Name: 셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 배우세요 3D 프린팅 금형과 아가로스 우물을 이용한 조직 반지 제작 방법입니다. 다양한 세포 유형으로 조직 구조와 기능을 평가할 수 있는 조직 공학 플랫폼을 제공합니다.

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우리가 기꺼이 그녀의 지원에 대 한 3d 인쇄, 금형 디자인, 그들의 입력에 대 한 아만다 조이 Reidinger, 박사, 크리스 Nycz, 그리고 카 렌 레 마인 박사 에리카 스 털 츠 (학술 연구 및 응용 과학자, WPI 정보 기술 서비스)을 인정 캐시 Suqui와 제니퍼만 금형 디자인을 테스트 하는 그들의 도움에 대 한 촬영과 그의 도움에 대 한 마이클 오키프.  이 작품은 NSF IGERT 당선 1144804 (MWR, 있다), NIH R15 HL097332에 의해 지원 되었다 (MWR, TAH), NSF 소장 EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, 있다)와 NIH R15 HL137197 (MWR, 있다).
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1. 3D 인쇄 형 준비 하기
<ol><li>CAD 드로잉의 원하는 크기에 형을 준비 합니다.</li>
	<li>고해상도 3D 프린터에 CAD 파일을 보냅니다. 광택 마무리, 적절 한 플라스틱 인쇄 자료를 선택 합니다.</li>
	<li>인쇄 후 철저 하 게 세제와 물으로 금형 세척.</li>
</ol>2. 주조 PDMS 제외
<ol><li>균형에 기본 PDMS의 원하는 금액을 측정 합니다. 60 m m 금형에 대 한 직경 및 2mm 잘 게시물, 25 g를 사용 하 여.</li>
	<li>1:10 (w/w)에 경화제를 추가 PDMS 베이스에 비율.</li>
	<li>적극적으로 두 개의 구성 요소는 철저 하 게 결합 될 때까지 저 어. 부족 한 혼합 "저속" 표면 결과 PDMS의 불완전 한 치료 될 수 있습니다.</li>
	<li>3D 인쇄 금형, 인쇄 된 우물 위에 PDMS 기본 층의 형성을 활성화의 테두리 실험실 테이프의 조각을 넣으십시오.</li>
	<li>PDMS 혼합물을 금형에 부 어 고 형 될 때까지 모든 거품은 탈 가스 진공 챔버 합니다.</li>
	<li>제거 하려면 2-4 h, 또는 충분히 경화 될 때까지 50 ° C에서 PDMS를 치료.</li>
	<li>랩 테이프를 제거 하 고 신중 하 게 추출 PDMS 부정.</li>
	<li>금형은 완전히 치료 되도록 (3D 인쇄 형에서 제거) 후 추가 1 시간에 대 한 60 ° C에서 PDMS를 품 어.</li>
	<li>어떤 잔류물을 제거 하는 세제와 물으로 깨끗이 PDMS를 씻어. 부족 한 세척 PDMS 네거티브의 첫 번째 사용에 대 한 불 쌍 한 링 형성 될 수 있습니다.</li>
</ol>3. 조작 Agarose 웰 스
<ol><li>Agarose 웰 스 셀을 뿌리기 전에 1 일 준비.</li>
	<li>DMEM과 압력솥 2% (w/v) agarose 솔루션을 확인 합니다.</li>
	<li>피펫으로 4 mL 압력가 PDMS 부정적으로 녹은 agarose. 다음 피펫으로 agarose 직접 PDMS의 게시물에 음화. 거품 잘 차원에서 이질성을 발생할 수 있습니다 피펫으로 팁 모든 기포를 제거 합니다.</li>
	<li>참고: 금형; 연극 하지 마십시오 agarose의 위쪽 표면 agarose 우물 PDMS에서 제거와 6-잘 문화 접시에 배치 수준 수 있도록 평면, 해야 합니다. 남은 agarose 있을 수 있습니다 다시 압력가 사용 다시, 하지만 한 번 이상 하지.</li>
	<li>agarose 냉각 후 (약 10 분 4 mL agarose;에 대 한 큰 형 이상 냉각 시간을 할 수 있습니다), 신중 하 게 무딘 집게를 사용 하 여 PDMS 원판에서 agarose 웰 스를 분리 하 고 6-잘 접시의 우물으로 전송.</li>
	<li>완전 한 문화 매체의 agarose 우물 잠수함 그리고 하룻밤 사용 하기 37 ° C 배양 기 전에 equilibrate.</li>
</ol>4. 시드 조직 반지
<ol><li>문화 쥐 대동맥 평활 근 세포21 (RaSMCs) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1% 포함 된 DMEM L-글루타민, 1% 비 본질적인 아미노산, 1% 나트륨 pyruvate, 및 1% 페니실린-스 70% 합류를 도달할 때까지. 참고: 셀 5% CO2 와 15 cm 조직 배양 배지에서 37 ° C 배양 되어야 한다.</li>
	<li>금형 equilibrated 후 (3 절), 시드를 위한 RaSMCs를 준비.</li>
	<li>버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 접시 당 5 mL로 두 번 접시를 헹 구 십시오.</li>
	<li>15 cm 배양 접시 당 3 mL 0.25 %trypsin 추가 합니다. 2-3 분, 또는 때까지 세포가 접시를 낸 37 ° C 배양 기에 격판덮개를 이동 합니다.</li>
	<li>완전 한 문화 매체의 동일한 볼륨 (접시 당 3 mL) 트립 신을 무력화. 철저 하 게 덩어리 헤어 셀 resuspend</li>
	<li>세포 현 탁 액 trypan blue 염료와 1: 1의 약 수를 희석 하 고는 hemocytometer와 셀.</li>
	<li>세포 현 탁 액 셀 펠 렛을 200 x g에 5 분의 총 볼륨 원심</li>
	<li>ML; 당 10 백만 셀의 농도에서 세포 resuspend 50 µ L 당 500, 000 셀이 됩니다. 참고: 다른 세포 유형을 다른 세포 농도 요구할 수 있습니다.</li>
	<li>Agarose 금형에서 모든 중간 발음 개별 우물에서 모든 매체를 제거 하지만 하지 우물의 바닥 찌를 다는 것을 조심 하십시오.</li>
	<li>피펫으로 50 µ L의 각 음에 서 스 펜 션.</li>
	<li>조심 스럽게 agarose 몰드의 외부 신선한 매체의 2 개 mL를 추가 합니다. 하도록 하지 중간 오버플로 agarose의 우물에 주의 해야 합니다. (약 16 h) 하룻밤 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>하룻밤 부 화 후 금형, 외부에서 매체를 발음 하 고 금형과 반지 완전히 빠져들 수 있도록 6 잘 플레이트의 각 음에 4.5 mL 신선한 매체를 추가 합니다. 매일 변경 매체입니다.</li>
</ol>

<ol><li>L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+biological+tissue-engineered+human+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A completely biological tissue-engineered human blood vessel.</a> FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리 3D 인쇄를 사용 하 여 쉽게 사용자 정의 크기와 자기 조립된 조직 링의 빠른 제작을 위해 다양 한 방법 제시는. 우리의 방법은 비슷합니다 Svoronos 외에 보고. 6 , 벌집 3D 인쇄와 개 뼈 모양의 왁 스 금형 PDMS 원판을 사용 했다. 그러나, 금형 몇 가지 독특한 디자인 기능을 포함 하도록 수정 되었습니다. 노치 (그림 4A(1)) 표시를 개별적으로 모니터링 각 링 수 있도록 금형의 방향을 제공 합니다. 중앙 홀 (그림 4A(2)) 우물에 매체의 확산을 향상 시킬 수 있습니다. CAD 파일 번호 형;에 직접 인쇄 따라서, PDMS 제외 각 버전 번호 표시 됩니다 하 고 직경 (그림 4A3) 게시. 테이퍼 외부 벽 (그림 3(1), 5 °), 잘 골짜기 (그림 3(2), 45 °), 그리고 중앙 구멍 (그림 3(3), 5 °)의 상단에 쉽게 3D 인쇄 금형에서 PDMS 제외를 제거 하려면 agarose 우물이 쉽게 PDMS 원판에서 제거 하 고 (그림 4A(2), A(4)).
우리는 다양 한 직경 및 기본 인간의 부드러운 근육 세포 (SMCs)18,22, 쥐 대동맥 SMCs7 을 포함 한 세포 종류의 자기 조립된 고리 모양의 조직 조작 하 여이 시스템의 다양성을 증명 하고있다 , 23, 인간 간 엽 줄기 세포 (hMSCs)13, 그리고 SMCs 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)11 (표 1)에서 파생 된. 진행 중인 작업에서 우리는 반지 추가 셀 유형 내 피 세포에서에서 형성 평가 하 고 tracheal 교체에 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 다양 한 크기의 연골 고리 융합. 완전히 세포 유래 구조 뿐만 아니라 우리는 또한 사용이 시스템 통합된 복사해올된 젤라틴 스피어13,22와 반지를 조작 하. 스피어 자기 집합 추가 기계적 강도 제공 하기 위해 동안 조직 고리 내에서 통합 될 수 있다 또는 지역화 성장 요인13,22의 배달.
조직 링을 조작 하는 경우 휴대폰 번호의 최적화 다른 세포 유형에 대 한 필요할 수 있습니다. 숫자 다를 수 있습니다 최소 셀 크기와 세포의 종류에 따라. 예를 들어 Ipsc에서 파생 된 hSMCs 600000 셀/링11에 씨를 뿌리고, hMSCs 및 기본 hSMCs 400000 셀/반지13,22, 그리고 쥐 대동맥 SMCs는 500, 000 셀/반지18시드 시드. 물마루 차원 반지 형성 및 셀 링 형성24에 필요한 최소 수 영향을 또한 수 있습니다. 인간의 세포와 3D 인쇄 형 연구, 대 한 여 물통 폭 2 m m의 사용 되었다. 원래 폴 리 카보 네이트 형 750000 hSMCs 2mm 셀 링18를 형성 하는 데 필요한 3.75 m m의 구 유 폭을 했다. 감소 물 폭 46%, 반지25당 400000 셀 링 형성에 필요한 셀의 수를 줄일 수 있었습니다. 셀 링 당 시드의 표 1에 요약 되어 있습니다.
3D 인쇄 소재를 선택할 때 많은 요인 고려 될 필요가 있다. PDMS은 60 ° C에 일반적으로 치료 된다, 때문에 3D 인쇄 자료 충분히 높은 있어야 PDMS 경화 하는 동안 손상을 방지 하려면 온도 용융. 이 연구에 사용 되는 재료의 용융 온도 (독점 소재, 재료의 표참조)는 사용할 수 없습니다. 그러나, 1 시간에 60 ° C에서 구운 우리는 자료는 냄새를 생산 하기 시작 했다 관찰 했다. 따라서, 우리가 하기로 낮은 경화 온도 50 ° C를 위해 3D 인쇄 자료 손상 없이 PDMS를 구워 경화 시간을 증가. 경화 시간 조정 형태 큰 PDMS 네거티브에 금형 수정 하는 경우 필요할 수 있습니다. 3D 인쇄 금형에서 PDMS 제거 후 60 ° C에서 추가 치료 기간에 노출 되는 3D 인쇄 형 온도 제한 하는 동안 볼품 없는, 나머지에서 부정적인 최종 PDMS를 방지 합니다. 참고 일부 자료 치료 PDMS의 억제, 그래서 선택한 소재 PDMS와 호환 되는지 확인 하십시오. 마지막으로, 금형 소재 독성 또한 고려 되어야 한다. 3D 인쇄 형 세포와 직접 접촉에서 되지 것입니다, 하는 동안 금형에서 일부 잔류물 PDMS 부정적인 치료 절차 동안에 전송 될 수 있습니다 가능 하다. 우리는 매우 철저 한 세척 세제로 부정적인 PDMS에서 어떤 잔류물을 제거 하는 충분 한 발견. 그러나, 우리는 이전 부적절 한 세척 agarose 웰 스 처음에 가난한 반지 형성에 부정적인 PDMS의 몇 가지 사용 지도 관찰. 다른 3D 인쇄 자료에서 PDMS 캐스트를 사용 하 여 세제 포함 하 여 모든 잠재적인 leachates 형 잔류물 제거 충분 한지 확인 하기 위해 추가 조사를 요구할 수 있습니다. 정기적인 테스트 시간이 지남에, 금형을 손상 하 고 반복된 사용 후 잔류물에 있는 증가 일으킬 수 있습니다 난방 사이클 (50 ° C)에 반복 가능한 그것으로 필요할 수도 있습니다. 날짜 하려면, 조직 반지를 성공적으로 생성 하는 데 사용 된 30 개 이상의 PDMS 원판을 생산 하는 단일 3D 인쇄 형을 사용 했습니다.
전반적으로, 3D 인쇄 폴 리 카보 네이트의 가공 보다 agarose 금형의 제작에 대 한 더 큰 다양성을 허용 한다. 그것은 가능 툴, 보다 높은 해상도 제공 하 고 금형 설계 도구를 사용할 수의 크기에 의해 제한 되지 않는다. 큰 사용자 지정 가능 하 고 그 끝이 등 기능 추가 가공 가능 하지 않을 수 있습니다. 이 시스템은 반지6,17이외에 다른 모양 뿐만 아니라, 자기 조립된 조직 조작에 적용할 수 있습니다. 반지 제조 방법을 사용 하 여, 조직 반지 세포 유형 및 tracheal 조직 공학13, 조작된 혈관7, 그리고 모델링 혈관 질환11에 잠재적인 응용 프로그램에 대 한 크기의 다양 한 개발 했습니다.

세포질 자기 집합 조작 설계 조직 혈관에 접근은 비 계 기반 접근 대신. 자기 조립, 비 계 없는 조직 큰 세포 밀도, 향상 된 매트릭스 증 착 및 강도, 그리고 비 계 기반 조직1,2,3,4에 비해 향상 된 생물 학적 기능을 할 수 있습니다. . 그러나, 특정 크기 및 모양 세 비 계 지원의 사용 없이 3D 조직 형성 도전 남아 있습니다. 이 프로세스는 시간과 노동 집약적인5될 수 있지만 몇 가지 방법을 함께 두꺼운 구조를 셀 시트의 레이어 퓨즈. 또는 셀 비 접착제 금형에 시드 수 하 고 허용 spheroids, 반지, 그리고 다른 조직 모양6,,78으로 집계 하.
자기 집합된 조직 반지 필요 적은 셀, 문화 시간을 단축, 그리고 관 보다 더 큰 적은 약 설계 조직, 하지만 여전히 기계적 테스트, 조직학, 검사 하거나 수 수축 및 다른 기능 테스트7 사용 , 9 , 10 , 11. 조직 반지 문화 매개 변수 수가 많은 검사에 이상적입니다 그리고 질병 모델11 로 사용을 위한 잠재력 또는 약12상영을 위한 도구가 그들은 빠르게 조작 및 쉽게 테스트할 수, 때문에. 또한, 반지 혈관 등 기관7,13, 더 복잡 한 조직 구조에 융합 될 수 있다 그리고 반지 spheroids,1415등 다른 모양 보다는 더 완전 하 게 융합 될 수 있습니다.
Agarose는 생체 적합성, 침투성, 및 비 세포 접착 속성 자체 조립된 조직 날조를 위한 금형 소재로 널리 이용 된다. 예를 들어, Norotte 그 외 여러분 agarose 금형 금형 모양 및 필요한 전문된 장비15제한 제어 사용 압출된 봉에서 조작. 황갈색 외 다양 한 모양 (피라미드, 광장)16사용자 지정 히드로 금형을 조작 하는 단위 건축 alginate 방울 입금. 그러나, alginate spheroids (300 μ m)의 큰 직경 낮은 해상도 기능 귀착되는. 낮은 해상도 셀 집계 일관성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 고르지 못한 몰드 표면에 발생할 수 있습니다. 또는, agarose 매끄러운 기능 및 특정 크기6,,717비 접착제 금형을 만드는 폴리머 원판으로 캐스팅 될 수 있습니다.
우리는 이전 사용자 지정 환상 agarose 셀 시드 웰 스 가공 된 폴 리카 보 네이트 몰드7,18에서 PDMS 부정적인 캐스트에서 날조를 위한 시스템을 보고 했다. Agarose는 PDMS 부정으로 부 고7,18설정할 수 있습니다. 셀은 다음 시드 agarose 웰 스, 어디 그들은 자기 조립 하는 형태로 집계에 24 h7,18미만에서 비 계 없는 조직 반지. PDMS 원판 멸, 여러 번 다시 사용할 수 있으며 부드럽고 유연 하 고, 쉽게 응고 agarose 웰 스를 제거 하는. 때이 시스템 처음에 알려졌다 Gwyther 외. 7, PDMS 원판에서 캐스팅 됐다 가공 된 폴 리 카보 네이트 형 (그림 1A). Agarose 주조, 후 셀 시드 웰 스 개별적으로 잘라 되었고 12-잘 접시7,18의 우물에 배치. 단일 agarose 몰드 5 고리를 생성 하 고 개별 웰 스를 잘라 필요가 없습니다 및 PDMS와 각 반지 (그림 1B)를 생산 하는 데 필요한 agarose의 양을 줄이는 6 잘 플레이트의 잘에서 맞는 그런 디자인 더 최근에 바뀌었습니다. 작은 셀 구 유 폭 시드 고리 형성을 달성 하는 데 필요한 시드 셀의 수를 줄이기 위해 사용 되었다. 이러한 변화에도 불구 하 고 해상도 금형의 사용자 지정에 사용할 수 있는 표준 엔드밀, 제한 했다 그리고 micromilling는 엄청나게 비쌀 수 있다. 또한, 컴퓨터 수치 제어 (CNC) 가공 하는 시간이 소요 될 수 있습니다 및 성가신에 시간을 예약 하는 필요 때문에 무 겁 게 사용자 지정 장비, 컴퓨터 지원 설계 (변환 하는 추가 컴퓨터 지원 제조 (CAM) 소프트웨어 활용 프로그래밍 도구 경로 및 가공 중 폴 리카 보 네이트 부품의 안정적인 없애거나 CAD) 파일입니다.
현재 연구에서 우리는 CNC 가공 하는 대신 3D 인쇄를 사용 하 여를 검사합니다. 3D 인쇄 엔지니어링 사용자 지정 임 플 란 트, 비 계 자료를 날조 한 세포와 조직 spheroids15,,1920의 직접 인쇄에 널리 사용 됩니다. 고해상도 3D 프린터를 사용 하는 우리 고 전문된 3D 인쇄 소재는 매끄러운을 가진 엄밀한 형 인쇄 수, 광택 표면 마무리 ( 재료의 표참조). 우리의 기술 주조 PDMS 네거티브와 agarose 우물에 사용할 수 있는 고도로 사용자 정의 고해상도 플라스틱 금형의 제작에 대 한 수 있습니다. 디자인 반복 그림 1에서 요약 된다. 금형 설계 추가 3D 인쇄 형에서 모두 PDMS 원판 및 PDMS 원판에서 agarose 웰 스의 제거를 쉽게 하기 위해 테이퍼 외부 벽과 중앙 구멍을 포함 하도록 3D 인쇄 형 버전에서 수정 되었습니다. 이 테이퍼 기능 표준 프로세스 가공으로 얻을 수 없다. 금형의 하단에는 우물의 바닥에서 거리는 두꺼운 agarose 게시물 agarose 잘 제거 하는 동안 침입의 위험을 줄이기 위해 게시물 아래의 기본 인이 반복에서 증가 되었다. 형과 링 제조 절차 개요로 그림 2에 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50040</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>VeroWhite</td><td>StrataSys</td><td>RGD835</td><td></td></tr><tr><td>3D 프린터</td><td>StrataSys</td><td>Objet 260 Connex</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>써모 피셔</td><td>16000069</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>코닝 Cellgro</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>펜-스트렙</td><td>Corning Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>코닝 Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>WKY 3M-22 쥐 대동맥 평활근 세포</td><td>제공 T. Wight [ref 21]</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

셀 시드를 위한 사용자 지정 agarose 우물 및 자기 조립 금형 3d 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

엔지니어링된 조직 조직 수리 및 교체, 임상적으로 사용 되 고 마약 검사 및 인간 질병 모델링 도구도 개발 되 고 있다. 자기 집합된 조직 향상 된 매트릭스 증 착, 강도, 기능 등 비 계 기반 조직 공학에 이점을 제공합니다. 그러나, 3 차원 조직 세포 또는 지원 비 계 시드 없이 날조를 위한 몇 가지 사용할 수 있는 방법이 있다. 이전에, 우리는 비 접착제 agarose 우물으로 셀 시드 여 자기 조립된 조직 반지를 날조를 위한 시스템을 개발. 음수입니다 (PDMS) 처음 가공된 폴 리카 보 네이트 몰드, 캐스팅 그리고 agarose는 gelled 고리 모양의 셀 시드 웰 스를 만드는 부정적인 PDMS에. 그러나,이 접근의 다양성은 폴 리카 보 네이트 몰드 가공에 사용할 수 있는 도구의 해상도 의해 제한 되었다. 여기, PDMS 원판 날조를 위한 3D 인쇄 플라스틱 가공된 폴 리 카보 네이트 하는 대신 사용할 수 있습니다 설명 합니다. 3D 인쇄 형과 개정된 형 디자인은 사용 하 여 간단 하 게, 생산, 저렴 하며 훨씬 더 적은 agarose 및 PDMS 잘 시드 셀 당. 우리가 시연 결과 agarose 웰 스 다른 세포 유형의 다양 한 사용자 지정 된 직경 자기 집합된 조직 반지를 만드는 데 사용할 수 있습니다. 링 기계, 기능, 및 조직학 분석을 위해 또는 더 크고 복잡 한 관 조직 조작에 대 한 사용할 수 있습니다.

이 시스템은 간단 하 고, 고리 모양의 3D 자기 집합의 셀 수 있도록 agarose 셀 시드 웰 스의 사용자 정의 제조 설계 조직 허용 합니다. 3D 인쇄 보다 크기는 사용 가능한 도구 크기에 의해 제한는 폴 리카 보 네이트 가공 금형 설계에 더 나은 해상도 더 큰 유연성을 허용 한다. 고해상도 3D 프린터 0.254 m m로 얇은 벽은 인쇄 될 수 있다와 여 물통 크기 (15.2 µ m 해상도 이러한 연구에 대 한) 프린터의 해상도 의해서만 제한 됩니다. 일반적으로, CNC 엔드밀 미만 0.3 m m 그래서 되지 않습니다 상용, 작은 폭의 골짜기를 만들 수는 없습니다. 마이크로 밀링 작은 기능을 생성할 수 있다, 장비 필요 하지만 엄청나게 비싼 또는 많은 생물 의학 연구 실험실에 액세스할 수 있을 수 있습니다. 여 물 크기와 곡률도 엔드밀 팁 모양에 의해 제한 됩니다. 또한, 기능 같은 각도 또는 테이퍼 벽은 가능, 고 작은 기능 가공 과정에서 휴식 수 있습니다.
CAD 드로잉 금형 3D 인쇄 및 사용자 정의 크기의 PDMS 원판을 생산 하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 그림 3 에서는 우리의 현재 2mm 게시물 3D 인쇄 형의, 이전 디자인 반복에 비해 크기를 설명 합니다. 과정은 비싼; 2 mm, 5-링 3D 인쇄 형 3d 인쇄, 44.67 달러 비용과 각 부분 여러 PDMS 네거티브를 만드는 데 사용할 수 있습니다. 날짜 하려면, 우리는 단일 3D 인쇄 형에서 30 개 이상의 PDMS 원판 만들었습니다. 각 부정적인 g (PDMS 부정적인 당 2.75 달러) 당 0.11 USD에서 PDMS의 25 g을 필요합니다. 각 PDMS 부정적인 압력가 마로 소독, 세제로 청소 하 고 다시 사용의 주파수에 따라 몇 년까지 사용 수 있습니다. 원래 디자인18에 비해 소형 3D 인쇄 형 사용 하 여 상당히 적은 PDMS 2mm 조직 반지 (그림 1E) 당 agarose.
셀 집계 미만의 24 h. 반지 치수 agarose 우물의 크기에 따라 달라 집니다 양식 조직 반지 equilibrated agarose 스에서 시드. 여기, 우리는 자기 조립된 쥐 평활 근 셀 링 2, 4, 또는 12 mm 직경 게시물 (그림 4)와 웰 스에서 날조 될 수 있다 설명 했다. 이 연구에서 반지만 3 일에 대 한 교양 했다, 우리는 이전 최대 2 주22, hSMC 반지를 경작 및 hMSC-연골 링으로 최대 3 주13. 이전에 보고 된, 반지 수 작동 3D 생체 외에서 조직에 대 한 양적 평가 대 한 인간의 조직 기능11 및 기계적 강도13,22, 모델과 모듈 건물 단위를로 봉사 할 수도 튜브 모양의 조직 구조7,13을 생성 합니다. 시드 조건 셀 고이 셀 형식에서 설계 조직 반지의 기능 특성 표 1에 요약 되어 있습니다.
<img alt="폴리머 몰드 제조, 다이어그램 A-D, 15/5웰 형식, PDMS/아가로스 사용표." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 폴 리카 보 네이트 몰드 디자인. 처음에, 15 잘 금형 폴 리 카보 네이트 (A)에서 가공 했다. 이후 버전 6 잘 플레이트의 한 잘 내 단일 폴 리 카보 네이트 형에 맞게 설계 된 5 웰 스와 더 컴팩트한 디자인 (B)를 선보였습니다. 여기, 우리는 가공된 폴 리 카보 네이트 (C)에 더 많은 사용자 정의 대신 3D 인쇄 플라스틱을 사용 하 여이 디자인을 수정. (D) 표시는 agarose 웰 스는 초기에서 조작 디자인18 (왼쪽) (오른쪽), 현재 소형 디자인에 비해 훨씬 적은 agarose를 요구 하 고 우물의 수동 분리를 필요 하지 않습니다. PDMS의 agarose 각 디자인 반복에 필요한 수량 (E)에 표시 됩니다. 센터 포스트는 직경에서 2 밀리미터. (A) 형 6 cm x 12 cm, (B)는 5 cm 직경, 그리고 (C)는 6 cm 직경입니다. 눈금 막대 (D) = 3 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="아가로스 우물 제작 및 자체 조립 링 공정 다이어그램; 조직 링 형성에 대한 3D 금형." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 자기 집합된 조직 반지의 제작. 3D 인쇄 형 agarose 웰 스 (A)를 캐스팅 하는 데 사용 되는 PDMS 부정, 캐스팅 하는 데 사용 됩니다. 셀은 다음 agarose 웰 스, 그들은 양식 조직 반지 (B)에 24 시간 미만에 집계에 직접 시드. (B)에서 파선 잘 개요를 보여줍니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="폴리카보네이트 금형 설계도; 다양한 형식에 대한 사양표와 함께 AF로 표시된 치수." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 3D 인쇄 형 CAD 드로잉의 횡단면 뷰. 구 유 폭 (A), 여 물 높이 (B), 센터 구멍 (C), 총 직경 (D), 외부 립 (E), 그리고 외부 벽 높이 (F)에 대 한 치수 표시 됩니다. 외부 벽 (1), 웰 스 (2), 및 센터 구멍 (3)의 상단 부분 (2 대 1, 3, 45 ° 5 ° 각도)에서 PDMS 부정적인 제거의 용이성을 개선 하기 위해 테이퍼 됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="3D 프린팅 금형 CAD 모델, PDMS 네거티브 캐스트, 미세 유체용 아가로스 우물 공정 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56618/56618fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: 해당 PDMS 원판으로 CAD 도면 및 자기 조립된 SMC 반지 2 (A), 4 (B)와 (C) 12mm 직경 게시. (A), (1) 오리 엔 테이 션을 제공 하기 위한 노치를 나타냅니다, (2) 나타냅니다 관류를 개선 하기 위해 중앙 구멍, (3) PDMS 원판에 직접 인쇄물, 파일 번호 이며 (4)는 외부 벽, PDMS 부정적인 제거를 쉽게 하기 위해 테이퍼입니다. Agarose 스에서 바 규모 = 1 cm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56618/56618fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>셀 유형</td>
			<td>셀 링 당 시드</td>
			<td>링 직경</td>
			<td>문화 기간</td>
			<td>기능 분석 수행</td>
		</tr>
<tr>
<td>쥐 SMC</td>
			<td>0.5, 1 또는 3 x 106
</td>
			<td>2, 4, 또는 12 mm</td>
			<td>3 일</td>
			<td>현재 연구; N/A</td>
		</tr>
<tr>
<td>
iPSC 파생 SMC 11
</td>
			<td>0.6 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>17 일</td>
			<td>수축 테스트, 단축 인장 시험, 조직학 분석</td>
		</tr>
<tr>
<td>
인간의 SMC 22
</td>
			<td>0.4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>2, 7 일 또는 14 일</td>
			<td>단축 인장 시험, 조직학 분석</td>
		</tr>
<tr>
<td>
인간 MSC 14
</td>
			<td>0.4 x 106
</td>
			<td>2 mm</td>
			<td>21 일</td>
			<td>단축 인장 시험, 조직학 분석, 반지 퓨전 및 튜브 압축 테스트, 연골 조직으로 차별화</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 셀 번호 다른 세포 유형에서 반지 제작에 필요한.

이 프로토콜 사용자 정의 3D 인쇄 하는 플라스틱 금형을 사용 하 여 변수 크기의 자기 조립된 조직 반지 날조를 위한 플랫폼을 설명 합니다. PDMS 원판 3D 인쇄 형;에 치료 된다 다음 agarose 치료 PDMS 원판에 캐스팅 됩니다. 세포는 그들은 조직의 반지로 집계 결과 agarose 우물에 시드.

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 치수의 자체 조립 조직 링을 만드는 데 사용되는 맞춤형 세포 파종 주형을 만드는 것입니다. 이 방법을 사용하면 조직 구조, 강도 및 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 인간 세포에서 3차원 조직 고리를 만들 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 맞춤형 치수로 자체 조립 조직용 금형을 제작하는 간단한 방법이라는 것입니다.절차를 시작하려면 CAD(Computer-Aided Design) 소프트웨어를 사용하여 원하는 치수의 금형 도면을 만듭니다. CAD 파일을 고해상도 3D 프린터로 보냅니다. 섭씨 50도에서 안정적인 광택 마감 처리된 플라스틱에 금형을 인쇄하십시오.인쇄된 금형을 브러시, 세제, 물로 철저히 씻으십시오. 증류수로 금형을 헹구고 랙에서 자연 건조시킵니다. PDMS 경화 온도에서 안정적인 3D 프린팅 플라스틱을 선택하는 것이 중요합니다.가열 중 PDMS로 이동하는 잔류물은 고리 형성에 영향을 미칠 수 있습니다. 다음으로, 일회용 계량 보트에서 25g의 PDMS 베이스를 측정합니다. 경화제를 중량 기준으로 1:10 비율로 첨가하고 베이스와 경화제가 완전히 혼합될 때까지 격렬하게 저어줍니다.그런 다음 금형 측면에 실험실 테이프를 고정하여 인쇄된 웰이 있는 얼굴 주위에 약 1cm 높이의 벽을 형성합니다. 테이프 벽에 틈이 없는지 확인하십시오. PDMS 혼합물을 3D 프린팅 금형에 붓습니다.진공 챔버에서 30-60분 동안 또는 기포가 남지 않을 때까지 PDMS의 가스를 제거합니다. 섭씨 50도에서 2-4시간 동안 또는 PDMS가 금형에서 제거될 수 있을 만큼 충분히 단단해질 때까지 PDMS를 경화합니다. 그런 다음 테이프를 제거하고 PDMS 네거티브를 금형에서 조심스럽게 분리합니다.PDMS 네거티브를 섭씨 60도의 오븐에서 1시간 동안 배양하여 완전히 경화되었는지 확인합니다. 그런 다음 세제와 물로 네거티브를 철저히 씻으십시오. 증류수로 금형을 헹구고 자연 건조시킵니다.아가로스 주형을 제작하기 전에 PDMS 네거티브, 한 쌍의 뭉툭한 집게 및 기타 원하는 도구를 고압멸균합니다. 제조를 시작하려면 DMEM에서 최소 50밀리리터의 2% 아가로스를 준비하고 오토클레이브합니다. 고리 파종 하루 전에 아가로스 웰을 준비합니다.4밀리리터의 용융된 아가로즈를 오토클레이브 PDMS 네거티브에 피펫으로 주입하고 금형을 과도하게 채우지 않도록 주의합니다. 그런 다음, 피펫 용융은 아가로 로즈 웰 포스트의 공동으로 아가로즈를 넣었습니다. 피펫 팁을 사용하여 모든 기포를 제거합니다.최종 아가로스 표면은 평평해야 합니다. 아가로스를 약 10분 동안 식히십시오. 그런 다음 뭉툭한 집게를 사용하여 냉각된 아가로스 주형을 PDMS 네거티브에서 조심스럽게 분리합니다.6개의 웰 플레이트의 한 웰에 몰드를 위로 향하게 놓습니다. 아가로스 웰이 완전히 잠기도록 플레이트 웰에 적절한 완전 배양 배지를 추가합니다. 사용하기 전에 밤새 아가로스 우물을 섭씨 37도에서 평형을 이룹니다.먼저, 15cm 배양 접시에서 70%의 합류점이 달성될 때까지 5%의 이산화탄소 분위기에서 섭씨 37도의 쥐 대동맥 평활근 세포를 배양합니다. 원하는 아가로스 곰팡이가 준비되고 밤새 평형을 이루면 5ml의 인산염 완충 식염수로 배양 접시를 두 번 헹굽니다. PBS를 제거한 후 접시에 0.25% 트립진 3ml를 추가합니다.섭씨 37도에서 2-3분 동안 또는 세포가 접시에서 꺼낼 때까지 배양합니다. 3ml의 완전한 배양 배지로 tripzin을 중화합니다. 세포를 원뿔형 튜브로 옮기고 완전히 재현탁될 때까지 세포를 부드럽게 피펫으로 주입합니다.세포 현탁액의 aliquat를 동일한 부피의 trypan blue 염료로 희석하고 혈구계로 세포를 계수합니다. 그런 다음 200배 G에서 5분 동안 서스펜션을 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 완전한 배양 배지에서 세포를 재현탁시켜 밀리리터당 1,000만 개의 세포 농도를 달성합니다.일관된 고리 형성을 보장하기 위한 가장 중요한 단계는 사용 중인 세포주에 대한 세포 수와 배양 배지를 최적화하는 것입니다. 다음으로, 평형을 이룬 아가로스 웰을 얻습니다. 아가로스 바깥쪽과 아가로스 우물 내부에서 모든 배지를 조심스럽게 흡인하고 우물 바닥에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오.50 마이크로 리터의 세포 현탁액을 각 웰에 피펫으로 넣습니다. 배지가 웰로 흘러 들어가지 않도록 아가로스 웰 바깥쪽에 2ml의 새 배지를 추가합니다. 세포가 응집될 수 있도록 섭씨 37도의 5% CO2 대기에서 밤새 플레이트를 배양합니다.그런 다음 아가로스 외부에서 배지를 흡인합니다. 플레이트 웰에 4.5ml의 새 배지를 추가하여 아가로스 웰이 채워지고 전체 아가로스 곰팡이가 완전히 잠기도록 합니다. 조직 고리가 충분히 발달할 때까지 플레이트를 계속 배양하여 매일 배지를 교체합니다.그런 다음 집게를 사용하여 각 조직 링을 포스트에서 부드럽게 밀어냅니다. 즉시 조직학을 위해 링을 고정하거나 기능 또는 기계적 평가를 위해 링을 사용하십시오. 3D 프린팅을 통해 보다 유연한 금형 설계가 가능했습니다.기둥의 지름은 쉽게 다양했는데, 내 쥐의 평활근 세포 고리는 지름이 2, 4, 12mm인 기둥 주위에 만들어졌다. 조직 고리는 또한 일차 인간 SMC, 인간 중간엽 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 SMC에서 제조되었습니다. 링은 조직 기능 및 기계적 강도를 평가하기 위해 체외 조직 모델로 사용되었습니다.이 방법은 원래 혈관 조직을 제작하고 모델링하도록 설계되었지만 연골, 골격근 및 심장 조직과 같은 다른 조직 유형의 세그먼트를 제작하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 방법은 연구원들이 다양한 치수의 3D 조직 링을 제작하기 위해 맞춤형 금형을 만들 수 있는 간단한 방법을 제공합니다. 이 고리는 다양한 세포 유형으로 만들어진 엔지니어링 조직의 구조, 기계적 특성 및 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

fabrication-custom-agarose-wells-for-cell-seeding-tissue-ring-self

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 문서는 휴대 자기 조립에 의해 세포 - 파생 조직 반지를 만드는 다양한 방법을 설명합니다. 평활근 세포는 링 모양의 아가로 오스 웰스의 집계 7 일 이내에 강력한 입체 (3D) 조직을 형성하기 위해 계약을 씨뿌린. 밀리 대규모 조직 반지는 기계 테스트에 도움이되는이며 조직 조립 블록을 건물로 제공하고 있습니다.

자기 조립 셀룰러이 Biomechanical 분석 및 조직 공학을위한 셀 유래 조직 반지를 조작하는 감독

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

이질적인 세포 집단을 가진 하중지지 조직의 엔지니어링 및 분석은 여전히 어려운 과제입니다. 여기에서는 하나의 구조 내에서 다양한 세포 집단의 공동 배양을 위한 플랫폼으로서 이중층 알기네이트 하이드로겔 디스크를 만드는 방법을 설명합니다.

계층화 된 알긴산를 구축 : 이기종 세포 인구의 공동 문화를위한 플랫폼

확장 가능한 설계 혈관 임상 적용 가능성을 향상시킬 것입니다. 쉽게 상당한 3D 인쇄 가이드 사용, 혈관 평활근의 고리가 생성되었고, 혈관 이식을 형성, 튜브형 형태로 쌓여있다. 이식 단순히 3D 인쇄 된 안내서의 크기를 변화시킴으로써 인간 동맥 치수의 범위를 만족하는 크기로 할 수있다.

3D 인쇄 가이드 및 반지 스태킹 방법을 사용하여 엔지니어링 혈관 이식의 크기 조정

여기 우리는 복잡 한 형상의 설계 조직 히드로-기반 생산에 사용할 수 있는 사용자 지정입니다 금형 날조를 위한 신속 하 고, 손쉬운, 고 저가 방법 제시. 우리는 또한이 기술을 사용 하 여 생산 조작된 심장 조직에서 실시 하는 기계 및 조직학 평가 결과 설명 합니다.

사용자 지정 레이저 에칭 마스터스에서 조직 문화 금형 설계

이 프로토콜은 표준 형광 현미경 상에서 그들의 산소화 및 세포 사멸에 대한 다중 파라메트릭 분석을 사용하여 바이오프린팅을 위한 고처리량 스페로이드 생성을 기술한다. 이러한 접근법은 구상체 생존력을 제어하고 표준화를 수행하기 위해 적용될 수 있으며, 이는 3D 조직, 종양 미세환경 및 성공적인 (마이크로)조직 생물제작을 모델링하는데 중요하다.

다세포 구상체의 저렴한 산소 현미경 보조 생물 제조

본 프로토콜은 3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 사용하여 비용 효율적으로 조직 스페로이드를 대규모로 생산하는 기술을 설명합니다.

3D 프린팅된 스탬프와 같은 장치를 통한 조직 스페로이드 생성

이 연구는 스탬프 기반 시스템을 사용하여 아가로스 주형에 마이크로웰을 생성함으로써 3D 세포 구조를 생성하는 비용 효율적이고 효율적인 방법론을 제시합니다. 이 시스템은 균일한 스페로이드/오가노이드의 형성을 촉진하여 세포 상호 작용을 개선합니다. 이 접근 방식은 실험 변동성을 줄이고 약물 테스트 및 조직 공학의 응용 분야를 지원합니다.

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우리는 시험관 내 배우자 형성을 보완하는 새로운 스캐폴드가 없는 아가로스 곰팡이에서 난소 난포를 배양하는 방법을 설명합니다.

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라만 분광법은 비 접촉에 적합한 기술, 살아있는 세포, 조직 - 엔지니어링 구조와 기본 조직의 라벨이없는 분석입니다. 소스 고유의 스펙트럼 지문가 생성 및 복수 변수 분석을 사용하여 분석할 수 있습니다.

라만 분광학을 사용하여 세포와 세포외 기질의 비 접촉, 레이블이없는 모니터링

배우세요 3D 프린팅 금형과 아가로스 우물을 이용한 조직 반지 제작 방법입니다. 다양한 세포 유형으로 조직 구조와 기능을 평가할 수 있는 조직 공학 플랫폼을 제공합니다.

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

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