Name: 동맥 경화 증의 영상에 대 한 펩 티 드 Amphiphile Micelles Monocyte 타겟팅의 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 학습하세요 단핵구 표적 펩타이드 양친매성 미셀 합성법으로 동맥경화증 영상화를 개선하는 방법을. 조기와 말기 병소를 구분하여 진단 정확도를 높입니다.

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저자 남부 캘리포니아 대학, 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 (NHLBI), R00HL124279, Eli와 Edythe 넓은 혁신 상 수상, 고 L.K. 위 티어 재단 비 암에서 재정 지원을 인정 하 고 싶습니다. 번역 상 연구 상 EJC 부여입니다. 저자 감사는 센터 전자 현미경 및 Microanalysis, NanoBiophysics에 있는 우수의 센터, 분자 특성 분석을 위한 우수의 센터 및 들어가게 이미징 센터에 남부 캘리포니아 대학에 경 음악 설정입니다.

참고: 시 약에 대 한 MSDS를 읽고을 로컬 기관에 의해 필요에 따라 모든 화학 안전 조치를 따르십시오.
1입니다. MCP-1 PAMs의 준비
<ol><li>
MCP-1 펩 티 드의 준비
	<ol>
<li>Fmoc L 리스 (Boc)의 0.25 mmol을 무게-반응 선박 (RV)에 왕. 화학 증기 두건에서 5 mL dimethylforamide (DMF)와 RV의 측을 씻어.</li>
		<li>자동된 벤치탑 펩 티 드 합성기에 RV를 로드 합니다. 사전 패키지 된 아미노 산 성 튜브, N '-CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS-C', C N-말단을 로드 합니다. 최종 deprotection 단계 끝에 빈 병을 포함 합니다. 참고: 시퀀스, N '-CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK-C', 스크램블된 펩 티 드 수 또한 될 합성 같은 프로토콜을 사용 하 여.</li>
		<li>합성이 완료 되 면 전송는 펩 티 드 수 지에는 RV에서 2-3 mL 메탄올을 가진 섬광 유리병에 수 지의 모든 전송 되기 전 까지는. 수 지 바닥에 침 몰 했다, 후 표면에 뜨는 메탄올을 제거 하 고 건조까지 남은 증발. 진공 건조는 추가적인 2 시간 또는 하룻밤 실 온에서.</li>
		<li>화학 증기 두건에서 94:2.5:2.5:1 vol %trifluoracetic 산 (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane를 포함 하는 12 mL 분열 솔루션을 확인 합니다. 그것은 균일 하 게 혼합 되도록 절단 솔루션을 소용돌이 친다. 주의: triisopropylsilane와 ethanedithiol는 공기에 민감한, 때문에 아르곤 triisopropylsilane 그리고 그들을 다시 퍼 팅 하기 전에 1 분 동안 ethanedithiol의 재고 튜브를 제거.</li>
		<li>SV의 절반 하단 클램핑 함으로써 팔 쉐이 커에 합성 선박 (SV)를 배치 합니다. 펩 티 드 수 지의 모든 전송 됩니다 때까지 분열 솔루션의 2 mL와 SV에 펩 티 드-수 지를 전송 합니다.</li>
		<li>워시 3 mL 분열 솔루션 SV의 측면. SV의 뚜껑 닫고 흔들어 4 h 300 진동/분.</li>
		<li>무게는 빈 50 mL 원심 분리기 튜브 밖으로. 질량을 기록 합니다.</li>
		<li>4 h 후 SV에서 쪼개진된 펩 티 드 솔루션 50 mL 원심 분리기 관으로 배출. SV를 나머지 분열 솔루션으로 여러 번 헹 구 십시오.</li>
		<li>증발 질소로 쪼개진된 펩 티 드 솔루션 4 mL 미만 원심 분리기 튜브에 남아 있을 때까지.</li>
		<li>펩 티 드 죽 습 솔루션에 얼음 처럼 차가운 에테르의 36 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>소용돌이 그것까지 솔루션은 완전히 흰색 또는 노란색. 4 ° C에서 5 분 동안 3000 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한 가만히 따르다.</li>
		<li>튜브를 얼음 처럼 차가운 에테르 40 mL를 추가 합니다. 소용돌이 다시 sonicate. 원심 분리 과정을 반복 합니다. 상쾌한을 가만히 따르다.</li>
		<li>건조 질소 가스 정화 에테르 가시 증발 때까지 함께 원유 PA 펠 릿.</li>
		<li>두 배 증류수 20 mL를 추가 물, 소용돌이, 그리고 펩 티 드 솔루션에 완전히 용 해 될 때까지 sonicate.</li>
		<li>솔루션을 동결 하 고 건조까지 lyophilize.</li>
		<li>펩 티 드 건조 되 면 원유 펩 티 드를 포함 하는 원심 분리기 튜브의 질량을 무게. 5 mg/mL 물에 원유 펩 티 드를 분해.</li>
		<li>25 밀리 그램 5 mg/mL의 총 농도 만들기 위해 이중 증 류 물 5 mL에에서 원유 MCP-1 펩타이드의 분해. 0.1%와 0.1 %TFA 물 (용 매 A)를 사용 하 여 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 원유 MCP-1 펩타이드 정화 TFA C8 역 상 열에 모바일 단계에로 (용 매 B) 이기에. 여 HPLC로 펩 티 드의 5 mL를 주사. 참고: 초기 모바일 단계 이루어져 100% 용 매 9.0 mL/분의 유량에서 용 매 A 27 분에 30%를 천천히 감소 하 고 3 분 반환 100% 용 매 그라데이션에 대 한이 구성에는 3 분 고 1 분에 게이 구성에 보류 34 분의 총 실행 시간 유지 열 온도 55 ° c. 긍정적인 이온 소스 모드를 사용 하 여 분석에 대 한. 개미의 산 성 TFA HPLC 열에 대 한 너무 산 성 경우 TFA, 대신 사용할 수 있습니다. 유기 용 매 조성 램프 속도 더 나은 분리를 위한 2%/min를 초과 하지 않아야 합니다 것이 좋습니다.</li>
		<li>각 분수 2,890에서 예상된 제품 m/z에 대 한 매트릭스 보조 레이저 탈 착 또는 이온화 (MALDI) 질량 분석을 사용 하 여 분석 합니다. 참고: 매트릭스 솔루션으로 이기/물 (50: 50 vol %)에 1 mg/mL에서 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산을 분해. MALDI 격판덮개, 각 분수의 0.75 µ L 뒤에 매트릭스 솔루션의 0.75 µ L 자리. 500-5000 다의 질량 범위에서 긍정적인 반사 이온 모드를 사용 하 여 분석을 실시 합니다.</li>
		<li>결합 제품 분수, 이기, 버릴, 동결 및 건조까지 순화 된 펩 티 드를 lyophilize.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MCP-1 PA의 준비
	<ol>
<li>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-말뚝 (2000)-maleimide 별도 섬광 튜브에 펩 티 드를 1.1 어 금 니 과잉을 준비 합니다. 확인을 두 번 증 류 물에 두 화합물을 분해 ~ 15 mg/mL. 15 분 또는 때까지 두 솔루션은 완전히 분명 sonicate. 참고: DSPE 말뚝 (2000)-Cy5 솔루션의 pH 8.5로 조정 된다 DSPE-말뚝 (2000)-아민 및 N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스테 르 기능성된 Cy5 단계 1.2.3을 제외 하면 동일한 프로토콜을 사용 하 여 합성 됩니다.</li>
		<li>펩 티 드 솔루션 DSPE 말뚝 (2000)-maleimide 솔루션을 추가 합니다. 소용돌이 sonicate.</li>
		<li>1 추가 M NaOH dropwise (1 µ L) 솔루션의 pH가 7까지 한 번에.</li>
		<li>5 분을 위한 질소 제거 솔루션 솔루션 밤새 저 어.</li>
		<li>솔루션을 동결 하 고 건조까지 lyophilize.</li>
		<li>원유 제품 건조 되 면 5 mg/mL 물에 고체를 용 해.</li>
		<li>위에서 설명한 대로 HPLC와 정화. 참고: 결합형된 펩 티 드 및 DSPE-PEG(2000) 해야 elute 사이 15-30% 유기 농도 (vol %), DSPE-나무 못 동안 (2000)-MCP-1 켤레는 40-50% 유기 농도 사이 elute 한다.</li>
		<li>대 한 해당 m/z. DSPE 말뚝 (2000)-MCP-1 5,760 광범위 한 m/z 피크 있어야 MALDI 질량 분석을 사용 하 여 각 분수를 분석 합니다. 참고: 2, 5-dihydroxybenzoic 산은 가장 사용 매트릭스로 DSPE 말뚝 (2000)-MCP-1 MALDI와.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MCP-1 PAMs의 조립
	<ol>
<li>1.75 mg 분해 1 드람 유리병에서 3 mL 메탄올을 가진 MCP-1 파. MCP-1 PA 완전히 해산 때까지 sonicate. 참고: Cy5 amphiphiles 이미징 응용 프로그램에 대 한 10:90 MCP-1 PA의 어 금 니 비율에서 통합 될 수 있다.</li>
		<li>균일 한 필름 유리병의 바닥에 형성 될 때까지 유리병의 측면에서 나머지 메탄올을 rinsing 동안 원형 운동에 있는 질소에서 메탄올을 증발. 진공 건조 하룻밤 영화입니다.</li>
		<li>물 또는 인산 염 버퍼의 3 mL와 함께 영화 화 염의 MCP-1 PAMs 100 µ M 솔루션 (PBS). 부드럽게 소용돌이 클리어까지 솔루션을 sonicate. 30 분 동안 80 ° C에 품 어. 참고: 온도 상승된 자기 집합 프로세스를 가속 화 하기 위해 표시 되었습니다 및 임계 micelle 농도 (CMC)42,43를 줄이면서 가장 안정 된 이차 구조를 형성 하는 펩 티 드 구성 요소 수 있습니다.</li>
		<li>차가운 실내 온도에 결과 분산.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. MCP-1 PAMs의 특성
<ol><li>
동적 산란 (DL) 및 잠재적인 제타
	<ol>
<li>MCP-1 팸 또는 DL 또는 제타 잠재적인 악기의 지시에 따라 멧에 스크램블된 팸의 장소 100 µ M. 참고: DLS 및 제타 잠재적인 큐 벳 다 수 있습니다 악기의 지침에 따라.</li>
		<li>실내 온도에 악기 equilibrate 크기와 표면 충전 PAM의 측정.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전송 전자 현미경 (TEM)
	<ol>
<li>7 µ L 추가 50 µ M의 MCP-1 팸 또는 TEM grid에 스크램블된 팸 중지 5 분 윅 거리에 대 한 자체 닫는 트위터 내에서 섬세 한 작업 지우기와 방울.</li>
		<li>그리드를 씻어 물 7 µ L를 추가 합니다. 거리는 물방울 심지.</li>
		<li>드롭릿에 1 wt %phosphotungstic 산 2 분 윅 거리의 7 µ L를 추가 합니다. 2.2.2 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>TEM 분석에 앞서 가장 그리드를 건조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
원형이 색 성 (CD) 분광학
	<ol>
<li>악기의 사용 하기 전에 5-10 분 동안 질소에 설정.</li>
		<li>멧에 빈 물 (PBS)의 300 µ L를 배치 합니다.</li>
		<li>190-265 nm, 0.2 m m 경로 길이 1 s 통합 시간 및 실 온에서 1 nm 대역폭 스펙트럼을 측정 합니다. 3 복제를 수집 합니다.</li>
		<li>측정 100 µ M MCP-1 펩 티 드, MCP-1 팸, 펩 티 드, 발진 하 고 팸 2.3.3 단계에서 설명한 동일한 조건 하에서 발진. 빈에서 뺍니다.</li>
		<li>Polylysine로 스펙트럼의 선형 보간을 사용 하 여 데이터에 맞게.</li>
		<li>악기를 해제 합니다. 질소를 끄기 전에 10 분을 기다립니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. MCP-1 PAMs의 분석 생체 외에서
<ol><li>
생체 적합성 생체 외에서
	<ol>
<li>문화 및 Dulbecco의 수정이 글 중간 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 보충에 WEHI 274.1 murine monocytes 확장 1% 페니실린-스, 그리고 0.05 m m 2-mercaptoethanol 37 ° c 미만 5% CO2 통로 5. 참고: WEHI 274.1 정지 세포 이다입니다. 경작 때 미디어에 2-3 일 마다이 보충 한다.</li>
		<li>살 균 50 mL 원심 분리기 관으로 미디어에 피펫으로 monocytes. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기</li>
		<li>오래 된 미디어를 발음 하 고 10 mL 신선한 매체에서 원심 분리기 튜브에 resuspend. 세포 미디어에 고르게 배포 됩니다 때까지 천천히 섞는다. Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer를를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>되도록 잘 당 미디어의 90 µ L 당 4000 monocytes 셀을 희석. 96 잘 접시의 우물에 셀의 90 µ L를 추가 합니다. 24 h에 대 한 품 어. 참고: 증발에 차이 접시에 열 변화를 피하기 위해 접시의 외부 가장자리에 우물을 사용 하지 마십시오. 100 µ L PBS로 외부 우물을 채우십시오.</li>
		<li>MCP-1 펩 티 드, MCP-1 팸, 스크램블된 펩타이드, 또는 별도, 멸 균 microcentrifuge 튜브에서 150 µ L PBS에 뒤섞여 팸의 0.15 µmol 분해. 1, 10, 및 각 샘플의 100 µ M의 65 µ L을 직렬 희석을 수행 합니다.</li>
		<li>각 농도의 10 µ L PBS WEHI 274.1 포함 된 우물에 추가 (전체 용량: 잘, 6 라인, 총 96 웰 스 당 100 µ L). 72 h에 품 어.</li>
		<li>추가 10 µ L (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS)에 각 잘. 1 시간에 품 어.</li>
		<li>490에서 플레이트 리더를 사용 하 여 흡 광도 분석 nm 또는 제조업체의 지침에 따라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
생체 외에서 micelle 바인딩
	<ol>
<li>씨앗 500000 monocytes에 100 µ M Cy5 표시 된 MCP-1 팸 (DSPE-말뚝 (2000)-Cy5 및 MCP-1 PA의 10:90 어 금 니 비율)를 포함 하는 미디어의 2 ml에서 6 잘 플레이트의 각 잘. 1 시간에 품 어.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리에 의해 WEHI 274.1 수집 미디어 발음</li>
		<li>Resuspend 고 2 mL PBS에에서 세포를 씻어. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 원심 분리기 PBS 발음 2 mL PBS로 세척 프로세스를 반복 합니다. PBS 발음</li>
		<li>세포를 해결 하기 위해 찬 4 %paraformaldehyde 2 개 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
		<li>피펫으로 멸 균 유리 coverslip 6 잘 플레이트의 우물 내에 고정 된 세포. 5 분에 대 한 400 x g에서 원심.</li>
		<li>paraformaldehyde를 제거 합니다. 세척 하 고 2 mL PBS로 한 번 씻어. 1 mL PB와 함께 resuspend 참고: 때 rinsing는 coverslip에 셀을 방해 하지 마십시오.</li>
		<li>슬라이드에 PBS에 90% 글리세롤의 10 µ L를 넣어. 바늘과 트위터를 사용 하 여는 coverslip 데리 러. 건조는 coverslip의 가장자리. 부드럽게 장소 슬라이드에 coverslip 놓습니다.</li>
		<li>부드럽게 투명 매니큐어와 coverslip 가장자리 물개. 이미징에 대 한 준비까지 냉장고에 넣습니다.</li>
		<li>Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 레이저와 Cy5 λ여기 에 설치 된를 사용 하 여 = 650 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

MCP-1 PAMs 친수성 대상 펩 티 드와 소수 성 꼬리는 나노 입자의 자기 조립된 특성을 구성 된 유망 분자 이미징 플랫폼은. 이 monocyte 타겟팅 micelle 간단한 합성 및 (2000)-MCP-1 MCP-1 펩 티 드와 DSPE-못의 정화 단계에 의해 준비 될 수 있습니다. PAMs vivo에서 분자 이미징와 같은 대 한 많은 유익한 특성을가지고 그들의 본질적인 biodegradability, 온화한 조건과 다른 이미징 moieties의 설립을 허용 하는 구조 및 화학 다양성에서 자기 조립 또는 관심의 특정 사이트를 선택적으로 제공 하는 펩 티 드를 대상으로. 그들의 입자 크기, 모양, 및 구성 펩 티 드, 소수 성 꼬리, 또는 micelle 농도, 수 있도록 다양 한 응용 프로그램22,33에 대 한 최적의 화학 및 물리적 특성을 변경 하 여 조정 될 수 있습니다.
<p class="jo...

심혈 관 질환 약 17.3 백만 죽음 전세계1와 세계적으로 죽음의 주요한 원인에 남아 있다. 심혈 관계 질환 동맥 경화, 있는 패 동맥, 억제 함으로써 혈액에는 바디2,3의 셀에 산소 흐름을 구축 하는 조건에 의해 크게 기여 하고있다. 동맥 경화 증의 진행 한 염증 반응, 불규칙 한 지질 물질 대사, 및 패 형성, 플 라크 파열과 심근 경색4,5로 이어지는 두껍게 및 동맥의 경화를 포함 한다. 내 피 세포 cytokines와 접착 분자, MCP-1 C-C chemokine 수용 체 (CCR2) monocytes6,,78의 표면에서 발견을 포함 하는 표현. 산화 된 콜레스테롤 플 라크 형성, 지역에서 염증 반응을 증폭 하 고 조직 상해와 불안정 하거나 취약 한 패9, 의 형성의 초기 단계 동안 세포 monocytes 변환 10.
전통적으로, 동맥 경화는 혈관 또는 초음파11,12를 사용 하 여 해부학 적 영상에 의해 luminal 협 착 증을 평가 하 여 평가 됩니다. 그러나, 이러한 방법을 확인할 수 있습니다만 심각한 동맥 벽의 하지 동맥 경화 증의 초기 단계 축소로 초기 패 성장 하면 동맥 크기를 유지 하 여 혈액 흐름 속도12,13, 개장 하는 동맥 14. 따라서, 조 경화 유행 underrepresent. 또한, 비 침 투 적인 이미징 기법 등 단일 광자 방출 단층 촬영, 양전자 방출 단층 촬영 및 자기 공명 영상 최근 그들은 초기 세부 정보를 제공할 수 있는 플 라크 형태를 특성화 하는 데 사용 되었습니다 계산 및 플 라크 특성 그러나, 이러한 형식은 종종 감도, 해상도의 부족에 의해 제한 또는 이미징 패 진행15,16, 훨씬 더 도전 하는 여러 단계에서 만드는 이온화 방사선의 사용을 필요로 17. 특히 동맥 경화 증의 여러 단계에서 플 라크를 식별 것는 영상 전달 시스템 개발에 남아 있다.
나노 입자는 vivo에서 플 라크 타겟팅 및 진단18,19,,2021신흥 플랫폼으로 나타났습니다. 특히, PAMs는 유리한 그들의 화학 다양성 및 moieties, 구성, 크기, 모양 및 표면 기능화22의 다양 한 수용할 수 있습니다. 펩 티 드 amphiphiles (Pa)는 친수성, 펩 티 드 "headgroup"는 일반적으로 지질; 소수 성 꼬리에 연결 구성 이 amphiphilic 구조 자가 조립 기능을 수 여 하 고 입자22,,2324의 표면에 펩 티 드의 multivalent 표시에 대 한 수 있습니다. 펩 티 드 headgroups 폴딩 및 수소 펩 티 드25사이 결합을 통해 입자 모양에 영향을 수 있습니다. Β-시트 상호 작용을 통해 배 펩 티 드 α 나선형 확인 모두 구형 하 고 길쭉한 micelles22,,2324, 를 형성할 수 있다 동안 길쭉한 micelles을 형성 하기 위하여 보였다 25,,2627. 방패는 펩 티 드의 표면 충전 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 링커 친수성 펩 티 드와 조직의 순환28, 나노 입자의 가용성을 향상 PAMs의 소수 성 꼬리 사이 놓일 수 있다 29 , 30 , 31. PAMs는 또한 유리 때문에 생체 이며 다양 한 응용 프로그램32,33를가지고 표시 되었습니다. Micelles의 물 용 해도 물에 용 해 되지 않으며 주사34착에 정지 해야 하는 특정 고분자 나노 입자와 같은 나노 기반 시스템 다른 이점을 제공 합니다. 또한, 분해 PAMs 특정 자극에 대 한 응답에서을 제어 세포내 약물 전달35매력적인 후보를 PAMs를 만든다.
CCR2 수용 체에 바인딩 및 대동맥 아치에 축적, PAMs 이전 monocyte 모니터링9대동맥 동맥 경 화성 병 변의 다른 단계를 대상으로 개발 했다. ApoE-/- 생쥐에서 monocyte 누적 패 진행36비례적으로 증가합니다. 또한, 환자 파열 발생 하기 쉬운, 단계의 플 라크 monocytes37의 높은 금액을 포함 발견 했다. 따라서, MCP-1 통합 PAMs 수정은 큰 대상 특이성 및 초기-을 단계의 동맥 경 화성 병 변 사이 감 별 법에 대 한 허용 하기 때문에 유용 합니다. 이러한 개념 증명 연구 또한 PAMs 충분히 안전 하 게 pre-clinically 사용할 수 있으며38renally 삭제를 확인 합니다. Monocytes과 염증은 다른 질병에, MCP-1 PAMs는 롬8,,3940 넘어 다른 질병에서 치료 및 진단 응용 프로그램에 사용 될 가능성이 , 41.
여기, 우리는 입자의 최적의 크기, 표면, 그리고 선택적 monocytes 동맥 경화에서 향상 된 이미징 응용 프로그램을 대상으로 시연 하는 높은 확장성과 자기 조립 MCP-1 PAMs의 제조를 보고 합니다.

<table><tbody><tr><td>펩타이드 합성을 위한</td> <td>1,2-에탄디티올</td><td>VWR</td><td>E0032</td></tr><tr><td>10mL 일회용 혈청학 피펫</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>세포 배양을 위한</td></tr><tr><td>15mL 원심분리 튜브, 폴리프로필렌</td><td>VWR</td><td>89401-566</td><td>다양한 응용 분야용</td></tr><tr><td>2,5-디하이드록시벤조산, 99%</td> <td>MALDI</td><td></td><td></td></tr><tr>25mL용 Fisher Scientific AC165200050<td>일회용 </td><td>세포 배양을 위한</td>혈청학 피펫 <td>VWR</td><td>89130-900</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올, 50 mM</td> 세포 배양을 위한 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>31350010</td><td>세포 배양을 위한</td></tr> 5 <tr><td>mL 일회용 혈청학 피펫</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>세포 배양을 위한</td></tr><tr><td>50 mL 원심분리 튜브</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>다양한 응용 분야를 위한</td></tr><tr><td>75 cm2 배양 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>세포 배양을 위한 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>펩타이드 합성을 위한</td><td>75mL 반응 용기</td><td>Protein Technologies</td><td>3000005</td></tr><tr><td>96웰 세포 배양 플레이트</td>, <td>MTS 분석을 위한</td><td>VWR</td><td>40101-346</td></tr><tr><td>, 아세토니트릴, HPLC 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998SK-4</td>, <td>HPLC 정제를 위한</td></tr><tr><td>붕규산 유리, PAM</td><td>합성을 위한</td> 1 드램 <td>VWR</td><td>66011-041</td></tr><tr><td>Borosillicate 유리 피펫, 다양한</td><td>응용 분야를위한</td>긴 팁 <td>VWR</td><td>14673-043</td></tr><tr><td>Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mm</td><td>컨 포칼 현미경 검사 용</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td></tr><tr><td>펩타이드 접합</td><td>용 Abcam</td><td>ab146463</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether, ACS 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>E138-1</td><td>펩타이드 침전</td></tr> 용 일회용 <tr><td> 주사기, 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td>HPLC 정제용</td></tr><tr><td>이중 뉴바우어 규칙 혈구계</td><td>VWR</td><td>63510-13</td><td>세포 계수용</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) 아</td><td>민 Avanti</td><td>880128P</td><td>펩타이드 접합</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000) 말레이미드</td><td>Avanti</td><td>880126P</td><td>펩타이드 접합</td></tr><tr><td>DSPE-PEG(2000)-NHS 에스테르용&nbsp;</td>Cy5 Dulbecco의 변형 독수리 매체 - 고 포도당<td>에 대한 접합</td>을위한 <td>Nanocs</td><td>PG2-DSNS-10K</td></tr><tr><td></td><td>세포 배양</td>용 <td>Sigma Aldrich</td><td>D5796-500ML</td></tr><tr><td>태아 소 혈청, 적격, 열 비활성화</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10438026</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Ala-OH / HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-A</td><td>펩타이드 합성</td></tr><tr><td>펩타이드 합성을 위한 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-RBF</td><td>펩</td></tr><tr><td>타이드 합성을 위한</td><td>Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-NT</td> 펩타이</tr>드 <tr>합성을 위한<td>Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-CT</td><td>펩타이드 합성을</td></tr><tr><td>위한</td> <td>Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-QT</td></tr><tr><td>펩타이드 합성을 위한</td> <td>Fmoc-L-Ile-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-I</td> 펩타이드 합성을 위한</tr><tr><td>Fmoc-L-Leu-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-L</td><td>펩타이드 합성을 위한</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-KBC</td><td>펩타이드 합성을 위한</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-F</td><td></td></tr><tr><td>펩타이드 합성을 위한</td> <td>Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-SB</td> 펩타이</tr>드 <tr><td>합성을 위한</td><td>Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-TB</td> 펩타이</tr>드 <tr>합성을 위한<td>Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-YB</td><td>펩타이드 합성</td></tr><tr><td>을 위한</td> <td>Fmoc-L-Val-OH /HBTU</td><td>Protein Technologies</td><td>PS3-H5-V</td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-wang 수지,</td><td>펩타이드 합성을 위한</td>100-200 메쉬 <td>Novabiochem</td><td></td></tr><tr><td>856013 포름산, HPLC 정제를 위한 optima LC/MS 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 검사용</td><td>글리세롤</td><td>VWR</td><td>M152-1L</td></tr><tr>세포 <td>계수용</td><td>핸드 탈리 카운터</td><td>Fisher Scientific</td><td>S90189</td></tr><tr><td>자기 교반 막대, 펩</td><td></td><td></td><td>타이드 접합</td></tr><tr><td>메탄올, ACS 인증</td><td>PAM 합성을 위한</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td></tr><tr><td>MTS 세포 증식 비색 분석 키트</td><td>VWR</td><td>10191-104</td><td>MTS 분석</td></tr><tr><td>N,N-디메틸포름아미드, 펩</td><td>타이드 합성 N-Methylmorpholine을 위한</td>염기서열 분석 등급 <td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td></tr><tr><td></td><td>Protein Technologies</td><td>S-1L-NMM</td><td>펩타이드</td></tr><tr><td>합성용 파라포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC416780250</td><td>세포 고정용</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>다양한 응용 프로그램에 사용</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신, 10,000 U/mL</td> 세포 <td>배양을 위한</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td></tr><tr><td>, 25 mL & 주의;</td><td>펩타이드 합성을 위한</td> <td>Fisher Scientific</td><td>CG186011</td></tr><tr><td>포스포텅스텐 산&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A248-25</td><td>TEM</td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Spectrum</td><td>P1146-2.5LTGL</td><td>펩타이드 합성용</td></tr><tr><td>평면 유리 현미경 슬라이드 75 x 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>컨포칼 현미경 검사용</td></tr><tr><td>시약 저장고, 멸균&nbsp;</td><td>세포 배양을 위한</td> <td>VWR</td><td>95128093</td></tr><tr><td>자체 폐쇄 핀셋</td><td>TedPella</td><td>515</td><td>TEM</td></tr><tr><td>지원 필름</td><td>TedPella</td><td>01814F</td><td>TEM</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid&nbsp;</td><td>펩타이드 절단 및 HPLC 정제를 위한</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP618-500</td></tr><tr><td>트리이소프로필실란</td><td>VWR</td><td>TCT1533-5ml</td><td>펩타이드 절단용</td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션, 0.4%</td>세포 <td>계수를 위한</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td></tr><tr>, <td>컨포칼 현미경 검사용</td><td>범용 톱니 모양</td><td>VWR</td><td>231-SA-SE</td></tr><tr><td>WEHI-274.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; CRL-1679</td><td>쥐 단핵구</td></tr><tr><td>자동화 벤치탑 펩타이드 합성기</td><td>Protein Technologies</td><td></td><td>PS3 벤치탑 펩타이드 합성제</td></tr><tr><td>&알파;- 시아노-4- 하이드록시신남산, 99%</td><td>MALDI용</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>476870-2G</td></tr></tbody></table>

동맥 경화 증의 영상에 대 한 펩 티 드 amphiphile micelles monocyte 타겟팅의 합성

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

동맥 경화는 매년 17.3 백만 생활을 요구 하는 심혈 관 질환, 세계, 죽음의 주요 원인에 큰 기여. 동맥 경화는 급 사, 심근 경색, 불안정 플 라크 파열 및 경고 없이 혈관을 가리고 하는 사주의 주요 원인 이기도 합니다. 현재 modalities 이미징 안정과 불안정 플 라크 파열을 구별할 수 없습니다. 펩 티 드 amphiphiles micelles (PAMs)로 다양 한 병에 걸린 조직을 구체적으로 바인딩할 moieties를 대상으로 수정할 수 있습니다이 결점을 극복할 수 있다. Monocytes는 monocytes의 큰 축적은 플 라크 파열 경향이 연관 동맥 경화 증의 조기 표식 되도록 표시 되었습니다. 따라서, monocytes 대상 나노 차별 동맥 경화의 다른 단계를 사용할 수 있습니다. 이 위해, 여기, 우리 PAMs monocyte 타겟팅의 준비에 대 한 프로토콜 설명 (monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs 15의 형태로 나노 입자에 온화한 조건에서 합성을 통해 조립 자체는 중립 표면 충전 근처와 직경에서 nm. 생체 외에서 PAMs 생체 발견 했다 및 monocytes에 대 한 높은 바인딩 선호도 했다. 여기에 설명 된 방법을 다른 염증 성 질환 및 동맥 경화에 다양 한 응용 프로그램에 대 한 약속을 보여줍니다.

MCP-1 팸의 준비 MCP-1 단백질 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] 또는 스크램블된 펩 티 드 [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] CCR2-바인딩 모티브 (잔류물 13-35) N-말단에 시스테인 잔류물을 추가 하 여 수정 되었습니다. MCP-1 펩타이드 자동된 펩타이드 합성기를 사용 하 여 Fmoc 중재 고체 단계 방법에 의해 합성 되었다. 원유 펩 티 드 역 상 HPLC 0.1%를 사용 하 여 50 ° C에서 c 8 열에 의해 순화 되었다 이기/물 혼합물에 있는 TFA MALDI 질량 분석 (그림 1)에 의해 특징. 시스테인-포함 펩 티 드 DSPE-PEG2000-maleimide thioether 연결을 통해 DSPE 말뚝 (2000)-펩타이드 어원이 같은 말을에 활용 했다. 후 실 온에서 24 h, 원유 제품 (그...

이 종이 합성 및 펩 티 드 amphiphile micelles monocyte 대상의 특성을 포함 하는 메서드를 제공 하 고 해당 생체 적합성 및 monocytes에 바인딩할는 micelle의 능력에 대 한 테스트 분석 실험.

동맥 경화 증의 영상에 대 한 펩 티 드 Amphiphile Micelles Monocyte 타겟팅의 합성

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 죽상동맥경화증 이미징을 위해 단핵구 표적 펩타이드 양친매성 미셀을 합성하는 것입니다. 이 방법은 죽상경화성 플라크의 진단 영상에 대한 심혈관 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 펩타이드 양친매성 미셀과 MCP-1의 통합으로 초기 및 후기 단계의 죽상경화성 병변 사이의 표적 특이성과 차별화를 높일 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 죽상동맥경화증의 여러 단계에서 플라크를 진단하는 데까지 확장되는데, 파열되기 쉬운 말기 플라크가 있는 환자는 더 많은 수의 단핵구를 함유하고 있기 때문입니다. 이 방법은 죽상동맥경화증에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 암과 같은 다른 질병에도 적용할 수 있습니다. 저와 함께 절차를 시연할 사람은 우리 연구실의 대학원생인 Jonathan Wang입니다.반응 용기에서 0.25 밀리몰의 fmach-L-lysine-bach-wong-resin의 무게를 측정하는 것으로 시작합니다. 용기를 화학 흄 후드로 옮기고 용기 측면을 5ml의 디메틸포라미드로 헹굽니다. C-to-N 말단에서 반응 용기와 사전 포장된 아미노산 바이알을 자동 벤치탑 펩타이드 합성기에 로드하며, 최종 탈보호 설정을 위해 끝에 빈 바이알이 있습니다.합성을 실행한 후 반응 용기의 펩타이드와 수지를 모든 수지가 전달될 때까지 2-3밀리리터의 메탄올이 들어 있는 섬광 바이알로 옮깁니다. 레진이 바이알 바닥으로 가라앉으면 슈퍼난을 제거하고 레진을 자연 건조시킨 다음 실온에서 최소 2시간 동안 진공 건조합니다. 바이알이 완전히 건조되면 클램프를 사용하여 합성 용기의 아래쪽 절반을 암 셰이커에 고정하고 섬광 바이알에 2ml의 절단 용액을 추가합니다.전체 부피의 펩타이드 수지를 합성 용기로 옮기고 3밀리터의 새로운 절단 용액으로 용기의 측면을 세척합니다. 그런 다음 뚜껑을 씌운 용기를 분당 300회 진동으로 4시간 동안 흔듭니다. 진탕 배양이 끝나면 절단된 펩타이드 용액을 균형 잡힌 50ml 원뿔형 튜브로 배출하고 남은 절단 용액으로 합성 용기를 여러 번 헹굽니다.원심분리 튜브에 용액이 4ml 미만으로 남을 때까지 절단된 펩타이드 용액을 질소로 증발시키고 펩타이드 절단 용액에 36ml의 얼음처럼 차가운 에테르를 추가합니다. Vortex는 결과 솔루션입니다. 현탁액이 완전히 흰색 또는 황색으로 변하면 원심분리로 펩티드를 펠릿화합니다.펩타이드를 40ml의 얼음처럼 차가운 에테르와 와류에 재현탁시키고 펩타이드를 다시 초음파 처리합니다. 두 번째 원심분리 및 상등액 디캔팅 후 미처리 펩타이드 양친매성 펠릿을 질소 가스 퍼징으로 건조시킵니다. 에테르가 눈에 띄게 증발하면 20ml의 이중 증류수를 튜브에 넣고 펩타이드가 용액에 완전히 용해될 때까지 튜브를 소용돌이치게 하고 초음파 처리합니다.용액을 얼리고 마를 때까지 생명을 불어넣습니다. 그런 다음 튜브의 무게를 다시 측정하고 미처리 펩타이드를 물 1밀리리터당 5밀리그램에 녹입니다. 다음으로, 전체 부피의 미처리 MCP-1 펩타이드를 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC 기기에 주입합니다.매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분광법을 사용하여 2, 890에서 예상 제품 질량 전하에 대해 각 분획을 분석합니다. 그런 다음 곱 분획을 결합합니다. 아세토니트릴을 불어내고 정제된 펩타이드를 건조될 때까지 동결하고 생명을 불어넣습니다.MCP-1 펩타이드 양친매성 또는 PA를 준비하려면 먼저 생명화된 펩타이드를 물 1밀리리터당 15밀리그램에 용해시키고 펩타이드 용액을 DSPE PEG 2000 밀리마이드 용액 밀리리터당 15밀리그램과 결합합니다. 용액의 pH가 7이 될 때까지 수산화나트륨 1몰을 적가합니다. 그런 다음 5분 동안 질소를 퍼지한 다음 밤새 저어줍니다.다음날 아침, 용액을 얼리고 생명을 불어넣습니다. 조잡한 제품이 건조할 때, milliliter 물 당 5 밀리그램에 있는 고체를 녹이고 다만 설명되는 것과 같이 HPLC에 의하여 펩티드를 순화하십시오. PA 멤브레인을 조립하려면 1.75mg의 MCP-1 PA를 1 드램 바이알에 3 밀리리터의 메탄올에 용해시키고 MCP-1 PA가 완전히 용해 될 때까지 초음파 처리합니다.질소 하에서 메탄올을 증발시키면서 바이알을 원을 그리며 움직이고 바닥에 균일한 막이 형성될 때까지 바이알 측면에서 남은 메탄올을 헹굽니다. 필름을 밤새 진공 건조하십시오. 다음 날 아침, 3ml의 물로 필름을 수화시켜 100마이크로몰 MCP-1 PAM 용액을 만들고 용액이 투명해질 때까지 용액을 부드럽게 와류와 초음파 처리합니다.용액을 섭씨 80도에서 30분 동안 배양한 다음 생성된 분산액을 냉각시킵니다. 이하의 대표적인 실험에서는 아세토니트릴 물 혼합물에 0.1%트리플루오로아세트산을 사용하여 섭씨 50도의 CA 컬럼에서 역상 HPLC로 MCP-1 및 스크램블 펩타이드를 정제하였다. 그리고 방금 시연된 바와 같이 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량 분석법을 특징으로 합니다.desisting 함유 펩타이드를 DSPE PEG 2000 밀리아미드에 접합하여 티오에테르 결합을 통해 DSPE PEG 2000 펩타이드 접합체를 수득하고 C4 컬럼을 사용하여 HPLC로 정제했습니다. PAM을 표적으로 하는 단핵구의 동적 광 산란 분석 및 투과 전자 현미경 이미징은 약간 양의 제타 전위를 가진 잘 분산된 구형 나노 입자를 보여주었습니다. 원형 이분법 분광 분석은 미셀 내에 MCP-1 펩타이드가 통합되어 2차 구조를 향상시키는 것을 확인했습니다.최대 100마이크로몰 농도의 MCP-1 펩타이드, MCP-1 PAM, 스크램블 펩타이드 및 스크램블 PAM을 72시간 동안 배양한 아말스 단핵구는 펩타이드의 생존력과 생체 적합성을 입증했습니다. 그런 다음 스크램블 PAM과 비교하여 MCP-1 PAM에 대한 단핵구의 특이적 결합을 컨포칼 현미경으로 확립합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 MCP-1 펩타이드의 합성 및 정제와 MCP-1 펩타이드 양친매성 및 미셀 어셈블리의 준비를 통해 펩타이드 양친매성 미셀을 표적으로 하는 단핵구를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.화학 시약으로 작업하는 것은 매우 위험 할 수 있으며 MSDS를 읽고 화학 흄 후드 내부에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

쥐 전립선 암 모델에서 종양 침윤에 응고 된 혈장 단백질에 특정한 MRI 조영제를 대상으로 작은 펩티드와 암 MR 분자 이미징을 입증.

작은 분자 CLT1 펩타이드 표적 조영제와 전립선 암의 MR 분자 영상

polymalic 산계 나노 약물의 예는 암에 적용 가능하다 맞춤 의학의 합리적인 디자인으로 제시된다. 그것은 누드 마우스에 HER2가 긍정적 인간 유방암을 치료하는 나노 약물의 합성을 설명한다.

여러 종양 마커의 대상으로하기위한 Polymalic 산 기반의 나노 생물 고분자 물질 : 개인화 된 약을위한 기회?

우리는 암의 광음향 이미징을 위해 금 나노막대를 포함하는 세포 운반체의 준비 및 타당성을 보여줍니다.

금 나노 막대를 포함하는 세포 차량의 제조 및 광 음향 분석

마이크로 웨이브 기술은 동맥 경화 플라크 특성에 대한 산화철 나노 입자의 매우 빠른 합성을 할 수 있습니다. 나노 입자의 외부면에 aminobisphosphonate의 사용은 죽상 영역에서 고속 퇴적을 제공한다.

동맥 경화의 빠른 검색을위한 산화철 나노 입자의 전자 레인지 중심의 합성

특이성이 높고 부작용이 적은 암 약물을 종양 부위에 전달하려면 나노 입자를 기반으로 하는 새로운 방법이 필요합니다. 여기에서는 과산화수소 매개 산화에 의해 쉽게 준비될 수 있고 종양이 감소하는 환경에서 효율적으로 해리되어 페이로드를 방출할 수 있는 이황화 가교 미셀에 대해 설명합니다.

가역 디설파이드 가교 미셀 제조를위한 손쉬운 효율적인 접근법

바이러스 성 파생 된 펩 티 드 항 체 어원이 같은 말 (ACs)에 결합 된 증가 된 종양 세포 축적과 분자 페이로드를 제공의 가능성으로 인해 기세를 얻고입니다. 펩 티 드 활용, AC 및 페이로드 세포내 축적, 및 종양을 대상으로 평가 하는 일반적인 방법을 활용 하 고,이 프로토콜 연구원 주요 초기 개발 단계에서 도움이 됩니다.

세포 축적을 증가 하 고 종양을 대상으로 개선에 대 한 바이러스 성 파생 된 펩 티 드 항 체 어원이 같은 말의 초기 평가 수정

Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.

Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

우리 인간의 내 피 monolayers에 걸쳐 monocytes에 의해 환생 및 거품 세포로 그들의 후속 성숙 측정 프로토콜을 설명 합니다. 이 혈액이 경향이 향상 시킬 수 있는 요인을 평가 하 고 다른 질병 조건 가진 사람에서 격리 하는 monocytes의 atherogenic 속성을 평가 하기 위해 다양 한 메서드를 제공 합니다.

Monocyte 환생 및 개인 만성 염증 성 조건에서 거품 세포 형성의 정량화

여기에서 우리는 마우스 모형에 있는 혈액 단핵구의 화학전술 활동을 정량화하고, 혈액 단핵구에 영양, 약리학 및 유전 내정간섭의 효력을 평가하고 혈액 단핵구 파생된 대식세포특성화하기 위하여 프로토콜을 제시합니다 단핵구 화학 유도제 단백질-1 (MCP-1)을 사용하여 마우스 모델 - 로드 지하 막 유래 젤 플러그.

생체 내에서 단핵구 화학 적 활동의 정량화 및 혈액 단핵구 유래 대식세포의 특성화

여기서 우리는 자기 조립 3 차원 비계 문화에 인간 신경 전구 세포의 사용을 설명합니다. 우리는 유동세포계측법에 의해 연속적 예 분석하는 공사장 공중 발판에서 세포를 릴리스하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 상세한 mechanistically 연구를 수행하는 다른 세포 유형에 맞게 수 있습니다.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

학습하세요 단핵구 표적 펩타이드 양친매성 미셀 합성법으로 동맥경화증 영상화를 개선하는 방법을. 조기와 말기 병소를 구분하여 진단 정확도를 높입니다.

동맥 경화 증의 영상에 대 한 펩 티 드 Amphiphile Micelles Monocyte 타겟팅의 합성

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