셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

이 절차의 전반적인 목표는 다양한 치수의 자체 조립 조직 링을 만드는 데 사용되는 맞춤형 세포 파종 주형을 만드는 것입니다. 이 방법을 사용하면 조직 구조, 강도 및 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 인간 세포에서 3차원 조직 고리를 만들 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 맞춤형 치수로 자체 조립 조직용 금형을 제작하는 간단한 방법이라는 것입니다.

절차를 시작하려면 CAD(Computer-Aided Design) 소프트웨어를 사용하여 원하는 치수의 금형 도면을 만듭니다. CAD 파일을 고해상도 3D 프린터로 보냅니다. 섭씨 50도에서 안정적인 광택 마감 처리된 플라스틱에 금형을 인쇄하십시오.

인쇄된 금형을 브러시, 세제, 물로 철저히 씻으십시오. 증류수로 금형을 헹구고 랙에서 자연 건조시킵니다. PDMS 경화 온도에서 안정적인 3D 프린팅 플라스틱을 선택하는 것이 중요합니다.

가열 중 PDMS로 이동하는 잔류물은 고리 형성에 영향을 미칠 수 있습니다. 다음으로, 일회용 계량 보트에서 25g의 PDMS 베이스를 측정합니다. 경화제를 중량 기준으로 1:10 비율로 첨가하고 베이스와 경화제가 완전히 혼합될 때까지 격렬하게 저어줍니다.

그런 다음 금형 측면에 실험실 테이프를 고정하여 인쇄된 웰이 있는 얼굴 주위에 약 1cm 높이의 벽을 형성합니다. 테이프 벽에 틈이 없는지 확인하십시오. PDMS 혼합물을 3D 프린팅 금형에 붓습니다.

진공 챔버에서 30-60분 동안 또는 기포가 남지 않을 때까지 PDMS의 가스를 제거합니다. 섭씨 50도에서 2-4시간 동안 또는 PDMS가 금형에서 제거될 수 있을 만큼 충분히 단단해질 때까지 PDMS를 경화합니다. 그런 다음 테이프를 제거하고 PDMS 네거티브를 금형에서 조심스럽게 분리합니다.

PDMS 네거티브를 섭씨 60도의 오븐에서 1시간 동안 배양하여 완전히 경화되었는지 확인합니다. 그런 다음 세제와 물로 네거티브를 철저히 씻으십시오. 증류수로 금형을 헹구고 자연 건조시킵니다.

아가로스 주형을 제작하기 전에 PDMS 네거티브, 한 쌍의 뭉툭한 집게 및 기타 원하는 도구를 고압멸균합니다. 제조를 시작하려면 DMEM에서 최소 50밀리리터의 2% 아가로스를 준비하고 오토클레이브합니다. 고리 파종 하루 전에 아가로스 웰을 준비합니다.

4밀리리터의 용융된 아가로즈를 오토클레이브 PDMS 네거티브에 피펫으로 주입하고 금형을 과도하게 채우지 않도록 주의합니다. 그런 다음, 피펫 용융은 아가로 로즈 웰 포스트의 공동으로 아가로즈를 넣었습니다. 피펫 팁을 사용하여 모든 기포를 제거합니다.

최종 아가로스 표면은 평평해야 합니다. 아가로스를 약 10분 동안 식히십시오. 그런 다음 뭉툭한 집게를 사용하여 냉각된 아가로스 주형을 PDMS 네거티브에서 조심스럽게 분리합니다.

6개의 웰 플레이트의 한 웰에 몰드를 위로 향하게 놓습니다. 아가로스 웰이 완전히 잠기도록 플레이트 웰에 적절한 완전 배양 배지를 추가합니다. 사용하기 전에 밤새 아가로스 우물을 섭씨 37도에서 평형을 이룹니다.

먼저, 15cm 배양 접시에서 70%의 합류점이 달성될 때까지 5%의 이산화탄소 분위기에서 섭씨 37도의 쥐 대동맥 평활근 세포를 배양합니다. 원하는 아가로스 곰팡이가 준비되고 밤새 평형을 이루면 5ml의 인산염 완충 식염수로 배양 접시를 두 번 헹굽니다. PBS를 제거한 후 접시에 0.25% 트립진 3ml를 추가합니다.

섭씨 37도에서 2-3분 동안 또는 세포가 접시에서 꺼낼 때까지 배양합니다. 3ml의 완전한 배양 배지로 tripzin을 중화합니다. 세포를 원뿔형 튜브로 옮기고 완전히 재현탁될 때까지 세포를 부드럽게 피펫으로 주입합니다.

세포 현탁액의 aliquat를 동일한 부피의 trypan blue 염료로 희석하고 혈구계로 세포를 계수합니다. 그런 다음 200배 G에서 5분 동안 서스펜션을 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 완전한 배양 배지에서 세포를 재현탁시켜 밀리리터당 1,000만 개의 세포 농도를 달성합니다.

일관된 고리 형성을 보장하기 위한 가장 중요한 단계는 사용 중인 세포주에 대한 세포 수와 배양 배지를 최적화하는 것입니다. 다음으로, 평형을 이룬 아가로스 웰을 얻습니다. 아가로스 바깥쪽과 아가로스 우물 내부에서 모든 배지를 조심스럽게 흡인하고 우물 바닥에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오.

50 마이크로 리터의 세포 현탁액을 각 웰에 피펫으로 넣습니다. 배지가 웰로 흘러 들어가지 않도록 아가로스 웰 바깥쪽에 2ml의 새 배지를 추가합니다. 세포가 응집될 수 있도록 섭씨 37도의 5% CO2 대기에서 밤새 플레이트를 배양합니다.

그런 다음 아가로스 외부에서 배지를 흡인합니다. 플레이트 웰에 4.5ml의 새 배지를 추가하여 아가로스 웰이 채워지고 전체 아가로스 곰팡이가 완전히 잠기도록 합니다. 조직 고리가 충분히 발달할 때까지 플레이트를 계속 배양하여 매일 배지를 교체합니다.

그런 다음 집게를 사용하여 각 조직 링을 포스트에서 부드럽게 밀어냅니다. 즉시 조직학을 위해 링을 고정하거나 기능 또는 기계적 평가를 위해 링을 사용하십시오. 3D 프린팅을 통해 보다 유연한 금형 설계가 가능했습니다.

기둥의 지름은 쉽게 다양했는데, 내 쥐의 평활근 세포 고리는 지름이 2, 4, 12mm인 기둥 주위에 만들어졌다. 조직 고리는 또한 일차 인간 SMC, 인간 중간엽 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포에서 유래한 SMC에서 제조되었습니다. 링은 조직 기능 및 기계적 강도를 평가하기 위해 체외 조직 모델로 사용되었습니다.

이 방법은 원래 혈관 조직을 제작하고 모델링하도록 설계되었지만 연골, 골격근 및 심장 조직과 같은 다른 조직 유형의 세그먼트를 제작하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 방법은 연구원들이 다양한 치수의 3D 조직 링을 제작하기 위해 맞춤형 금형을 만들 수 있는 간단한 방법을 제공합니다. 이 고리는 다양한 세포 유형으로 만들어진 엔지니어링 조직의 구조, 기계적 특성 및 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.