유체역학 꼬리 정 맥 주입을 사용 하 여 마우스 Hepatocytes의 유전 Vivo에서 수정에 대 한 제정 및 유도할 수 있는 시스템

이 방법의 전반적인 목표는 유도성 유전자 또는 shRNA 발현을 위한 벡터 구조를 사용하여 in vivo에서 간세포의 안정적인 transfection입니다. 이 방법은 간 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 간암과 재생의 메커니즘을 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 유체역학적 꼬리 정맥 주입에 의해 달성된 생체 내 마우스 간세포에서 유도성 transgene R shRNA 발현과 함께 CreER의 발현이 결합되어 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 의대생인 Eric Hubner가 맡을 것입니다. 먼저 표적 단백질에 대한 짧은 헤어핀 RNA를 포함하는 150나노그램의 진입 벡터와 150나노그램의 pTC Tet 벡터 및 TE 버퍼를 총 8마이크로리터 부피로 결합합니다.

그런 다음 LR 클로나제 효소 믹스 II를 얼음에 옮기고 2분 동안 배양합니다. 배양 중 두 번 소용돌이. 그런 다음 2마이크로리터의 LR 클로나제 효소 믹스 II를 반응에 첨가하고 섭씨 25도에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 후 1마이크로리터의 proteinase K 용액을 첨가하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 표준 열 충격 프로토콜을 사용하여 2마이크로리터의 클로닝 혼합물로 Stbl3 수용 박테리아를 변환합니다.

암피실린을 함유 한 한천 플레이트에 형질전환을 도금 한 후 섭씨 30도에서 24 시간 동안 배양한다. 다음 날, 단일 집락을 선택하고 밤새 배양을 위해 소량의 박테리아 성장 배지를 접종합니다. DNA를 분리하고 Sanger 염기서열분석으로 벡터 무결성을 확인한 후 주입을 위해 구조체의 최대 크기 DNA prep을 준비합니다.

쥐의 무게를 재는 것으로 시작합니다. 그런 다음 내독소가 없는 잠자는 숲속의 미녀 벡터 구축물 15마이크로그램과 내독소가 없는 pchsB5 밀리리터당 1마이크로그램을 포함하는 멸균 식염수를 준비합니다. 각 마우스에 체중의 10%에 해당하는 부피를 주입할 수 있는 충분한 용액을 준비합니다.

멸균 3ml 주사기에 마우스 한 마리에 필요한 양을 채우고 27게이지 바늘을 부착합니다. 움직일 수 있는 최소한의 공간이지만 숨을 쉴 수 있는 충분한 공간을 확보하기 위해 적절한 양의 티슈 페이퍼를 추가한 후 호흡 구멍이 있는 적절한 구속기에 마우스를 삽입합니다. 적외선 램프를 사용하여 꼬리를 30-60초 동안 따뜻하게 하면서 꼬리의 빠른 움직임이나 기타 동요 징후와 같은 과열 징후를 주의 깊게 관찰합니다.

그런 다음 알코올 면봉으로 꼬리를 청소하십시오. 꼬리 기저부에 가까운 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나에 바늘을 거의 수평으로 삽입합니다. 성공적으로 삽입되면 소량의 혈액이 바늘의 원뿔로 역류할 수 있습니다.

8-10초 이내에 꼬리 정맥에 총 부피를 주입합니다. 주입 후 즉시 억제기에서 마우스를 제거하십시오. 멸균 거즈로 주사 상처를 최소 30초 동안 또는 출혈이 가라앉을 때까지 압박합니다.

성공적인 유체역학적 꼬리 정맥 주입은 transfection에 매우 중요하며, 특히 주입 속도, 부피 및 시간에 따라 달라집니다. 정맥 주사를 더 쉽게 하려면 주사 당일 쥐가 스트레스를 받거나 탈수되지 않았는지 확인하십시오. 복구 케이지에서 30-60분 동안 단독 하우징을 한 후 마우스를 원래 케이지로 다시 옮깁니다.

꼬리 정맥 주입 후 10-15일 후에 Cre 재조합효소 유도를 시작하여 통합되지 않은 벡터를 제거할 수 있도록 합니다. 10mg의 타목시펜을 40마이크로리터의 에탄올에 녹이고 섭씨 55도에서 10분 동안 흔들면서 배양합니다. 타목시펜이 녹을 때까지 여러 번 소용돌이칩니다.

그런 다음 960마이크로리터의 옥수수 기름을 넣고 섭씨 55도에서 5분 동안 배양합니다. 냉각 후 20게이지 바늘이 있는 1ml 인슐린 주사기에 용액을 뽑습니다. 그런 다음 27 게이지 바늘로 변경합니다.

주입하려면 먼저 엄지 손가락과 두 번째 손가락으로 마우스의 목을 조심스럽게 잡고 손바닥과 네 번째와 다섯 번째 손가락 사이에 꼬리를 고정하여 마우스를 긁습니다. 그런 다음 복강내로 0.1ml의 용액을 복부의 왼쪽 아래 사분면에 주입합니다. 10일 미만의 실험의 경우 다음 프로토콜에 따라 음용수를 통해 독시사이클린을 지속적으로 투여합니다.

먼저 수돗물 100ml에 자당 5g을 녹이고 오토클레이브를 사용합니다. 그런 다음 100mg의 독시사이클린 히클레이트를 15ml 원뿔형 튜브에 5ml의 자당 용액에 녹입니다. 그런 다음 10ml 주사기를 사용하여 0.2미크론 필터를 통해 용액을 멸균 여과합니다.

그런 다음 여과 된 독시사이클린 용액을 나머지 95 밀리리터의 자당 용액에 첨가하고 식수 대신 용액을 마우스에 공급합니다. 매일 확인하고 용액이 흐려지면 박테리아 과다 증식을 나타내므로 즉시 교체하십시오. 1 밀리리터의 4 % 파라 포름 알데히드 용액과 27 게이지 바늘로 1 밀리리터 주사기를 준비합니다.

해부 가위와 해부학적 집게를 사용하여 정중 개복술을 수행하고 안락사된 쥐의 간을 노출시킵니다. 소장을 오른쪽으로 움직여 문맥과 하대정맥을 노출시킵니다. 준비된 주사기의 바늘을 하대정맥에 삽입하고 문맥을 절단합니다.

PFA 1ml를 천천히 주입하여 간 조직을 풍부하게 하고 자가형광 적혈구를 제거합니다. 간을 제거한 후 물로 헹구고 절편 전에 5-10 밀리리터의 4 % PFA 용액을 옮겨 고정시킵니다. Cre 리포터 마우스에 대한 유도성 Cre 재조합효소의 구성적 발현과 전이유전자 또는 선택의 shRNA의 유도성 발현을 결합한 트랜스포존 구조체의 주입은 타목시펜에 의한 Cre 재조합효소 활성화 후 GFP 리포터 유전자의 강력한 발현을 보여주었습니다.

독시사이클린 치료 후, 형질주입된 간세포에서 적절한 항체에 의해 유도성 전이유전자 발현을 시각화할 수 있습니다. 유도성 shRNA 발현을 위해 immunostaining에 의해 검출된 세포질 GFP 발현을 shRNA 발현의 대리 마커로 사용할 수 있습니다. 간 특이적 프로모터 작제물의 제어하에 루시페라제 발현 카세트를 보유하는 트랜스포존 작제물을 주입하였다.

루시페린을 주입한 후, 유체역학적 꼬리 정맥 주입 2주 후 생체 내 이미징 시스템을 사용하여 마우스를 이미지화했습니다. 이미징은 주사 후 15일 후에 간에서 강력하고 안정적인 루시페라제 생물 발광을 보여주었으며, 이는 시스템이 생물 발광 이미징을 통해 생체 내에서 형질 주입된 세포의 존재를 추적하는 데 성공적으로 사용될 수 있음을 보여주었습니다. 일단 숙달되면 유체역학적 꼬리 정맥 주사는 약 15분 안에 수행할 수 있으며, 마우스 주사 복제, 전이유전자 R shRNA 발현 유도에서 간 준비에 이르는 전체 절차는 약 3-4주가 소요됩니다.

이 절차를 시도하는 동안 플라스미드의 크기와 염기서열 무결성을 염두에 두는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 선택한 transgene R shRNA와 함께 pTC Tet 시스템을 모든 Crelux Pbase 마우스 모델에 적용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.