인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

이 프로토콜의 전반적인 목표는 인간 신경 전구 세포의 초기 뇌 발달 과정을 빠르고 재현 가능한 방식으로 특성화하고 이러한 과정을 조절하는 데 있어 중요한 세포 외 요인의 영향을 정의하는 것입니다. 이 방법은 신경 정신 의학 및 신경 발달 장애 분야의 중요한 질문, 예를 들어 영향을 받는 모든 개인이 동일한 세포 이상을 가지고 있는지 또는 각 개인이 개인의 특정 기능 장애를 나타내는지와 같은 중요한 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리 프로토콜의 가장 큰 장점은 빠르고, 재현성이 높으며, 구현하기 쉽다는 것입니다.

이 방법은 신경 발달 장애에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있지만 알츠하이머 및 우울증과 같은 신경 퇴행성 및 신경 정신 장애를 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 일부 기술은 세포를 한 접시에서 다른 접시로 이동시키는 것과 관련이 있거나 시각적 시연을 통해 가장 잘 전달되는 형태학적 분석이 필요하기 때문에 이러한 방법 중 일부의 시각적 시연이 필요합니다. 인간 신경 전구 세포를 들어 올리려면 배지를 흡인하고 1X 인산염 완충 식염수로 세포를 한 번 세척합니다.

인산염 완충 식염수를 흡인하고 500마이크로리터의 1X 세포 분리 용액을 신경 전구 세포가 있는 웰에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다. 다음으로, P1000 피펫을 사용하여 실온에서 유지되는 500마이크로리터의 인산염 완충 식염수를 첨가하여 세포를 세척하고 제거합니다.

그런 다음 인산염 완충 식염수의 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 1ml의 인산염 완충 식염수로 웰을 다시 세척하고 세척액을 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 300G에서 5분 동안 세포를 회전시켜 펠릿을 형성합니다.

그런 다음 상등액을 버리고 펠릿을 1-5ml의 예열된 DMEM F12 배지에 다시 현탁시킵니다. 플레이트 100, 24웰 플레이트의 3중 웰에 있는 000개의 세포. 46시간 후, 트리티화된 티미딘을 배양 배지에 첨가하고 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 배지를 제거한 후 예열된 0.25%트립신 EDTA 300마이크로리터를 넣고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하여 세포를 분해하고 DNA를 방출합니다. 그런 다음 세포 수확기를 켜고 펌프를 켭니다. 세포 수확기에 여과지를 놓습니다.

세포 수확기의 튜브를 빈 빈 트레이에 계속 모으십시오. 그런 다음 사전 세척을 눌러 여과지를 적십니다. 수집 튜브를 샘플 웰에 넣고 시작합니다.

뜨거운 광원을 사용하여 여과지를 건조시키고 트레이에 해당 바이알을 배열합니다. 바이알에 종이 뭉치를 펀칭한 다음 각 바이알에 2ml의 리퀴드 섬광 칵테일을 추가합니다. 기계를 작동하기 전에 섬광 카운터에서 바이알을 1시간 동안 배양하여 활성 DNA 합성을 반영하는 각 샘플의 분당 개수를 얻습니다.

35mm 배양 접시에 500, 000개의 세포를 파종합니다. 그런 다음 접시를 모든 방향으로 교반하여 세포가 고르게 분포되도록 합니다. 다음으로, 세포를 섭씨 37도에서 46시간 동안 배양합니다.

그런 다음 5밀리몰 EdU를 밀리리터당 2마이크로리터를 배양액에 추가하고 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 세포를 해리하고 펠릿화합니다. 세포 펠릿에 성장 인자 또는 약물의 유무에 관계없이 30% 확장 배지 3ml를 추가합니다.

사전 코팅된 접시에 1ml의 세포 현탁액을 플레이트하고 플레이트를 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 중 신경 전구체 세포 수를 연구하려면 2일 후에 미세 원심분리 튜브에 라벨을 붙이고 준비합니다. 그런 다음 웰에서 배지를 흡인하고 200마이크로리터의 1X 세포 분리 용액을 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.

세포 분리 후 각 웰에 300마이크로리터의 1X 인산염 완충 식염수를 추가합니다. P1000 피펫을 사용하여 세포 용액을 여러 번 피펫팅하고 플레이트에서 셀을 분리합니다. 그런 다음 준비된 1.5ml 튜브에 셀 용액을 옮기고 튜브를 2-3회 반전시킵니다.

피펫을 사용하여 튜브 중간에서 50마이크로리터의 세포를 빼내고 0.5ml 튜브에 트리판 블루 용액을 추가합니다. 그런 다음 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 신경구를 형성하기 위해 코팅 기판 없이 35mm 접시에 100% 팽창 매체 1밀리리터를 피펫팅합니다.

그런 다음 각 플레이트에 100만 개의 신경 전구 세포를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 48-96시간 동안 배양합니다. 신경구 이동을 위해 플레이트를 준비하려면 ECM-모방 겔 분취액을 30% 팽창 배지 6ml에 용해시킵니다. 6웰 플레이트의 단일 웰에 30% 팽창 배지가 있는 ECM-모방 젤 1ml를 추가합니다.

그런 다음 섭씨 37도에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다. 신경 영역을 플레이트하려면 피펫을 사용하여 35mm 접시에서 배지의 세포를 수집하여 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 100G으로 돌려 신경구를 펠릿으로 만듭니다.

그런 다음, 1-3 밀리리터의 예열 된 30 % 팽창 매체에 펠릿을 재현탁시킵니다. 다음으로, 200 마이크로 리터의 부유 신경 구체를 30 % 팽창 매체를 가진 ECM-mimic gel을 포함하는 6 웰 플레이트에 피펫팅하고 플레이트를 흔듭니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 48시간 동안 플레이트를 배양합니다.

ECM-mimic gel을 30% 확장 배지로 흡입한 다음 4% 파라포름알데히드를 사용하여 30분 동안 세포를 고정합니다. 신경구를 분석하려면 10X 배율에서 위상차 설정을 사용하여 이미지를 캡처합니다. NIH ImageJ 소프트웨어를 사용하여 신경구의 평균 이동을 측정합니다.

ImageJ에서 자유형 선 도구를 사용하여 신경구의 외부 윤곽을 추적합니다. 그런 다음 측정 기능을 사용하여 추적 영역을 계산하고 구의 내부 세포 질량을 추적합니다. 평균 이동을 정량화하기 위해 전체 신경구 영역에서 내부 세포 질량을 뺍니다.

면역세포화학적 염색은 3번 통로에서 신경 전구체 세포에서 세포골격 단백질과 SOX2, PAX6 및 네스틴과 같은 전사 인자의 발현을 연구하기 위해 수행되었습니다. 다음으로, 중성석을 함유한 세포를 식별하기 위해 위상차 이미지를 캡처했습니다. 이미지에서 두 개의 세포체보다 크거나 같은 돌기를 가진 세포는 중성석을 함유하는 것으로 간주되는 반면, 두 개의 세포체보다 짧은 돌기를 가진 세포는 중성석을 함유하는 것으로 간주되지 않습니다.

신경구 형성을 확인하기 위해 72시간 시점에서 수집된 신경구의 크기가 80마이크로미터에서 120마이크로미터 사이이므로 이동 분석에 사용할 수 있음을 보여주는 위상차 이미지를 캡처했습니다. 증식 능력을 정의하기 위해, 신경 전구체 세포는 대조군 또는 섬유아세포 성장 인자 조건에서 성장하고 EdU의 존재를 위해 염색되었습니다. 위상차 형광 이미지는 섬유아세포 성장 인자로 처리된 세포가 EdU 염색에서 볼 수 있듯이 S-상에 관여하는 세포의 비율이 더 높다는 것을 보여줍니다.

다음으로, 신경돌기 성장을 확인하기 위해 대조 조건에서 세포를 분석하고 PACAP와 비교했습니다. 위상차 이미지가 캡처되었으며 PACAP 처리 하에 신경돌기가 있는 세포의 수가 증가한 것을 보여줍니다. 그런 다음 신경구 이동을 이해하기 위해 세포를 PACAP 뉴로펩타이드로 처리했습니다.

얻어진 위상차 이미지는 대조군에 비해 증가된 신경구 이동을 보여줍니다. 당사의 프로토콜에는 각각 다른 시간이 필요한 많은 기술과 분석이 포함되어 있습니다. 숙달에 따라 평균 분석은 설정하는 데 2-3시간, 분석하는 데 30분에서 3시간이 걸릴 수 있습니다.

이러한 절차를 수행하는 동안 고품질 신경 전구 세포를 사용하고 있는지, 그리고 이러한 세포가 신경구 분석을 제외한 모든 조건에서 완전히 해리되고 균일하게 분포되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이러한 절차에 따라 기본 메커니즘을 특성화하기 위해 웨스턴 블로팅(Western blotting), QRT-PCR, 전사체학, 단백질체학 및 대사체학을 포함한 다른 분석을 수행할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.