Name: 자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 학습하세요 ALLIGATOR 시스템을 사용하여 배양 세포의 생체 발광 기자 유전자 발현을 비침습적으로 장기간 모니터링하는 방법을. 이 기술은 다양한 세포외 조건에서 생체 발광을 기록하여 생체 리듬 연구의 재현성을 향상시킵니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

우리는 케 른 연구 특히 마크 헨 슨, 제레미 그레이엄과 호 코 레이 아에서에서이 시스템을 개발 하기 위해 우리와 함께 작업 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 우리 또한 감사 데이비드 웨일스어 및 Akhilesh 레디 (하 마)의 이전 피터 Laskey 뿐 아니라 설계 단계 동안 귀중 한 토론에 대 한 원고를 그의 중요 한 입력에 대 한 데모 카메라와 데이비드 웡의 대출을 정리.

1. 시드 및 셀의 온도 유입
참고:이 프로토콜은 엄격 하 게 테스트 되었습니다 PERIOD2::LUCIFERASE (PER2::LUC) 융합 단백질4를 표현 하는 기본 및 불멸 하 게 마우스 fibroblasts을 사용 하 여. 실험 다른 셀 라인을 사용 하 여 만들 수 조정 해야 합니다.
<ol>
	<li>세포 배양을 시작 하기 전에 따뜻한 37 ° C 물 목욕으로 다음 장소: 0.68 m m ethylenediaminetetraacetic 산, pH 7.2 (PBS + EDTA), 적절 한 세포 배양, 예를 들면, 보충 식 염 수 (PBS) (pH 7.4), PBS 인산 염 버퍼 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 µ g/mL 스와 0.25 %trypsin 용액 보충.</li>
	<li>트립 신 1:3 미리 데워 공영 + EDTA 솔루션을 희석 하 고 물 목욕을 반환 합니다.</li>
	<li>70-90%는 luciferase 표현 셀의 125 cm2 플라스 크 confluent 가져가 라. 미디어 발음 10 mL 미리 데워 공영을 추가 합니다.</li>
	<li>PBS 발음 2.5 mL 미리 따뜻하게 트립 신-EDTA를 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C 배양 기에 플라스 크를 반환 합니다.</li>
	<li>인큐베이터와 현미경 아래 보기에서 셀을 제거 합니다. 대부분 세포의 플라스 크 바닥에서 분리 했으면, 다음 단계를 계속. 대부분의 세포는 플라스 크의 하단에 연결 된 남아, 반환 그것 인큐베이터에 대부분의 세포에에서까지.</li>
	<li>플라스 크를 표준 세포 배양 매체의 더 7.5 mL를 추가 합니다. 필요한 경우, 추가 필요에 따라 셀의 통과 위해 이것의 1 mL를 제거 합니다.</li>
	<li>Hemocytometer 고 trypan blue를 사용 하 여 나머지 셀의 밀도 계산. 또한, 셀 라인에 대 한 적절 한 셀을 희석. 참고: 아래 실험에 대 한 PERIOD2::LUC fibroblasts 6 x 103 셀/c m2 와 1 x 104 셀/cm2 96 잘 접시, 35mm 요리, 또는 채널 슬라이드 사이 시드 했다.</li>
	<li>씨 셀 조직 문화 요리 또는 기록을 위해 사용 될 판에. 참고: 블랙 양면, 분명 바닥 플레이트의 사용은 권장이 녹음 하는 동안 우물 사이 방해를 감소 하는 동안 녹음 시작 전에 평가 문화 건강 수 있습니다. 생물 발광 수준은 매우 낮은, 흰색 접시/접시 인광 이어질 수는 몇 시간 동안 지속 되는 배경 신호를 증가 하는 하십시오 빛 검출을 극대화 하기 위해 사용 되어야 한다.</li>
	<li>인큐베이터에 접시를 반환 하 고 100% 합류 (약 7 일)에 도달 하는 monolayers를 허용 합니다. 참고: 일단 confluent, 접촉을 억제 하는 세포 선 유지 될 수 최대 3 주 전에 실험에 대 한 미디어 정기적으로 새로 고치는 (매 5-7 일).</li>
	<li>일단 confluent, 동기화 실험5,6 직전 72 h의 최소 적용된 온도 사이클 (12 h 12 h 37 ° C에서 32 ° C에서)를 사용 하 여 셀룰러 리듬 (미리 프로그램 된 자전거 인큐베이터를 사용 하 여 의해 제어 되는 컴퓨터에 연결 되어 직렬 rs-232 포트를 통해 인큐베이터). 참고: 셀룰러 리듬의 동기화에 필요한 온도 사이클 수 셀 라인 사이 다를 수 있습니다 그리고 그러므로 다른 셀 라인에 대 한 최적화를 할 수 있습니다. 급성 약물 자극 산림 또는 dexamethasone을 사용 하 여 또한 사용 되었습니다 이전 동기화 셀룰러 리듬7,8.</li>
</ol>
2. NS21 준비
참고: NS21 신경 및 기타 세포 배양의 유지 보수에 대 한 혈 청 무료 보충 이다. B27 상용 이며 circadian 생물 발광 녹음9동안 혈 청 교체로 사용할 수 있습니다로 알려진 비슷한 보충의 상세입니다. 어느 보충 교재를 번갈아 기록 매체에서 아래 설명 된 실험 프로토콜에 대 한 사용할 수 있습니다. 그것은 확실히 가능 하 고 비용 효율적인 NS21 첸 외. 마찬가지로 사내 수 있도록 10, 그리고 여기에 설명 된 대로.
<ol>
	<li>시작 하기 전에 1 시간 실 온에서 표 1 에 설명 된 모든 구성 요소 equilibrate</li>
	<li>얼음에 324 mL 기저 매체 (예, neurobasal)에서 50 g 소 알 부 민을 디졸브. 가능 한 한 작은 혼합물을 저 어.</li>
	<li>다른 모든 구성 요소, 각 구성 요소 후 최소한 감동 하지만 여전히 철저 하 게 혼합을 추가 합니다. 시작의 90 분 이내에 모든 구성 요소를 분해 하는 것을 목표로.</li>
	<li>약 최종 혼합물 수 고가 필요할 때까지-20 ° C에서. 반복적인된 동결-해 동 주기를 하지 마십시오. 참고: 혼합물이 너무 점성이 단계에서 필터링 하지만 살 균 필터링 됩니다 때 셀에 추가 하기 전에 미디어로 희석.</li>
</ol>
3. 기록 미디어 준비
참고: 경도 bioluminescence를 기록 하기 위한 다른 장비를 통해 생물 발광 인큐베이터의 주요 장점은 그것이, 인큐베이터 축이다 O2 와 CO2의 부분 압력을 변화 있게 되 고, 덕 녹음 생물 발광에 대 한 미디어 조건의 넓은 범위를 사용 하 여- vivo에서유형 더 밀접 하 게 다른 세포에 의해 점유 하는 생리 적 틈새를 대략적인 조건을 포함 한. 아래 기록 매체에서 헤이스팅스 외. 적응의 공식 설명 9, 우리가 일상적으로 배양된 섬유 아 세포와 다른 세포 유형 사용. 첫 번째는 (가스 교환) 없이 봉인된 문화 조건 그리고 두 번째 순수 관련 조건에 대 한 5% CO2습도 조건 하에서 사용 해야 합니다.다른 많은 변이 모두 가능한 어플리케이션 및 셀 형식에 따라 권장 합니다.
<ol>
	<li>높은 포도 당 MOPS 버퍼 미디어 준비 참고: 재고 솔루션 (1 L): DMEM 분말 (8.3 g/L) 0.35 mg/mL 탄산, 5 mg/mL 포도 당, 0.02 M MOPS, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스.<ol>
		<li>8.3 g DMEM 파우더 1000 mL 측정 실린더에 초순 물 900 mL에에서 녹이 고 모든 입자는 해산 될 때까지 30 분 동안 저 어.</li>
		<li>포도 당 솔루션 (100 g/L), MOPS (1 M, pH 7.6)의 20 mL 50 mL 펜/strep 솔루션, x 100의 10 mL을 추가 하 고 추가로 10 분 동안 저 어.</li>
		<li>4.7 mL 7.5% 나트륨 중 탄산염 솔루션을 추가 하 고 추가 5 분 저 어.</li>
		<li>미디어 pH 7.6 (경우 실내 온도에) 또는 HCl/NaOH와 7.4 (37 ° C)를 조정 합니다.</li>
		<li>1000 mL의 최종 볼륨을 생산 초순 물을 추가 합니다.</li>
		<li>0.22 μ m 필터 및 필요한 때까지 4 ° C에서 저장소를 통해 여과 하 여 소독.</li>
		<li>실험, 이전 10% 혈 청, 2 mM L-alanyl-L-글루타민, NS21, 2% 및 1mm 소 일 주식을 재고 솔루션의 적절 한 볼륨을 보충 한다. 이 주식 0.22 μ m 살 균 필터를 통해 전달 합니다.</li>
		<li>osmometer을 사용 하 여 미디어의 osmolality를 측정 합니다.<ol>
			<li>osmometer을 켭니다.</li>
			<li>Osmometer 초순 물으로 먼저 보정. 50 µ L 물 측정 그릇의 바닥에 추가 합니다. 액체에 있는 아무 거품을 확인 합니다. 조사를 통해 배를 클립. '0'을 눌러 및 신중 하 게 가장 낮은 지점에 osmometer 팔. 읽기 완료 되 고 팔을 제기 하 고 배를 제거 하기 전에 녹색 '결과' 빛이 켜질 때까지 기다립니다.</li>
			<li>50 µ L 교정 표준을 사용 하 여 300 mOsmol/kg osmometer 보정을 반복 합니다. 팔을 낮추기 전에 '칼'을 누릅니다.</li>
			<li>샘플 osmolality 측정 용기와 위와 같이 측정의 하단에 미디어의 50 µ L을 추가 하 여 측정 합니다. Osmometer 팔을 낮추기 전에 ' 샘플'을 누릅니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>5 M NaCl을 사용 하 여 350 mOsmol osmolality를 조정 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HCO3-버퍼링 낮은 포도 당 미디어 (매체 관류) 준비 참고: 재고 솔루션 (1 L): DMEM 분말 (8.3 g/L), 3.7 mg/mL 나트륨 중 탄산염, 1 mg/mL 포도 당, 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스.<ol>
		<li>8.3 g DMEM 파우더 1000 mL 측정 실린더에 초순 물 900 mL에에서 녹이 고 모든 입자는 해산 될 때까지 30 분 동안 저 어.</li>
		<li>포도 당 솔루션 (100 g/L), 100 x 펜/strep 솔루션의 10 mL 50 mL를 추가 하 고 추가로 10 분 동안 저 어.</li>
		<li>49.4 mL 7.5% 나트륨 중 탄산염 솔루션을 추가 하 고 추가 5 분 저 어.</li>
		<li>(실 온)에서 7.6 또는 HCl/NaOH와 7.4 (37 ° C) 미디어 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>1000 mL의 최종 볼륨을 주고 초순 물을 추가 합니다.</li>
		<li>사용까지 0.22 μ m 살 균 필터와 4 ° C에서 저장소를 통해 솔루션을 전달 합니다.</li>
		<li>실험, 이전 2% 혈 청, 2 m m L-alanyl-L-글루타민, 2 %NS21 및 작업 주식을 1 mM 소 재고 솔루션의 적절 한 볼륨을 보충 한다. 이 주식 0.22 μ m 살 균 필터를 통해 전달 합니다.</li>
		<li>측정 하 고 osmolality MOPS 버퍼 미디어에 관해서는 5 M NaCl을 사용 하 여 350 mOsmol 조정 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
참고: 소 농도 각 세포 유형 및 상황에 대 한 실험적으로 결정 되어야 합니다. 자세한 내용은 참조 피 니 외. 11 혈 청 및 NS21 (또는 사용 하는 경우에, B27) 농도 응용 프로그램에 따라 다양 한 수 있습니다. 그러나, 우리 조언 한다, 그렇지 않으면 표시를 경험적으로 테스트 하지 않는 한 혈 청 및 NS21 (또는 다른 혈 청 자유로운 보충) 사용으로 이러한 홍보 세포 생존 및 첨부 파일. 연락 하지 않는 셀 라인에서 잘 억제, 그것은 또한 혈 청에 의해 추진 확산의 혼란 효과 방지 하기 위해 기록 미디어에서 혈 청 농도 낮출 필요가 있을 수 있습니다.
4입니다. 기록
<ol>
	<li>녹음 하기, 따뜻한 37 ° C 물 목욕에 (단계 3.1 또는 3.2 실험에 따라)에서 적절 한 작업 미디어 주식을 배치 합니다.</li>
	<li>동안 미디어 온난화, 생물 발광 인큐베이터에서 카메라 초점.
	<ol>
		<li>물 불 침투성, 온수 중립 밀도 필터를 나사 하 고 따로 설정 합니다.</li>
		<li>높은 수집 속도와 비디오 기록 소프트웨어를 설정 합니다. 클릭 "수집 | 수집 설정 "입니다. 0.2 s와 운동 시간 0.3 초를 '노출 시간'을 설정 합니다. 그들 이득 꺼져 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>' 수집 설정 ' 창을 닫고 "비디오 걸릴" 아이콘을 클릭 합니다.</li>
		<li>항목 기록 높이에서 선반에는 비디오에 초점에 명확 하 게 때까지 초점 실린더를 사용 하 여 카메라 렌즈를 회전 합니다.</li>
		<li>'비디오 중지' 아이콘을 클릭 하 여 비디오를 중지 합니다.</li>
		<li>나사 온수 중립 밀도 필터 위치로 다시; 이렇게 하지 않으면 EM-CCD 카메라 / 결로 인해 목표의 안개 손상 될 것 이다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>생물 발광 인큐베이터의 전면에 컨트롤 패널을 사용 하 여 원하는 실험 조건에 O2, CO2, 그리고 온도 설정 합니다. 참고: perfused 수행 하는 경우 세포 배양 진행 섹션 5에 직접이 단계에서.</li>
	<li>조직 문화 인큐베이터 및 미디어에서 aspirate에서 셀을 제거 합니다. 미디어를 미리 데워 작동 주식 바꿉니다.</li>
	<li>생물 발광 인큐베이터 실험 기간 동안 습도 하지 않습니다, 경우 다음 봉인 요리와 플레이트 가스 불 침투성 물개와 함께.</li></ol>생물 발광 인큐베이터 습도 수 번 창 하 고 있다면, 다음 필요는 없습니다 엄격 하 게 요리, 인감 인감 96 잘 접시, 작은 양의 증발 할 수 있는 그렇지 않으면 가스 침투성 물개를 사용 하 여 같은 작은 볼륨으로 요리 하는 것이 좋습니다 있지만 여전히 습도 incubators에도 발생 합니다. 참고: 습기 인큐베이터의 기지에서 물 트레이 작성 하 여 이루어집니다.
	<li>생물 발광 인큐베이터, 가까운 인큐베이터 문과 보안 인큐베이터 빛 단단한 물개를 형성 하는 자리에 커버를 셀을 전송 합니다.</li>
	<li>응용 프로그램에 대 한 적절 한 녹화 매개 변수를 선택 합니다.
	<ol>
		<li>클릭 "수집 | 수집 설정 "입니다.</li>
		<li>' 카메라 설치 ' 패널에서 설정: '수집 모드' '운동'; '노출 시간'을 원하는 노출 시간에서 초 (아래 참고 참조); ' 축적 ' 1; '운동 시리즈 길이' 취득 주기의 수를 원하는; '운동 주기 시간'을 원하는 이미지 간격 (이것은 노출 시간 보다 큰 수 있도록); ' 이동 속도 ' 4.33 µsecs; 1. ' 이득 ' 그리고 그들 이득 '을 원하는 레벨 (아래 참고 참조)</li>
		<li>'자동 저장' 패널에서.sif 또는.tif 파일 타입을 설정 합니다. 파일 이름을 입력 하 고 저장 위치 적절 한.</li>
		<li>'스풀링' 패널에서 티파니에 파일 형식을 설정 합니다. 파일 이름을 입력 하 고 저장 위치 적절 한. 인수 설정 창을 닫습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>'받아 신호' 버튼을 클릭 하 여 녹음을 시작 합니다. 참고: 생물 발광 인큐베이터는 다른 세포와 조직 유형, 모두는 생물 발광의 다른 수준을 것입니다의 많은 수를 위해 사용할 수 있는 적절 한 발광 신호를 수집 하는 데 필요한 노출 시간 달라 집니다 사이 실험입니다. 그것은 또한 신호 수집의 크기를 늘리기 위해 이미징의 전자 멀티 (EM) 이득 다 수 있습니다. 알 수 없는 밝기의 새로운 애플 리 케이 션에 대 한 것이 좋습니다 먼저 EM 이득 없이 비교적 짧은 노출 시간 (약 10 분)와 함께 하나의 이미지를 복용 하 고 이후 노출 시간 및 그들을 조정 얻을 원하는 녹음 조건 되었습니다 때까지 에 도달 했습니다. 대부분의 경우, 카메라에 대 한 최대 가능한 화소 강렬의 10-20%의 평균 신호를 목표로 좋은 수준입니다. 위에서 설명한 대로 녹음 매개 변수 집합에 도달 하면 일단 이미지의 경도 수집을 시작 합니다.</li>

5. 끼얹는다 조직 문화 (선택 사항)
참고: 소개에 설명 된 대로 생물 발광 인큐베이터 비표준 조직 문화 시스템의 이미징에 적합 하다. 이것은 끼얹는다 세포 배양에 대 한 시스템의 개발에서 궁 행.
<ol>
	<li><li> </li><li><li><li><li></li><li><li><li><li> </li><li><li><li></ol><ol><li><li><li><li><li></ol><ol><li><li><li><li><li> <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56623/56623eq1.jpg"> </li></ol>

<ol><li>Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+light-induced+expression+of+luciferase+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+and+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa.</a> Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).</li>
<li>Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Circadian+Phenotype+Based+on+Firefly+Luciferase+Expression+in+Transgenic+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants.</a> Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).</li>
<li>Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Firefly+Luciferase+Activity+Assays+to+Monitor+Circadian+Molecular+Rhythms+In+Vivo+and+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circadian+Rhythms%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro.</a> Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).</li>
<li>Yoo, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li>
<li>Buhr, D. E., Yoo, S. -H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+as+a+universal+resetting+cue+for+mammalian+circadian+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators.</a> Science. 330 (6002), 379-385 (2010).</li>
<li>Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythms+of+mammalian+body+temperature+can+sustain+peripheral+circadian+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks.</a> Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).</li>
<li>Balsalobre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+of+circadian+time+in+peripheral+tissues+by+glucocorticoid+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling.</a> Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).</li>
<li>Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+elicit+circadian+gene+expression+in+cultured+Rat-1+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts.</a> Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).</li>
<li>Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circadian+mechanisms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+by+transgenesis+and+biolistic+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection.</a> Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres,, Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NS21%3A+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li>
<li>Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+Characterization+of+Firefly+Luciferase+as+a+Reporter+of+Circadian+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Rhythms%22%5BJournal%5D)">In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells.</a> J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li>
<li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+%28+CK1+%29+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li>
<li>Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flyglow%3A+Single-fly+observations+of+simultaneous+molecular+and+behavioural+circadian+oscillations+in+controls+and+an+Alzheimer%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model.</a> Sci. Rep. 6, 33759(2016).</li>
</ol>

아니 이해 충돌 존재 한다.

여기에 설명 된 프로토콜 끼얹는다 고 정적 조건 모두 포유류 세포 배양입니다. 그러나, 악어 쉽게 다른 모델 시스템에 적용할 수 있습니다. 실제로, 그것은 이미 표시 되었습니다 동시 운동, 수 면, 그리고 주변 유전자 초파리 melanogaster 상수 어둠15. 유지에 식 리듬의 모니터링을 위한 뛰어난 플랫폼을 제공 하 그것은 또한 응용 프로그램에 따라 여기에 언급 된 그 외 카메라 유형을 적절 한 있을 수 있습니다, 지적 했다. 우리는 적절 한 필터와 함께 현재 설치의 수정된 된 버전 보안 주체에 사용 될 수 형광 정량화 정시.
악어 적절 한 않을 수 있습니다 유일한 응용 프로그램은 특히 높은 공간 해상도 필요할는 포유류의 organotypic 조각에 PER2::LUC 식의 spatiotemporal 조직의 이미징 suprachiasmatic 핵, 또는 다른 작은 조직 조각입니다.
악어는 지금 까지는 되지 않은 기존의 레코딩 기술에 의해 쉽게 달성 많은 실험을을 수행할 수 있습니다. 생물 발광의 측정을 위한 현재 방법과 비교해, 악어 셀 문화 접시 또는 사용할 수 있는 슬라이드, 외부 미디어 조건, 감도, 및 processivity 두 유형의 증가 유연성을 제공 합니다.
이것은 특히 적합 한 번에 3D organoid 문화 시스템이 향해 문화 모델은 표준 2D 셀에서 이동이 있을 때. 이와 같이, 악어는 생물 발광은 많은 일 및 광범위 한 조건 아래 주에 측정 될 수 있다 적응 방법을 제공할 것입니다 예상 된다.

유전자 발현 및 단백질 활동의 기자로 luciferases 사용 하 여 분자 및 세포 생물학 연구에서 인기 있는 기술 되고있다. 이것은 사실이 circadian 필드, 반딧불 luciferase 합성 및 촉매 비활성화의 속도 약 24 h circadian 주기 동안 발생 하는 유전자 발현의 경도 변화를 보고 하는 데 특히 적합. 이와 같이, luciferase 생물, 균 류, 식물, 파리, 그리고 포유류1,2,,34를 포함 하 여의 넓은 범위에 걸쳐 circadian 기자로 채택 된다.
Circadian 유전자 식에 체 외에서측정 될 때 광 전 증폭 관 관 (PMT) 발광 신호를 기록 하는 데 주로 사용 됩니다. 그러나 PMT 기반 측정 제한 유연성, 일반적으로 미리 정해진된 접시 또는 접시 크기에 제한 되 고. 그것은 불가능도 luciferase 식에서 공간 변화를 보여 주는 샘플을 이미징 하는 경우 정보의 손실에 지도할 수 있는 PMT를 사용 하 여 모니터링 샘플에서 공간 정보를 수집 합니다. 또한, PMT와 관련된 전자는 표준 셀 문화 인큐베이터의 습도 환경에 노출 되 면 오작동 하는 경향이, Pmt를 사용 하 여 경도 luciferase 녹음은 항상 비 습도 인큐베이터에서 수행 됩니다. 결과, 셀 문화 요리 공기 증발을 통해 수 분 손실을 방지 하기 위해 꽉 밀봉 해야 합니다 및 3-따라서 문화 미디어를 버퍼링 해야 합니다 (N-morpholino) propanesulfonic 산 (MOPS) 또는 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), vivo 기능 그리고 포유류 조직 문화에서 일상적으로 사용 하는 시스템을 버퍼링 CO2/bicarbonate 보다는.
이러한 제한의 결과로 Pmt에 의해 생물 발광의 측정은 일반적으로 세포 실험 동안 유지 되는 조건에 꽉 제한을 장소. 이러한 문제를 극복 하 고 또한 가능한 실험 조건의 범위를 증가, 우리는 표준 공동2/N2 170 L 조직 문화 인큐베이터는 물 냉장 전자-멀티의 추가 의해 적응 되었습니다 사용 하 여 전 하 결합 소자 (EMCCD) 카메라 anti-mist 광학 및 디지털 제어 온도 가스 레벨의. 이 가스 이미징 Luciferase 자동 경도 및 Temperature-Optimized 레코더, 또는 악어 별명은. 악어 발광 이미징, 모두 표준 조직 배양 플레이트의 높은 처리량 이미징의 유연성을 크게 증가 수 있습니다 (동시에 최대 6 x 96-또는 384-잘 접시)와 또한 비표준 조직 문화 시스템에 대 한 이러한 끼얹는다 셀으로 미세 장치에서 성장. 이 악기는 또한 가변 제어 모두 CO2 와 O2 부분 압력으로 온도 습도 조건 하에서 발생 하는 화상 진 찰에 대 한 수 있습니다.
프로토콜 아래 포유류 세포와 악어 (이제부터 '생물 발광 인큐베이터' 라고도 함)를 사용 하 여 조직 문화 시스템의 발광 녹음 하는 방법을 설명 합니다. 그러나 그것은,, 시스템 발광 영상 하 고 또한, 일부 수정, 형광 이미징, 다른 생물 학적 시스템 및 컨텍스트 수에 적합 될 것 이라고 주목 한다.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone FetalClone III Serum</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30109.03</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermofisher</td><td>21103049</td><td>basal</td></tr><tr><td>medium 소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>카탈라아제</td><td>시그마</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온</td><td>시그마</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼옥사이드 디스뮤타제</td><td>시그마</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>홀로트랜스페린</td><td>칼바이오켐</td><td>616424</td><td></td></tr><tr><td>T3 (트리요오도-L-티로닌</td><td>시그마</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>L-카르니틴</td><td>시그마</td><td>C7518</td><td></td></tr><tr><td>에탄올아민</td><td>시그마</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>D (+) - 갈락토스</td><td>시그마</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>시그마</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 셀레 나이트</td><td>시그마</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>코르티코 스테론</td><td>시그마</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>리놀레산</td><td>시그마</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>리놀렌산</td><td>시그마</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>리포산</td><td>시그마</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>시그마</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>레티놀 아세테이</td>트 <td>시그마</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>레티놀, 모든 트랜스</td><td>시그마</td><td>95144</td><td></td></tr><tr><td>D, L-알파-토코페롤</td><td>시그마</td><td>95240</td><td></td></tr><tr><td>D,L-알파-토코페롤 아세테이트</td><td>시그마</td><td>T3001</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨 용액</td><td>시그마</td><td>S8761-100ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>갤럭시 170R 인큐베이터&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>CO17301001</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Biosynth</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>D -(+)-글루코스 용액</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 파우더</td><td>Sigma</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>PHG0007</td><td></td></tr><tr><td>1 mm I.D. 실리콘 튜빙&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>19-4692-01</td><td></td></tr><tr><td>엘보우 루어 커넥터</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>남성 루어 피팅</td><td>Ibidi</td><td>10826</td><td></td></tr><tr><td>여성 루어 피팅</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-슬라이드 루어 I 0.6</td><td>Ibidi</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>BD plastipak 20ml 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1mm I.D. ETFE 튜빙</td><td>GE 헬스케어</td><td>18-1142-38</td><td></td></tr><tr><td>PF670462</td><td>시그마</td><td>SML0795</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제 (50x)</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD 카메라</td><td>Andor</td><td>iXon 888</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>Graphpad Software</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Deltaphase 등온 패드</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>가열 중성 밀도 필터&nbsp;</td><td>케언 리서치</td><td>커스텀 아이템</td><td></td></tr><tr><td>Osmomat 030</td><td>Gonotech</td><td>단종</td><td></td></tr><tr><td>300 mOsmol/kg 교정 표준</td><td>고노테크</td><td>30.9.0020</td><td></td></tr><tr><td>측정 용기</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0010</td><td></td></tr><tr><td>포커싱 실린더</td><td>케언 리서치</td><td>커스텀 아이템</td><td></td></tr><tr><td>NE-1600 프로그래머블 실린지 펌프</td><td>펌프 시스템 Inc. </td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis 소프트웨어</td><td>및</td><td>해당 없음</td><td></td></tr></tbody></table>

자동된 경도 luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

세포 유전자 발현의 기자 luciferase 기반 둘 다 경도 대 한 광범위 한 사용에 있고 끝점 생물 학적 활동의 분석 실험. Circadian 리듬 연구, 예를 들어 반딧불 luciferase와 시계 유전자 융해 일으키 강력한 리듬에 많은 일 동안 유지 세포 생물 발광. 광 전 증폭 관 관 (PMT)와 관련 된 기술 제한 또는 생물 발광 정량화에 대 한 기존의 현미경-기반 방법 일반적으로 세포와 조직 중 아주 비 생리 적 조건 하에서 유지 될 요구 했다 녹음, 감도 처리량 사이 교환. 여기, 우리 수 있도록 장기적인 생물 발광 영상 높은 감도와 처리량을 문화 조건, 습도 제어, 가변 가스 등의 광범위 한 범위를 지원 하 고 많은 종류를 원하는 다른 이전 방법의 상세 보고 조직 문화 접시 그리고 요리입니다. 또한 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징이 자동화 경도 luciferase 셀 단층 또는 전통에 의해 쉽게 관찰 될 수 없습니다. 있는 조직, luciferase 식 공간 변이의 관측 수 방법입니다. 우리는 악어 기존의 방법에 비해 luciferase 활동의 탐지에 대 한 대폭 증가 유연성을 제공 하는 방법을 강조 표시 합니다.

이 문서는 악어 (생물 발광 인큐베이터)를 사용 하 여 포유류 세포의 발광 영상에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 기술은 발광 시스템 이미징 extracellular 조건과 실제 설치의 유연성에 대 한 수 있습니다. 간단한 정적 조직 문화 (그림 1, 보조 비디오 1) 및 (그림 2, 보조 비디오 2) 끼얹는다 세포 배양 방법을 설명 하지만 다른 많은 설정을이 시스템을 사용 하 여 이미지 수 있습니다. 모든 데이터 섹션 7에 설명 된 방법을 사용 하 여 정량 했다.
그림 1A PER2::LUC fibroblasts4를 포함 하는 6 x 96 잘 접시에서 녹음 하는 생물 발광의 비디오는 예를 보여 줍니다. 이들은이 실험에 필요한으로 바깥쪽 웰 스 셀을 포함 하지 않습니다. 녹음에 대 한 지속적인 37 ° C에서 개최 되 고 전에 셀 차동 온도 유입, 그것에 의하여 그들은 32 ° C 12 h 72 h 또는 대화 (12 h, 12 h 72 h에 32 ° C에 뒤 37 ° C에서), 37 ° C에 의해 다음에 12 h의 어느 온도 사이클을 받게 받은 합니다. 60 분 노출 매 시간을 촬영 했다. 이러한 조건 중 두 개는 그림 1B에서 정량.
그림 2A 끼얹는다 조직 문화에 대 한 시스템의 설치의 회로도 보여준다. 배관으로 연결 하는 두 개의 채널 슬라이드 이것에 의하여 이루어져 있다. 미디어 셀에 걸쳐 주사기 펌프에 의해 구동 됩니다. 이 슬라이드의 첫 번째 가스 투과성 거품 트랩 (버퍼 슬라이드) 역할을 하며, 두 번째 셀 포함 생물 발광은 기록 하는 셀을 포함 하. 이 시스템에서 비디오를 녹화 하는 대표는 그림 2B에 표시 됩니다. 15 분 노출 매 15 분을 촬영 했다. 표준 관류 조건 또는 카 세 인 키 니 아 제 억제 물 PF670462, 이전 circadian 기간을 길게 하 고 경작에 시계 유전자 식 리듬의 진폭을 감소를 보여왔다 존재 셀의 유지 관리 하는 자, 포유류 세포14. PER2::LUC 식에 미치는 영향의 정량화와 그림 2C (하단 패널)에 표시 된 표준 정적 셀 문화 조건 하에서 약물의 동일한 농도로 처리 하는 셀에 대 한 그림 2C (상단 패널)에 표시 됩니다. 그림 2D에 나와 있습니다. 그것은 이것에서 PF670462 치료 조건의 두 세트에서 PER2::LUC 식 영향입니다. 그러나, 동안 셀 끼얹는다 조건 표시 기간 길어 약 3 h (3 ±0.9 h)에서 PF670462로 치료, 약물으로 치료 하는 정적 조건에서 셀 표시의 기간에 실질적으로 더 큰 기간 길이 &gt; 48 h. 이 섹션 7에 설명 된 대로 감쇠 코사인으로 들어갈 수 있는 (사각형의 여분 합계 F 대 직선 p 테스트 &lt; 0.0001). 흥미롭게도, 관류에서 기간 연장의 진도 훨씬 vivo에서14관찰에 가까운 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg"> 
그림 1: 데이터 예제. (A) 예를 들어 6 x 96에서 불멸 하 게 PER2::LUC에서 생물 발광의 비디오 스냅샷 잘 생물 발광 인큐베이터에 접시. 웰 스를 측정할 수 있다 보조 비디오 1에서 노란색으로 강조 되었다. A.에서 생물 발광의 부 량 (B) 두 셀의 3 판 서로 반대 PER2 단백질 식의 단계 생산을 반대로 phasic 했다 온도 사이클 (32 ° c h 12; 12 h, 37 ° C에서)를 사용 하 여 개입 했다 (n = 6, ± SEM을 의미). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg"> 
그림 2: CK1δ 억제제와 관류. 관류 시스템의 (A) 회로도 (B) 예를 들어 PER2::LUC에서 기록 하는 생물 발광의 비디오 스냅샷 관류에서 세포. 정량화의 샘플 영역 노란색으로 강조 표시 됩니다. PER2::LUC 섬유 아 세포 관류에서 고 3 µ M CK1 억제제 PF670462 없이 정적 조건에서의 생물 발광의 (C) 정량화 (n = 3, ± SEM을 의미). 생물 발광은 최소 및 최대 값을 정규화 되었습니다. (D) 분석 기간 (양방향 ANOVA, Holm Sidak 여러 비교 테스트).<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>최종 중간 농도 (μ M)</td>
			<td>주식 (mg/mL)</td>
			<td>400 mL NS21에 대 한</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>소 민</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>카 탈 라 제</td>
			<td>0.01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>티</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>인슐린</td>
			<td>0.6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superoxide dismutase</td>
			<td>0.077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>홀로 처리가</td>
			<td>0.062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (triiodo-L-thyronine)</td>
			<td>0.0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-카 르 니 틴</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>방법</td>
			<td>16</td>
			<td>액체 (1 g/ml)</td>
			<td>20 Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D (+)-갈 락 토스</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 밀리 그램</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 밀리 그램</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>나트륨 Selenite</td>
			<td>0.083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 Μ L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corticosterone</td>
			<td>0.058</td>
			<td>2</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>리 놀 레 산</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>리 놀 렌 산</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>리 포 산</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>황 체 호르몬</td>
			<td>0.02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0.04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>레 티 놀 아세테이트</td>
			<td>0.2</td>
			<td>20</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol, 모든 트랜스</td>
			<td>0.3</td>
			<td>10</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-알파-토 코 페 롤</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0. 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D, L-알파-토 코 페 롤 아세테이트</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0.2 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: NS21 준비입니다.
보충 비디오 1: 예제 비디오 잘 플레이트에서 생물 발광의. 예를 들어 생물 발광 인큐베이터에서 6 x 96 잘 접시에서 불멸 하 게 PER2::LUC에서 생물 발광의 비디오 스냅샷. 웰 스 측정할 수를 노란색으로 강조 표시 됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 비디오 2: PER2::LUC에서 기록 하는 생물 발광의 예제 비디오 스냅샷 세포 관류에서. 정량화의 샘플 영역 노란색으로 강조 표시 됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

유전자 인코딩된 luciferase 유전자 발현의 인기 있는 비-침략 적 기자입니다. 자동된 경도 luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미징의 사용에는 다양 한 조건에서 발광 세포에서 경도 녹음 수 있습니다. 여기 우리가 어떻게 악어 circadian 리듬 연구의 맥락에서 사용할 수 있습니다 보여줍니다.

자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

이 시스템의 전반적인 목표는 지속적인 매체 관류를 포함하여 광범위한 세포 외 조건에서 생물 발광 기자를 쉽게 관찰할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 배양된 세포와 조직에서 세로로 생물 발광을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 대부분의 기존 시스템에서는 불가능한 다양한 세포 외 매체 및 가스 조건에서 세포에서 기록할 수 있다는 것입니다.여기서는 일주기 리듬 실험의 맥락에서 이 기술을 시연하지만, 며칠에서 몇 주까지 시간 척도에 따라 생물 발광 또는 형광 기록이 필요한 다른 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다. 절차를 시작하려면 조직 배양 접시 또는 플레이트에 배양된 세포를 파종합니다. 단층이 100% 합류점에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.실험 직전에 컴퓨터로 제어되는 사이클링 인큐베이터를 사용하여 최소 72시간 동안 12시간마다 섭씨 32도에서 37도를 번갈아 가며 세포 리듬을 동기화합니다. 배양 내부 및 배양 간 세포 일주기 진동의 강력한 동기화는 실험 재현성에 매우 중요합니다. 우리는 체온 리듬을 모방하여 세포를 동기화하는 각 기록 전에 일일 온도 주기를 적용하여 이를 달성합니다.또는 약리학적 동기화도 매우 효과적일 수 있습니다. 다음으로, 8.3g의 고포도당 DMEM 분말과 900ml의 초순수를 혼합합니다. 분말이 완전히 녹을 때까지 용액을 30분 동안 저어줍니다.그런 다음 용액에 리터당 100g 포도당 용액 50ml, pH 7.6 20ml, 몰 MOPS 용액 100 배 페니실린 스트렙토 마이신 용액 100 밀리리터를 첨가합니다. 혼합물을 10분 동안 저어줍니다. 그런 다음 7.5% 중탄산나트륨 용액 4.7ml를 넣고 혼합물을 5분 더 저어줍니다.염산 또는 수산화나트륨을 사용하여 실온에서 pH를 7.6으로 조정합니다. 용액에 초순수를 첨가하여 최종 부피 1리터를 얻습니다. 0.22마이크로미터 멸균 필터를 통해 용액을 멸균 플라스크에 여과합니다.여과된 원료 배지를 섭씨 4도에서 보관하십시오. 실험을 수행하기 직전에 원하는 양의 원료 배지에 10%혈청, 2밀리몰 글루타맥스, 2%NS21 및 1밀리몰의 루시페린을 보충합니다. 생성된 작동 매체를 0.22마이크로미터 멸균 필터에 통과시킵니다.5몰의 염화나트륨 용액을 사용하여 작동 매체 삼투압을 350밀리오스몰로 조정합니다. 그런 다음 수조에서 중기를 섭씨 37도까지 데웁니다. 다음으로, 생물 발광 인큐베이터 카메라의 초점을 맞추기 시작하려면 불투수성 가열식 중성 밀도 필터의 나사를 푸십시오.기기 소프트웨어에서 노출 시간을 0.2초로 설정하고 운동 사이클 시간을 0.3초로 설정합니다. 전자 증식 이득이 꺼져 있는지 확인한 다음 설정 창을 닫고 비디오 녹화를 시작합니다. 초점 실린더를 사용하여 적절한 샘플 선반의 테스트 항목이 명확하게 초점이 맞춰질 때까지 카메라 렌즈를 회전합니다.그런 다음 비디오 녹화를 중지합니다. 중성 밀도 필터를 교체하고 테스트 항목을 제거합니다. 다음으로, 생물발광 인큐베이터 전면에 있는 제어 패널을 사용하여 실험에 필요한 산소, 이산화탄소 및 온도 수준을 설정합니다.가습 실험의 경우 인큐베이터 바닥에 있는 물받이를 채우십시오. 조직 배양 인큐베이터에서 세포를 제거하고 배양 배지를 예열된 작동 배지로 교체합니다. 소량을 사용하는 가습 실험의 경우 가스 투과성 필름 또는 테이프로 플레이트를 밀봉하십시오.플레이트를 생물 발광 인큐베이터에 넣습니다. 인큐베이터를 닫고 도어 커버를 고정하여 시스템에서 빛을 차단합니다. 그런 다음 기기 소프트웨어에서 획득 모드를 kinetic으로 설정합니다.원하는 노출 시간을 설정합니다. accumulations를 1로, kinetic series length를 원하는 수집 주기 수로, kinetic cycle time을 원하는 이미징 간격으로 설정합니다. 4.33마이크로초의 변속 속도, 1의 게인 및 원하는 수준의 EM 게인을 설정합니다.그런 다음 자동 저장 파일 형식을 sif 또는 tiff로 설정합니다. 자동 저장 파일의 이름을 지정하고 파일 경로를 설정합니다. 스풀링 파일 형식을 sif 또는 tiff로 설정합니다.파일 스택의 이름을 지정하고 파일 경로를 설정합니다. 설정 창을 닫고 데이터 기록을 시작합니다. 데이터 수집이 완료되면 획득한 이미지 스택을 이미지 처리 소프트웨어로 가져옵니다.생물 발광을 최적으로 볼 수 있도록 밝기와 대비를 조정합니다. 그런 다음 관심 영역을 선택하고 선택한 영역에 대한 평균 신호를 내보냅니다. 추가 처리를 위해 데이터를 분석 소프트웨어에 복사합니다.실험을 시작하려면 Luer 커넥터와 0.6 또는 0.8mm의 채널 깊이가 있는 단일 채널 슬라이드에 세포를 시드합니다. 세포를 배양하고 동반합니다. 탄산수소 완충 저포도당 DMEM 관류 배지를 준비하고 예열합니다.다음으로, 내경이 1mm인 실리콘 튜브의 2cm 섹션 5개를 자릅니다. 1.2미터, 10센티미터 및 30센티미터의 1mm 내경 에틸렌 테트라플루오로에틸렌 튜브를 자릅니다. 튜브를 70% 에탄올로 살균하고 튜브를 멸균 PBS로 세척합니다.멸균된 실리콘 튜브를 사용하여 1.2미터 ETFE 튜빙을 멸균 암 Luer 커넥터 및 멸균 엘보우 Luer 커넥터에 연결합니다. 이 어셈블리를 사용하여 관류 매체 주사기를 빈 Luer 채널 슬라이드에 연결합니다. 다음으로, 세포 배양 배지를 예열된 관류 배지로 교체합니다.20ml 멸균 주사기에 예열된 관류 매체를 채웁니다. 실리콘 튜브를 사용하여 10cm ETFE 튜브와 Luer 커넥터를 끼우고 튜브를 슬라이드에 연결합니다. 3-5ml의 관류 매체를 튜브와 채널 슬라이드를 통해 플러시합니다.그런 다음 30cm ETFE 튜브를 세포 함유 채널 슬라이드에 맞춥니다. 10cm ETFE 튜브의 다른 쪽 끝을 세포 채널 슬라이드의 다른 쪽 끝에 연결하여 완전한 관류 시스템을 형성합니다. 튜브를 통해 1ml의 관류 매체를 세척하고 기포를 제외하기 위해 슬라이드합니다.관류 시스템을 생물 발광 인큐베이터로 운반합니다. 관류 매체 충전 주사기를 주사기 펌프에 고정하고 튜브가 분리되지 않도록 주의하십시오. 주사기 펌프를 사용하여 관류 시스템을 통해 1ml의 관류 매체를 플러시합니다.펌프에 주사기 직경을 입력하고 유량을 시간당 50마이크로리터로 설정합니다. 실험 시작 시 관류 시스템에 기포가 없는 것이 중요한데, 이는 생물 발광 신호를 방해할 수 있기 때문입니다. 펌프를 시동하고 즉시 생물 발광 인큐베이터 도어를 닫습니다.도어 커버를 조여 시스템에서 빛을 차단합니다. 정적 조직 배양에 대해 설명된 대로 데이터를 수집하고 분석합니다. PER2 LUC 섬유아세포의 6개 플레이트를 일일 온도 주기를 사용하여 혼입하고 생물 발광 인큐베이터를 사용하여 이미지화했습니다.선택된 웰의 이미지를 분석하고 생물 발광 출력을 정량화했습니다. PER2 LUC 세포는 또한 PER2 LUC 발현에 대한 카제인 키나아제 억제제의 효과를 평가하기 위해 관류 조건에서 이미지화되었습니다. 그 결과를 정적 조건에서 동일한 농도의 억제제로 처리된 세포와 비교했으며, 이는 정적 조건에서 실질적으로 더 긴 기간 연장을 보여주었습니다.관류 조건에서 기간이 길어지는 정도는 생체 내에서 관찰된 것과 가까운 것으로 밝혀졌습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 ALLIGATOR를 사용하여 정적 및 관류 생물 발광 실험을 모두 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

flexible-measurement-bioluminescent-reporters-using-an-automated

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기, 우리는 Promega에서 듀얼 GloTM 루시페라제 분석 시스템을 사용 루시페라제 기반 리포터 유전자 접근 방식과 phagocytosis 유발 유전자 발현의 변화를 공부하고 절차를 설명합니다.

루시페라제 기반 리포터 유전자 분석과 함께 막 Biogenesis 유학

생활 동물 세균성 감염의 bioluminescence 이미징을위한 방법은 설명되어 있습니다. 병원균은 살아있는 동물에 감염 광학 온 몸이 이미징을 허용 루시페라제 표현을 수정합니다. 동물 모델은 루시페라제 표현 병원균에 감염과 질병의 발생 과정은 bioluminescence 이미징에 의해 실시간으로 시각하실 수 있습니다.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

여기 우리는 그들의 성장과 전이 동안 전이성 유방암 세포에 표현 반딧불과 renilla 루시 페라 제 효소 모두의 발광 생물 반응을 구축 시각화 및 정량화 할 수있는 방법을...

생체 듀얼 기판 발광 생물 이미징에

Circadian 시계는 개별 세포 내 기능, 즉, 그들은 세포 자율적 있습니다. 여기, 우리는 비 침습적, 루시 페라 기반의 실시간 bioluminescence 기술을 사용하여 셀 자치 클럭 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 리포터 전지는 circadian 생물학을 공부를위한 다루기 쉬운, 기능 모델 시스템을 제공합니다.

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

이 동영상은 루시페라아제 태그가 지정된 단백질을 정량화하는 데 사용되는 루시페라아제 분석을 보여줍니다. 이 분석은 관심 단백질과 접합된 작은 단편과 결합하는 큰 단편으로 구성된 엔지니어링된 루시페라아제 효소를 사용합니다. 결합된 소단위체는 기질이 있을 때 발광 신호를 방출하는 활성 효소를 형성합니다. 그런 다음 이 신호는 광도계를 사용하여 정량화됩니다.

Luciferase Assay: 엔지니어링된 Nanoluciferase 시스템 기반 바이오리포터를 사용하여 발광 신호를 측정하는 고처리량 분석

세균의 생물 발광 유전자 카세트를 표현하는 포유 동물 세포...

세포 독성의 지속적인 실시간 모니터링을위한 자율적으로 바이오 루미 네 센트 포유 동물 세포

여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

발광 박테리아 메커니즘, 쿼럼 센 싱 등의 다양 한 통해 빛 생산을 통제 한다. 이 새로운 메서드는 생물 발광의 현장에서 조사와 발광 셀 밀도 상관 관계를 수 있습니다. 인공 발광 대장균 시스템 럭 스 operons, 럭 스 단백질, 그리고 그들의 상호 작용의 특성을 수 있습니다.

제자리에서 측정 및 셀 밀도의 상관 관계 및 발광 박테리아의 발광

신경 줄기/전구 세포는 세포 이벤트의 다른 결과로 이끌어 내는 노치 신호 분대의 각종 표현 역학을 전시합니다. 이러한 동적 발현은 유전자 발현의 급격한 변화를 시각화할 수 있는 매우 민감한 생물 발광 이미징 시스템을 사용하여 정적 분석이 아닌 실시간 모니터링을 통해 밝혀질 수 있습니다.

뮤린 신경 발생 시 노치 신호 역학의 실시간 생물 발광 이미징

대부분의 유기체에 존재하는 일주기 리듬은 생물학적 과정의 시간적 조직을 조절합니다. 3D 오가노이드는 최근 생리학적으로 유의미한 in vitro 모델로 부상했습니다. 이 프로토콜은 생물 발광 리포터를 사용하여 오가노이드의 일주기 리듬을 관찰하는 방법을 설명하며, 이를 통해 다세포 시스템의 일주기 리듬에 대한 체외 조사를 가능하게 합니다.

Organoids에서 Bioluminescence Reporter를 사용한 Circadian Oscillations 모니터링

학습하세요 ALLIGATOR 시스템을 사용하여 배양 세포의 생체 발광 기자 유전자 발현을 비침습적으로 장기간 모니터링하는 방법을. 이 기술은 다양한 세포외 조건에서 생체 발광을 기록하여 생체 리듬 연구의 재현성을 향상시킵니다.

자동된 경도 Luciferase 가스 온도 최적화 레코더 (악어) 이미지를 사용 하 여 발광 기자 들의 유연한 측정

더 많은 동영상 탐색