전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

이온 선택성 미세전극과 결합된 거대 패치 방법은 이온 플럭스를 검출하고 정량화하는 데 사용되는 다목적 방법입니다. 구체적으로, 세포막에서 발현되는 전기 중성 이온 수송체, 나트륨-수소 교환기 또는 NHE의 활성에 의해 생성된 양성자 플럭스를 측정하는 데 사용됩니다. 나트륨-수소 교환기는 원형질막에 매우 근접한 양성자의 구배를 생성하며, 여기에 주황색 고리로 표시됩니다.

세포막을 가로지르는 이러한 양성자의 구배는 양성자 선택적 미세전극을 사용하는 기술과 결합된 전체 세포 패치 클램프 기록으로 측정됩니다. 양성자 선택성 미세전극은 세포 표면 가까이로 이동하며, 여기서 세포 표면으로부터 멀리 떨어진 위치 A.And 에 표시된 세포로부터 이동하는 양성자의 플럭스를 기록하고, 여기서 위치 B.그리고 나서, 위치 A로 표시된 용액에 존재하는 자유 양성자 농도를 기록하고, 세포막에 가까운 위치 A로 돌아가서, 반복적이고 진동하는 움직임으로. A에서 B까지의 전압 차이가 기록되며 NHE 활동의 대표자에 따라 달라집니다.

세포막을 가로지르는 양성자와 같은 수송 이온은 생명에 필수적인 과정에 영향을 미칩니다. 따라서 pH의 변화는 원형질막 양성자 배제 시스템인 나트륨-양성자 교환기를 포함한 분자 배열에 의해 엄격하게 조절됩니다. 전체 세포 패치 클램핑과 결합된 진동 pH 미세전극은 나트륨-양성자 교환기 활성에 의해 매개되는 양성자 플럭스를 연구하는 새로운 접근 방식입니다.

이 방법의 적용은 적당한 감도 및 시간 분해능 및 세포 내 환경의 또 다른 우수한 제어와 같은 나트륨-양성자 교환기 활성을 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 기술의 주요 제한 중 일부를 극복합니다. 저는 공동 연구자인 Victor Babich 박사와 함께 이 방법을 시연할 것입니다. 매튜 헨리(Matthew Henry) 박사가 해설을 맡습니다.

우리는 장과 신장 상피를 가로질러 물에서 염을 흡수하는 주요 조절자인 나트륨-양성자 교환기 동형 3의 활성을 측정하여 이 방법의 적용을 시연할 것입니다. 양성자 농도 측정을 위한 양성자 선택성 미세 전극은 표준 붕규 유리 튜브로 제작됩니다. 외경이 1.2mm이고 필라멘트가 없는 붕규산 유리 전극은 기존의 이중 당김 프로토콜을 사용하여 수직 풀러로 당깁니다.

직경이 2-3마이크로미터인 피펫 팁이 얻어집니다. 피펫은 피펫 팁이 위를 향하도록 하여 용기 홀더에 넣습니다. 다음으로, 피펫을 실리콘화하기 위해 혼합물을 준비합니다.

항아리에 붓고 뚜껑을 단단히 닫습니다. 피펫은 24 - 48시간 동안 실리콘화 혼합물과 함께 배양됩니다. 주의를 기울이고, 혼합물을 준비하고 환기가 잘 되는 화학 연기 후드에서 실온에서 피펫을 실리콘화하십시오.

피펫에 적절한 이온 선택성 수지를 다시 채우고 피펫 팁이 아래를 향하도록 하여 용기 홀더에 수직으로 조심스럽게 놓습니다. 패치 클램핑을 준비하려면 먼저 기존의 이중 풀 프로토콜을 사용하여 수직 풀러에서 외경이 2mm이고 내부 직경이 1.4mm인 얇은 벽의 붕규산 유리에서 패치 클램핑 피펫을 당기는 것으로 시작합니다. 도립 현미경의 스테이지에 장착된 마이크로포지를 사용하여 넓은 피펫 팁을 만듭니다.

피펫을 마이크로포지의 두꺼운 백금 와이어 가까이에 놓습니다. 전류를 켜고 끄는 것을 제어하는 풋 스위치를 사용하여 난방을 켭니다. 마이크로포지의 두꺼운 백금선 중간을 덮고 있는 저융점 유리를 가열한 다음 피펫 팁을 용융된 연질 유리에 가깝게 이동합니다.

가열은 백금 와이어를 중심쪽으로 약간 이동합니다. 백금 와이어가 초기 위치로 돌아가고 파이펫 팁이 파손됩니다. 원하는 팁 직경을 얻을 때까지 절차를 반복하고 마지막으로 열을 가하여 팁을 매끄럽게 만듭니다.

피펫 팁은 마이크로포지로 연마한 후 직경이 10마이크로미터입니다. 두꺼운 백금선을 사용하면 전기를 켠 후 팽창이 적고 과도한 전류로 전선과 피펫이 과열될 가능성이 적다는 장점이 있습니다. 트립신을 사용하여 세포를 해리하고 트립신화를 차단한 후, 세포는 덩어리 형성을 방지하기 위해 흔들림이 있는 셰이커에서 유지됩니다.

이 작업은 트립신화 후 최대 2시간 동안 수행됩니다. 전기 생리학 설정은 관류 시스템에서 용액의 온도를 조절하는 온도 컨트롤러로 구성됩니다. 모든 실험은 약 섭씨 37도에서 수행됩니다.

및 형광 이미징을 위한 필터 휠을 제어하는 광학 필터 스위처. 관류 시스템 밸브의 개폐를 조절하는 관류 시스템 밸브 컨트롤러. 및 온도 조절기는 기록 챔버의 온도를 조절합니다.

파형을 관찰하기 위한 오실로스코프와 패치 클램프 증폭기. 이 Capmeter 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터입니다. 및 이온 선택성 미세전극 신호를 기록하는 전위계를 포함한다.

및 전위계의 신호를 증폭하는 차동 증폭기를 포함한다. 전기 생리학 설정에는 스테이지 컨트롤러가 있는 도립 현미경, 현미경의 왼쪽과 오른쪽 위치에 배치된 컨트롤러가 있는 두 개의 마이크로 매니퓰레이터, 인라인 용액 히터가 있는 관류 시스템도 장착되어 있습니다. 이온 선택성 미세전극 피펫을 미세조작기에 장착한 후 패치 클램핑 피펫을 세포 내 용액으로 다시 채웁니다.

용액이 피펫 끝에 도달하는지 확인하십시오. 피펫 끝의 기포를 제거하기 위해 몇 번의 부드럽게 두드려야 할 수도 있습니다. 그런 다음 패치 클램핑 피펫을 전기생리학 설정의 헤드 스테이지에 장착합니다.

건강하게 보이는 세포를 정의된 부피의 수조 용액으로 채워진 기록 챔버로 부드럽게 옮깁니다. 헤드 스테이지를 수평축과 45도 각도로 유지하는 것이 중요합니다. 이는 고내성 밀봉 형성에 적합한 피펫의 진입 각도를 보장합니다.

패치 클램프 피펫이 수조 용액에서 내려져 있는 동안 피펫에 소량의 양압을 가하여 팁이 막힐 가능성을 줄입니다. 셀을 선택하고 소량의 양압으로 접근합니다. 팁이 세포에 가까워지면 패치 클램프 피펫의 이동을 중지합니다.

수조 용액의 이온 선택성 미세전극을 패치 클램프 피펫 팁과 동일한 초점면이 될 때까지 내립니다. 피펫이 셀 중앙에 위치할 때 소량의 음압을 가하여 밀봉을 시작합니다. 몇 초 내에 메가 옴 밀봉을 얻을 수 있습니다.

유지 전위가 증폭기에 의해 유지되는지 확인하십시오. 마지막으로, 일련의 짧은 흡입 펄스로 세포막을 파열하고 기록을 시작합니다. 자이언트 패치 기록 방법을 사용하면 피펫 내 관류 시스템을 통해 유리 피펫에서 용액을 빠르게 관류하여 이온, 지질 및 단백질의 세포 내 함량을 수정할 수 있습니다.

이온 선택성 미세전극 피펫을 패치 클램프 피펫이 고정하는 셀 가까이에 배치하고 이온 선택성 미세전극 피펫을 셀 안팎으로 이동하여 발진을 시작합니다. 이 기술을 적용하면 나트륨-수소 교환기의 분자 조절을 연구할 수 있습니다. 자이언트 패치(giant patches) 방법을 활용하여 ATP와 지질의 세포 내 조성을 피펫 내 관류 시스템에 의해 수정했습니다.

세포 내 ATP를 가수분해하고 포스포이노시티드 함량을 감소시키는 아피라제의 세포 내 관류는 NHE 동형 3 활성을 50% 감소시켰습니다. NHE3 활성에 대한 아피라제 효과는 포스포이노시티드, PIP2의 세포 내 관류에 의해 역전되지 않았습니다. 그러나 포포이노시티드(phophoinositide, PIP3)의 세포 내 관류에 의해 역전되었습니다.

NHE 활성의 측정은 양성자 선택성 미세전극과 패치 클램핑 방법을 결합하는 이점을 활용합니다. 이를 통해 포스포이노시티드와 다운스트림 신호 캐스케이드에 의한 NHE의 차등 조절 뒤에 있는 분자 기초를 연구할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 모든 세포 패치 클램핑과 결합된 진동 pH 미세 전극을 사용하여 나트륨-양성자 교환기의 활성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

그리고 방법의 가능한 적용의 예.