Name: 생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 학습하세요 쥐 뇌 유래 신경교세포를 3D 하이드로겔 배양하는 방법을. HAMA 하이드로겔 캡슐화와 공초점 현미경 기술을 활용하여 신경염증 연구와 재생 전략 개발에 필수적인 생체 외 모델을 구축합니다.

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저자는 NSERC, CFI, AIHS, 알버타 헬스 서비스, 그리고 뇌 연구를 위한 비 기부금에서 재정 지원에 대 한 감사.

주 1 Sprague Dawley 쥐 새끼, 잘린에 의해 안락사에서 뇌 조직 추출 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회 앨버타의 대학에 의해 승인 되었다.
1. Microglia 및 사이토 격리67,68
참고: 격리 및 세포 배양에 대 한 모든 미디어는 물 욕조에 37 ° c으로 미리 데워 행 크의 균형된 소금물 (HBSS)는 1% 페니실린-스 (PS). 모든 Dulbecco의 햄의 F12 영양소 혼합 (DMEM/F12) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린-스 (PS) 보충은 글의 미디어를 수정 합니다. 트립 신으로 유일한 혼합물 FBS 부족합니다. 이 프로토콜에서 모든 물질이 살 균 (필터, 알코올, 산, 고 압력가) 고 단계 번호 1.8 이후 모든 단계 biosafety 무 균 기법으로 캐비닛에서 수행 됩니다.
<ol><li>뇌, 당 전 15 mL HBSS의 그리고 12.5 mL 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 37 ° C에 DMEM/F12 약 2 mL 1 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 0.25 %trypsin 열. DMEM/F12의 추가 25 mL가 열. 효소 활동의 손실을 방지 하기 위해 사용 하 여 따뜻한 트립 신 약 10 분 전에.</li>
	<li>살 균, 6 충분 한 따뜻한 HBSS 붓고와 표면 하 10 cm 문화 요리. 한 10 cm 접시 마다 2 개의 두뇌에 대 한 더하기 추가로 6 cm 접시를 준비 합니다.</li>
	<li>각 10 cm2 접시 (그림 2A)에 최대 2 두뇌를 놓습니다.</li>
	<li>해 부 현미경 아래 곡선 및 직선 겸 자 사용 하 여 뇌 줄기 따라 중간, 그리고 소 뇌 외피가 구분. 이 뇌 (그림 2B) 당 조직의 3 개의 섹션을 생성합니다.</li>
	<li>혈관 조직 및 삭제, 별도 문화 그릇에 남은 조직 전송의 각 섹션에서 포함 된 조직의 얇은, 반투명, 레이어 (meninges) 껍질. 집게와 조직의 상처에 의해 노출 되는 얇은 층을 파악 하 고 주요 부분은 '걸려' 뇌 조직 때까지 조심 스럽게 빼냅니다. 마지막으로 부드럽게 잡아 당 겼 여이 부분을 제거 합니다. 그림 2C참조-2E 전에, 동안, 그리고이 단계 후의 대표 이미지.</li>
	<li>Biosafety 내각에서 나머지 HBSS 신중 하 게 유지 하는 조직 문화 접시에서 제거 합니다. 메스와 조직 macerate 하 고 조직을 트립 신으로 미리 데워 15 mL 튜브에 전송.</li>
	<li>조직을 효소 소화 37 ° C 목욕에서 25 분이 튜브를 품 어.</li>
	<li>실 온에서 2 분 동안 500 x g에서 다운 튜브를 원심과 상쾌한 밖으로 붓는 다.</li>
	<li>10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 조직 헤어 따뜻한 DMEM/F12 비활성화는 트립 신을 triturate 솔루션 5 번의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 2 분 동안 500 x g에서 다운 튜브를 원심과 상쾌한 밖으로 붓는 다.</li>
	<li>10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 다시 따뜻한 DMEM/F12의 10 mL에 펠 릿을 일시 중단 하 고 솔루션 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 전송.</li>
	<li>18 게이지 바늘 10 mL 주사기를 사용 하 여, triturate 솔루션 3 번.</li>
	<li>따뜻한 DMEM/F12 뇌 당 12.5 mL 씩으로이 솔루션을 배포 합니다.</li>
	<li>12에 triturated 솔루션의 피 펫 1 mL 씩 잘 (뇌 당 1) 접시.</li>
	<li>습도 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO2에서 품 어. 3 일 후, 미디어를 교체 하 고 모든 후속 3 일 미디어를 새로 고침. 2 주 후, 실험에 대 한 셀을 수집할 수 있습니다.</li>
</ol>2. Macromer 종합69
<ol><li>히 알루 론 산 (HA) 소금의 375 mg 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 무게 고 37.5 mL의 증류수를 추가 합니다.</li>
	<li>1 분 동안 vortexer와 함께 솔루션을 플러시 하 고 동질적인 나타납니다의 젤 같은 점도 잃는 때까지 혼합물을 sonicate. 이 프로세스는 6 h를 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>자기와 함께 100 mL 비 커에 전송 솔루션 (38mm), 바 저 어 하 고 실 온에서 적극적으로 저 어.</li>
	<li>8과 12 사이 pH 안정화 될 때까지 신중 하 게 혼합 하 고 pH 종이 측정으로 5.0 M NaOH 적정.</li>
	<li>보관 시 질소 blanketed 신선한 酸 무수 물 (MA, 94%)의 3 mL를 수집 합니다. 참고: MA 긴 기간에 대 한 분위기에 노출은 (일), 그것은 그것의 반응성을 잃을 것 이다. 주의: 엄마의 모든 사용 증기 두건에서 이루어져야 합니다.</li>
	<li>혼합 HA 솔루션으로 엄마의 200 µ L를 추가 합니다. 반응 8 아래 솔루션의 pH를 낮춘 다.</li>
	<li>2.4 2.6 단계를 반복 하 여 엄마의 3 mL 솔루션에 추가 되었습니다. 이 과정은 1-2 h까지 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>반응 혼합 하지 않고 4 ° C에서 밤새 계속 허용 합니다.</li>
	<li>400 ml 500 mL 비 커에 찬 에탄올 (EtOH)의 솔루션을 전송 및 4 ° c.에 24-72 h에 대 한 강 수를 허용 56
</li>
	<li>신중 하 게 처리, 별도 비 커에는 솔루션의 주요 부분을 가만히 따르다을 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 침전을 수집 합니다. 이 필요한 경우 2-4 튜브에 배포할 수 있습니다.</li>
	<li>실내 온도 상쾌한의 dispose에서 2 분 동안 원심 분리기에서 200 x g에서 튜브 원심</li>
	<li>차가운 EtOH와 튜브 top 가기 하 고 1 분 동안 vortexer 솔루션 혼합 단계 2.10 2.11 반복.</li>
	<li>살 균 이온된 물 25 mL를 추가, 1 분 동안 vortexer 솔루션 혼합, sonicate (> 20 kHz) 1 시간, 및 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>15 분 또는 때까지 동결-80 ° C 냉동 고에서 솔루션 배치 또는 플래시 동결에 액체 질소. 주의: 액체 질소를 사용할 경우 사용 하 여 보호 장갑, 얼굴 방패, 및 앞치마.</li>
	<li>동결 건조 24-48 시간 (아래 0.1 mBar-30 ° C) 튜브 눈 모양의 분말 생산 될 때까지.</li>
	<li>이 시점에서 1H 핵 자기 공명, HA 등뼈에 메타 크 릴 산 양성자 (6.1 및 5.6 ppm에서 봉우리) 메 틸 양성자 (1.9 p p m), 기준의 금액을 확인할 수 있습니다 통해 순도 대 한 샘플 테스트. 95% 메타 크 릴 산 메 틸 양성자에의 최소 비율 허용 됩니다. 69
</li>
</ol>3. 젤 형성 및 3D 캡슐화65
<ol><li>
Coverslip 및 금형 준비
	<ol>
<li>2%의 증류수 50 mL 물 솔루션 3-(Trimethoxysilyl) 틸 메타 크 릴 산 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서.</li>
		<li>18 m m 유리 coverslips를 솔루션 및 실 온에서 1 h에 대 한 바위에 놓습니다. 50 coverslips까지 한 번에 추가할 수 있습니다.</li>
		<li>Coverslips 직렬 3 비 커 100ml 이온된 물에 각각 담거 서 린스.</li>
		<li>40 ° C 하룻밤 desiccator와 오븐에서 진공 상태에서 coverslips를 건조.</li>
		<li>신속 하 게 담가 70%에서 개별 coverslips EtOH 집게와.</li>
		<li>건조 하지 않고 12 잘 접시의 우물에 각 coverslip 드롭.</li>
		<li>세척 하 고 살 균 이온된 수 (우물 당 1 mL)으로 각 잘 발음.</li>
		<li>각 잘을 1 mL의 멸 균 2 µ g /mL 폴 리-L-리 신 (PLL)를 추가 하 고 위해 품 어 > 2 h.</li>
		<li>PLL 솔루션을 발음 하 고 건조 공기를 coverslips 있습니다.</li>
		<li>Polydimethyl 실록 산 (PDMS) 형 ( 그림 1참조) 70 %EtOH, 및 각 coverslip의 센터에 장소 하나에 담가 건조 공기를 허용 하 고 형과 유리 사이 물개를 만들.<ol>
<li>폴리스 티 렌 접시 바닥에 10:1 비율에서 PDMS 섞은 약을 캐스팅 하 여 PDMS 몰드를 준비 합니다. 준비 된 PDMS의 수량 약 1 m m 두꺼운 시트를 선택 합니다. 10의 내부 직경을 가진 원형 펀치와 함께 시트를 잘라 PDMS에의 모양 우물을</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 준비 참고: 프로토콜에서 모든 단계는 biosafety 캐비닛에 무 균 기법으로 수행 됩니다. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)은 모든 단계에 대 한 pH 7.4에 조정 된다.<ol>
<li>하 마에 셀 캡슐화 하기 전에 24 시간 12 잘 플레이트에 (에서 단계 1.15) 2 주 기본 문화권에 대 한 매체를 새로 고칩니다. DMEM/F12의 1 mL을 추가 (10 %FBS 1 %PS) 잘 당 중간.</li>
		<li>셀의 각 12-잘 접시 준비의 희석 trypsin (0.25% trypsin EDTA 희석 30 %DMEM / F12 미디어), 12.5 mL 25 mL DMEM/F12 (10 %FBS 1 %PS)에 따뜻한 물 욕조에 37 ° C에서.</li>
		<li>10 mL 혈 청 학적인 피 펫 (> 0.5 mL 잘 당)를 사용 하 여 격판덮개에서 조절된 매체를 수집, 철저 하 게 남은 액체, 발음 및까지 희석 트립 신 (0.075% 트립 신-EDTA) (37 ° C, 5% CO2) 인큐베이터에서 20-30 분의 당 1 mL를 바꿉니다 confluent 셀 레이어 접시에서 분리합니다.</li>
		<li>1 mL 피 펫 (단일 부동 조각으로 표시)와 정지 셀 자료를 복구 하 고 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 수집 합니다. DMEM/f 12의 동등한 양으로 희석 (10 %FBS 1 %PS), 그리고 삭제는 상쾌한 실내 온도에 2 분 동안 200 x g에서 원심 분리기.</li>
		<li>Resuspend 셀 펠 릿 10 ml에서 따뜻한 DMEM/F12 (10 %FBS 1 %PS), triturate 셀 10 mL 피 펫을 5 번 하 고 2 분 200 x g에서 원심.</li>
		<li>상쾌한 가만히 따르다, 다시 5 mL에 셀 중단 DMEM/F12, 따뜻하고 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 세포를 전송.</li>
		<li>18 게이지 바늘 10 mL 주사기를 사용 하 여, triturate 셀 솔루션 3 번 하 고 새로운 원뿔 원심 분리기 튜브로 40 µ m 세포 체를 통해 정지를 필터링 합니다.</li>
		<li>세포 현 탁 액의 10 µ L를 수집, 따뜻한 DMEM/F12, 및 자동화 된 셀 카운터 카운트 셀에서 1: 100 희석</li>
		<li>캡슐화 단계까지 37 ° C 물 욕조에 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 캡슐화 참고: 프로토콜에서 모든 단계는 biosafety 캐비닛에 무 균 기법으로 수행 됩니다.<ol>
<li>3D의 각 12-잘 접시 hydrogels DMEM/F12의 12.5 mL 및 셀 준비 하는 동안 수집 된 바른된 DMEM/F12 미디어의 12.5 mL 따뜻한.</li>
		<li>Methacrylated 히 알루 론 산 (하 마) 최종 농도 0.5 %wt / vol.의 분해 (2 %wt / vol);의 농도에서 살 균 필터링 된 PBS에이 마에 필요한 양의 무게 최종 농도 보다 4 배 높은 농도 세포 및 다른 시 약의 추가 수용 하기 위하여 이용 된다. 한 12 잘 접시 hydrogels 필요 7 mg 하 마와 ~ 350 µ L PBS.</li>
		<li>Sonicate (> 20 kHz) 솔루션 하 마 60 분 동안 완전히 해산 될 때까지.</li>
		<li>Triethanolamine (차) 및 1-비닐-2-pyrrolidinone (NVP), 개별 10% 솔루션 및 살 균 PBS pH 7.4의 1 mL aliquots에서 1 m m 솔루션 오신 Y (EY)의 준비.</li>
		<li>한 12 음 접시에 대 한 확인 1 x 10의 최종 1.4 mL 혼합7 셀, 0.5 %wt / 집 하 마 (2 %wt / 집의 350 µ L), 0.1% 차 (10%의 14 µ L), 0.1 %NVP (10%의 14 µ L), 0.01 m m EY (1 m m의 14 µ L) 그리고 20% 기저 lamina 혼합물 (재고의 280 µ L). 나머지 볼륨은 PBS.</li>
		<li>부드럽게 솔루션을 혼합 하 고 1 mL 팁 각 PDMS 몰드로 100 µ L를 플라스틱.</li>
		<li>샘플 높은 강도 녹색 LED 빛에 노출 (~ 520 nm, 60 mW는 동봉 된 20 cm x 20 cm x 20 cm 상자에에서) 실 온에서 5 분.</li>
		<li>12 잘 접시에 따뜻한 조건된 DMEM/F12의 당 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>각 coverslip 엄지와 검지로 잡고, 천천히 젤, 치환 하지 않도록 주의 되 고 곡선된 핀셋으로 PDMS 몰드를 벗기다 고 그것 조절된 매체와 잘 합니다.</li>
		<li>추가 1 mL을 추가 각 잘 DMEM/F12 따뜻한.</li>
		<li>2 주 동안, 각 우물에서 미디어의 pipetting 1 mL에 의해 매주 셀 미디어를 상쾌하 고 1 mL DMEM/F12 교체 5% CO2 와 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 현미경
<ol><li>
Immunocytochemistry 참고: 거꾸로 confocal 현미경이이 샘플 이미지를 사용 했다 고 ImageJ 처리 하 고 이미지를 표시 하는 데 사용 되었다. Microglia, 이다, oligodendrocytes, 및 핵, 3 주 후에 하 마 문화 표시 됩니다.<ol>
<li>10 %PBS 버퍼링 포 르 말린 (pH 7.0) 37 ° C 욕조에 예 열. 주의: 포 르 말린 증기 두건 밖에 서 사용할 수 있습니다, 하지만이 자료는 조직와 반응 이며 항상 관심과 장갑 처리 되어야 합니다. 그것은 별도로 삭제 해야 합니다.</li>
		<li>신중 하 게 각 우물에 접시와 피 펫 10% 포 르 말린의 1 mL에서 미디어 발음.</li>
		<li>5% CO2 20 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
		<li>각 접시에서 액체를 발음 하 고, 플라스틱 2 mL PBS (pH 7.4)의 각 음에 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>4.1.4 단계를 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>접시에서 액체를 발음, 10% 정상 말 혈 청 (NHS)와 0.5% 트라이 톤 X-100, PBS의 잘 당 1 mL을 추가 하 고 최소 속도로 부드럽게 바위) 1 시간에 대 한.</li>
		<li>4.1.4 단계를 세 번 반복 합니다.</li>
		<li>액체를 발음 하 고 PBS에 다음 혼합물의 당 1 mL을 추가: 토끼 이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 (Iba1) 1:1, 000, 닭고기 glial fibrillary 단백질 (GFAP) 1:5, 000, 마우스 2', 3'-주기적-nucelotide 3'-phophodiesterase (CNPase) 1:1, 000, 1% 보 건국 0.1% 세포 꿰 뚫는 계면 활성 제. 품 어 4 ° C에서 하룻밤, 접시를 최대한 부드럽게 락.</li>
		<li>사이 세 번 1 h 외피와 4.1.4 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>액체를 발음 하 고 PBS에 다음 혼합물의 당 1 mL을 추가: 647 nm 흥분 당나귀 안티 토끼 항 체 1: 200, 546 nm 흥분 염소 안티 닭 항 체 1: 200, 488 nm 흥분 당나귀 반대로 마우스 항 체 1: 200, 1% 보 건국, 1:1,000 파란 핵 얼룩. 부드럽게 접시 락 1 시간 실 온에서 품 어.</li>
		<li>사이 세 번 1 h 외피와 4 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>유지는 hydrogels, 버퍼, 발음 하 고 설치 중간에 밖으로 1 분 피 펫에 대 한 셀 장착 매체의 0.5 mL에 그들을 담가 부드럽게 유리 사이의 계층 젤 위에 coverslip 장소. 하이드로 겔의 건조를 방지 하기 위해 coverslips의 발견된 측에 장착 매체의 작은 금액을 추가 합니다. 참고: 문제 해결을 위해, 젤 수 수 몇 군데 단계 4.1.11에. 더 처리 하기 전에 적절 한 라벨을 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스캐닝 전자 현미경 (SEM) 참고: 시각화는 히드로, 스캐닝 전자 현미경이이 샘플 이미지를 사용 되었다.<ol>
<li>전 2.5%도 및 2% paraformaldehyde PBS (0.1 M)에서 37 ° C 물 목욕에서 통 혼합 열. 주의:이 시 약 조직, 반응성이 매우 높은 이며 진료와 장갑 처리 합니다. 그들은 가능한 한 많이 연기 후드에 처리 한다 고 별도로 삭제.</li>
		<li>세포 배양 배지에서 매체를 발음 하 고 미리가 열된 통 혼합물의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>5% CO2 20 분 동안 37 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
		<li>4 ° C (냉장고/쿨러)에 하룻밤 접시를 놓습니다.</li>
		<li>우물에서 통 솔루션을 발음 하 고 PBS의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>각 접시에서 액체를 발음, 각 음에 PBS의 2 개 mL를 추가 하 고 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>단계 4.2.6 두 번 더 반복 합니다.</li>
		<li>PBS를 발음 하 고 1% 오스뮴 tetraoxide 각 우물에 PBS에 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 샘플, 건조 될 때까지 모든 후속 단계 및이 단계에서에서 수행 됩니다 증기 두건.</li>
		<li>액체에서 30 분 오스뮴 증기 같은 접시;에 다른 샘플을 수정할 수 있습니다에 대 한 발생 하는 고정 허용 따라서, 그에 따라 샘플을 분할 하기 전에이 단계. 주의: 오스뮴 tetraoxide 높은 조직으로 반응 하 고 휘발성 이다. 그것은 위험 하며 장갑과 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. 그것은 및 즉시 세척 되어야 disposed 별도로.</li>
		<li>4.2.6 단계를 세 번 반복 합니다.</li>
		<li>액체를 발음 탈수 혼합물 순서 대로 아래 목록에 추가 하 고 지정 된 시간에 대 한 (실내 온도)를 품 어. 에탄올 (EtOH) hexamethyldisilazane (HMDS) 다음 다음 점차적으로 추가 하 여 시작 합니다. 각 증분에 표 2 를 참조 하십시오. 참고: HMDS를 추가 하는 경우는 coverslips 고 수 있습니다 강력 하 게 플라스틱을 제거 하기 매우 어려운 될. 이 후 HMDS의 첫 번째 응용 프로그램 유리 슬립 아래 작은 플라스틱 플랫폼을 배치 하 여 방지할 수 있습니다. 두 번째 EtOH 부 화 후 샘플 촬영 고 액체 질소 동결 골절 샘플 몇 초 동안 침묵 될 수 있습니다.</li>
		<li>조심 스럽게 말린된 샘플을 제거 하 고 이중 양면된 전도성 테이프와 스캐닝 전자 현미경 명세서에 샘플을 탑재.</li>
		<li>스퍼터 코트 최소한 골드의 샘플. 홀더 샘플 놓고 15 시 2 분에 대 한 기계 작동 mA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

모델 glial bioreactivity 3 차원 문화 시스템 및 glial 흉터 프로세스 생성의 목표를 향해 우리 셀의 강력한 묘사를 가능 하 게 이다 및 oligodendrocytes 기본 교양된 microglia를 지원할 수 있는 시스템을 개발 했습니다. 형태학 및 세포 세포 상호 작용입니다. 표시 하는 현미경 사진에서 각 셀 형식의 형태학이 달랐다 분명히 2D, 3D-하 마, 그리고 3D 하 마 기저 lamina 혼합 플랫폼. 2D 시스템에서의 표면, 평면 형태 치우친 분명히 있었으나 3D 하 마에 비해 microglia 및 이다 oligodendrocyte 클러스터 제외한 매트릭스 안에 일반적으로 더 작은. 스캐닝 전자 현미경에서 세포 했다 일반적으로 더는 하 마에 둥근 모양. 이것은 크게 운동 및 자유로운 이동 및 프로세스의 성장에 대 한 행렬을 수정 하려면 제한 된 용량으로 캡슐화 되 고 셀 원인일 수 있습니다. 하 마에서 셀 파생물 이다와 oligodendrocytes에 대 한 일반적으로 레이디얼 이었다. 이러한 ...

중앙 신경 조직 (CNS)의 염증이 오래 고려 되었습니다 급성의 특징 (예:허 혈 성 뇌졸중, 외상 성 뇌, 척수 손상) 및 만성 (예: 알츠하이머병, 파 킨 슨 병의, 그리고 Huntington의 질병) CNS 상해, 하지만 점점 신경 정신병 무질서 하 인과 기여자로 인식 됩니다. 지속 또는 부적 절 한 수 있습니다 신경 상해의 원인과 demyelination (예: 다 발성 경화 증), 염증과 부정적인 영향 (예를 들어, 정신 분열 증, 자폐증) 두뇌 개발 및 기분 상태 (예, 우울증, 불안 양극성 질환). 또한, 새로운 치료 전략을 이식할 수 있는 장치를 사용 하 여 (예., 뇌-컴퓨터 인터페이스1,2,3, 깊은 두뇌 자극4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,,910) 장치 및 CNS에서 결과 사이의 인터페이스에서 예측 가능한 선 동적인 응답을 생성 한 11임 플 란 트 수명에 걸쳐 효능 또는 장치 실패의 손실을 일으킬 수 있는 보호 조직 응답. CNS에 염증은 일반적으로 CNS 조직 감시 및 이물질 응답 (검토12) 장착에 대 한 책임의 거주 면역 세포 기능 microglia에 의해 시작 됩니다. 모욕의 심각도에 따라, microglia 신호 및 모집 추가 부상 사이트 종류 세포. 특히,는 microglia 활성화에 보조 염증 세포 및 양식 부상 사이트13,14를 포함 하는 밀도 보호벽 역할 이다. Microglia 또한 (참조15검토) 면역 침투를 허용 하도록 BBB의 붕괴 귀 착될 수 있다 주변 면역계의 세포에 활동 캐스케이드를 시작할 수 있습니다.
CNS에 이식 하는 장치의 경우 조직을 피해 외국 장치의 지속적인된 존재로 서 장치 삽입 glial 흉터 라고 하는 프로세스를 시작할 수 있습니다. 이 과정에서는 microglia 마이그레이션을 하 고 상해의 사이트에 확산. 그들은 또한 잠재적인 위협을 중화 하 고 모집 추가 glial 세포를 염증 인자의 방출을 시작 합니다. 그 후, 활성화 이다 hypertrophic 되 고 연속 섬유 장벽16이식된 장치를 캡슐화 시작. 염증 신호는 임 플 란 트의 주변에서 신경 프로세스의 철수를 촉진 하는 역할도 하 고 결국 개발 glial 흉터17강화 섬유 아 세포를 신병. Oligodendrocytes, 전도성, 강화 하기 위하여 myelin 신경 세포를 넣는 담당 할 하지이 과정 생존과 먼 셀 플에서 흉터18으로 분할 된다. Glial 흉터 크게 기능과 기록 전극, 특히 이식된 소자의 수명 감소 하 고 궁극적으로 신경 인터페이스19의 기능을 제한 하는 역할.
몇 가지 방법은 생체 적합성 및 CNS20,21,,2223에서 이식 장치 인터페이스 활동 증가 악용 되어 있다. 이러한 신경 인터페이스24의 생체 디자인에 광범위 한 검토를 이용하실 수 있습니다. 가장 눈에 띄는 전략 polyelthyleneglycol (PEG), 공동 glycolic polylactic 산 (PLGA)25, 같은 호환 코팅 전극 주변 또는 강화 폴 리 (에틸렌 등 전도성 폴리머와 전극 포함 dioxythiophene) (PEDOT), polypyrrole (PPy)26,,2728,29,30,31. 생리 활성 코팅 collagens, 히 알루 론 산32,33,34, fibronectins, 등 세포 외 매트릭스에서 파생 하는 ligands를 사용 하 여 신경 조직의 성장에 대 한 단서를 제공 하기 위해 고용 또한 있다 ,35,,3637. 성장 인자 릴리스 시스템을 흉내 낸 자연 세포 분 비 물30,38,39,,4041 이 코팅의 bioactivity 더 탐험 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. 동시에, 일부 연구 그룹 전극 형상, 유연성, 및 구성 장치 및 조직51,52,53 사이 기계적인 불일치 감소을 개장 하기로 ,,5455,,5657. 그러나 이러한 전략 있는 많은 유망 개선 이어질 다음-세대 신경 계면 장치, 장기 호환성에 문제 이며 진행 복잡 하 고 시간이 걸리는 시내 vivo 모델에 의해 방해 받을 수 있습니다. .
동물 모델 기반 접근 실험 처리량을 제한 하 고 전극 생체 적합성 테스트의 비용을 증가 시킬 수 있습니다. 생체 외에서 기존의 세포 배양 기술을 더 비용 효율적인 대안을 제공 하지만 많은 장치 및 조직58사이 상호 작용의 복잡성을 정리 하지를 사용 하 여 접근 한다. 특히, 전극 형상의 모델링 및 기계적 불일치 및 micromotion 장치 오류59 기여 호스트 응답 생성을 생각 영향 문화 제한, 2D 셀을 사용 하 여 표면 코팅의 테스트 , 60.
2 차원 세포 배양과 관련 된 문제를 해결 하려면 신경 세포의 하이드로 겔 문화 개발 되었으며, 다양 한 응용 프로그램, 약리 연구61, 신경 세포 분화62, 질병을 이해 하는 것을 직접 경로63,64또는 다른 세포 유형 모델 셀 마이그레이션, neuroprotection, 또는 모델 조직 microenvironments61층된에 공동 문화. Hydrogels 쉽게 다른 크기로 형성 되 고 형상 기본 또는 불멸 하 게 한 세포 배양의 수많은 종류를 통합할 수 있습니다 매우 공초점 형광 현미경 등 일반적으로 사용 되 기술에 의해 분석을 받을. Glial 흉터 프로세스의 모델을 만들려면, 우리는 최근 개발과 이식된 전극 (그림 1)65glial 응답의 높은 처리량 테스트를 위해 히 알루 론 산 기반된 3 차원 하이드로 겔 시스템 특징. 이 시스템은 여러 가지 이점이 있다: 1) 3 차원 매트릭스 고분자 히 알루 론 산, 생 세포 외 매트릭스 구성;의 구성에서 기본 glial 세포 (microglia, 이다, 및 oligodendrocytes) 캡슐화 2)는 매트릭스 강성 조정 될 수 있다 '' 두뇌 또는 척수 조직;의 기계적 특성을 재현 하 그리고 3) 세포는 빠른 벤치탑 접근 제한 독성 캡슐화 중 녹색 빛으로 photopolymerization를 사용 하 여 매트릭스에 캡슐화 될 수 있습니다. 이 시스템은 생체 내에서 생체 적합성의 주요 기능 수 있습니다: 장치는 하이드로 겔 조직으로, 유사한 방식으로 삽입 되 고 이식된 장치에 세포질 응답은 다양 한 매개 변수65에 대 한 모니터링. 다양 한 구조와 전기 자극 펄스의 하이드로 겔 코팅, 기계 불일치나 장치 포함 됩니다. 이 시스템은 또한 oligodendrocyte 및 자주 존재 하 고 glial 흉터에 채용 관련된 선구자 포함 됩니다. 그들의 손상, 죽음, 그리고 microglia에 의해 식 균 작용은 매우 선 동적인 상해의 지표 그리고 모델 감소 흉터 또는 복구, 그들은 능력을 다시-myelination 뉴런66의 설명.
여기는 합성 및 하이브리드 히 알루 론 산 hydrogels 셀 병합을 개선 하기 위해 상용 지하실 멤브레인 공법으로 결합의 형성 하는 방법에 설명 합니다. 또한, 우리는 기본 교양된 glial 세포 (microglia, 이다, 및 oligodendrocytes)의 설립 및 문화 성장 immunocytochemistry 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석을 시연할 예정 이다.

<table><tbody><tr><td><강한>1. HAMA 합성 및 광중합을 위한 재료</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>히알루론산(HA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>53747-10G</td><td>스트렙토코커스 equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6</td></tr><tr><td>메타크릴 무수물(MA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>275585-100ML</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>시그마-알드리치</td><td>221465-25G</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(EtOH)</td><td>상업용 알코올 주식회사</td><td></td><td>무수</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(pH 7.4) 정제</td><td>Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>트리에탄올아민(TEA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1-비닐-2피롤리디논(NVP)</td><td>시그마-알드리치</td><td>V3409-5G</td><td></td></tr><tr><td>EosinY(EY)</td><td>시그마-알드리치</td><td>E6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS) 실가드 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>다우 코닝</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3- (트리 메 톡시 실릴) 프로필 메타 크릴 레이트</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>440159-100ML</td><td></td></tr><tr><td>비커 (100mL)</td><td>코닝</td><td>1000-100</td><td></td></tr><tr><td>비커 (500mL)</td> <td>코닝</td><td>1000-600</td><td></td></tr><tr><td>pH 종이 (Labstick)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>9580</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>2. 신경교세포 분리 및 세포 배양을 위한 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1-2 Sprague Dawley 쥐 새끼</td><td>Charles River</td><td>CD Sprague Dawley 쥐 변형 코드 001</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위 - 슬림 블레이드(소형)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14081-09</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위 - Toughcut(대)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14130-17</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게(Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11521-10</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 미세집게(Dumont #7)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (PS)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신(PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6282</td><td></td></tr><tr><td>50mL 코니컬 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>15mL 코니컬 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5</td><td></td></tr><tr><td>12웰 조직 배양 처리 플레이트(Cellstar)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 108</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청학 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 혈청학 피</td>펫 <td>Fisher Scientific</td><td>12-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 (60 mm X 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 ( 100 mm X 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버슬립 (18 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100 18CIR</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>3. 현미경 (공초점 및 주사 전자 현미경) 용 재료 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-CNPase</td><td>abcam</td><td>ab6319</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-Iba1</td><td>Wako Laboratory Chemicals</td><td>019-17741</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-GFAP</td><td>abcam</td><td>ab4674</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>포르말린</td><td>시그마 알드리치</td><td>HT501128-4L</td><td>완충 (10%)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td>완충(8%)</td></tr><tr><td>구테알데히드</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>16019</td><td>버퍼링(8%)</td></tr><tr><td>사산화오스뮴</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>19152</td><td>버퍼(2%)</td></tr><tr><td>헥사메틸딜라잔(HMDS)</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>16700</td><td></td></tr><tr><td>에탄올(EtOH)</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>15055</td><td>무수</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드(25 X 75 X 1mm)</td><td>VWR International</td><td>48311-703</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

중앙 신경 조직, 수많은 급성 부상 및 신경 장애, 뿐만 아니라 이식 장치 또는 생체 같은 결과에서 함수 결과 향상 시키기 위해 설계: gliosis, 세포 독성, 이끌어 과잉 염증 또는 집합적으로 부상 악화 또는 건강 회복을 방해 glial 흉터 대형. 우리가 3 차원 셀 비 계 기본 교양된 glial 세포 수 있는 모델 glial 흉터 대형 그리고 연구 염증 성 프로세스에 시스템을 만드는의 도와 함께 생성: microglia 이물질 응답을 통제 하 고 시작 하는 염증 성 이벤트, 이다 섬유질 흉터 형성에 응답 하는 및 oligodendrocytes 일반적으로 염증 성 손상에 취약. 현재 작업 방법을 제공 한다는 상세한 단계별 제작, 문화, 및 캡슐화 된 쥐와 히 알루 론 산 기반 3D 히드로 발판의 현미경 특성 두뇌 파생 glial 세포를. 또한, 세포 캡슐화 및 confocal 면역 형광 및 전자 현미경을 스캐닝 하 여 하이드로 겔 비의 특성에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다와 생리 활성 기판으로 비 계를 수정 하는 능력 뿐만 아니라 향상 된 셀 통합 상업 기저 lamina 혼합물 설립

신경 조직 호스트 응답 및 높은 처리량 glial 흉터를, 에서 시험관 시스템 생체, 원래의 장소에 형성 하는 동안 세포 독성 이벤트를 초래 하지 않습니다 이며 대 행렬 자료와 3D 셀 비 계 필요 로 자비로 운 응답 가이드 bioactive 구성 요소. 이 위해, 우리 히 알루 론 산에 따라 3D 셀 발판 시스템 하 고 캡슐화 기본 혼합된 glial 세포 인구 세포 세포 상호 작용 및 glial bioreactivity 공부 하. 세포와 발판의 간단한 시각적 연구 수행 되었다. Oligodendrocytes (CNPase 녹색에)를 포함 하 여 셀 부분 모집단의 형태 microglia 빨간색에서 (Iba1), 이다 (노란색에서 GFAP), confocal immunofluorescent 현미경 검사 법 (그림 3Ai-ii-Ci-ii)에 의해 표시 됩니다....

여기, 우리는 쥐의 3D 문화에 대 한 프로토콜 이다, microglia, 및 oligodendrocytes를 포함 하 여 두뇌 파생 명과 셀을 제시. 1 차 세포 배양, methacrylated 히 알루 론 산 (하 마) 하이드로 겔 합성, HAMAphoto 중 합 및 셀 캡슐화 및 샘플 공초점 레이저 스캐닝 전자 현미경 이미징 처리 설명 합니다.

생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

이 3D 세포 배양 프로토콜의 전반적인 목표는 주요 지표 세포인 미세아교세포, 성상세포, 희소돌기아교세포를 사용하여 중추신경계의 신경교세포 반흔 이벤트를 모델링하는 것입니다. 이 방법은 신경 염증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 신경교세포가 재생 전략을 강화하고 신경교 세포의 흉터를 풀 수 있는 가능성에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신경교 생물학이 체계적이고 높은 처리량 조작을 통해 3D 마이크로 환경에서 빠르게 특성화될 수 있다는 것입니다. 파종을 위한 커버 슬립을 준비하려면 먼저 3-프로필 메타크릴레이트 1밀리리터를 증류수 49밀리리터에 첨가하여 2% 용액을 만드는 것으로 시작합니다. 그런 다음 18mm 유리 덮개를 용액에 넣고 실온에서 1 시간 동안 흔듭니다. 1시간 후 각 커버 슬립을 100밀리리터의 탈이온수가 담긴 세 개의 비커에 연속적으로 담그어 커버 슬립을 헹굽니다. 그런 다음 건조제와 섭씨 40도의 오븐으로 진공 청소기에서 덮개를 건조시킵니다. 다음날 집게를 사용하여 개별 커버 슬립을 70% 에탄올에 빠르게 담그십시오. 그런 다음 건조하지 않고 각 덮개 슬립을 12웰 플레이트의 우물에 떨어뜨립니다. 다음으로, 1ml의 멸균 탈이온수로 각 우물을 씻습니다. 그런 다음 1ml의 멸균 폴리를 추가하십시오.

improved-3d-hydrogel-cultures-primary-glial-cells-for-vitro-modelling

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 신경교세포의 3차원 배양을 확립하는 기술을 보여줍니다. 쥐 뇌 유래 신경교세포는 세포외 기질 성분을 포함하는 광가교결합 가능한 고분자 기질 내에 캡슐화되어 있습니다. 성장 배지에서 배양하면 신경교세포가 지지 매트릭스 내에서 증식하여 3차원 배양을 생성합니다.

쥐의 뇌 유래 신경교세포(Rat Brain-derived glial cell)의 3차원 배양 확립

플록스, 조건부 발암성 대립유전자로 조작되고 바이러스 Cre 매개 재조합을 통해 형질전환된 마우스에서 채취한 표현형 야생형 성상세포와 신경 줄기세포는 syngeneic, immune-competent littermate의 뇌에 형질전환된 세포의 orthotopic 주입에 의해 in vitro 및 in vivo에서 성상세포종 발병기전을 모델링하는 데 사용할 수 있습니다.

모델링 성상 세포종 병인 체외와 생체 대뇌 피질의 성상이나 조건, 유전자 조작 쥐에서 신경 줄기 세포를 사용하여

구형세포는 현재 효과적인 장기 치료법이 없는 백혈구이영양증인 크라베병의 특징적인 병리학적 특징입니다. 우리는 활성화된 미세아교세포의 선천적 생물학 및 병원성 잠재력과 구형세포로의 변형을 연구하기 위해 세포 배양 모델을 개발했습니다.

체외 Globoid 셀 Leukodystrophy에서 휴대 병태 생리의 연구에 대한 모델

신경 병성 통증의 개발 척수 신경교 세포의 병리학 적 변화를 수반한다. 시험관 내에서 이들 세포를 공부 성인 척수 조직으로부터 유래 설계된 신뢰성 신경교 배양 시스템이 부족하다. 따라서, 우리는 성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 된 아교 문화를 설정하는 방법을 여기에 표시됩니다.

성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비

여기, 우리 두뇌 매트릭스를 모방 하도록 설계 하는 기가 가변 생체 내의 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한 프로토콜을 제시. 이 접근 한 생체 외에서세포종 세포 vivo에서 일반적으로 문화에서 길을 잃 었의 많은 특성을 유지 하는 실험 플랫폼을 제공 합니다.

히 알루 론 산 기반 Hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한

여기서, 우리는 높은 수율과 재현성을 가진 배아 피질에서 뉴런 및 성상세포 농축 배양, 또는 뉴런 glia 배양을 확립할 수 있는 특정 배양 매체를 사용하여 간단한 접근법을 제시합니다.

이혈증에서 신경 신경-Glia 상호 작용의 역할을 공부 하기 위한 세포 배양 모델

여기서는 패턴 뉴런에서 교모세포종(GBM) 마이그레이션을 분석하기 위해 사용하기 쉬운 공동 배양 분석을 제시합니다. 우리는 뉴런에 GBM 세포 마이그레이션의 쉬운 정량화를 위한 FiJi 소프트웨어에 있는 매크로를 개발하고, 뉴런이 GBM 세포 침습 용량을 수정한다는 것을 관찰했습니다.

이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양

여기서 우리는 중추 신경계에 있는 성상세포의 기능 및 신경질 세포와 관련시키는 기계장치를 연구하기 위하여 신경같이 조직을 biofabricating을 위한 3D 생물 인쇄 murine 피질 성상 세포의 방법을 보고합니다.

신경과 같은 조직을 위한 Murine 피질 성상 세포의 3D 생물 인쇄

이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

여기서는 iPSC 유래 뉴런 및 성상세포의 3D 바이오프린팅 공동 배양을 생산하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 하이드로겔 스캐폴드 내에서 96웰 또는 384웰 형식으로 생성된 이 공동 배양 모델은 7일 이내에 높은 인쇄 후 생존율과 신경돌기 성장을 입증하고 두 세포 유형 모두에 대한 성숙 마커의 발현을 보여줍니다.

스크리닝 응용 분야를 위한 인간 iPSC 유래 뉴런-성상세포 공동 배양의 3차원 바이오프린팅

간질액 흐름을 포함하는 침습적 전면부에서 신경교종 종양 미세환경을 복제하는 방법을 제시합니다. 이 모델은 유체 압력 헤드를 적용할 수 있는 조직 배양 삽입물에 포함된 히알루론산-콜라겐 I 하이드로겔입니다. 침입을 정량화할 수 있으며 세포를 분리하거나 용해할 수 있습니다.

간질 흐름이 있는 침습적 신경교종 미세환경의 광중합 가능한 히알루론산-콜라겐 모델

학습하세요 쥐 뇌 유래 신경교세포를 3D 하이드로겔 배양하는 방법을. HAMA 하이드로겔 캡슐화와 공초점 현미경 기술을 활용하여 신경염증 연구와 재생 전략 개발에 필수적인 생체 외 모델을 구축합니다.

생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선

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