Name: 유체역학 꼬리 정 맥 주입을 사용 하 여 마우스 Hepatocytes의 유전 Vivo에서 수정에 대 한 제정 및 유도할 수 있는 시스템 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 학습하세요 마우스 간세포의 안정적인 형질전환을 위한 유체역학 꼬리 정맥 주입법을 사용하여 유도 가능한 유전자 발현을 연구하는 방법을. 이 기술은 간암 및 재생 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 독일 Krebshilfe, 독일 (부여 번호 111289 UE), 어린이 건강 (어니스트와 아멜리아 Gallo 부여 박사 원정대-CTSA 보조금 번호 UL1 RR025744 UE)의 루 패 커드 재단에 의해 지원 되었다. 우리는 벡터 구문에 대 한 박사 마크 A. 케이 감사 하 고 실험 조언과 박사 줄리앙 세이 지 마우스이 고 실험적인 지원.

모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 수행 하 고 (Regierung 폰 오베르 바이 엠, 뮌헨, 독일 및 스탠포드 기관 동물 관리 및 사용 위원회 책임 당국에 의해 승인 했다 스탠포드, 캘리포니아, 미국)입니다. (단계 1-4) 복제에 대 한 모든 플라스 미드의 목록이 보충 테이블 s 1에에서 제공 됩니다.
1. 제정 유전자 발현에 있는 Transgene의 복제
<ol><li>디자인 transgene 증폭13,14를 위한 뇌관.</li>
	<li>PacI (TTAATTAA)에 대 한 앞으로 뇌관의 5' 끝에 금지 사이트를 추가 합니다. 반전 뇌관의 5' 끝에 AscI (GGCGCGCC) 또는 FseI (GGCCGGCC)에 대 한 금지 사이트를 추가 합니다.</li>
	<li>Transgene 원하는 transgene14에 최적화 된 조건을 사용 하 여 PCR에 의해 증폭. 상업적으로 이용 가능한 DNA 정제 키트를 사용 하 여 정화. 참고: 시간을 어 닐 링 단계 1.1에서에서 설계 뇌관에 따라 달라 집니다., 신장 시간 구성의 길이에 따라 달라 집니다. 예: 신장 시간 1000 bp 길이 사용 60 s의 생성 합니다.</li>
	<li>밤새 소화 transgene 및 제정 진 식15 각각 금지 nucleases (단계 1.2 참조)와 37 ° C에서 50 µ L의 전체 볼륨에 버퍼에 대 한 벡터. 예를 들어 소화 5 단위 PacI 구문 5 단위 FseI 적절 한 경우 (단계 1.2 참조).</li>
	<li>젤 정화 소화 벡터 및 제조업체의 지침에 따라 상업 젤 추출 키트를 사용 하 여 삽입. 100 벡터의 ng와 65 ° C에서 10 분 동안 400 U t 4 리가 14 ° C 16 헤 열에서 비활성화를 사용 하 여 삽입의 100-1000 ng의 표준 결 찰을 수행 합니다.</li>
	<li>유능한 박테리아16표준 열-충격-프로토콜 사용 하 여 변환.</li>
	<li>Agar에 접시 접시 포함 100 µ g/mL 암 피 실린. 24 h 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>단일 식민지를 선택 하 고, 제조업체의 지침에 따라 상업 miniprep 키트를 사용 하 여 플라스 미드 DNA를 정화 하 고 생어 시퀀싱17 에 의해 순서를 확인 (시퀀싱 뇌관: 5' 3' TGCTGGAGTTCTTCGCC).</li>
	<li>긍정적인 식민지 맥시에 대 한 플라스 미드 DNA의 증폭을 조정 하 고 제조업체의 지침에 따라도 무료 플라스 미드 준비 키트18 를 사용 하 여 정화를 사용 합니다.</li>
	<li>구문 주입에 대 한 준비가 되어, 따라서 5 단계를 계속.</li>
</ol>2. 복제는 Transgene의 유도할 수 있는 유전자 발현에 대 한
<ol><li>디자인 transgene 증폭13,14를 위한 뇌관.</li>
	<li>앞으로 뇌관의 5' 끝에 SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT), 또는 KpnI (GGTACC)에 대 한 금지 사이트를 추가 합니다. 반전 뇌관의 5' 끝에 노트 (GCGGCCGC) 또는 XhoI (CTCGAG)에 대 한 금지 사이트를 추가 합니다.</li>
	<li>Transgene 원하는 transgene14에 최적화 된 조건을 사용 하 여 PCR에 의해 증폭. 상업적인 DNA 정제 키트를 사용 하 여 정화.</li>
	<li>순화 transgene 항목 벡터의 4 µ g를 소화 (pEN_TTmcs-벡터, 재료의 표참조) 적절 한 제한 nucleases (단계 2.2 참조)와 하룻밤에 37 ° C에서 50 µ L의 전체 볼륨에 버퍼 별도로19 .</li>
	<li>젤 정화 소화 벡터 및 제조업체의 지침에 따라 상업 젤 추출 키트를 사용 하 여 삽입. 100 벡터의 ng와 65 ° C에서 10 분 동안 400 U t 4 리가 14 ° C 16 헤 열에서 비활성화를 사용 하 여 삽입의 100-1000 ng 표준 결 찰을 수행 합니다.</li>
	<li>유능한 박테리아16표준 열-충격-프로토콜 사용 하 여 변환.</li>
	<li>Agar에 접시 포함 15 µ g/mL gentamicin 접시. 16 h 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>단일 식민지를 선택 하 고, 플라스 미드 DNA를 정화 하 고 시퀀싱17 pCEP 앞으로 뇌관을 사용 하 여 삽입을 확인: 5' 3' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG. 참고: 단일 식민지에 PCR 뇌관 pCEP 앞으로와 이전 정화 없이 수행할 수 있습니다 그리고 pCEP 리버스 (5' 아가 아 그 CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). 이 단계는 긍정적인 식민지의 사전 선택에 대 한 유용한 할 수 있다.</li>
	<li>4 단계로 진행 합니다.</li>
</ol>3. 복제 미르 shRNA 유도할 수 있는 유전자 때 려 눕에 대 한의
<ol><li>복제 프로토콜19pSLIK에 따르면 미르 shRNA oligonucleotides 디자인. Anneal oligonucleotides 정화 하 고 희석 ddH2오 1시 20분</li>
	<li>3 h 50 ° C에서 5 U BfuAI 항목 벡터의 다이제스트 3 µ g 다음 20 분 동안 65 ° C에서 반응 비활성화. 참고: 녹색 형광 단백질 (GFP)의 공동 식 바란다면 그렇지 않으면 사용 pEN_TTmiRc219, 항목 벡터로 pEN_TTGmiRc19 을 사용 합니다.</li>
	<li>젤 정화 단계 2.5에서 소화 벡터. 100의 표준 결 찰 수행 벡터의 ng와 1 µ L의 정화 및 희석 shRNA oligonucleotides (3.1 단계) 400 U t 4를 사용 하 여 리가 1 헤 열에 대 한 실 온에서 10 분 동안 65 ° C에서 비활성화.</li>
	<li>유능한 박테리아16표준 열-충격-프로토콜 사용 하 여 변환.</li>
	<li>Agar에 접시 포함 15 µ g/mL gentamicin 접시. 16 h 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>선택 단일 식민지, 플라스 미드 DNA를 정화 하 고 생어 시퀀싱17 에 의해 삽입을 확인 (시퀀싱 뇌관: 5' 3' TAGTCGACTAGGGATAACAG).</li>
	<li>4 단계로 진행 합니다.</li>
</ol>4. recombinational 복제 준비에 대 한 주입 클론을 생성 하
<ol><li>(2 단계 또는 3 단계)에서 입력 벡터의 믹스 150 ng, 150 pTC의 ng TET 벡터20.</li>
	<li>TE 버퍼 8 µ L의 총 볼륨을 추가 (pH = 8).</li>
	<li>LR clonase 효소 혼합 II ( 재료의 표참조), 얼음에 품 어 2 분 소용돌이 대 한 두 번 전송 합니다.</li>
	<li>반응에 LR clonase 효소 혼합 II 2 µ L을 추가 하 고 1 시간에 25 ° C에서 품 어.</li>
	<li>가수분해 K-솔루션의 1 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다. 10 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>유능한 박테리아 recombinational 복제의 2 µ L 혼합16표준 열-충격-프로토콜 사용 하 여 Stbl3를 변환.</li>
	<li>Agar에 접시 접시 포함 100 µ g/mL 암 피 실린. 24 h 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>선택 단일 식민지, 제조업체의 지침에 따라도 무료 플라스 미드 준비 키트18 를 사용 하 여 플라스 미드 DNA를 정화 하 고 벡터 무결성 생어 시퀀싱17 (시퀀싱 뇌관 5' AGGGACAGCAGAGATCCAGTTTGG 3')입니다.</li>
	<li>구조는 주입에 대 한 준비, 5 단계를 계속.</li>
</ol>5. 유체역학 꼬리 정 맥 주입에 대 한 솔루션을 준비합니다.
참고: 제정 및 유도할 수 있는 유전자 발현에 대 한 구문의 준비 단계 1, 2, 3, 및 4에에서 설명 되어 있습니다.
<ol><li>살 균 0.9% 식 염 수 주입에 대 한 준비 (사용 PBS 하지 않습니다). 마우스 몸 무게의 약 10%에 해당 하는 볼륨을 사용 합니다. 예: 마우스 무게 20 g, 2 mL 솔루션의 준비.</li>
	<li>(각각 1.8 또는 4.8, 단계 참조)도 무료 플라스 미드 정화 키트18 을 사용 하 여 정화 된 주입 경로 준비 합니다.</li>
	<li>10 µ g 또는 잠자는 미녀 도 무료 벡터 구문의 15 µ g 추가 (단계 1 사용 10 µ g에서에서 단계 4 사용 15 µ g, 각각)와 무료 pc-HSB521 살 균 염 분의 mL 당 1 µ g.</li>
	<li>최대 4 h 4 ° c.에 대 한 저장소 솔루션 고정 하지 마십시오.</li>
</ol>6. 수행 유체역학 꼬리 정 맥 주입
<ol><li>restrainer를 사용 하 여 꼬리 정 맥 주입 (상업적 또는 구멍 호흡 및 꼬리 50 mL 원뿔 튜브에서 준비). 휴지로 튜브의 하단을 채우십시오.</li>
	<li>주입, 20-25 g의 무게와 나이의 약 8-10 주의 마우스를 사용 합니다.</li>
	<li>주입 하기 전에 마우스 무게와 몸 무게에 따라 주입 볼륨 준비 (몸 무게의 10%를 해당 단계 5.1 참조). 27 G-바늘으로 살 균 3 mL 주사기 주입 및 필요한 볼륨을 채우기 위한 준비.</li>
	<li>restrainer에 마우스를 놓습니다. 휴지의 양을 조절 (단계 6.1 참조) 호흡에 대 한 충분 한 공간이 있지만 운동에 대 한 최소한의 공간을 두고.</li>
	<li>마우스 정기적으로 호흡을 확인 합니다.</li>
	<li>따뜻한 신중 하 게 30-60 미에 대 한 적외선 램프를 사용 하 여 꼬리의 과열 징후에 대 한 감시.</li>
	<li>꼬리는 알코올 면봉으로 청소 합니다.</li>
	<li>거의 수평으로 꼬리의 기지에 가까운 두 측면 꼬리 정 맥 중 하나에 바늘을 삽입 합니다. 참고: 성공적으로 배치, 바늘의 콘에 다시 혈액의 작은 양의 흐름 수 있습니다. 그것은 적극적으로 발음으로 바늘의 어떤 추가적인 움직임의 변위 및 정 맥의 상해에 발생할 수 있습니다 권장 하지 않습니다.</li>
	<li>총 볼륨 8-10 s 내 꼬리 정 맥에 주사.</li>
	<li>즉시는 restrainer에서 마우스를 제거 합니다. 적어도 30에 대 한 상처는 사출 압축 s 또는 출혈이 라 앉 다 때까지.</li>
	<li>별도 감 금 소에 마우스를 놓습니다. 마우스는 절차 (약 30-60 분)에서 회복 하 고, 일단 마우스 다시 전송 그것의 원래 감 금. 정기적으로 다음 24 h에 대 한 마우스에 확인 하십시오. 참고: 마우스의 온화한 진정은 정기적으로 관찰 2 h까지 주입 후.</li>
	<li>(즉, 7 단계) 추가 실험을 계속 하기 전에 통합 되지 않은 벡터의 10-15 일을 기다립니다.</li>
</ol>7입니다. Tamoxifen Transfected 크리스챤의 유도
주의: Tamoxifen은 유해한, 수 암 또는 다 산을 손상. 안전 데이터 시트를 참조 하십시오.
<ol><li>3 일에 복 tamoxifen 주사를 계획 한다.</li>
	<li>1 일, 40 µ L 에탄올에 tamoxifen의 10 mg을 디졸브. 품 어 55 ° C 10 분 소용돌이에서 여러 번은 tamoxifen 해산 했다 때까지.</li>
	<li>960 µ L 옥수수 오일을 추가 합니다. 55 ° c.에 5 분 동안 품 어 소용돌이 명확한 솔루션을 여러 번.</li>
	<li>27 G 바늘 1 mL 인슐린 주사기에 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>아저씨 엄지와 두 번째 손가락으로 신중 하 게 마우스의 목 잡아서 마우스 손 기지와 넷째와 다섯째 손가락 사이 꼬리를 고정.</li>
	<li>솔루션의 0.1 mL (= tamoxifen의 1mg) 주사 intraperitoneally 복 부의 왼쪽된 하단 사분면에.</li>
	<li>2-3 일에 주사를 반복 합니다.</li>
</ol>8. 항생물질 종속 유전자 또는 shRNA 식의 유도
주의: Doxycycline 해로울 수 있습니다. 안전 데이터 시트를 참조 하십시오.
참고: 형식 실험의 기간에 따라, doxycycline 공급 될 수 있다 식용 수 (8.1 단계) 또는 차 (8.2 단계)
<ol><li>
짧은 기간 실험 (< 10 일) 다음 프로토콜을 사용 하 여 식 수를 통해 doxycycline 관리.
	<ol>
<li>수도 물 100 mL에 5 g 자당 분해. 오토 클레이 브.</li>
		<li>100mg doxycycline-hyclate 15 mL 원뿔 튜브에 자당 솔루션 (단계 8.1.1) 5 mL에 용 해.</li>
		<li>살 균 필터 0.2 µ m 필터를 통해 솔루션 10 mL 주사기를 사용 하 여. 8.1.1 단계에서 준비 된 자당 솔루션에 추가 합니다.</li>
		<li>마우스에 식용 수로 doxycycline 자당 솔루션을 제공 합니다. 솔루션 세균성 무성 (늦어도 3 일 후 바꾸기 명확한 솔루션)을 나타내는 흐린 때 매일 및 대체를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>장기 실험에 대 한 (> 10 일) 또는 실험 신진 대사 변화에 민감한 상업 doxycycline-차 우 사용 (예를 들어, Doxycycline Hyclate 차 우 0.625 g/kg) 탈수 또는 치료 동물의 간에서 자당 유도 된 변화를 피하기 위해.</li>
</ol>9. Immunostaining 분석에 대 한 마우스 간의 준비
주의: Paraformaldehyde 해로울 수 있습니다. 안전 데이터 시트를 참조 하십시오.
참고: 마우스를 분석할 것 이다 때 timepoint 실험에 따라 달라 집니다. 3 일 이상 transgene 또는 shRNA 식의 충분 한 유도 되도록 doxycycline 치료 후 간 조직을 분석 하는 것이 좋습니다.
<ol><li>4 %paraformaldehyde 솔루션 (PFA)의 1 mL를 27g 바늘 1 mL 주사기를 준비 합니다.</li>
	<li>승인 된 동물 프로토콜에 따라 적절 한 방법으로 마우스를 안락사. 참고: 안락사의 적절 한 방법에 대 한 지침 교육 기관에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>해가 위와 집게를 해 부 사용, 신중 하 게 노출 간 중간 개복 술과 복 부 구멍을 열어. 소장 포털 정 맥와 열 등 한 베 나 정 맥 (IVC)를 오른쪽으로 이동 합니다.</li>
	<li>준비 된 주사기의 바늘을 삽입 (단계 9.1 참조)는 IVC와 포털 정 맥으로. 간 조직 perfuse (바람직한 수행 됩니다 immunofluorescent 얼룩 경우) 자동 형광 적혈구를 제거 하 IVC로 PFA의 1 mL를 천천히 주사.</li>
	<li>간을 제거 합니다. 물에 헹 구 고 4 %PFA 솔루션의 5-10 mL을 전송.</li>
	<li>파라핀 섹션, 36-48 h. 조직에 대 한 수정 조직 탈수 및 파라핀 포함에 대 한 준비입니다.</li>
	<li>
냉동된 섹션에 대 한 수정 조직 4%에서 PFA 1 h.
	<ol>
<li>Cryoprotection에 대 한 10% 자당 해결책에 전송 합니다. 60 분을 품 어.</li>
		<li>20% 자당 해결책을 전송. 60 분을 품 어.</li>
		<li>30% 자당 해결책에 전송 합니다. 12-16 h. 소스 포함에 냉동된 섹션에 대 한 복합 incubate 고-20 ° c.에 동결</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3E+secreted+by+damaged+hepatocytes+regulates+the+sinusoidal+regeneration+and+liver+fibrosis+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration.</a> Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).</li>
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저자 공개할 게 없다

유체역학 꼬리 정 맥 주사로 hepatocytes의 transfection 되고있다 설립된 방법 그것의 소개부터 15 년 이상 전6. 주입 된 볼륨 심장 출력을 초과 하 고 간7, 어떤 경우에 약 10-20%의 transfection hepatocytes25,26의 40%까지 이어지는의 사인으로 열 등 한 베 나 정 맥에서 흐른다. 예언자는 성공적인 transfection 주입된 시간22,23당 주입 된 볼륨입니다. 따라서, 낮은 transfection 효율 (그림 1A, 왼쪽된 패널) 일반적으로 실패는 절차7동안 사출 속도 유지 하기 때문입니다. 그러나, 최적의 ...

만성 간 질환 주요 건강 부담 전세계1를 선물 한다. 동물 연구 모델 간 질환의 연구에 필수적인 도구 이며, 간 재생, 간 염증, steatosis 뿐만 아니라 간 암2에 복잡 한 질문에 대답 하는 데 도움이. 이러한 동물 모델의 상당수는 간 세포의 유전 수정에 의존합니다. 따라서, hepatocytes에 유전자 발현을 조작 하는 효율적인 도구는 도움이3. 유전자 조작된 마우스 종자의 번 식 또는 hepatocyte 감염에 대 한 바이러스 성 벡터의 생성 등 설립된 방법 중 시간이 걸리고, 항구 안전 우려, 또는 vivo에서 hepatocytes에서 가난한 transgene 식 양보 4 , 5. 유체역학 꼬리 정 맥 주입 (HTVI) 간에서 유전자 기능, 빠른, 쉽고 비용 효율적인 심문 허용 hepatocytes의 transfection 비보에 대 한 대체 방법입니다. HTVI에 대 한 원하는 DNA 시퀀스를 들고 벡터 주입 된 동물의 몸 무게의 10%에 해당 하는 염 분의 볼륨에 녹입니다. 솔루션은 다음 5-10의6이내 꼬리 정 맥에 주입 됩니다. 심장 출력을 초과, 고 염 분에서에서 흐름 열 등 한 베 나 정 맥 간 확장 및 hepatocytes7의 유체역학 transfection 간 정 맥으로. 안정적인 게놈 통합을 달성 하기 위해 메서드 자 아름다움-transposon 시스템 등 transposon 기반 벡터와 결합 하고있다. 이 시스템 게놈 재결합 사이트 자 아름다움-transposase8,9에 의해 촉매와 대상 벡터의 재결합을 중재 한다. 간 섬유 증 또는 발암 모델, 그것은 종종 overexpress 또는 침묵 유전자 질병 모델의 특정 시간 지점에서 하는 것이 좋습니다. 이 목적에 대 한 Cre/LoxP 시스템 등 항생물질을 유도할 수 있는 유전자 표현 시스템 유도할 수 있는 유전자 발현에 대 한 도구 (Tet에서) 사용된10될 수 있습니다.
여기, 우리가 잠자는 미녀 transposon-기반 시스템의 HTVI를 사용 하 여 murine hepatocytes의 transfection 비보에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 우리가 제정 tamoxifen 종속 Cre recombinase (크리스챤) 식으로 결합 하는 고급 벡터 시스템을 설명 하는 간 전용 모터의 제어 transgene의 안정적이 고 구성 적인 표현 위한 프로토콜 이외에 유도할 수 있는 표현의 transgene 또는 예측에 관한 적응 shRNA (미르-shRNA), pTC 라는 TET 시스템11. 이 벡터 시스템에서 유도할 수 있는 transgenes 또는 항생물질 종속 식 미르-shRNAs recombinational 복제 시스템, 새로운 벡터12의 신속 하 고 쉽게 생성 수 있도록 백본 벡터에 복제 됩니다. 이 비디오 기반 가이드 유도할 수 있는 transgene/미르-shRNA 식 달성에 적합 한 벡터, 주입 및 쥐의 치료의 준비 그리고 마지막으로 간 조직 분석에 대 한 준비를 다루고 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 식과 Cre/loxP 중재 마우스 시스템의 조합 또는 간 질환의 연구에 널리 적용 가능한 시스템을 만드는 선택의 어떤 유전자의 노크 다운 수 있도록 설계 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>General Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher</td><td>#SM1331</td><td>전기영동용 DNA 사다리</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>극저온 절편</td></tr><tr><td>Biozym 매립 LE Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>D (+) -Saccharose</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td>독시실린 용액의 감미료</td></tr><tr><td>Ampicillin Sodium Salt</td><td>AppliChem</td><td>A0839,0010</td><td>Amp 내성 클론 선택</td></tr><tr><td>LB Agar (Luria/Miller)</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth (Luria/Miller)</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Fischer</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate</td><td>AppliChem</td><td>A1492,0001</td><td>For selection of Gentamicin-resistant clones</td></tr><tr><td>Roti-Histofix 4 %</td><td>Fa. Roth</td><td>P087.6</td><td>파라포름알데히드 용액</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>GatewayTM LR ClonaseTM II 효소 혼합물</td><td>Invitrogen/ThermoFisher</td><td>11791-020</td>에는 <td>LR-클로나제 효소 혼합물 II와 단백질분해효소 K</td></tr><tr><td>DB3.1 Competent</td><td>Cells Thermo Fisher</td><td>11782-018</td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 Chemically Competent E. coli</td><td>Thermo Fisher</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>Restriction Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>AscI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0558S</td><td></td></tr><tr><td>FseI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0588S</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩</td><td>R0156S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>BfuAI</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩</td><td>R0701S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>For DNA Extraction from gel</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean Up</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740609.10</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond PC20</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740571</td><td>플라스미드 추출(미니 준비)</td></tr><tr><td>NucleoBond PC500</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740574</td><td>Plasmid extraction (Maxi prep)</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Materials for Mouse Experiments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injekt 주사기 F 1ml</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td>복강내 주사용</td></tr><tr><td>Omnifix Luer 3ml</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td>정맥 주사용</td></tr><tr><td>Sterican Cannula 24G</td><td>Braun</td><td>4657675</td><td></td></tr><tr><td>Sterican Cannula 27G</td><td>Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td>CreER 활성화용</td></tr><tr><td>옥수수 기름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td>타목시펜 주사용 캐리어</td></tr><tr><td>독시사이클린 하이클레이트</td><td>AppliChem</td><td>A2951,0025</td><td>테트라사이클린 의존성 발현의 활성화</td></tr><tr><td>Injekt 10 ml 주사기</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2</td><td>Sarstedt</td><td>831,826,001</td><td>독시사이클린</td></tr><tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Braun</td><td>의 여과용</td><td>3200905 정맥 주사용 캐리어</td></tr><tr><td>팔콘 원뿔형 튜브 50ml</td><td>코닝 생명 과학</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>적외선 램프</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>마우스 꼬리 온난화용</td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>생체 내 이미징 시스템</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids for sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pTC</td><td></td><td></td><td>Vector for constitutive gene expression, ref. 15</td></tr><tr><td>pEN_TTmcs</td><td></td><td>Addgene #25755</td><td>Entry vector for inducible gene expression, ref. 19</td></tr><tr><td>pEN_TTGmiRc2</td><td></td><td>Addgene #25753</td><td>GFP의 동시 발현을 통한 유도성 miR-shRNA 발현을 위한 엔트리 벡터, ref. 19</td></tr><tr><td>pEN_TTmiRc2</td><td></td><td>Addgene #25752</td><td>GFP의 동시 발현 없이 유도성 miR-shRNA 발현을 위한 엔트리 벡터, ref. 19</td></tr><tr><td>pTC ApoE-Tet</td><td></td><td>Addgene #85578</td><td>ApoE.HCR.hAAT promotor를 사용한 유도성 유전자 또는 miR-shRNA 발현을 위한 발현 벡터, ref. 11</td></tr><tr><td>pTC-CMV-Tet</td><td></td><td>Addgene #85577</td><td>CMV promotor를 이용한 유도성 유전자 또는 miR-shRNA 발현을 위한 발현 벡터, ref. 11</td></tr></tbody></table>

유체역학 꼬리 정 맥 주입을 사용 하 여 마우스 hepatocytes의 유전 vivo에서 수정에 대 한 제정 및 유도할 수 있는 시스템

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

간 암, 재생, 염증, 섬유 증의 연구 모델에서 vivo에서 유전자 발현 및 침묵에 대 한 유연한 시스템은 매우 유용 합니다. 유체역학 꼬리 정 맥 주입의 transposon 기반 구문 성인 쥐 hepatocytes의 유전자 조작에 대 한 효율적인 방법입니다. 제정 transgene 식 이외에 유전자 돌연변이 유도 하는 CRISPR/Cas9 시스템 또는 유도할 수 있는 시스템의 shRNA 중재 유전자 노크 다운, 의미 같은 고급 응용 프로그램에 대 한이 시스템을 사용할 수 있습니다. 여기는 transgene의 유도할 수 있는 표정과 함께 제정 있다 식의 조합 또는 선택의 미르 shRNA이 기술의 예로 제공 됩니다. 우리는 잠자는 미녀의준비에서 시작 하는 다단계 절차를 커버-transposon, 주입 및 마우스의 처리 및 분석에 대 한 간 조직 준비 하 여 구성 immunostaining. 제시 하는 시스템은 hepatocytes에서 복잡 한 유전자 조작을 달성 하기 위해 안정적이 고 효율적인 접근 이다. 그것은 Cre/loxP 기반 마우스 종자와 함께에서 특히 유용 하 고 다양 한 간 질환의 연구에서 모델에 적용할 수 있습니다.

유체 꼬리 정 맥 주입 하 여 transfection 효능: Hydrodynamically 단일 주사로 페는 murine hepatocytes의 비율 변수 이며 여러 매개 변수 주입 량, 주입 시간, 주입 된 DNA의 양과 주입된 구성6,의 크기에 따라 달라 집니다. 22,23. 또한, transfection 효율 큰 정현파 지역 뿐만 아니라 더 큰 혈관 직경 전체 압력에 있는 감소에 지도 한다 더 큰 동물에 일반적으로 낮습니다. Transfection 효율을 시각화, 크리스챤 transposon 구문 HTVI Rosa26mTmG 취재 원 유전자 있다 구조물의 tamoxifen 중재 활성화 하 여 다음을 은닉 하는 쥐에서 수행 되었다. ...

유체역학 꼬리 정 맥 주입 transposon 기반 통합 벡터의 수 murine hepatocytes의 안정 되어 있는 transfection vivo에서. 여기, 우리는 단일 transgene의 장기 제정 식 또는 결합 된 제정 및 doxycycline 유도할 수 있는 표현의 transgene 또는 간에서 미르 shRNA 있도록 transfection 시스템을 위한 실용적인 프로토콜 제시.

유체역학 꼬리 정 맥 주입을 사용 하 여 마우스 Hepatocytes의 유전 Vivo에서 수정에 대 한 제정 및 유도할 수 있는 시스템

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

이 방법의 전반적인 목표는 유도성 유전자 또는 shRNA 발현을 위한 벡터 구조를 사용하여 in vivo에서 간세포의 안정적인 transfection입니다. 이 방법은 간 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 간암과 재생의 메커니즘을 조사하는 데 적용할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 유체역학적 꼬리 정맥 주입에 의해 달성된 생체 내 마우스 간세포에서 유도성 transgene R shRNA 발현과 함께 CreER의 발현이 결합되어 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 의대생인 Eric Hubner가 맡을 것입니다. 먼저 표적 단백질에 대한 짧은 헤어핀 RNA를 포함하는 150나노그램의 진입 벡터와 150나노그램의 pTC Tet 벡터 및 TE 버퍼를 총 8마이크로리터 부피로 결합합니다.그런 다음 LR 클로나제 효소 믹스 II를 얼음에 옮기고 2분 동안 배양합니다. 배양 중 두 번 소용돌이. 그런 다음 2마이크로리터의 LR 클로나제 효소 믹스 II를 반응에 첨가하고 섭씨 25도에서 1시간 동안 배양합니다.배양 후 1마이크로리터의 proteinase K 용액을 첨가하여 반응을 중지합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 표준 열 충격 프로토콜을 사용하여 2마이크로리터의 클로닝 혼합물로 Stbl3 수용 박테리아를 변환합니다.암피실린을 함유 한 한천 플레이트에 형질전환을 도금 한 후 섭씨 30도에서 24 시간 동안 배양한다. 다음 날, 단일 집락을 선택하고 밤새 배양을 위해 소량의 박테리아 성장 배지를 접종합니다. DNA를 분리하고 Sanger 염기서열분석으로 벡터 무결성을 확인한 후 주입을 위해 구조체의 최대 크기 DNA prep을 준비합니다.쥐의 무게를 재는 것으로 시작합니다. 그런 다음 내독소가 없는 잠자는 숲속의 미녀 벡터 구축물 15마이크로그램과 내독소가 없는 pchsB5 밀리리터당 1마이크로그램을 포함하는 멸균 식염수를 준비합니다. 각 마우스에 체중의 10%에 해당하는 부피를 주입할 수 있는 충분한 용액을 준비합니다.멸균 3ml 주사기에 마우스 한 마리에 필요한 양을 채우고 27게이지 바늘을 부착합니다. 움직일 수 있는 최소한의 공간이지만 숨을 쉴 수 있는 충분한 공간을 확보하기 위해 적절한 양의 티슈 페이퍼를 추가한 후 호흡 구멍이 있는 적절한 구속기에 마우스를 삽입합니다. 적외선 램프를 사용하여 꼬리를 30-60초

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오는 마우스 모델에서 타목시펜의 복강 내 주입 후 타목시펜 유도 Cre-recombinase 시스템을 사용하여 표적 유전자 녹아웃을 수행하는 절차를 설명합니다.

CreER-LoxP 시스템 기반 표적 유전자 불활성화: 마우스 모델에서 표적 유전자 녹아웃을 위한 타목시펜 유도성 Cre 재조합효소 시스템

이 비디오는 마우스 모델의 테트라사이클린 또는 Tet-On 유전자 발현 시스템을 보여줍니다. 테트라사이클린 유도체인 독시사이클린(doxycycline)이 존재할 때, 역테트라사이클린(reverse tetracycline)으로 제어되는 트랜스액티베이터(transactivator) 단백질로 구성된 Tet-On 시스템이 활성화되고 관심 유전자를 발현합니다.

Inducible Tet-On 조절 가능한 시스템 기반 유전자 발현 In Vivo: 마우스 모델에서 표적 유전자 전사 활성화를 위한 테트라사이클린 유도 유전자 발현 시스템

이 비디오는 유체역학적 꼬리 정맥 주입에 의한 쥐 간세포의 유전적 생체 내 형질 주입 기술을 설명합니다. 이 transfection system은 간세포에서 transgene의 장기 발현을 생성합니다.

유체역학적 유전자 전달: 꼬리 정맥 주입을 통한 쥐 간세포에서 외인성 DNA의 생체 내 형질 주입 기술

유체 유전자 전달에 의한 벌거 벗은 DNA의 생체 내 형질에서 최소한의 염증 반응과 동물의 조직에 유전자를 소개합니다. 유전자 산물의 충분한 양의 유전자 기능 및 조절뿐만 아니라, 단백질의 구조 및 기능 분석 될 수 있도록 생성된다.

마우스의 수력 학적 유전자 전달에 의한 단백질의 일시적 발현

여기에서는 미성숙 및 확장 가능한 인간 간 줄기 세포의 이식 후 Alb-toxin receptor mediated cell knockout(TRECK)/SCID 마우스에서 생성된 새로운 인간화 마우스 간 모델을 제시합니다.

인간 간 줄기 세포를 이용한 인간형 마우스 간 세대

클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템 유전 공학에 대 한 유망한 도구를 제공 하 고 transgenes 대상된 통합의 가능성을 엽니다. (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝 설명-효율적인 DNA 비보에 통합 대상 및 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 치료를 대상으로 전략을 기반으로.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

여기 선물이 쥐에서 심장 관련 유전자 조작에 대 한 프로토콜. 마 취, 마우스 마음 4 있는 공간을 통해 externalized 했다. 그 후, adenoviruses 인코딩 특정 유전자 단백질 식 측정 뒤에 vivo에서 이미징 및 서 부를 통해 심근에 주사기로 주입 했다 분석 오 점.

Intramyocardial 쥐에 주입 하 여 심장 관련 유전자 조작 비보에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법

여기, 우리 현재 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 hepatocytes를 사용 하 여 가족성 콜레스테롤 혈 증의 인간 간 공상 마우스 모델을 생성 하는 프로토콜. 콜레스테롤 혈 증에 대 한 새로운 치료법을 테스트 하기 위한 유용한 모델입니다.

가족성 콜레스테롤 혈 증 인간의 간 공상 마우스 모델을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 Hepatocytes

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 세포 유형별 번역 mRNA를 신속하고 효율적으로 분리할 수 있습니다. 여기서, 우리는 간 재모독 및 TRAP의 마우스 모델에서 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 결합하여 간세포를 재채우는 발현 프로필을 검사하는 방법을 입증한다.

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링

이 프로토콜은 간으로부터 원발성 마우스 간세포를 단리하고 리보뉴클레오단백질 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9를 전기천공하여 간장의 유전된 대사성 질환과 관련된 치료적 표적 유전자를 교란시키는 기술을 기술한다. 기술된 방법은 전기천공 후 높은 생존력과 높은 수준의 유전자 변형을 초래한다.

갓 분리된 일차 마우스 간세포로의 Cas9 리보뉴클레오단백질 및 mRNA의 전기천공-매개 전달

이 프로토콜은 마우스 난관에서 국소적으로 제한된 CRISPR 매개 게놈 편집을 위한 미세주입 및 생체 내 전기천공을 설명합니다.

생체 내 미세주입 및 전기천공을 사용한 체세포 게놈 공학 마우스 모델

학습하세요 마우스 간세포의 안정적인 형질전환을 위한 유체역학 꼬리 정맥 주입법을 사용하여 유도 가능한 유전자 발현을 연구하는 방법을. 이 기술은 간암 및 재생 메커니즘 연구에 활용됩니다.

유체역학 꼬리 정 맥 주입을 사용 하 여 마우스 Hepatocytes의 유전 Vivo에서 수정에 대 한 제정 및 유도할 수 있는 시스템

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