게놈 넓은 식별 및 소문의 ATL E3 유비퀴틴 리가 유전자 가족의 식 메타 분석을 위한 포괄적인 워크플로

이 절차의 전반적인 목표는 유전자 구조, 관련 단백질 모티프, 염색체 위치, 유전자 복제 및 발현 패턴의 정의를 포함하는 글로벌 접근 방식으로 식물의 유전자 군에 대한 철저한 특성화를 달성하는 것입니다. 이 방법은 유전자 발현 분석을 통해 가족 구성원의 세계 게놈 식별 및 전사체절개와 같은 과의 식물 분류에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 전체 절차의 주요 장점은 완전한 유전자군 특성화를 달성하기 위한 실험 단계의 철저한 목록을 제공한다는 것입니다.

이 절차는 유전 데이터를 사용할 수 있는 모든 식물 종의 모든 유전자군에 적용할 수 있습니다. 또한 이 접근 방식은 기능 연구를 위한 흥미로운 후보를 식별하는 데 유용한 정보를 제공합니다. 전체 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 Pietro Ariani가 맡을 것입니다.

Blast 웹 페이지를 열고 단백질 블라스트 섹션을 클릭합니다. enter query sequence(쿼리 시퀀스 입력) 필드에 다른 패밀리 구성원을 식별하기 위한 프로브로 사용될 단백질의 아미노산 서열을 입력합니다. 가족을 특징짓는 모든 중요한 기능을 가진 단백질을 사용하십시오.

다음으로, 필드에서 search set(검색 세트)를 선택하고 reference protein data base(참조 단백질 데이터베이스)와 관심 유기체를 선택합니다. 이제 필드 프로그램 선택에서 PSI-BLAST 알고리즘을 선택합니다. 원하는 경우 알고리즘 매개변수를 클릭하여 최대 표적 시퀀스 및 스코어링 매트릭스와 같은 고급 매개변수를 조정합니다.

E 값은 이 검색에 대해 005에서 001로 감소한 임계값입니다. BLAST 버튼을 클릭하여 해석을 실행합니다. 쿼리에 대한 상대적 일치를 표시하는 모든 시퀀스에서 분명히 패밀리에 속하지 않는 항목을 선택 취소합니다.

PSI-BLAST 선택 열의 체크 표시를 클릭하여 이 작업을 수행합니다. 그런 다음 이동 버튼을 클릭하여 두 번째 PSI-BLAST 반복을 실행합니다. 새로 식별된 모든 염기서열은 노란색으로 강조 표시됩니다.

다시 한 번 패밀리에 속하지 않는 히트를 선택 취소합니다. 알고리즘이 관련 항목을 찾지 못하거나 수렴에 도달할 때까지 이 프로세스를 계속합니다. 모든 거짓 양성이 제거되면 FASTA 형식의 파일에서 아미노산 염기서열을 수집하고 파일을 생물 정보학 소프트웨어 제품군에 업로드합니다.

그런 다음 목록에서 가져온 모든 시퀀스를 선택하고 도구 모음에서 정렬/어셈블 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 쌍별 다중 정렬을 클릭하고 MUSCLE 정렬 및 확인을 선택합니다. 이제 기본값을 사용하여 정렬이 수행됩니다. 이제 정렬의 염기서열 로고를 시각화하고 유전자를 육안으로 검사하여 거짓 양성을 검색합니다.

단백질의 물리적 매개 변수 및 도메인, 염색체 분포, 복제 및 엑손 인트론 조직에 대한 추가 분석은 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. 다음으로, 고품질 계통 발생 나무의 구성과 과 명명법의 정의를 통해 ATL 가족 구성원 간의 관계를 분석합니다. 먼저, 참조를 위해 UmoProt 데이터베이스에서 포도 덩굴 유전자 명명법에 대한 참조로 필요한 아랍인 채택 systeliana ATL 염기서열을 검색합니다.

그런 다음 계통발생학적 분석을 위해 포도 덩굴과 애기장대 유전자 패밀리의 모든 뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 FASTA 파일을 만듭니다. 이제 계통발생 프랑스 홈페이지를 탐색하고 계통발생 분석 파이프라인을 선택합니다. 대부분의 경우 한 번의 클릭이 적합하지만, 필요한 경우 고급 옵션을 사용하여 특정 고급 설정을 선택하거나 개별 옵션을 사용하여 완전히 사용자 정의된 분석을 선택할 수도 있습니다.

그런 다음 분석 이름을 입력하고 FASTA 파일을 업로드합니다. 그런 다음 제출을 클릭하여 분석을 실행합니다. 이 절차로 인해 오류 메시지가 발생하면 계통 발생 제품군 파이프라인의 각 단계를 개별적으로 완료합니다.

먼저 MUSCLE 소프트웨어 홈페이지로 이동하여 FASTA 파일을 업로드합니다. 출력 형식으로 Pearson FASTA를 선택하고 제출합니다. 그런 다음 파일을 FASTA 형식으로 다운로드하고 잘못 정렬된 위치를 제거합니다.

G-block 서버 도구를 열고, 정렬 FASTA 파일을 업로드하고, 염기서열 유형으로 DNA를 선택하고, 분석에 가장 적합한 엄격성을 선택합니다. 포도 덩굴 ATL 유전자군 정렬의 경우, 높은 염기서열 발산으로 인해 덜 엄격한 선택을 위해 제안된 세 가지 옵션을 모두 선택하십시오. 그런 다음 get blocks를 클릭하여 해석을 실행합니다.

결과를 저장하려면 출력 페이지 하단의 결과 정렬을 클릭하고 새 FASTA 파일을 만듭니다. G 구획은 계통발생학 분석을 위해 더 적당하게 된다 그래야 DNA의 발산하는 지구에 있는 불량한 정렬된 위치를 삭제한다. 이 단계에서는 열 엄격성에 대한 임페리클 매개 변수를 선택하는 것이 세 가지 책임인지 확인하는 데 중요합니다.

트리를 완성하기 위해 Phylogeny France 홈페이지로 이동합니다. 거기에서 단품 파이프라인을 선택하고 다중 정렬 및 정렬 큐레이션 옵션을 선택 취소합니다. 그런 다음 워크플로우 생성을 클릭하고, G-blocks 선별된 FASTA 파일을 업로드하고, 부트스트래핑 절차를 선택하고, 기본 매개변수 및 설정을 사용합니다.

마지막으로 제출을 클릭하여 분석을 실행합니다. 이것으로 단계별 프로세스가 완료됩니다. 이제 계통 발생 트리가 만들어졌으므로 부트스트랩 값이 70% 미만인 지원이 부족한 분기를 축소한 다음 추가 분석을 위해 최종 결과를 Newick 형식으로 다운로드합니다.

텍스트 프로토콜은 계통발생에 따라 유전자 이름을 할당하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜의 경우, 유전자 발현 라이브러리에서 가져온 arma-normalized 발현 값의 탭되고 선형화된 텍스트 형식 파일을 만듭니다. 각 패밀리 유전자에 대한 값을 동일한 패턴 행 아래에 구성합니다.

다음으로, 다중 실험 뷰어 소프트웨어를 사용하여 계층적 이중 클러스터 분석을 수행합니다. 먼저 작업 데이터 매트릭스를 업로드하고 텍스트 파일을 선택합니다. 단색 배열을 선택하고 자동 주석이 제공되지 않은 경우 로드 주석에서 눈금을 제거합니다.

표현식 테이블 미리보기의 가장 왼쪽 위에 있는 표현식 값을 선택하고 로드 버튼을 클릭합니다. 다음으로, Log2 변환 및 유전자/행 정규화를 적용하여 데이터를 조정합니다. 그런 다음 적절한 배율 제한을 설정합니다.

이제 계층적 클러스터링을 계산합니다. ordering optimization(순서 최적화) 필드에서 optimize gene leaf order(유전자 잎 순서 최적화) 및 optimize sample leaf order(샘플 잎 순서 최적화)를 선택합니다. 다음으로, 연결 방법 선택 필드에서 평균 연결 클러스터링을 선택하고 거리 행렬 선택 필드에서 Pearson 상관 관계를 선택합니다.

그런 다음 확인을 클릭하여 해석을 실행합니다. 창의 왼쪽 패널에서 결과를 보고 파일 메뉴에서 이미지 저장을 클릭하여 히트 맵을 내보냅니다. BLAST-P 검색에 따르면 애기장대(arabidopsis thaliana) ATL2와 가장 유사한 유전자는 포도 덩굴 게놈의 ATL 패밀리 구성원을 조사하는 데 사용되었습니다.

PSI BLAST 분석은 몇 번의 주기 후에 수렴되어 유전자군의 추정 유전자 목록을 제공했습니다. 각 후보에 대한 표준 고리 H2 도메인의 존재는 MUSCLE 정렬의 육안 검사에 의해 평가되었습니다. 이로 인해 96개의 포도 덩굴 유전자로 검색 범위가 좁혀졌습니다.

식별된 유전자의 계통발생학적 분석을 애기장대 ATL 유전자군과 비교하여 명명법을 위해 사용하였다.96개의 포도 덩굴 ATL 중 13개는 애기장대 ATL 유전자 ortholog로 특정 식별자를 받았습니다. 계층적 이중 클러스터 분석을 사용하여 식별된 유전자를 포도 덩굴 글로벌 유전자 발현 아틀라스에 매핑하면 96개 유전자가 모두 하나 이상의 조직에서 발현되고 5개의 발현 클러스터를 식별할 수 있음을 보여주었습니다.

생물 스트레스에 대한 반응으로 이러한 유전자의 발현을 연구하기 위해 유사한 접근 방식이 적용되었습니다. 병원체 감염에 대한 반응으로 ATL 유전자군이 직접 관여했으며, 62개의 유전자가 적어도 두 가지 조건에서 상당한 조절을 보였습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 유전자군을 특성화하는 데 사용되는 소프트웨어를 다루는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 주어진 유전자군의 특성과 전체 게놈 패밀리 구성원 식별에 사용되는 해당 프로브를 신중하게 정의하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 유전자 패밀리 명명법의 귀속에 필요한 종 이외의 다른 종을 기반으로 추가 계통 발생 트리를 만들어 유전자 패밀리 진화 및 P30 기능을 조사할 수 있습니다.