Name: 검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 학습하세요 재조합 프로토타입 거품 바이러스 인테그레이스 정화 시 뉴클레아제 오염 제거 방법을 Escherichia coli 발현 시스템에서. 헤파린 친화 크로마토그래피와 뉴클레아제 분석을 활용하여 레트로바이러스 통합 연구에 적합한 고순도 단백질을 제조합니다.

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이 작품은 NIH AI099854 및 AI126742 키에 의해 지원 되었다.

1. 유도 PFV 대장균 에 식에서
<ol><li>
대장균 BL21(DE3) pLysS의 20 μ 1 μ PFV에 식 플라스 미드 (10 ng/μ)의 추가 (상업적으로 사용 가능한 셀의 20 μ 약 수는 > 2 x 106 CFU/μ g 플라스 미드) 1.5 mL 튜브에. 부드럽게 손가락 도청 또는 튜브를 터치 믹스. 품 어에 얼음 5 분.
	<ol>
<li>정확히 30 충격 열 42 ˚C에 s 물 목욕 한 후 바로 2 분 동안 얼음을 반환할.</li>
		<li>Catabolite 억제 (SOC) 미디어 실 온 슈퍼 최적의 국물의 80 μ를 추가 합니다. 1 h 225 분당 회전 (rpm) 떨고와 37 ˚C에서 품 어.</li>
		<li>접시는 100 m m x 15 m m Luria 국물 (파운드) agar의 25 mL를 포함 하는 배양 접시에 혼합물의 25 μ (1 L 파운드 agar: 10 g NaCl, 5 g 효 모 추출 물, bacto tryptone 10 g 15 g 천) 및 100 μ g/mL 암 피 실린 (100mg/mL 재고 솔루션).</li>
		<li>두 번째 동일한 접시에 변환 된 셀의 나머지 75 μ 접시 37 ° c.에 하룻밤 내려 뚜껑 접시를 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>
검색의 판 변형 대장균. 단일 식민지를 사용 하 여 파운드의 3 mL 접종 (1 L 파운드: bacto tryptone, 10 g의 NaCl, 효 모 5 g의 10 g 추출) 14 mL 둥근 바닥 폴 리 프로필 렌 문화 관에서 100 μ g/mL 암 피 실린 보충. ~ 8 h 225 rpm 동요와 37 ˚C에서 품 어.
	<ol>
<li>50 mL 파운드 100 μ g/mL 암 피 실린과 34 μ g/mL 페니 (34 mg/mL 재고 솔루션) 250 mL 삼각 플라스 크에에서 보충에 문화의 3 mL를 추가 합니다. 225 rpm 동요와 37 ° C에서 하룻밤 문화를 품 어.</li>
		<li>1 L 파운드, 100 μ g/mL 암 피 실린, 그리고 4 L 삼각 플라스 크에 34 μ g/mL 페니를 이동 문화의 53 mL. 225 rpm 동요와 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600) 정기적으로 문화. 처음에, 모든 h 문화 OD600 확인 하십시오. 문화는 원하는 OD600에 도달, 하지 자라 다를 15 분 마다 확인 합니다. 0.9와 1.0 사이 세600 문화를 성장. 얼음 목욕을 플라스 크를 전송 및 문화의 온도 줄이기 위해 소용돌이.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SDS 페이지 분석을 변성 시키기에 의해 나중에 분석 1.5 mL 튜브에 문화의 1 mL를 전송.
	<ol>
<li>실 온에서 14000 x g에서 microfuge에 1 분 동안 원심 분리에 의해 1.5 mL 튜브에 세포를 작은. 폐기는 상쾌한. Pipetting으로 150 μ 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 펠 릿을 resuspend. PBS 또는 CaCl2 , MgCl2없이 있을 수 있습니다.</li>
		<li>SDS 페이지 샘플 버퍼 x 2의 150 μ 추가 (150 m m Tris HCl, pH 6.8, 1.2 %SDS, 30% 글리세롤, 15% β-mercaptoethanol (βME), 블루 0.0018 %bromophenol) 피펫으로 또는 소용돌이 의해 철저 하 게 혼합. -20 ° c.에 3 분 저장소에 대 한 종 기</li>
	</ol>
</li>
	<li>세균성 문화에 추가: 0.25 m m 이소프로필-베타-D-thiogalactopyranoside (IPTG, 0.25 M 재고 솔루션) 및 50 μ M ZnCl2 (50 m m 재고 솔루션)의 최종 농도. IPTG T7 발기인에서 PFV 유전자의 표정을 유도 및 ZnCl2 PFV 인치 품 즉시 4 헤 대 한 225 rpm에서 떨고와 25 ° C에서 문화에에서 아미노 터미널 아연 손가락 영역의 올바른 접는 보충 교재로 추가 됩니다. 얼음 목욕을 플라스 크를 전송. SDS 페이지 분석 1.3에서 위와 같이 동일한 프로토콜을 다음 위한 문화의 1 mL를 저장 합니다.</li>
	<li>
적절 한 크기의 원심 병 세균성 문화를 전송 합니다. 예를 들어 1 L 문화 4 살 균 일회용 250 mL 원뿔 바닥 폴 리 프로필 렌 병을 양도할 수 있습니다. 4 ˚C에서 20 분 동안 3000 x g에서 냉장된 탁상 원심 분리기에 병을 회전 합니다. 붓는 의해 supernatants를 삭제 합니다.
	<ol>
<li>25 mL (6.25 mL 병 당) 차가운 PBS (또는 CaCl2 및 MgCl2)의 총 볼륨 1 L 세균성 문화에서 알 약의 모든 pipetting으로 resuspend. 결합 하 고 한 50 mL 원뿔 튜브에 세균성 정지를 전송. 4 ° c.에 20 분 동안 3000 x g에서 냉장된 원심 분리기에서 회전 붓는 또는 pipetting는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipetting으로 세균 펠 릿 10 mL 물의 resuspension 버퍼 (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 및 500 μ M phenylmethylsulfanoxide (PMSF) 프로 테아 제 억제 물)에서 resuspend. 스냅 잠수함 50 mL 튜브에 충분 한 액체 질소와 함께 Dewar 플라스 크에 튜브를 삽입 하 여 펠 릿을 동결. 조심 스럽게 액체 질소에서 튜브를 제거 하 고-80 ° c.에 저장 참고: 세균성 펠 릿-80 ° c.에 몇 달 동안 저장 될 수 있습니다. 우리는 2 년 동안-80 ° C 저장 다음 활성 단백질의 손실 없이 보았다.</li>
	<li>
분석 사전 유도 후 유도 샘플 8.3 c m, 높이 7.3 c m 0.75 m m 두께 SDS 페이지 젤 1.5 mL 6 %polyacrylamide 레이어 스태킹와 (125 mM Tris HCl, pH 6.8, 6% 아크릴, 0.1 %SDS, 0.1% 염화 persulfate, 0.001 %TEMED) 3.5 mL 10% 레이어를 해결 polyacrylamide (375 mM Tris HCl, pH 8.8, 10% 아크릴, 0.1 %SDS, 0.1% 염화 persulfate, 0.001 %TEMED)12.
	<ol>
<li>겹쳐 쌓이는 젤을 붓는 후 10 잘 빗을 삽입 합니다. 젤 생산은 때 페이지 장치를 조립 하 고 충분 한 SDS 페이지 실행 버퍼 (25mm Tris, 192 m m 글리신, 0.1 %SDS)를 추가 합니다.</li>
		<li>각 샘플의 10 μ prestained 단백질 표준의 4 μ를 로드 합니다. 염료 앞 약 60 분, 젤의 하단에 도달할 때까지 16.5 V/cm에서 실행 합니다.</li>
		<li>젤 접시를 분해 하 고 젤 플라스틱 욕조를 전송. Coomassie 화려한 블루 솔루션 (0.1 %Coomassie 화려한 블루 R-250, 40% 메탄올, 10% 아세트산) 아낌없이 젤 커버 하 고 주위 온도에서 20 분 동안 얼룩 얼룩을 추가 합니다.</li>
		<li>붓는 의해 얼룩 솔루션을 제거 하 고 바꿀 솔루션 (40% 메탄올, 10% 아세트산) destain까지 밴드를 쉽게 볼 수 있습니다. 붓는 의해 destaining 솔루션을 제거 하 고 이온된 수를 바꿉니다. PFV에 후 유도 샘플에서 쉽게 식별 되어야 합니다. Hexahistidine 태그와 PFV에 47374 Da의 분자량.</li>
		<li>PFV에 표시 되지 않는 경우 변환 접시 중 하나에서 다른 식민지로 시작 하는 유도 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 니켈 친화성 크로마토그래피
<ol><li>얼음에 대 한 세균 펠 릿 녹여 참고:이 중요 한 시간 (약 2-3 h) 소요 됩니다. 펠 릿은 셀 슬러리에 동 때 추가 500 μ M PMSF (100 m m 재고 솔루션)를 추가 합니다.</li>
	<li>계속 박테리아의 50 mL 튜브 얼음 슬러리. 30 대 30% 진폭에서 박테리아를 sonicate s (1 초, 1에서 s) 0.125 인치 직경 0.5 인치 직경 바이오 경적 sonicator는을 사용 하 여 1 L 문화에서 파생 된 펠 릿 당 테이퍼 microtip, 20 kHz의 주파수 및 400 w.의 최대 전력</li>
	<li>차가운 ultracentrifuge 튜브에 셀 샘플을 전송. 폴 리 탄산염 병 어셈블리 (25 m m 직경, 89 m m 높이) 유형 60 Ti 고정된 각도 터와 호환을 사용 합니다. 동일한 중력 힘을 달성 하는 경우 대체 튜브와로 터를 사용할 수 있습니다. 4 ° c.에서 60 분에 대 한 회전 120000 x g 명백한 펠 렛 이어야 한다. 상쾌한 노란 색깔을 할 수 있습니다.</li>
	<li>붓는 또는 찬 50 mL 원뿔 튜브에 pipetting는 상쾌한 전송. 참고 볼륨; 이 볼륨 스냅 동결 전에 사용 되는 물의 resuspension 버퍼의 볼륨 약 해야 합니다. 상쾌한 점성 경우에, 착 색 인쇄기 열을 방해할 수 있는 세균성 DNA에 의해 오염 될 수 있습니다. 이 경우에, 세균성 DNA를 펠 렛을 ultracentrifugation를 반복 합니다.</li>
	<li>
500 mL를 준비 (50mm pH 7.5, 500 mM NaCl, Tris HCl 500 μ PMSF) 버퍼와 500ml 버퍼 B (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 500 mM NaCl, 500 μ PMSF, 200mm 이미). 참고:이 프로토콜에서 계속 고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템, 모든 버퍼 및 샘플 콜드 룸에 4 ° C에서.<ol>
<li>살 균 필터 완충기 A와 B 0.2 μ m 일회용 필터 단위. FPLC 시스템에 따라 씻고 펌프 A 펌프 B 버퍼 A와 버퍼 B, 각각. 전도도 및 UV 수치가 안정 될 때까지 시스템을 통해 흐름 10%와 90% 버퍼 A 버퍼 B. 최대 유량; 악기에 따라 달라 집니다. 5 mL/min 흐름 속도 사용 하 여 1.0 MPa의 최대 압력 제한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>준비는 110 m m, 5 m m 직경 FPLC 열 1.5 mL 니켈 충전 지 (최대 바인딩 용량 50 mg/mL, 최대 1 MPa의 압력). 열 정화 하기 전에 하루를 준비 하 고 4 ˚C에 저장 된 수 있습니다.</li>
	<li>FPLC 악기에 열을 연결 합니다. 0.5 MPa의 최대 압력 한계를 가진 90% 버퍼 A와 10% 버퍼 B (이미 20 m m) 0.5 mL/min의 유량의 20 mL와 함께 열 equilibrate 악기는 전도도 및 280에서 UV 흡 광도의 실시간으로 데이터를 수집 한다 nm (280). 전도도 및 UV 수치 안정화 해야 합니다. 이러한 수치 안정 하지, 계속 열 통해 흐름 버퍼 안정 될 때까지.</li>
	<li>
0.5 MPa의 최대 압력 한계를 가진 0.15 mL/min 흐름 속도로 열을 단백질 샘플 (펠 릿 당 ~ 10 mL)를 로드 합니다. 흐름 속도 열 압력 정화에 걸쳐 동일 남아 있습니다. 50 mL 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다.
	<ol>
<li>열을 씻어 20 mL 10%와 90% 버퍼 A와 B. 버퍼 수집 50 mL 튜브에서 세척. 선형 그라데이션 20 mL의 10% ~ 100% 버퍼 B (200 m m 이미 20 m m)와 단백질 elute</li>
		<li>마지막으로, 5 mL 100% 버퍼 B (200 m m 이미) 열 세척. 수집에 그라데이션 하 고 마지막 세척 0.27 mL 분수.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 x SDS 페이지 샘플 버퍼의 15 μ 15 μ, 세척, 그리고 피크 A280 분수를 통해 흐름의 결합. 3 분에 대 한 샘플을 끓인 다.
	<ol>
<li>두 개의 10 %SDS 페이지 젤 이전 단계에서 설명한 1.6 제외 하 고 15 잘 빗을 준비 합니다. 10 μ는 젤을 각 샘플의 prestained 단백질 표준의 4 μ를 로드 합니다. 실행 하 고 얼룩, 1.6 단계에서 설명한 대로 젤 분석.</li>
		<li>육안 검사에 따라 거의 순수한 PFV에 포함 하도록 표시 되는 분수를 결합 한다. Pipetting, 일반적으로 8-10 mL를 볼륨을 측정 한다.</li>
		<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 결합 된 분수의 A280 을 측정 하 고 PFV에 단백질;의 총 금액을 계산 우리의 전형적인 수확량은 유도 문화 L 당 ~ 10 mg 이다. Hexahistidine 태그 PFV에 소멸 계수는 59360 c m-1 M-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hexahistidine 태그를 제거 하려면 PFV에 10 m m dithiothreitol (DTT, 1 M 재고 솔루션)와 0.1 m m EDTA, pH 8.0 (0.5 M 재고 솔루션)을 보충 한다. 4 ˚C에서 하룻밤 mg PFV 인치 품 당 인간의 이노 (HRV) 3 C protease의 15 μ g를 추가 합니다. 분열 47374 다에서 44394 다 PFV에 분자량을 감소 하 고 10 %SDS 페이지 분석 하 여 확인할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 헤 파 린 친화성 크로마토그래피
<ol><li>
250 mL 준비 버퍼 C (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 mM DTT, 0.1 m m EDTA, 500 μ PMSF)와 250 mL 버퍼 D (50 mM Tris HCl, pH 7.5, 10 m m DTT, 0.1 m m EDTA, 500 μ PMSF, M 1 M NaCl). 참고:이 프로토콜 FPLC 시스템, 버퍼, 그리고 샘플 보관 됩니다 4 ˚C에서 차가운 방에.<ol>
<li>살 균 필터 버퍼 C 그리고 D 0.2 μ m 일회용 필터 단위. FPLC 시스템에 따라 씻고 펌프 A 펌프 B C 버퍼와 버퍼 D, 각각. 전도도 및 UV 수치가 안정 될 때까지 시스템을 통해 흐름 버퍼 C 80%와 20% 버퍼 D. 최대 유량; 악기에 따라 달라 집니다. 우리는 정기적으로 5 mL/min의 유량을 사용 하 여 1.0 MPa의 최대 압력 제한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
80 m m, 5 m m 직경 FPLC 열 덤플링 sepharose 수 지 (최대 바인딩 용량 소의 2.0 mg mL 당 antithrombin III 수 지; 최대 1.4 MPa의 압력)의 1 mL를 준비 합니다. 열을 정화 하기 전에 하루를 준비 하 고 4 ° c.에 저장 된 수 있습니다. FPLC 악기에 열을 연결 합니다.
	<ol>
<li>1 MPa의 압력을 최대 제한 버퍼 C 80%와 20% 버퍼 D (200 m m NaCl) 0.5 mL/min의 유량의 20 mL와 함께 열 equilibrate 악기는 전도도 및 280에서 UV 흡 광도의 실시간으로 데이터를 수집 한다 nm (280). 전도도 및 UV 수치 안정화 해야 합니다. 이러한 수치 안정 하지, 계속 열 통해 흐름 버퍼 안정 될 때까지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.5 볼륨 버퍼 c.를 추가 하 여 200mm PFV에 샘플의 NaCl 농도 감소 예를 들어 10 mL PFV 인치를 버퍼 C의 15 mL를 추가 우리의 전체 볼륨은 일반적으로 25 mL.</li>
	<li>
부하 최대 압력 0.5 mL/min 흐름 속도로 덤플링 sepharose 열에 희석된 PFV에 샘플 1.0 MPa를 제한 합니다. 흐름 속도 열 압력 정화에 걸쳐 동일 남아 있습니다. 50 mL 원뿔 튜브에서를 통해 흐름을 수집 합니다.
	<ol>
<li>워시 버퍼 C 80%와 20% 버퍼 D (200 m m NaCl), 20 mL로 열 워시 50 mL 원뿔 튜브에 수집. (200 m m 1 M NaCl) 30 mL 선형 그라디언트의 20% ~ 100% 버퍼 D 열 elute</li>
		<li>워시 100% 버퍼 디의 5 mL와 열 수집 0.37 mL 분수에 그라데이션 하 고 마지막 세척 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석 로드, 통해, 세척, 분수 8 %SDS 페이지 2.9에 설명 된 대로. 다음 hexahistidine 태그의 분열 하는 PFV에 44394 Da의 분자량 있으며 멸종 계수 hexahistidine 태그를 하지 않고 59360 c m-1 M-1 에 남아 있다. 4 ˚C에서 모든 분수 nuclease 분석 결과 완료 될 때까지 저장 합니다.</li>
</ol>4. nuclease 분석 결과
<ol><li>
식별 덤플링 분수 및 50의 거의 순수한 PFV 인치 결합 3 μ를 포함 하도록 표시 되는 헤 파 린 sepharose 분수 3 kb의 ng supercoiled 플라스 미드 DNA에 반응 버퍼 (10 mM HEPES, pH 7.5, 110 m NaCl, 5mm MgSO4, 4 μ M ZnCl2 m 10 mM DTT) 15 μ의 최종 볼륨. 없는 PFV 인치와 90 분 포함 부정적인 컨트롤에 대 한 37 ˚C에서 품 어
	<ol>
<li>1 mg/mL 가수분해 K와 반응 (20 mg/mL 재고 솔루션) 및 0.5 %SDS 중지 (10% 주식 솔루션). 37 ° C에서 품 어 1 h. 샘플 나중에 분석-20 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1의 x TAE 버퍼 (40 m m 트리 아세테이트, 1 mM EDTA) 0.1 µ g/mL ethidium 평범한 사람 (10mg/mL 재고 솔루션)13에 볼륨 (w/v) agarose 당 1% 무게의 125 mL 젤을 준비 합니다. Agarose 솔루션을 녹여와 15 cm x 10 cm 젤 캐스팅 용지함에 붓는 다. 5 m m, 0.75 m m 두께 웰 스도 15 잘 빗을 삽입 합니다. 얇은 스 웰 스 1.5 m m 두께에 비해 더 나은 밴드 해상도 얻을. 허용 주위 온도에서 응고 하 젤.
	<ol>
<li>1에서 젤 담가 0.1 µ g/mL ethidium 평범한 사람으로 x TAE. Nuclease 분석 결과 반응 염료 (50% 글리세롤, 0.15% 오렌지 G 염료) 로드 x 6의 3.5 μ를 추가 합니다. 전체 볼륨 젤을 로드 합니다. 정 전압, 1 시간 또는 오렌지 G 염료 전면 젤의 끝에 도달할 때까지 주위 온도에 (100) cm 당 10 볼트에서 젤을 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
바로 형광 스캐너 ethidium 평범한 사람을 감지를 설정 agarose 젤 이미지. 선형 DNA 3 kb 크기 true로 실행 해야 합니다, supercoiled DNA 빠른 (~ 2 kb), 실행 해야 하 고 편안한 원형 DNA 느린 (~3.5 kb)를 실행 해야 합니다.
	<ol>
<li>이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여, 각 차선에 supercoiled, 선형, 그리고 편안한 원형 플라스 미드의 픽셀 볼륨을 계산 합니다. 이러한 세 가지 DNA 형태 "총 DNA"에 대 한 볼륨 값 및 선형 및 편안한 원형의 비율을 계산 하는 데 사용할 픽셀의 합계를 호출 합니다. 예를 들어 편안한 서클의 픽셀 볼륨 나눈 값입니다 그 차선에 있는 총 DNA 픽셀 값, 백분율을 결정 하는 100이이 숫자를 곱합니다. 분수 오염 nuclease 포함 하는 부정적인 컨트롤에 비해 선형이 고 편안한 서클의 더 높은 백분율을 표시 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>헤 파 린 sepharose 분수 오염 nuclease 활동을 표시 하지 않는 결합. 6-8 kDa 분자량 컷오프 (MWCO) 투 석 튜브 50 mM Tris HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 50 μ M ZnCl2, 10 m m DTT, 20% 글리세롤의 1 리터에 하룻밤 4 ° C에서 10 mm dialyze.</li>
	<li>투 석 배관에서 nuclease 무료 PFV에 샘플을 복구 합니다. A280 을 측정 하 고 최종 단백질 농도 계산. 약 수 및 액체 질소에서 동결. -80 ° c.에 aliquots 저장</li>
</ol>

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<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409(2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
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저자는 공개 없다.

DNA 복구 단백질, 단일 분자 현미경 검사 법 응용 프로그램, 또는 retroviral integrases 산소 청소부와 같은 DNA와 상호 작용 하는 재조합 단백질 오염 세균 nucleases2,3의 무료 되어야 합니다. 이러한 오염 물질은 동안에 대량 생물 또는 단일 분자 분석 실험 결과의 해석을 혼동 수 있습니다.
우리는 세균 nuclease 자주 공동 정화 PFV 인치와 발견 그러나, PFV에 세균성 nuclease 오염 물질1에서 쉽게 구별할 수 있는 덤플링 sepharose에 대 한 선호도 표시 합니다. PFV에 nuclease 무료의 준비에 열쇠 덤플링 sepharose에서 그라데이션 차입에 따라 각 분수에서 nuclease 활동의 주의 깊은 정량 이다. 그라데이션 충분히 얕은 nuclease 오염;에서 PFV에 별거를...

Dna 단백질 상호 작용의 생 화 학적 및 단일 분자 연구 매우 순수한 재조합 단백질을 필요로합니다. 박테리아에서 nucleases 오염 이러한 분석의 결과 모호한 수 있습니다. 오염 nuclease 재조합 단백질 산소 폐품 protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) 및 대장균 (대장균)1 에서 절연 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV) integrase (IN)의 준비에서 발견 되었습니다. , 2 , 3.
Retroviral 통합 분석 실험 활동4의 측정으로 긁어 또는 선형 제품 supercoiled DNA의 변환에 의존합니다. 세포 감염 동안에 호스트 chromatin5바이러스 성 cDNA의 두 끝에 합류 했다. 반응에 참여 하는 각 끝에는 스트랜드 전송 되 나 이다. 분석 실험 활동 두 DNA 올리고 참여 수 재조합에의 공동된 통합 반응4,,56,7,8에서 표적 DNA에 종료 바이러스 성 cDNA를 흉내 낸. 또는 재조합에 비 순수 관련 반 사이트 통합 반응9,10단 하나의 DNA 끝을 참여할 수 있습니다. Supercoiled 플라스 미드 DNA의 대상인 통합, 공동된 통합 제품은 오는지 DNA 고 반 사이트 통합 제품은 편안한 서클. 이러한 반응 제품 agarose 젤 전기 이동 법1동안 상대 그들의 이동성에 의해 식별 됩니다. 재조합에 오염 nuclease 있으면 가짜 편안한 원이나 실험 결과 혼란 가능성이 선형화 플라스 미드 있을 것입니다. 바이러스 성 DNA 올리고 nuclease 제품 반대로 통합 제품을 결정적으로 식별 하 붙일 표시 될 수 있습니다. 그러나,에서 크게 하시 더군요 supercoiled DNA 목표; 편안한 원 또는 오염 nuclease에 의해 선형 DNA supercoiled 플라스 미드의 손실 결과 및 해석 데이터11의 왜곡 수 있습니다. 따라서 세균 nucleases retroviral 준비에서에서 제거 하는 것이 필수적 이다.
PFV에 세균성 nuclease1에 비해 헤 파 린 sepharose에 대 한 다른 선호도 하고있다. PFV에 고는 nuclease 덤플링 sepharose에서 선형 그라데이션 차입에 의해 분리 될 수 있습니다. 280 nm 첨단 자외선 (UV) 흡 광도 또는 분석 나트륨 라우릴 황산 염의 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)는 nuclease 쉽게 감지 되지 않습니다. 대신,는 nuclease 편안한 원이나 선형 제품 supercoiled 플라스 미드의 전환 채용 nuclease 활동 분석 결과 의해 감지 됩니다. 헤 파 린 sepharose 크로마토그래피 다음 각 분수는 nuclease 활동에 대 한 테스트입니다. PFV에 nuclease 오염 물질 모노-Q 음이온 수 지에 대 한 선호도에 차이가 있다. 모노-S 양이온 수 지에 대 한 선호도에 작은 차이가 있다. 그러나, 세균성 nuclease 모노 S 해상도 PFV에 단백질의 효율적인 분리를 수 없습니다. 궁극적으로, 덤플링 sepharose 친 화력 정화 PFV에 세균성 nuclease의 최고의 분리를 제공 하 고 무제한 부하 볼륨의 이점이 있다.
오염 nuclease 활동에 대 한 테스트 다른 단백질을 적용할 수 있습니다. 관심사의 단백질 대체 선호도 특성 PFV에; 보다 가능성이 해야한다. 바인딩 관심과 nuclease 오염 물질의 단백질의 특성에 차이 실험적으로 결정 되어야 합니다. Nuclease 오염 식별이 방법론 모노-S 양이온 또는 모노-Q 음이온 교환 수 지를 포함 하 여 다른 수 지에 적용할 수 있습니다. 선호도 및 이온 교환 수 지는 크로마토그래피 중 단백질의 볼륨에 제한이 없는 nucleases 오염에서 재조합 단백질을 분리 하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>BL21/DE3 Rosetta E. coli</td><td>EMD Millipore</td><td>70956-4</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>EMD biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0230</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510</td><td></td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0998-01</td><td></td></tr><tr><td>HRV14 3C 프로테아제&nbsp;</td><td>EMD 화학 물질</td><td>71493-3</td><td></td></tr></tbody></table>

검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 integrase의 정화 동안 nuclease 오염의 제거

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

레트로 바이러스 프로토 타입 거품 바이러스 (PFV)의 integrase (IN) 단백질은 retroviral 통합의 메커니즘 연구 모델 효소 이다. 다른 레트로 바이러스에서에 비해, PFV에 더 많은 가용성과 실험적인 조작에 순종. 또한, 그것은 임상으로 관련 된 인간 면역 결핍 바이러스 (hiv-1)에 억제제, PFV에 촉매 메커니즘은 그의 HIV-1 인치에 catalyzes 바이러스 무료 DNA (cDNA) 대상의 공유 결합 비슷한 제안에 민감한 과정에서 DNA 가닥 전송을 이라고합니다. 이 물가 이동 반응 대상 DNA에 닉스를 소개합니다. 통합 반응 제품의 분석 nucleases 마찬가지로 DNA를 닉의 존재에 의해 혼동 될 수 있습니다. 세균성 nuclease 공동 재조합 PFV에 대장균 (대장균)에 표현 된 정화 표시 되었습니다. 여기 헤 파 린 친화성 크로마토그래피에 의해 오염 nuclease에서 PFV에 격리 하는 방법을 설명 합니다. 분수는 쉽게 supercoiled 플라스 미드와 agarose 젤 전기 이동 법 nuclease 오염에 대 한 상영 됩니다. PFV에 및 오염 nuclease nuclease 무료 준비 재조합 PFV에 통합의 대량 생 화 확 적인 또는 단일 분자 분석에 대 한 적합 한 허용 하는 헤 파 린 sepharose에 대 한 대체 선호도 표시 합니다.

재조합 PFV에 종종 세균 nuclease1오염 됩니다. 생 화 확 적인 통합 분석 편안한 원 및 선형 제품 supercoiled 플라스 미드 DNA의 변환의 정량에 따라 달라 집니다. 오염 nuclease의 존재는이 분석 실험의 스 퓨 리 어스 정량으로 이어질 수 있습니다. Hexahistidine 태그와 표현의 PFV에 대장균 (그림 1)에서 유도 된 이며 니켈 친화성 크로마토그래피 (그림 2)에 의해 먼저 정화. 거의 순수한 PFV in 분수 결합 되 고 hexahistidine 태그는 효소에 의해 죽 습. 우리는 PFV에 및 오염 nuclease 덤플링을 sepharose 크로마토그래피 (그림 3)1에 대 한 다른 선호도 결정 했습니다. PFV에 분수 덤플링을 s...

재조합 프로토 타입 거품 바이러스 integrase 단백질은 종종 정화 동안 세균성 nuclease로 오염 됩니다. 이 메서드는 nuclease 오염을 식별 하 고 효소의 마지막 준비에서 그것을 제거 합니다.

검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

이 프로토콜의 전반적인 목적은 단백질 정제 과정에서 오염된 뉴클레아제 활성을 식별하고 제거하는 것입니다. 이 방법은 생화학, 구조 및 통합 역학과 같은 레트로바이러스학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정제 과정 중에 목적 재조합 단백질로부터 오염된 DNA 뉴클레아제 활성을 식별하고 제거할 수 있다는 점입니다.먼저 프로토타입 거품 바이러스(prototype foamy virus) 인테그레이스를 발현하는 E.coli 펠렛 하나를 얼음 위에서 해동합니다. 0.5인치 직경의 바이오혼과 0.125인치 직경의 테이퍼드 마이크로팁이 장착된 초음파 분쇄기를 사용하여, 튜브를 얼음 위에 둔 상태에서 30% 진폭으로 30초 동안 초음파 분쇄를 수행합니다. 초음파 분쇄 후, 세포 샘플을 냉각된 초원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 120,000 ×g로 60분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 분명한 펠렛(pellet)이 형성되어야 하며 상층액은 노란색을 띨 수 있습니다. 상층액을 차가운 50-milliliter 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 1.5 milliliter의 니켈 충전 수지를 사용하여 길이 110-millimeter, 직경 5-millimeter의 FPLC 컬럼을 준비합니다.먼저, 컬럼을 FPLC 장치에 연결하고 버퍼를 주입합니다. 장치는 전도도와 280 nanometers에서의 UV 흡광도 데이터를 실시간으로 수집해야 합니다. 전도도와 UV 측정값이 안정될 때까지 기다립니다.필요한 경우, 측정값이 안정될 때까지 컬럼에 버퍼를 계속 흘려줍니다. 슈퍼루프(superloop)를 사용하여 0.15 milliliters per minute의 유속과 0.5 megapascal의 최대 압력 제한 조건으로 단백질 시료를 컬럼에 로딩합니다. 슈퍼루프를 AKTA FPLC에 연결합니다.컬럼을 세척하고 단백질을 용출시킨 후, 초기 통과액(flowthrough), 세척액 및 280 nm 흡광도 피크 분획물을 각각 15 µL씩 분취하고, 각 시료에 2X SDS-PAGE 샘플 버퍼 15 µL를 첨가합니다. 시료를 3분 동안 가열하여 끓입니다. 각 시료 10 µL를 10% SDS-PAGE 겔에 로딩하고, 함께 미리 염색된 단백질 표준물질(pre-stained protein standards) 4 µL를 로딩합니다.겔을 시각적으로 검사하여 거의 순수한 prototype foamy virus inte

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

인플루엔자 바이러스의 게놈은 RNA와 단백질 여덟 별도 단지, 칭했다 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스 (vRNPs)로 구성되어 있습니다. 본 논문은 글리세롤 기울기 정화 및 독감 vRNPs의 전송 전자 현미경의 시각화에 대해 설명합니다.

인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

새 면도날이나 메스 날을 사용하여 깨끗한 표면에서 200 µL 팁의 끝부분 2-4 mm를 제거하여 와이드 보어 피펫 팁 2개를 준비한다. 참고: 이 팁들은 단계 1.3과 1.5에서 사용된다.

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 프로토타입 포미 바이러스 인타좀의 정제

Source: Lopez Jr., M. A., et al. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the purification of polyhistidine-tagged viral integrase using nickel affinity chromatography. The protocol uses imidazole gradient elution to selectively isolate the integrase based on its affinity for nickel-charged resin.

친화성 크로마토그래피를 이용한 바이러스 인테그레이스의 정제

Source: Lopez Jr., M. et al. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the procedure for purifying viral integrase from bacterial nuclease contamination using heparin Sepharose column chromatography followed by SDS-PAGE analysis to confirm protein purity.

헤파린 친화성 크로마토그래피를 이용한 바이러스 인테그라제 정제

출처: Gao, Y., et al. 호흡기 세포융합 바이러스의 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드 생성 및 조립. J. Vis. Exp. (2021)본 영상에서는 정제된 RNA-free 뉴클레오단백질-인단백질 복합체로부터 바이러스 특이적 뉴클레오캡시드를 시험관 내(in vitro)에서 조립하는 방법과 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 정제 과정, 그리고 조립된 입자 내의 전체 길이 바이러스 RNA 검증 과정을 보여줍니다.

바이러스 뉴클레오캡시드 유사 입자의 인비트로(In Vitro) 재구성 및 정제

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

재조합 retroviral integrase와 바이러스 성 DNA 끝을 흉내 낸 DNA 올리고는 intasome로 알려진 복잡 한 효소 활성을 형성할 수 있다. Intasomes 생화학, 구조, 및 키네틱 연구에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 intasomes를 정화 하는 방법을 자세히 설명 합니다.

조립 및 프로토 타입 거품 바이러스 Intasomes의 정화

우리 여기는 생체 외에서 세대의 HBV DNA는 B 형 간염 바이러스 감염 시스템을 통해 설명 하 고 역을 사용 하 여 (1-2 부) 통합의 매우 민감한 탐지 중첩 PCR.

낮은 복사의 번호 통합된 바이러스 성 DNA 생체 외에서 B 형 간염 감염에 의해 형성 된

재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)는 임상 및 전임상 유전자 전달에 널리 사용됩니다. rAAV의 과소평가된 용도는 정제 없이 배양된 세포의 강력한 transduction입니다. rAAV를 처음 접하는 연구자를 위해 transgene cassette 클로닝, 미정제 벡터 생산 및 세포 배양 transduction을 위한 프로토콜을 제공합니다.

Unpurified Recombinant Adeno-associated Viral Vectors를 사용한 배양 세포에서의 전이유전자 발현

이 원고는 최적화된 헤파린 기반 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하여 아데노 관련 바이러스 벡터의 생성 및 정제를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 접근 방식을 제시하여 초원심분리가 필요하지 않습니다. 생성된 벡터는 높은 순도와 생물학적 활성을 나타내며 전임상 연구에서 그 가치를 입증합니다.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

삽입 돌연변이 유발은 기능적 게놈 요소를 식별하기 위한 순 유전학의 필수 도구입니다. 여기에서는 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리 내에서 렌티바이러스 통합 부위를 검출하는 방법인 InSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts)에 대해 설명합니다.

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional mutagenesis cell library(삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리에서 기능적으로 관련된 렌티바이러스 통합 부위 식별)

학습하세요 재조합 프로토타입 거품 바이러스 인테그레이스 정화 시 뉴클레아제 오염 제거 방법을 Escherichia coli 발현 시스템에서. 헤파린 친화 크로마토그래피와 뉴클레아제 분석을 활용하여 레트로바이러스 통합 연구에 적합한 고순도 단백질을 제조합니다.

검색 및 재조합 프로토 타입 거품 바이러스 Integrase의 정화 동안 Nuclease 오염의 제거

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