Name: 인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 배우세요 인간 신경 선구자 세포에서 신경발달 과정을 신속하고 재현 가능하게 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 세포외 인자의 효과를 평가하여 신경정신 및 신경발달 장애 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 의료 연구 및 치료의 자폐증 (CAUT13APS010;에 대 한 뉴저지 주지사의 위원회에 의해 지원 되었다 CAUT14APL031; CAUT15APL041), 낸시 Lurie 표시 Mindworks 자선 리드 신뢰, 가족 재단과 큰 보스턴과 뉴저지의 유태인 공동체 기초.

<ol><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).</li>
<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+the+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145 (6), 831-834 (2011).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li>
<li>Bershteyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-Derived+Cerebral+Organoids+Model+Cellular+Features+of+Lissencephaly+and+Reveal+Prolonged+Mitosis+of+Outer+Radial+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-Derived Cerebral Organoids Model Cellular Features of Lissencephaly and Reveal Prolonged Mitosis of Outer Radial Glia.</a> Cell Stem Cell. 20 (4), 435-449 (2017).</li>
<li>Giandomenico, S. L., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+human+brain+evolution+and+development+in+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing human brain evolution and development in organoids.</a> Curr Opin Cell Biol. 44, 36-43 (2017).</li>
<li>Vaccarino, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+tool+to+confront+the+challenge+of+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new tool to confront the challenge of neuropsychiatric disorders.</a> Neuropharmacology. 60 (7-8), 1355-1363 (2011).</li>
<li>Walsh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+structural+variants+disrupt+multiple+genes+in+neurodevelopmental+pathways+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rare structural variants disrupt multiple genes in neurodevelopmental pathways in schizophrenia.</a> Science. 320 (5875), 539-543 (2008).</li>
<li>Guilmatre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+rearrangements+in+synaptic+and+neurodevelopmental+genes+and+shared+biologic+pathways+in+schizophrenia%2C+autism%2C+and+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gen+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Recurrent rearrangements in synaptic and neurodevelopmental genes and shared biologic pathways in schizophrenia, autism, and mental retardation.</a> Arch Gen Psychiatry. 66 (9), 947-956 (2009).</li>
<li>Pinto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+genes+and+cellular+pathways+dysregulated+in+autism+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Convergence of genes and cellular pathways dysregulated in autism spectrum disorders.</a> Am J Hum Genet. 94 (5), 677-694 (2014).</li>
<li>Parikshak, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+functional+genomic+analyses+implicate+specific+molecular+pathways+and+circuits+in+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative functional genomic analyses implicate specific molecular pathways and circuits in autism.</a> Cell. 155 (5), 1008-1021 (2013).</li>
<li>Birnbaum, R., Jaffe, A. E., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., Weinberger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+expression+patterns+of+genes+associated+with+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Prenatal expression patterns of genes associated with neuropsychiatric disorders.</a> Am J Psychiatry. 171 (7), 758-767 (2014).</li>
<li>Voineagu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+autistic+brain+reveals+convergent+molecular+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of autistic brain reveals convergent molecular pathology.</a> Nature. 474 (7351), 380-384 (2011).</li>
<li>Willsey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+networks+implicate+human+midfetal+deep+cortical+projection+neurons+in+the+pathogenesis+of+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Coexpression networks implicate human midfetal deep cortical projection neurons in the pathogenesis of autism.</a> Cell. 155 (5), 997-1007 (2013).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-+and+anti-mitogenic+actions+of+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+in+developing+cerebral+cortex%3A+potential+mediation+by+developmental+switch+of+PAC1+receptor+mRNA+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pro- and anti-mitogenic actions of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide in developing cerebral cortex: potential mediation by developmental switch of PAC1 receptor mRNA isoforms.</a> J Neurosci. 33 (9), 3865-3878 (2013).</li>
<li>Mairet-Coello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p57%28KIP2%29+regulates+radial+glia+and+intermediate+precursor+cell+cycle+dynamics+and+lower+layer+neurogenesis+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">p57(KIP2) regulates radial glia and intermediate precursor cell cycle dynamics and lower layer neurogenesis in developing cerebral cortex.</a> Development. 139 (3), 475-487 (2012).</li>
<li>Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclin-dependent+kinase+inhibitor+p57Kip2+regulates+cell+cycle+exit%2C+differentiation%2C+and+migration+of+embryonic+cerebral+cortical+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">The cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 regulates cell cycle exit, differentiation, and migration of embryonic cerebral cortical precursors.</a> Cereb Cortex. 21 (8), 1840-1856 (2011).</li>
<li>Mairet-Coello, G., Tury, A., DiCicco-Bloom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factor-1+promotes+G%281%29%2FS+cell+cycle+progression+through+bidirectional+regulation+of+cyclins+and+cyclin-dependent+kinase+inhibitors+via+the+phosphatidylinositol+3-kinase%2FAkt+pathway+in+developing+rat+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factor-1 promotes G(1)/S cell cycle progression through bidirectional regulation of cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in developing rat cerebral cortex.</a> J Neurosci. 29 (3), 775-788 (2009).</li>
<li>Tury, A., Mairet-Coello, G., DiCicco-Bloom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple+roles+of+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitory+protein+p57%28KIP2%29+in+cerebral+cortical+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The multiple roles of the cyclin-dependent kinase inhibitory protein p57(KIP2) in cerebral cortical neurogenesis.</a> Dev Neurobiol. 72 (6), 821-842 (2012).</li>
<li>Li, B., DiCicco-Bloom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+exhibits+dual+and+rapid+regulation+of+cyclin+D1+and+p27+to+stimulate+proliferation+of+rat+cerebral+cortical+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor exhibits dual and rapid regulation of cyclin D1 and p27 to stimulate proliferation of rat cerebral cortical precursors.</a> Dev Neurosci. 26 (2-4), 197-207 (2004).</li>
<li>Lu, N., DiCicco-Bloom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+is+an+autocrine+inhibitor+of+mitosis+in+cultured+cortical+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide is an autocrine inhibitor of mitosis in cultured cortical precursor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3357-3362 (1997).</li>
<li>Zhou, X., Suh, J., Cerretti, D. P., Zhou, R., DiCicco-Bloom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrins+stimulate+neurite+outgrowth+during+early+cortical+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Ephrins stimulate neurite outgrowth during early cortical neurogenesis.</a> J Neurosci Res. 66 (6), 1054-1063 (2001).</li>
<li>Falluel-Morel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetyl+cysteine+treatment+reduces+mercury-induced+neurotoxicity+in+the+developing+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">N-acetyl cysteine treatment reduces mercury-induced neurotoxicity in the developing rat hippocampus.</a> J Neurosci Res. 90 (4), 743-750 (2012).</li>
<li>Rossman, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed2+modulates+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation%2C+differentiation+and+insulin-like+growth+factor+1+signaling+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Autism%22%5BJournal%5D)">Engrailed2 modulates cerebellar granule neuron precursor proliferation, differentiation and insulin-like growth factor 1 signaling during postnatal development.</a> Mol Autism. 5 (1), 9(2014).</li>
<li>Tao, Y., Black, I. B., DiCicco-Bloom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+neurogenesis+is+inhibited+by+neutralizing+antibodies+to+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo neurogenesis is inhibited by neutralizing antibodies to basic fibroblast growth factor.</a> J Neurobiol. 33 (3), 289-296 (1997).</li>
<li>Vaccarino, F. M., Grigorenko, E. L., Smith, K. M., Stevens, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cerebral+cortical+size+and+neuron+number+by+fibroblast+growth+factors%3A+implications+for+autism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autism+Dev+Disord%22%5BJournal%5D)">Regulation of cerebral cortical size and neuron number by fibroblast growth factors: implications for autism.</a> J Autism Dev Disord. 39 (3), 511-520 (2009).</li>
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<li>Suh, J., Lu, N., Nicot, A., Tatsuno, I., DiCicco-Bloom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PACAP+is+an+anti-mitogenic+signal+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PACAP is an anti-mitogenic signal in developing cerebral cortex.</a> Nat Neurosci. 4 (2), 123-124 (2001).</li>
<li>Falluel-Morel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide+prevents+the+effects+of+ceramides+on+migration%2C+neurite+outgrowth%2C+and+cytoskeleton+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide prevents the effects of ceramides on migration, neurite outgrowth, and cytoskeleton remodeling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2637-2642 (2005).</li>
<li>Ataman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Osteocrin+as+an+activity-regulated+factor+in+the+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of Osteocrin as an activity-regulated factor in the primate brain.</a> Nature. 539 (7628), 242-247 (2016).</li>
<li>Doers, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+forebrain+neurons+from+FXS+individuals+show+defects+in+initial+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived forebrain neurons from FXS individuals show defects in initial neurite outgrowth.</a> Stem Cells Dev. 23 (15), 1777-1787 (2014).</li>
<li>Pasca, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+iPSC-derived+neurons+to+uncover+cellular+phenotypes+associated+with+Timothy+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Using iPSC-derived neurons to uncover cellular phenotypes associated with Timothy syndrome.</a> Nat Med. 17 (12), 1657-1662 (2011).</li>
<li>Brennand, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+differences+in+hiPSC+NPCs+derived+from+patients+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia.</a> Mol Psychiatry. 20 (3), 361-368 (2015).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+proliferation+and+networks+in+neural+cells+derived+from+idiopathic+autistic+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Altered proliferation and networks in neural cells derived from idiopathic autistic individuals.</a> Mol Psychiatry. , (2016).</li>
<li>Voineagu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+studies+in+autism%3A+moving+from+the+genome+to+the+transcriptome+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Gene expression studies in autism: moving from the genome to the transcriptome and beyond.</a> Neurobiol Dis. 45 (1), 69-75 (2012).</li>
<li>Waltereit, R., Banaschewski, T., Meyer-Lindenberg, A., Poustka, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+neurodevelopmental+pathways+and+synaptic+plasticity+in+mental+retardation%2C+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia%3A+implications+for+psychiatry%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Interaction of neurodevelopmental pathways and synaptic plasticity in mental retardation, autism spectrum disorder and schizophrenia: implications for psychiatry.</a> World J Biol Psychiatry. 15 (7), 507-516 (2014).</li>
<li>Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promises+and+challenges+of+human+brain+organoids+as+models+of+neuropsychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease.</a> Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).</li>
<li>Pasca, S. P., Panagiotakos, G., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+human+neurons+in+vitro+and+using+them+to+understand+neuropsychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generating human neurons in vitro and using them to understand neuropsychiatric disease.</a> Annu Rev Neurosci. 37, 479-501 (2014).</li>
<li>Huttunen, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.pagepress.org/journals/index.php/scs/article/view/2636">An automated continuous monitoring system: a useful tool for monitoring neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Studies. 1 (1), 10(2011).</li>
<li>Lappalainen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarly+derived+and+cultured+hESC+lines+show+variation+in+their+developmental+potential+towards+neuronal+cells+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Similarly derived and cultured hESC lines show variation in their developmental potential towards neuronal cells in long-term culture.</a> Regen Med. 5 (5), 749-762 (2010).</li>
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<li>ThermoFisher. Invitrogen Click-iT EdU Microplate Assay. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10214.pdf</a> (2017).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

여기에 제시 된 프로토콜 기본 neurodevelopmental 프로세스를 연구 하 고 성장 인자와 약물 hiPSC 파생 신경 선구자 세포를 사용 하 여 테스트를 신속 하 고 간단한 방법을 설명 합니다. hiPSC 기술 사는 영향을 받는 개인에서 인간의 신경 세포를 전례 없는 접근 제공 하 여 neurodevelopmental 질병의 병 인 연구를 혁명을 했다. 실제로, 레트 증후군, 티 모 증후군, 연약한 X 증후군을 포함 한 neurodevelopmental 장애의 수많은 hiPSC 연구 되었습니다 및 정신 분열 증, 질병 특정 차 모 수석에서 출토 있다, synapses, 그리고 신경 기능4,33,,3435,36. 이러한 연구의 대부분...

간단한 유기 체와 마우스 모델을 사용 하 여 기본 두뇌 개발 질병 pathogenesis의 메커니즘을 해명 했습니다. 이러한 발전에도 불구 하 고 많은 정신병 무질서의 병 인 간단한 유기 체에 있는 모든 발견은 인간 질병의 복잡 한 측면에 직접 관련이 있기 때문에 애매 남아 있습니다. 또한, 인간의 두뇌의 더 복잡 종종 모델 인간 개발을 어렵게 하 고 동물에 장애. 진화와 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 기술의 진보와 함께 체세포 줄기 세포로 재설정 고 인간의 질병을 연구 하는 신경 세포로 분화 될 수 있습니다. (유전체학, transcriptomics, proteomics, metabolomics) hiPSCs 및 "omic" 기술의 발전 인간 두뇌 개발의 이해에 혁명을 약속 드립니다. 이러한 기술은 지금 가능 하 게 "정밀 의학" 접근에 사건-의해-사건을 기준으로 정신병 질환의 특성에.
HiPSC 질병-모델링 분야에서 현재 주식은 특정 신경 하위는 단층으로 세포 분화 하거나 두뇌 개발1,2,의 측면을 정리 하는 organoid 라는 3D 문화 시스템을 사용 하 3. 이러한 시스템은 엄청나게 공부 하 고 인간의 개발 및 질병4,5,,67의 독특한 측면을 잠복 근무에 귀중 한 되었습니다. 그러나, 신경 문화와 organoids 종종 필요 어디서 나 주에서 문화에서 개월 공부 준비가 되기 전에. 이러한 프로토콜의 이러한 문화 시스템 자주 수행 될 수 있는 실험의 수 및 테스트할 수 있는 성장 요인 또는 (마약) 처럼 변수 수 제한 유지 하는 데 필요한 리소스의 양을 소모 자연. 또한, 포스트 mitotic 신경 및 organoids를 이용 하 여 많은 연구 개발에서 나중에 발생 하는 모 수석 파생물 또는 시 냅 스 형성, 등의 프로세스에 집중 했다. 이러한 프로세스 발달 장애 자폐증과 정신 분열 증 등의 병 리에 연루 되어, 이전 확실 한 신경 분화 하기 전에 발생 하는 개발 이벤트는 질병 병 인8에 대 한 중요 한 ,,910,11,,1213. 실제로, 최근 게놈 연구 보여줍니다 확산, 프로세스 파생물 및 마이그레이션 구성 되어, 중반에 태아 기간 자폐증 pathogenesis11,14에서 특히 중요 하다. 따라서, 신경 줄기와 조상 세포 인구 이러한 이전 프로세스를 보다 잘 이해 하려면 공부 하는 것이 중요 하다. Organoid 시스템을 더 나은 간주 정리 인간의 두뇌 개발 3D 자연 조직된 구조 때문에, 이러한 이전 이벤트의 일부 연구 활용 되어 조상 수영장을 포함지 않습니다. 그러나, organoids에 조상 인구 종종 스파스 이며 신경 줄기 또는 조상 세포5,15보다 광선 glial 세포 처럼. 따라서, 그것은 neurodevelopment 적극적으로 증식 세포 인구에서의 초기 단계를 공부 하는 높은 처리량 방법을 도움이 될 것 이다.
연구실에서 우리 hiPSC 파생 신경 선구자 세포 (Npc), 높은 증식, 확산, 세포 이동 등 neurodevelopmental 프로세스를 연구 하는 신경 줄기와 조상 세포의 혼합된 인구를 사용 하는 프로토콜을 만들었습니다 그리고 초기 프로세스 (neurite) 확장입니다. 이 분석 실험은 성공적으로 쥐와 쥐 대뇌 피 질의 문화16,17,,1819,20, neurodevelopment 공부를 수십 년 동안 우리가 실험실에서 사용 되는 기술에서 개발 되었다 21,,2223. 중요 한 것은, 그것은 또한 고기 및 쥐 및 마우스 문화 시스템에 정의 된 규정 신호는 매우 활성 vivo에서, 이러한 기술을16, 의 값을 나타내는 메커니즘의 예측 표시 했다 17,18,,1924. NPCs에 hiPSCs의 초기 분화 후 이러한 방법을 수 일의 문제에 중요 한 발달 과정을 연구. 이러한 방법에는 많은 이점이 있다: (1) 그들은 약간 정교한 장비가 필요 하 고 구현 하기 쉬운, (2) 수많은 실험적인 복제 시간, 결과, 그리고 (3)의 재현성의 빠른 확인을 위해 수 있도록 짧은 기간에 지휘 될 수 있다 신속 하 고 비용 효율적으로 코팅 행렬, 성장 요인의 효과 약물의 활동 문화 변수를 테스트할 수 있습니다. 또한, 우리 확고 역할 extracellular 성장 요인의 다양 한 개발 프로세스의 중요 한 레 귤 레이 터의 활용. NPCs는 직접 확산, neurite 결과, 및 셀 마이그레이션 같은 이벤트를 자극 하 고 그들은 제어 조건19 에 명백한 되지 않은 결함을 식별 하는 기능을 강화 하는 것을 발견 했다 발달 신호 선택에 노출 됐다 , 25 , 26 , 27 , 28. 마찬가지로, 약물 평가의 용이성 제공 다양 한 치료 적 개입의 효율성을 테스트할 정밀 의학 기술을 채택 하는 강력한 애비뉴. 따라서,이 프로토콜은 재현성, 높은 처리량 및 초기 두뇌 발달, 질병의 병 인, neurodevelopmental 고기에 성장 요인 및 약물의 잠재적인 유익한 효과 공부 하 고 간단한 방법론을 촉진 한다.

<table><tbody><tr><td>PSC 신경 유도 매체 : 프로토콜 링크 : https://goo.gl/euub7a&nbsp;</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A1647801</td><td>이 키트는 NB(Neurobasal) 배지와 50x NIS(Neural Induction Supplement)로 구성되어 있습니다. NIS는 1X 신경 유도 매체 및 100% 확장 매체</td></tr><tr><td>고급 DMEM/F12 매체</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12634-010</td><td>구성 요소 100% 확장 매체</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>21103049</td><td>NIM 및 100% 확장 매체 구성 요소를</td></tr> 만드는 데 사용됩니다.<tr><td>hESC 인증 Matrigel</td><td>Corning 354277</td><td></td><td>hESC 인증 세포외 기질-모방 겔 (ECM-mimic gel)&nbsp;</td></tr><tr><td>Y-27632 (2HCl), 1 mg</td><td>줄기세포 기술</td><td>72302</td><td>ROCK 억제제</td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>COR-3506</td><td>폴리스티렌 플레이트는 NPC 유지 보수 및 신경구 이동 분석에 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>2021-05</td><td>폴리스티렌 플레이트: NPC DNA 합성 분석에 사용</td></tr><tr><td>35mm 접시</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>2021-01</td><td>폴리스티렌 플레이트: NPC S-상 진입 및 신경석염 분석에 사용</td></tr><tr><td>Natural Mouse Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>코팅 플레이트용 기질: NPC DNA 합성, S-상 진입 및 세포 수 분석</td></tr><tr><td>에 사용코팅 플레이트용 Fibronectin</td><td></td><td>Sigma F1141</td><td>기판: Neurite Assay에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P0899</td><td>코팅 플레이트용 기판</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15140122</td><td>항생제, NIM 구성 요소, 100% 확장 및 30% 확장 미디어&nbsp;</td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>1X 세포 분리 솔루션&nbsp;</td></tr><tr><td>2.5% 트립신(10X)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>10X 효소 용액</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AM9261</td><td>DNA 합성 분석을 위한 세포 리프팅용 트립신 용액에 사용</td></tr><tr><td>트리티화 [3H]-티미딘</td><td>PerkinElmer</td><td>NET027E001</td><td>방사성 삼중수소, 티미딘</td></tr><tr><td>Fisherbrand 7mL HDPE 섬광 바이알</td><td>Fisherbrand</td><td>03-337-1</td><td>액체 섬광 계수용 바이알</td></tr><tr><td>EcoLite(+)</td><td>MP Biomedicals</td><td>0188247501&nbsp;</td><td>리퀴드 신틸레이션 칵테일</td></tr><tr><td>LS 6500 다목적 액체 섬광 카운터</td><td>Beckman Coulter</td><td>8043-30-1194</td><td>액체 섬광 카운터</td></tr><tr><td>Skatron 반자동 세포 수확기 유형 11019</td><td>분자 장치 및 스카트론 인스트루먼트, Inc.</td><td></td><td>반자동 세포 수확기</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor&reg; 488 이미징 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10337</td><td>EdU 및 S-Phase Entry Assay</td></tr><tr><td>용 염색 키트 Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td>세포의 생존력 평가</td></tr><tr><td>Grade GF/C 여과지</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Whatman</td><td>1822-849</td><td>유리 섬유 여과지</td></tr><tr><td>인간 기본 FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>성장 인자</td></tr><tr><td>뇌하수체 아데닐레이트 시클라제 활성화 폴리펩티드(PACAP-38)</td><td>BACHEM</td><td>H-8430</td><td>뉴로펩티드</td></tr></tbody></table>

인간의 신경 선구자 세포 (npc)에서 neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

인간의 두뇌 개발 초기 단계 확산, 마이그레이션 및 neurite 결과; 고유와 정확 하 게 조율 된 프로세스의 시리즈를 통해 진행 그리고 후기 축 삭/모 수석 파생물 및 시 냅 스 형성에 의해 특징. neurodevelopmental 장애, 종종 이러한 프로세스 중 하나 이상을 교란, 두뇌 형성과 기능에 이상이 선도. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 기술의 출현, 연구원은 지금 뉴런을 포함 한 거의 모든 세포 유형으로 분화 될 수 있다 인간 세포의 풍부한 공급이 있다. 이 세포는 정상적인 두뇌 개발 및 질병의 병 인 연구에 사용할 수 있습니다. HiPSCs 말기 정신병 질환 사용 모델을 사용 하 여 프로토콜 수 분화 신경 또는 3D 문화 시스템을 사용 되 나 organoids. 이러한 방법은 인간의 질병 병 인 공부에 귀중 한 입증 했다, 몇 가지 단점이 있습니다. HiPSCs 신경 세포로의 분화 및 organoids의 생성 하는 실험 및 평가 될 수 있는 변수의 수에 영향을 미칠 수 있는 긴 하 고 비용이 많이 드는 프로세스. 또한, 포스트 mitotic 신경 및 organoids 질병 관련 프로세스, 모 수석 파생물, synaptogenesis, 등의 연구를 허용 하는 동안 그들은 확산 및 마이그레이션 같은 이전 프로세스의 연구를 배제. Neurodevelopmental 장애, 자폐증, 등에서 풍부한 유전과 사후 증거는 초기 발달 과정에서 결함을 나타냅니다. 신경 선구자 세포 (Npc), 높은 증식 세포 인구 ontogenetic 프로세스 및 질병 개시에 대 한 질문에 적합 한 모델을 수 있습니다. 우리는 지금 인간 Npc에 마우스와 쥐 대뇌 피 질의 문화에서 개발 공부에서 배운 방법론을 확장 합니다. NPCs의 사용 우리가 질병 관련 고기를 조사 하 고 어떻게 다른 변수 (예를 들어, 성장 요인, 마약) 충격 발달 과정 등 확산, 마이그레이션, 차별화 몇 일만에 정의할 수 있습니다. 궁극적으로,이 도구 집합 질병 특정 메커니즘 및 neurodevelopmental 장애에 고기 식별 하 재현성 및 높은 처리량 방식으로 사용할 수 있습니다.

이러한 연구의 한 목표 Npc, 즉, 셀 숫자 증가의 증식 활동을 정의 하는. 이것은 전체 세포 인구 세포 추출 물에 방사성 추적 tritiated 티 미 딘의 설립이 고 그들이 인지 S 단계에 종사 하는 모든 셀을 반영 하는 높은 처리량 접근 방식의 DNA 합성을 평가 함으로써 얻을 수 5 분 또는 전체 2 시간에 대 한 합성. 또한, 이러한 분석 실험 S-위상 및 총 세포 숫자, 단일 셀의 더 노동 집약적인 분석 결과 입력 하는 셀의 비율의 결정을 수 있습니다. 세포는 유사 분열 및 세포 분열, 세포 수를 증가 하기 위하여 발생 한다 앞 단계 S 단계에서 DNA 음성 합성. 이러한 프로세스에는 시간이 좀 걸릴, 이후 48 시간에서 평가 하는 DNA 합성에 변화 변화이 시간 포인트에서 핸드폰 번호에 연결 하지 않을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 48 시간에서 DNA 합성에 변화 안정적으로 4-6 일에 세포 수의 증가 예측 발견 되었다.
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Neurodevelopmental 처리와 같은 확산, 마이그레이션, neurite 결과 종종 정신병 질환에 불안정 합니다. 따라서, 우리가 현재의 빠르게 그리고 reproducibly 인간의 iPSC 파생 된 NPCs에서 이러한 neurodevelopmental 프로세스를 평가 하는 프로토콜. 이러한 프로토콜은 또한 NPC 개발에 관련 된 성장 인자와 치료의 효과의 평가 허용 한다.

인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 인간 신경 전구 세포의 초기 뇌 발달 과정을 빠르고 재현 가능한 방식으로 특성화하고 이러한 과정을 조절하는 데 있어 중요한 세포 외 요인의 영향을 정의하는 것입니다. 이 방법은 신경 정신 의학 및 신경 발달 장애 분야의 중요한 질문, 예를 들어 영향을 받는 모든 개인이 동일한 세포 이상을 가지고 있는지 또는 각 개인이 개인의 특정 기능 장애를 나타내는지와 같은 중요한 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리 프로토콜의 가장 큰 장점은 빠르고, 재현성이 높으며, 구현하기 쉽다는 것입니다.이 방법은 신경 발달 장애에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있지만 알츠하이머 및 우울증과 같은 신경 퇴행성 및 신경 정신 장애를 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다. 일부 기술은 세포를 한 접시에서 다른 접시로 이동시키는 것과 관련이 있거나 시각적 시연을 통해 가장 잘 전달되는 형태학적 분석이 필요하기 때문에 이러한 방법 중 일부의 시각적 시연이 필요합니다. 인간 신경 전구 세포를 들어 올리려면 배지를 흡인하고 1X 인산염 완충 식염수로 세포를 한 번 세척합니다.인산염 완충 식염수를 흡인하고 500마이크로리터의 1X 세포 분리 용액을 신경 전구 세포가 있는 웰에 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다. 다음으로, P1000 피펫을 사용하여 실온에서 유지되는 500마이크로리터의 인산염 완충 식염수를 첨가하여 세포를 세척하고 제거합니다.그런 다음 인산염 완충 식염수의 세포를 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 1ml의 인산염 완충 식염수로 웰을 다시 세척하고 세척액을 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 300G에서 5분 동안 세포를 회전시켜 펠릿을 형성합니다.그런 다음 상등액을 버리고 펠릿을 1-5ml의 예열된 DMEM F12 배지에 다시 현탁시킵니다. 플레이트 100, 24웰 플레이트의 3중 웰에 있는 000개의 세포. 46시간 후, 트리티화된 티미딘을 배양 배지에 첨가하고 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양합니다.그런 다음 배지를 제거한 후 예열된 0.25%트립신 EDTA 300마이크로리터를 넣고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하여 세포를 분해하고 DNA를 방출합니다. 그런 다음 세포 수확기를 켜고 펌프를 켭니다. 세포 수확기에 여과지를 놓습니다.세포 수확기의 튜브를 빈 빈 트레이에 계속 모으십시오. 그런 다음 사전 세척을 눌러 여과지를 적십니다. 수집 튜브를

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

폐기 인간의 태아 대뇌 피질의 조직에서 신경 줄기 세포의 격리와 문화에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 알려진 인간의 신경 장애에서 파생된 문화가 같은 약리 효능을 평가하기위한 플랫폼을 제공뿐만 아니라, 병적인 세포 및 분자 공정의 특성에 사용될 수 있습니다.

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

이 비디오는 현미경 분석을 통해 신경 전구체 세포의 이동 반응을 연구하기 위한 체외 분석인 신경 전구체 세포 신경구 이동 분석을 보여줍니다.

NPC Neurosphere Assay: 신경권에서 신경 전구 세포의 이동 반응을 평가하기 위한 In Vitro Assay

이 동영상은 인간 신경전구세포(NPC)를 뉴런으로 분화하는 방법을 보여줍니다. NPC는 확립된 마우스 성상세포-쥐 피질 뉴런 공동 배양에 도입되어 NPC가 뉴런으로 분화되는 것을 촉진합니다. 분화는 컨포칼 현미경으로 세포를 시각화하여 확인됩니다.

인간 신경전구세포를 뉴런으로 분화시키기 위한 공동 배양 기술

인간 neuroprogenitor 세포 (NPC들)은 증식 조건 하에서 확장 하였다. 의 NPC는 neurotrophins과의 조합의 존재에 신경이 풍부한 문화로 분화되었다. 신경 세포 마커는 면역 형광 염색으로 검출되었다. 뉴런의 순수한 인구를 분리하기 위해,의 NPC는 PEN 막 슬라이드에 차별화 된 레이저 캡처 미세 절제를 행 하였다.

문화의 차별화 된 인간 Neuroprogenitor 세포에서 신경 세포의 레이저 캡처 미세 절제

이 프로토콜은 많은 신경 질환에서 질병 발병에 기여하는 발달 경로를 식별하는 데 사용할 수 있는 강력하고 복제적인 신경 세포 집단을 생성하기 위해 신경 전구 세포를 인간 유도 만능 줄기 세포와 구별할 수 있는 방법을 설명합니다.

신경 질환의 연구에 대한 생성 및 사용 hiPSC 파생 NPC들에 가이드

상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)는 암이 침습적이 될 수 있도록 합니다. EMT를 조사하기 위해 혈청과 효소가 없는 신경줄기세포(NSC) 기반 체외 모델을 설명합니다. 이 표준화된 시스템을 통해 세포 이동, 유전자 및 단백질 발현에 대한 정량적 및 정성적 평가를 수행할 수 있습니다. 이 모델은 신약 개발에 적합합니다.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

여기에 제시된 프로토콜은 체외 신경 내피 공동 배양 시스템과 sialoglycan의 대사 통합을 생체 장태 작용기와 결합하여 1 차적인 신경 줄기 및 전구 세포를 확장하고 그들의 표면에 레이블을 붙이는 프로토콜입니다 세포 표면 마커의 화상 진찰 또는 질량 분광분석을 위한 sialoglycoproteins.

Sialoglycan의 신진 대사 표지에 의하여 1 차적인 신경 줄기 및 전구 세포의 세포 표면 마커를 확인

이 프로토콜은 이전에 여러 주 동안 시험관 내 신경 전구체로부터 분화 된 인간 줄기 세포 유래 뉴런을 재중단하고 배양하기위한 상세한 절차를 설명합니다. 이 절차는 경질 현미경 검사법 및 고함량 스크리닝과 호환되는 형식으로 neurites, 시냅스 및 늦게 발현되는 뉴런 마커의 이미징 기반 검술을 용이하게 합니다.

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

제시된 프로토콜은 작은 분자 화합물의 neurite 아웃성장 분석 및 신경 독성 평가를 위한 방법을 설명합니다.

인간 신경 전구 세포 유래 뉴런을 가진 Neurite 아웃growth 분석 및 신경 독성 평가

우리는 성숙한 올리고드로시테스로 분화하는 태아 또는 성인 신경 줄기 세포에서 유래한 성상세포및 올리고드엔드로시테 전구세포의 혼합 배양, 유해자극의 시험관내 모델링을 설명한다. 셀 기반 고함량 선별 기술과 결합은 신뢰할 수 있고 견고한 약물 선별 시스템을 구축합니다.

태아 및 성인 신경 줄기 세포의 고함량 선별 분화 및 성숙 분석- 유래 올리고드로시테 전구체 세포 배양

배우세요 인간 신경 선구자 세포에서 신경발달 과정을 신속하고 재현 가능하게 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 세포외 인자의 효과를 평가하여 신경정신 및 신경발달 장애 연구에 활용됩니다.

인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

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