검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거

이 프로토콜의 전반적인 목적은 단백질 정제 과정에서 오염된 뉴클레아제 활성을 식별하고 제거하는 것입니다. 이 방법은 생화학, 구조 및 통합 역학과 같은 레트로바이러스학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정제 과정 중에 목적 재조합 단백질로부터 오염된 DNA 뉴클레아제 활성을 식별하고 제거할 수 있다는 점입니다.

먼저 프로토타입 거품 바이러스(prototype foamy virus) 인테그레이스를 발현하는 E.coli 펠렛 하나를 얼음 위에서 해동합니다. 0.5인치 직경의 바이오혼과 0.125인치 직경의 테이퍼드 마이크로팁이 장착된 초음파 분쇄기를 사용하여, 튜브를 얼음 위에 둔 상태에서 30% 진폭으로 30초 동안 초음파 분쇄를 수행합니다. 초음파 분쇄 후, 세포 샘플을 냉각된 초원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 120,000 ×g로 60분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후, 분명한 펠렛(pellet)이 형성되어야 하며 상층액은 노란색을 띨 수 있습니다. 상층액을 차가운 50-milliliter 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 1.5 milliliter의 니켈 충전 수지를 사용하여 길이 110-millimeter, 직경 5-millimeter의 FPLC 컬럼을 준비합니다.

먼저, 컬럼을 FPLC 장치에 연결하고 버퍼를 주입합니다. 장치는 전도도와 280 nanometers에서의 UV 흡광도 데이터를 실시간으로 수집해야 합니다. 전도도와 UV 측정값이 안정될 때까지 기다립니다.

필요한 경우, 측정값이 안정될 때까지 컬럼에 버퍼를 계속 흘려줍니다. 슈퍼루프(superloop)를 사용하여 0.15 milliliters per minute의 유속과 0.5 megapascal의 최대 압력 제한 조건으로 단백질 시료를 컬럼에 로딩합니다. 슈퍼루프를 AKTA FPLC에 연결합니다.

컬럼을 세척하고 단백질을 용출시킨 후, 초기 통과액(flowthrough), 세척액 및 280 nm 흡광도 피크 분획물을 각각 15 µL씩 분취하고, 각 시료에 2X SDS-PAGE 샘플 버퍼 15 µL를 첨가합니다. 시료를 3분 동안 가열하여 끓입니다. 각 시료 10 µL를 10% SDS-PAGE 겔에 로딩하고, 함께 미리 염색된 단백질 표준물질(pre-stained protein standards) 4 µL를 로딩합니다.

겔을 시각적으로 검사하여 거의 순수한 prototype foamy virus integrase를 포함하고 있는 것으로 보이는 분획을 확인합니다. 이 분획들을 합치고, 피펫팅하는 동안 해당 부피를 기록합니다. 이는 일반적으로 8~10 milliliters입니다.

분광광도계를 사용하여 통합 분획물의 280 nanometers에서의 UV 흡광도를 측정하고, prototype foamy virus integrase 단백질의 총량을 계산합니다. 전형적인 수율은 유도 배양액 1 liter당 약 10 milligrams입니다. hexahistidine 태그를 제거하려면, prototype foamy virus integrase에 10-millimolar DTT와 0.1-millimolar EDTA를 최종 농도로 첨가합니다.

그 다음, prototype foamy virus integrase 1 mg당 15 µg의 human rhinovirus 3C protease를 첨가하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. prototype foamy virus integrase의 헤파린 친화성 크로마토그래피 분획을 수행하려면, buffer C를 1.5배 부피로 첨가하여 시료의 sodium chloride 농도를 200 mM로 낮춥니다. 그런 다음, 희석된 prototype foamy virus integrase 시료를 최대 압력 제한 1 MPa, 유속 0.5 mL/min으로 헤파린 Sepharose 컬럼에 로딩합니다. 컬럼을 세척하고 그라디언트 및 최종 세척액을 수집한 후, 로드액, 통과액, 세척액 및 분획물을 8% SDS-PAGE로 분석합니다.

그 다음, 젤을 Coomassie blue로 염색하여 분획물을 평가합니다. Prototype foamy virus integrase와 오염된 nuclease는 heparin Sepharose 크로마토그래피에 대해 서로 다른 친화력을 가집니다. nuclease 분석에 사용할, 거의 순수한 prototype foamy virus integrase가 포함된 것으로 보이는 heparin Sepharose 분획물을 확인합니다.

뉴클레아제 분석을 시작하려면, 3 µL의 헤파린 분획과 50 ng의 3 kb 초나선형 플라스미드 DNA, 그리고 반응 버퍼를 혼합하여 최종 부피를 15 µL로 맞춥니다. 37 °C에서 90분 동안 배양합니다. 1 mg/mL Proteinase K와 0.5% SDS를 가하여 반응을 중단시키고, 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.

그 다음 6X 로딩 다이 3.5 µL를 뉴클레아제 분석 반응액에 첨가하고, 전체 부피를 1% 아가로스 겔에 로딩합니다. 상온에서 100 V로 1시간 동안 또는 다이 전선이 겔 끝에 도달할 때까지 겔을 전기영동합니다. 전기영동이 완료되면, 겔의 형광 스캐너 이미지를 통해 선형 DNA는 3 kb 크기에 맞게 이동하고, 초나선 DNA는 약 2 kb까지 더 빠르게 이동하며, 이완된 원형 DNA는 3.5 kb에 가깝게 더 느리게 이동하는 것을 확인할 수 있습니다.

이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 레인에 있는 초나선형(supercoiled), 선형(linear) 및 이완된 원형(relaxed circle) 플라스미드의 픽셀 부피를 계산합니다. 이 세 가지 DNA 형태의 픽셀 부피 합계를 총 DNA 값으로 정의하고, 이를 사용하여 선형 및 이완된 원형의 백분율을 계산합니다. 뉴클레아제(nuclease)가 오염된 분획은 음성 대조군에 비해 선형 및 이완된 원형의 백분율이 더 높게 나타납니다.

오염된 뉴클레아제 활성이 나타나지 않는 heparin Sepharose 분획들을 합치고, 10 mm, 6-8 kDa 분자량 컷오프 투석 튜브로 옮깁니다. 1 L의 투석 용액을 사용하여 4 °C에서 하룻밤 동안 투석합니다. 다음 날, 투석 튜브에서 뉴클레아제가 제거된 prototype foamy virus integrase 샘플을 회수합니다.

280 nanometers에서 흡광도를 측정하고, 최종 단백질 농도를 계산하십시오. 단백질을 소분하여 액체 질소로 급속 냉동하십시오. 그 후 소분된 샘플들을 minus 80 degrees Celsius에서 보관하십시오.

뉴클레아제 분석(nuclease assay)은 본 비디오에 설명된 대로 수행되었습니다. 음성 대조군은 단백질이 포함되지 않은 플라스미드 DNA와 뉴클레아제가 없는 것으로 알려진 야생형 프로토타입 포미 바이러스(prototype foamy virus) 인테그레이즈의 이전 정제물입니다. 오염된 뉴클레아제 활성에 대한 양성 대조군은 뉴클레아제가 오염된 것으로 알려진 촉매 불활성 프로토타입 포미 바이러스 인테그레이즈의 이전 정제물입니다.

이 절차를 마친 후, 효소 반응 속도론 및 역학 등 추가적인 의문에 답하기 위해 생화학적 분석이나 단일 분자 이미징과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 재조합 단백질에서 오염된 뉴클레아제 활성을 식별하고 제거하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.