)</td>
			<td>4.7 ± 0.6</td>
			<td>5.6 ± 0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (셀 루 로스-빼기)</td>
			<td>2.9 ± 0.7c
</td>
			<td>3.5 ± 0.6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624 C</td>
			<td>
wcaD (저 승 산 마이너스)</td>
			<td>1.8 ± 0.7c
</td>
			<td>2.4 ± 0.5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624 P</td>
			<td>
pgaC (PGA-빼기)</td>
			<td>&lt; 1.0c
</td>
			<td>1.0 ± 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>없음 (야생 타입)</td>
			<td>5.6 ± 0.2</td>
			<td>6.1 ± 0.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (셀 루 로스-빼기)</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
			<td>4.1 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (저 승 산 마이너스)</td>
			<td>3.9 ± 0.5c
</td>
			<td>4.8 ± 0.8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
pgaC (PGA-빼기)</td>
			<td>&lt; 1.0c
</td>
			<td>1.2 ± 0.7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">최소 3 일 후에 행 하는 박테리아의 수 (로그10)의 3 측정의 평균 ± 표준 편차입니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">b 콩나물 측정 하기 전에 세척 했다.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">크게 다른 야생 타입 c: P &lt; 0.01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">크게 다른 야생 타입 d: P &lt; 0.05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">이 테이블은 Matthysse, Deora, Mishra, 그리고 토레스10에서 수정 되었습니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1:의 바인딩에 exopolysaccharide 생산 유전자에 있는 돌연변이의 효과 대장균 을 O157:H7 콩나물. 다양 한 exopolysaccharides 및 병원 성의 바인딩에 lipopolysaccharide의 역할을 결정 하기 위하여 대장균 O157:H7 긴장을 알 팔 파 새싹, 콩나물과 오픈 시드 코트에 돌연변이의 세트의 바인딩 메서드를 사용 하 여 조사 되었다 6 단계에서 설명합니다. 결과 보여 그 폴 리-ß-1, 6-N-아 세 틸-D-글루코사민 (PGA) 콩나물에 대 한 바인딩을 위한 필수적인 것으로 나타나고 그 셀 룰 로스 및 colanic 산이 대장균 O157의 최대 바인딩 필요. 이 테이블은 Matthysse, Deora, Mishra, 그리고 토레스10에서 수정 되었습니다.
PGA의 생산 공장 표면, 인코딩 PGA에 필요한 유전자 복제 오 페론을 들고 플라스 미드 (pMM11) 세균성 바인딩 되도록 충분 한 지 확인 하기 위해 생산 하지 것이 두 개의 서로 다른 박테리아에 도입 되었다 일반적으로 토마토 뿌리10에 바인딩할 수 있습니다. A. tumefaciens A1045은 야생 타입 스트레인 C58 순환-β-1, 2 글 루 칸을 만드는 데 실패 하 고 또한 표면29공장에 바인딩할 실패의 돌연변이. Sinorhizobium meliloti 파에 뿌리 혹을 형성 하는 1021 비 콩에 바인딩하지 못합니다 토마토12를 포함 하 여. 1.1, 5.1, 6.3, 및 7.1 단계에 설명 된 기술은 일반적으로 PGA 하 루트 표면에 세균성 바인딩 증가 결정 하 사용 되었다. 토마토 종자 표면 소독 및 살 균 물에서 출 아 했다 했다. 뿌리 했다 세그먼트 길이 1cm로 잘라 하 고 메 마른 물에 박테리아를 주사 했다. 이 두 종의 박테리아를 서로 다른 속도로 성장, 바인딩 세균 성장의 대략 동일한 금액에 대 한 수 있도록 다른 시간에 측정 했다. 플라스 미드 pMM11의 존재는 두 종 (표 2)10의 바운드 박테리아의 수에서 비슷한 크게 증가 발생합니다. 바인딩 크게 증가 가벼운 현미경에 또한 보였다 하지만 바인딩 두 종 (그림 3)에 대 한 매우 달랐다. A. tumefaciens A1045 개별 박테리아 루트 표면에 바인딩됩니다. S. meliloti 박테리아의 몇 가지 루트에 직접 연결 된 박테리아의 대다수는 다른 박테리아에 연결 된만 있는 큰 클러스터에 바인딩된. 이 예제는 단순히 현미경 관측을 포함 하지 않고 행 하는 박테리아의 숫자를 분석 그 실험의 결과 대 한 잘못 된 인상을 줄 수를 보여 줍니다. 하지만 두 방법 (가능한 셀 개수와 현미경 관찰) 보여 그 pMM11 증가 토마토 뿌리에 세균성 바인딩, PGA의 생산에 의해 발생 하는 바인딩 형식을 달랐다 두 세균 종10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">토마토 뿌리에 바인딩의 박테리아에 플라스 미드 pMM11의 효과</td>
		</tr>
<tr>
<td>세균성 긴장</td>
			<td>플라스 미드</td>
			<td>박테리아의 수 mm 루트 길이 당 바인딩</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens A1045는는
</td>
			<td>없음</td>
			<td>103 ± 0.25 x 103 x 0.25
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (벡터)</td>
			<td>103 ± 0.25 x 103 x 0.25
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (PGA 합성)</td>
			<td>10 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. meliloti 1021b
</td>
			<td>없음</td>
			<td>감지 없음</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (벡터)</td>
			<td>감지 없음</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (PGA 합성)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">세균성 바인딩 2 시간 후에 측정 되었다</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b 세균성 바인딩 18 시간 후에 측정 했다</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">이 테이블은 Matthysse, Deora, Mishra, 그리고 토레스10에서 수정 되었습니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2:의 바인딩을에 PGA의 합성에 대 한 유전자를 운반 하는 플라스 미드의 효과 A. tumefaciens A1045 및 S. meliloti 토마토 루트 세그먼트 1021. 폴 리-ß-1, 6-의 능력을 시험 하기 위하여N-아 세 틸-D-글루코사민 (PGA) 공장 박테리아의 바인딩을 촉진 뿌리, 식물 관련 된 박테리아의 2 개의 긴장의 바인딩에 PGA (pMM11)을 만들 수 있는 능력을 부여 하는 플라스 미드의 효과 토마토 뿌리는 시험 되었다. 어느 긴장 박테리아의 유전자 PGA 합성 (pBBR1mcs)을 인코딩 없이 플라스 미드 플라스 미드의 존재 또는 부재에 토마토 뿌리에 중요 한 바인딩을 보여주었다. PGA 합성 유전자를 운반 하는 플라스 미드의 추가 바인딩 두 가지 유형의 박테리아에 의해 증가 했다. 때문에 A. tumefaciens S. meliloti 바인딩 S. meliloti에 대 한 18 h 그리고 A. tumefaciens 에 대 한 보육의 2 시간 후 측정 되었다 보다는 빨리 성장 한다. 7 단계에서 사용 된 기술은 그 기술 된다. 이 테이블은 Matthysse, Deora, Mishra, 그리고 토레스10에서 수정 되었습니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> 그림 3 : A. tumefaciens A1045 바인딩과 S. meliloti 1021 토마토 루트 머리카락에 PGA 생 합성 유전자를 운반 하는 플라스 미드 pMM11의 효과. A의 토마토 루트 머리카락 바인딩) A. tumefaciens A1045, B) A. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021, 및 D) S. meliloti 1021 pMM11. 비록 2 개의 세균성 종의 바인딩 증가 대략 비슷합니다 가벼운 현미경에서 보듯이 바인딩 세부 매우 다르다. 6 단계에서 사용 된 기술은 그 기술 된다. 이 그림은 Matthysse, Deora, Mishra, 그리고 토레스10에서 수정 되었습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
그것은 때로는 생물학적 인 표면에 바인딩을 사용 하 여 박테리아의 특정 상호 작용에 식물의 기여를 구별에 도움이 수 있습니다. A. tumefaciens 의 유 니 폴라 polysaccharide(UPP) 두 생물과 비 생물 표면30의 다양 한 세균성 바인딩 중재 수 표시 되었습니다. 칼슘은 식물 표면 UPP28에 의해 중재 A. tumefaciens 바인딩을 억제 하 관찰 되었다. 식물의 표면에 세균 바인딩의 칼슘 이온에 의해 저해 박테리아 나 식물 표면 효과 때문 인지를 파악 하기 위해 나일론 스레드를 박테리아의 바인딩 시험 되었다. 단계에서 설명 하는 기술을 8.2 사용 되었다. 토마토 종자 표면 소독 하 고 물 1 단계에 설명 된 대로에 출 아 했다 했다. 박테리아 자당과 최소한의 매체에서 성장 하 고 토마토 뿌리 또는 약 105/mL의 최종 농도에 나일론 스레드 5.1 단계에서 설명한 대로 추가 되었다. 에 세균에 바인딩 토마토 뿌리 및 나일론 스레드 추가 CaCl2 의 효과 현미경에서 시험 되었다. 그림 4 는 칼슘 중 표면 제안 칼슘의 효과 주로 박테리아10을 사용 하 여 바인딩의 유사한 금지를 보여준다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> 그림 4 : 토마토 루트 머리카락과 나일론 스레드 A. tumefaciens 의 바인딩에 칼슘의 효과. 1시 10분에서 토마토 뿌리 (A와 B) 또는 24 h에 대 한 나일론 스레드 (C 및 D) A. tumefaciens 를 incubated MS 염과 1시 20분의 희석 AB 최소한의 매체, 0.4% 자당 (A와 C) 또는 1:10에서 희석 MS 염과 1시 20분의 희석 AB 최소 매체의 희석 포함 하는 60 m m CaCl2 (B와 D)310.4% 자당. 추가 CaCl2 뿌리와 나일론 스레드 억제 보다 식물 표면에 박테리아에 영향 때문에 주로 이었다 제안 모두에 세균성 바인딩을 저해. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

측정 및 식물, 특히 뿌리와 콩나물, 세균성 접착을 위한 쉬운 방법이이 문서에 설명 되어 있습니다.

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 박테리아가 식물 표면에 결합하는 것을 관찰하고 측정하는 것입니다. 이 방법은 식물 병리학과 식품 안전 분야 모두에서 중요한 질문들에 대한 답을 제공할 수 있습니다. 특히, 박테리아가 식물 표면에 어떻게 결합하는지와 이를 어떻게 제거할 수 있는지에 대한 의문에 답할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 쉽고 빠르며 비용이 저렴하다는 것입니다. 수경 재배 묘를 준비하려면 30, 50, 100 또는 150 milliliter 유리 비커에 소량의 씨앗을 넣으십시오. 여기서는 토마토 씨앗이 사용되었습니다.종자를 80% ethanol로 덮고 가볍게 흔들어 줍니다. 그다음 종자를 1분 동안 담가 둡니다. ethanol을 따라내고 50% 상용 표백제, 0.1% Triton X-100 및 수돗물 혼합액에 종자를 완전히 잠기게 합니다.종자를 20분 동안 담가두며, 콩과 같이 종자가 큰 경우에는 더 오래 담가둡니다. 표백제 혼합액을 따라 버리고 멸균수로 종자를 3회 세척하며, 매 세척 시마다 종자를 물에 1분 동안 담가둡니다. 종자와 소량의 물을 멸균 페트리 접시에 붓고, 유묘가 1cm에서 10cm 사이의 원하는 크기에 도달할 때까지 암소에서 배양합니다.모래에서 성장시킨 종자 또는 묘목을 준비하려면, 종자와 식재 재료를 멸균한 후 텍스트 프로토콜에 따라 종자 또는 묘목에 박테리아를 접종하십시오. 멸균된 유리 막대를 사용하여 종자를 표면 아래에 배치할 수 있을 만큼만 모래에 얕은 구멍을 뚫습니다. 구멍에 종자를 넣고 얇은 모래 층으로 덮어줍니다.그 다음, 수분 손실과 외부 미생물의 유입을 막기 위해 밀봉 필름으로 용기 상단을 밀봉합니다. 식물의 종과 품종에 적합한 온도 및 일장 조건의 실험실 조명 아래 또는 온실에서 식물을 재배하십시오. 모종을 모래에 심습니다.멸균된 유리 막대를 사용하여 구멍을 만듭니다. 그다음 멸균된 스테인리스 스틸 코바늘을 사용하여 뿌리를 구멍 속으로 조심스럽게 안내하고, 모래를 사용하여 구멍의 측면을 채웁니다. 텍스트 프로토콜에 따라 박테리아와 함께 식물을 배양한 후, 현미경 슬라이드 위의 물 한 방울 또는 배양 배지에 샘플을 놓아 현미경 관찰용 샘플을 준비하고 이를 직접 관찰합니다.가시적인 유리 박테리아가 없는 경우, 박테리아가 사멸했거나 배양을 수행한 용기 벽면에 결합했을 수 있습니다. 시료를 액체가 담긴 바이알에 넣고 바이알을 부드럽게 뒤집어 물이나 배양 배지로 세척하십시오. 그 다음, 관찰을 위해 신선한 액체와 함께 시료를 현미경 슬라이드 위에 올리십시오.시료를 마운팅하려면 일반적인 커버 슬립을 사용하십시오. 시료가 두꺼워 돌출부가 생기는 경우, 가장자리에 고무 또는 플라스틱 링이 있는 프레스용 웰에 액체와 시료를 넣고 커버 슬립을 덮으십시오. 그 위에 슬라이드를 올리고 가볍게 눌러 커버 슬립과 슬라이드를 밀봉하십시오.슬라이드를 뒤집어 시료를 검사합니다. 또는, 유사한 방식으로 조류 계수 슬라이드와 커버 글라스를 사용하여 20배 이하의 배율로 관찰합니다. 모래에서 배양한 식물에서 발견되는 생존 박테리아 수를 결정하려면, 먼저 용기의 상단과 하단에서 밀봉재를 제거하는 것으로 시작하십시오.멸균지와 용기를 겹쳐 놓은 후, 용기를 표면에 가볍게 두드려 모래를 느슨하게 만든 다음 식물이 포함된 모래를 용기에서 조심스럽게 들어 올립니다. 모래 원통과 식물이 종이 위에 완전히 분리되면, 모래의 중앙을 갈라 식물 뿌리를 확인합니다. 필요에 따라 용기 가장자리 근처와 뿌리 근처의 모래 샘플을 함께 채취합니다.이는 박테리아의 확산, 축적 및 성장을 결정하는 데 유용할 수 있습니다. 뿌리를 들어 올려 정해진 부피의 물이나 완충액에 담그고 가볍게 흔들어 느슨하게 부착된 모래와 박테리아를 제거합니다. 결과물인 현탁액을 Luria agar와 같은 적절한 배지에 도말하여 박테리아의 생존 세포 수를 측정합니다.이는 뿌리와 느슨하게 결합된 박테리아의 수를 나타냅니다. 마지막으로, 초음파 처리를 통해 강하게 결합된 박테리아를 제거하고 그 수를 측정합니다. 이 그래프는 두 가지 서로 다른 cellulose minus 돌연변이가 박테리아의 토마토 뿌리 군집화 능력에 미치는 영향을 보여줍니다.일부 측정값의 표준 편차가 0.9 log base of 10만큼 높았음에도 불구하고, cellulose 결핍 돌연변이체의 결합 감소는 분명하게 나타났습니다. 본 실험에서는 다양한 외다당류를 생성하지 못하는 돌연변이체에서 야생형 E.Coli 0157:H7의 알팔파 싹 결합력을 측정하였습니다. 두 균주 모두에서 poly-beta one six glucuronic acid(PGA)의 생성이 병원성 E.coli의 식물 표면 결합에 가장 크게 기여하는 것으로 보였습니다.Colanic acid 또한 결합 과정에서 중요한 역할을 했습니다. 여기서는 식물 표면에 결합하지 못하는 두 가지 박테리아 균주가 PGA를 생성하도록 조작하여, PGA가 토마토 뿌리에 박테리아가 결합하도록 유도하는 데 충분한지 확인하였습니다. A.tumefaciens A1045의 경우, PGA로 인해 박테리아가 뿌리 표면에 개별적으로 결합하였습니다.반면, S.meliloti는 커다란 군집 형태로 결합하였으며, 이 군집 내에서 뿌리에 직접 부착된 박테리아는 소수였고 대부분의 박테리아는 다른 박테리아에 부착되어 있었습니다. 이 기술을 숙달하면 샘플에 따라 초기 설정에 1시간 미만, 여기에 배양 시간과 10분에서 1시간 정도의 판독 시간이 소요됩니다. 이 절차를 수행할 때 박테리아가 거의 모든 표면에 달라붙을 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청하고 나면 박테리아가 식물 표면에 결합하는 것을 관찰하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 식물의 어느 부위에 박테리아가 결합하는지 확인하고, 결합된 박테리아의 수를 측정하십시오. 인체 병원균을 사용하여 이 절차를 수행할 경우 매우 위험할 수 있으므로, 항상 밀폐 후드 내에서 작업하고 장갑을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

이 프로토콜은 교양 세포에 준수 아르 단위를 형성하는 박테리아 식민지의 숫자를 계산에 구성된 간단한 세균 유착 분석이다. 분석은 강력한이며, adhesin 독립 공부하고, 다수의 유사 콘텐츠는 세균 pathogenesis 작업을 대부분의 실험실에 사용됩니다.

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

감염 과정에서 핵심적인 단계는 호스트 세포로 병원균의 접착합니다. 대부분의 경우에서는이 유착 단계는 액체를 흐르는 의해 생성된 기계적 응력의 존재에 발생합니다. 우리는 세균 유착의 연구에 중요한 매개 변수로 전단 응력을 소개하는 기술을 설명합니다.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

합성 오페론 인코딩 모두 분비 장치와 curli 섬유의 구조 단량체의 디자인이 설명되어 있습니다. 이 amyloids와 자기편 고분자의 과잉은의 준수 측정 게인을 할 수...

단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

출처: Matthysse, A. G. 실험실에서 측정한 박테리아의 식물 표면 부착 현상. J. Vis. 경험 (2018).이 영상은 위상 차이 현미경을 이용해 박테리아가 식물 뿌리에 부착하는 상태를 평가하는 과정을 보여줍니다. 박테리아와 함께 배양된 묘목의 뿌리 샘플을 먼저 마운트하여 자유 박테리아를 확인합니다. 샘플은 느슨하게 붙어 있는 박테리아를 제거하기 위해 세척한 후, 손상을 방지하기 위해 적절한 커버슬립을 사용해 다시 장착합니다. 마지막으로, 뿌리털에 부착된 박테리아의 수를 현미경으로 세어봅니다.

식물 뿌리 표면에 대한 박테리아 부착의 현미경 기반 평가

출처: Matthysse, A. G. 실험실에서 측정한 박테리아의 식물 표면 부착 현상. J. 비스캐스트 익스피스, (2018)이 영상은 야생형 및 셀룰로오스 결핍 병원성 박테리아에 의한 토마토 묘목의 뿌리 정착 측정 프로토콜을 시연합니다. 밀착된 박테리아의 유효한 개체 수는 야생형 균주에 의한 더 높은 부착력과 미세군집 형성을 보여주며, 셀룰로오스가 안정적인 뿌리 집락화에서 역할을 함을 강조합니다.

생존 세포 수를 이용한 병원성 박테리아에 의한 토마토 묘목의 뿌리 정착 평가

출처: 해리스, S. L. 외 부유 수경재배 시스템에서 애기장대 뿌 리의 박테리아 정착 및 유지 모니터링. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 토양이 없는 환경에서 자란 Arabidopsis thaliana 묘목에서 뿌리 관련 박테리아의 정착 상태를 모니터링하는 프로토콜을 시연합니다. 집락화 후에는 초음파 검사로 박테리아를 떼어내고, 희석, 도금 및 배양하여 박테리아 부착과 생존 가능성을 반영하는 집락을 형성합니다.

토양이 없는 시스템에서 애 기장대 뿌 리의 박테리아 정착 모니터링

이 비디오는 형광 현미경 기반 이미징을 사용하여 숙주-병원체 상호 작용의 역학을 연구하기 위해 상피 세포 배양에 대한 GFP 태그 박테리아 부착을 평가하는 박테리아 부착 분석을 보여줍니다.

Detection of Bacterial Adherence to Host Cells Using Fluorescence Imaging(형광 이미징을 사용한 숙주 세포에 대한 박테리아 부착 감지)

숙주 세포에 대한 박테리아 부착은 숙주 집락화 및 감염 과정에서 중요한 단계입니다. 이 프로토콜은 폴리머 결합 재조합 애착체의 생성을 생체 모방 물질로 설명하며, 이를 통해 다른 박테리아 요인과 독립적으로 이러한 과정에 대한 개별 애착체의 기여도를 분석할 수 있습니다.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

여기에서 우리는 종의 존재를 정량화하고 식물 뿌리의 초기 식민지 동안 다른 성장 환경으로의 전송 후 박테리아의 공간 분포를 시각화하는 수경 식물 성장 분석방법을 설명합니다.

부동 수경 시스템에서 애기장대 뿌리에 세균 식민지화 및 유지 보수 모니터링

자동 통계 분석 방법과 함께 고처리량 형광 라벨링 이미징을 사용하여 페노티픽 준수를 기반으로 숙주 세균 병원체 상호 작용을 감지하면 숙주 세포와의 잠재적 세균 상호 작용을 신속하게 평가할 수 있습니다.

호스트 세포에 세균 준수의 자동화된, 높은 처리량 검출

뿌리권에서 식물 성장 촉진 rhizobacteria (PGPR)의 식민지화는 성장 촉진 효과에 필수적입니다. 세균성 rhizosphere colonization의 검출 방법을 표준화 할 필요가 있습니다. 여기에서는 뿌리 표면의 박테리아 집락을 정량화하기 위한 재현 가능한 방법을 설명합니다.

수경 재배 조건에서 Arabidopsis thaliana 뿌리에 대한 박테리아 집락 측정

배우세요 식물 표면에 박테리아 부착을 측정하는 방법을. 뿌리와 새싹을 대상으로 한 이 기술은 식물 병리학과 식품 안전 연구에 활용됩니다. 현미경 관찰과 생존 세포 계수로 박테리아 결합을 분석합니다.

공장 실험실에서 측정 하는 표면에 박테리아의 부착

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