Name: 전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 배우세요 전기 중립 이온 전송체인 나트륨-수소 교환체(NHE) 활성을 측정하는 거대 패치와 양이온 선택성 미세전극 기법을 활용한 전기생리학 방법입니다. 이 기술은 세포막 근처의 양성자 흐름을 정밀하게 측정하여 이온 수송 메커니즘을 연구합니다.

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저자 에릭 Fishback (데스 모인 스 행, 데스 모인 스 행, 아이오와, 미국)을 촬영 하 고 편집 하는 비디오와 함께 그의 도움에 감사 하 고 싶습니다. PS120 구와 같은 세포 안정적으로 NHE3 wt 또는 NHE3 YRK 표현 했다 친절 하 게 박사 마크 Donowitz (존스 홉킨스 대학의과 대학, 볼티모어, 메릴랜드, 미국)에 의해 제공 됩니다.

참고: 두 개의 앰프는 패치 클램핑, 전체 셀 구성 및 높은 들이 닥 침 증폭기 (에 셀을 유지 하기 위해 패치 클램프 앰프와 함께에서 자체 참조이 세 여 electroneutral 전송기의 활동을 기록 하는 데 필요한 전위 계)는이 세 통해 전송 활동을 기록 하 (재료의 표 참조). 패치 클램프 앰프 터미널 수집 보드에 직접 연결 됩니다. 전위 계는 신호를 증폭 및 필터링을 활용 하는 차동 증폭기에 연결 된다. 차동 증폭기는 터미널 수집 보드에 연결 됩니다. Capmeter, 셀 용량을 모니터링 하는 패치 클램프 소프트웨어 이전 연구20 에 사용 되었습니다 (재료의 표 참조). 녹음 실 및 관류 솔루션 37 ° c.에 유지 된다
1입니다. 펫 ISEs에 대 한 준비
<ol><li>1.2 m m의 외부 직경을 붕 규 산 유리 모 세관에서 펫을 당겨 ( 재료의 표참조) 피 펫 끌어당기는2 를 사용 하 여.</li>
	<li>폴란드어는 microforge를 사용 하 여 피 펫. 피 펫 팁의 직경은 2-3 µ m 이어야 한다.</li>
	<li>펫에 대 한 병 보유자에는 펫 피 펫 팁 ( 테이블의 자료참조)을 향하도록 넣습니다. 주의: 환기가 화학 증기 두건에서 1.4-1.6 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>Bis (dimethylamino) 디 메 틸 실 란 및 사염화 탄소 10 방울 1 방울 (~ 150 µ L)의 구성 된 siliconization 혼합물을 혼합 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>항아리에 siliconization 혼합물을 부 어 하 고 단단히 뚜껑을 닫습니다.</li>
	<li>혼합물은 완전히 증발 때까지 실내 온도에 화학 증기 두건에서 24-48 h에 대 한 siliconization 혼합 항아리를 품 어.</li>
	<li>약 2-4 mm의 열을 만드는 백필 적절 한 이온 선택적 수 지와 피 펫. 참고: 수소 ionophore 나 칵테일 B usedfor 녹음 NHE 활동 일 수 있다 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>팁에 이온 선택적 수 지를 배포 하는 피 펫의 끝을 누르고 아래로 피 펫 피 펫 팁 용기 거치대에 세로로 배치.</li>
	<li>Checkunder 해 현미경 수 지 칵테일 팁의 끝에 도달 했습니다. 필요한 경우, 긍정적인 압력 끝에 수 지를 적용.</li>
	<li>적절 한 솔루션으로 백필 반 피 펫 (~ 100 μ). 여기,를 사용 하 여 100 mM KCl와 10 mM HEPES pH 7.0에서 ionophore 사용 하는 경우 나 칵테일 b.</li>
	<li>ISE는 전위 계에 연결 고 ISE의 팁 목욕 솔루션 기록을 위해 사용 합니다. 제로 전위 계.</li>
	<li>H+테스트-목욕 해결책의 pH를 변경 하 여 선택이 세 응답. 평균 H+-선택적 세 응답은 ~ 58 단위 pH 당 mV.</li>
	<li>주기적으로 교정에이 세 응답을 평가 합니다.</li>
</ol>2. 기록에 대 한 패치 클램프의 준비 펫
참고: 단일 채널 녹화21 에 그의 기사에서 도널드 Hilgemann에 의해 설명 하는 방법은 것이 좋습니다.
<ol><li>붕 규 산 유리 모 세관에서 거 대 한 패치에 대 한 펫을 당겨 (2.0 mmOD / 1.5 m m ID) 피 펫 끌어당기는2,,2223에.</li>
	<li>microforge를 사용 하 여 다양 한 피 펫 팁 (10-22 μ m)23을 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 장착. 구슬을 녹여 (~ 0.5 mL)는 microforge의 두꺼운 백 금 철사에 부드러운 유리의. 참고: 상대적으로 두꺼운 백 금 철사는 필요한 거 대 한 패치 펫 조작 하 (~0.5 m m).</li>
	<li>부드러운 유리 구슬 가까운 패치 피펫으로 놓고 팁 손을 떼 다 때까지 전체 열을 적용. 백 금 철사 난방 centerduring 쪽으로 약간 이동 합니다.</li>
	<li>열을 끄고 부드럽게 유리 구슬에 피 펫 팁을 밀어. 냉각 와이어 철회 하 고 피 펫 팁을 깰 것 이다.</li>
	<li>부드럽게 피 펫 팁을 원하는 직경의 피 펫 팁을 만들 열을 다시 적용 합니다. 팁의 직경에 따라 달라 집니다 수를 셀의 크기 패치 (이 연구에서 8-10 μ m).</li>
</ol>3입니다. 셀의 준비
<ol><li>워밍업 없이 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 트립 신-EDTA 솔루션 성장 매체를 37 ° c.에 인산 염 버퍼 염 분 (PBS)</li>
	<li>PBS로 두번 세척 세포입니다. 버퍼의 1 mL를 사용 하 여 35mm 직경 셀 문화 접시.</li>
	<li>35 m m 직경 셀 문화 접시에 있는 셀에 트립 신 0.5 mL를 추가 합니다. 참고: 셀 시작 라운드-최대, 드 셀 연결 플레이트를 흔들.</li>
	<li>10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보완 하는 완전 한 성장 매체의 5 mL (35 m m 직경 셀 문화 접시에 대 한 금액)를 추가 하 여 트립 신 작업을 중지 합니다. 참고: 트립 신에 반응 시간은 셀 종속.</li>
	<li>덩어리의 형성을 방지 하기 위해 락을 통에 세포를 놓습니다.</li>
	<li>Trypsinization 후 최대 2 시간에 대 한 셀을 사용 합니다. 참고: 시간 셀 라인에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
</ol>4. 내 피 펫 관류 시스템의 준비
<ol><li>석 영 튜브의 적절 한 크기로 잘라 (150 µ m OD / 75 µ m ID) 내 피 펫 관류 라인을 준비 하.</li>
	<li>200 µ L 피 펫 팁에 석 영 튜브의 한쪽을 삽입 합니다. 팁에 석 영 튜브를 접착제와 날카로운 면도날으로 팁의 끝을 잘라.</li>
	<li>실리콘 튜브 내 피 펫 관류 솔루션에 대 한 저수지 역할을의 작은 조각에 관류 선 (석 영 튜브 끝에 붙어)를 연결 합니다.</li>
	<li>긍정적인 압력을 만들려고 주사기에 실리콘 튜브를 연결 합니다.</li>
	<li>삽입은 관류의 피 펫 소유자의 폴 리 에틸렌 튜브를 통해 석 영 튜브의 무료 끝 포트 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>피 펫 솔루션 관류 라인을 평가 합니다.</li>
</ol>5입니다. 솔루션의 준비
<ol><li>NHE (115 mM 칼륨 aspartate (KAsp), 1mm EGTA, 0.5 m m MgCl2, 10 m m Mg-ATP, 12.5 mM HEPES, 12.5 m m, 12.5 m m MOPS, 관과 12.5 m m MES, pH 6.0 aspartic 산 조정)를 기록 하기 위한 무 겁 게 버퍼링된 피펫은 솔루션을 준비 합니다. 참고: 주식 피 펫 솔루션 및 필터를 준비 합니다. 녹음 전에 Mg-ATP를 추가 합니다.</li>
	<li>(140 mM NaCl, 2mm CaCl2, 2 mM MgCl2, 그리고 0.1 m m Tris HCl pH 8.2) 때마다 신선한 목욕 솔루션을 준비 합니다.</li>
</ol>6. 전송 활동의 기록
<ol><li>운송업 자 활동은 온도 의존 하기 때문에 녹음 실과 37 ° C에서 모든 솔루션을 유지 합니다.</li>
	<li>녹음 실로 셀을 놓습니다. 그들은 챔버의 바닥에 드롭 하지만 그들 챔버에 연결 하지 마십시오 때까지 기다립니다.</li>
	<li>적절 한 셀을 선택 합니다. 눈 마이크로미터와 셀의 직경을 측정 합니다. 유사한 직경을 가진 셀을 선택 합니다. 참고: 일반적으로, 큰 셀이 해야한다 더 세포 표면 및 따라서 또한 데 더 운송업 자 활동의 원형질 막에 표현 가능 하 게 더 많은 전송기. 그러나, 이건 반드시 올바른 전송 활동 특정 운송업 자 및 연구에서 셀 형식에 따라 달라 집니다.</li>
	<li>탑재는 micromanipulator 하 이온 선택적 microelectrode 피 펫, 백필 세포내 솔루션 패치 클램핑 피펫으로 확인 솔루션2피 펫 끝에 도달 하면. 참고: 그것은 여러 부드러운 탭은 피 펫의 끝에 거품을 제거 하기 위해 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>2,,2223설정 전기 생리학의 머리 단계로 패치 클램핑 피펫으로 탑재 합니다. 참고: 그것은 중요 하다 수평 축에 45도 각도로 대 한 머리 무대에서 계속 그러면 저항력 인감의 형성에 대 한 적합 한 피 펫에 대 한 항목 각도.</li>
	<li>작은 긍정적인 압력 (~ 5 cm H2O) 패치 피 펫 팁, 차단의 기회를 줄이기 위해 목욕 솔루션으로 그것을 배치 하 게.</li>
	<li>팁 셀에 가깝다 면 패치 클램프 피 펫 이동 중지 합니다.</li>
	<li>피 펫 셀 접촉 하는 동안 긍정적인 압력을 완화 하 고 약간의 부정적인 압력 (~ 5 cm H2O)를 한 &gt; 1000 m ω (기가 옴) 인감 패치와 세포 막에 플라스틱23.</li>
	<li>셀과 패치 피 펫이 세와 같은 초점 평면에 놓고 패치 피펫으로 ISE에 근접에 있는 셀으로 이동 (~ 5-10 µ m)2,5 는 하지만 (그림 1A)이 세를 연결할 셀 수 있도록 하지 마십시오.</li>
	<li>잠재적인 지주 0 보장 mV.</li>
	<li>전체 셀 구성을 짧은 suctions의 시리즈와 함께 인감 파열.</li>
	<li>이 세 (또는 패치 클램프 피 펫) 이동 천천히 왼쪽에서 오른쪽 또는 아래로 전송 (그림 1B)의 활동을 기록 하.</li>
	<li>적어도 5-8 봉우리를 기록 (그림 1C, B A에서).</li>
	<li>구형 파 섭 물개 및 세포 막 커패시턴스 (그림 1)의 품질을 모니터링 하는 녹음 하는 동안 적용 됩니다.</li>
	<li>H+ 플럭스 예측 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) 세포 표면 및 대량 솔루션 (ΔH+) 무료 H+ 농도 차이에서 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> 참고: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> 및 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> H+ 고 확산 계수를 각각, 버퍼 BT 는 총 버퍼 농도, KD 는 버퍼의 분리 상수, r 은 셀 반경, 그리고 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> 무료 H+에 작은 변화에 대 한 바운드 H+ 의 농도에 정상 상태 변화를 결정 합니다. H+ 솔루션 무료 양성자를 나타냅니다. 이전 연구 결과와 일치 하도록 H+ 용 변환 됩니다 electrophysiological 유량 단위는 용의 현재 항목을 계산 하 여 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday) pA3,5].</li>
	<li>셀 크기에서 산출 될 수 있다 세포 표면 또는 막 커패시턴스 양성자 플럭스를 정상화.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

전송기의 중요 한 기능에도 불구 하 고 그들의 활동을 공부에 사용할 수 있는 방법 효과 및 불 충 분 한 있습니다. 한 가지 한계는 사용할 수 있는 방법을 측정 이온 운동 변동 세포내 이온 조성 실험4동안에 고려 하지 않고 전송 활동에 의해 중재입니다. 제시 방법 세포 외 및 세포내 이온의 정확한 제어를 보장 하 고 세포내 이온, 단백질 및 지질 구성3,4,5를 수정 하기 위한 강력한 도구를 제공 합니다.
이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 오랜 기간25안정 하는 ISE의 준비 합니다. 우리의 경험에서는, 불안정 한이 세 아니다 잘 시 (예를 들어, 선택적 이온 수 지가 세 피 펫 양쪽 배분)는이 세 신호에 일정 ...

이온과 플라즈마 막에 걸쳐 용액의 세포의 그리고, 따라서, 생물1의 생존을 위해 필수적 이다. 이온과 용액의 선택적 전송 전문된 채널 및 운송업 자 단백질의 배열에 의해 이루어집니다. 이 단백질에 돌연변이 다양 한 렌더링 약리 치료1채널 및 운송업 자 단백질 잠재적인 목표 임상 조건에에서 수시로 유래한 다. 불행히도, 기본 채널 및 전송 기능 및 규정 하는 메커니즘을 이해 종종 그들의 활동2,,34공부에 사용할 수 있는 방법에 의해 제한 됩니다.
특히, 전송기 분할 될 수 있다 약 하 그들은 용액의 전송 동안 세포 막 횡단 잠재력을 변경 여부에 따라 두 개의 큰 그룹으로: 변경 electrogenic 이온 운송업 자 [예를 들면, 나트륨 인산 염 공동 수송 2a (NaPi2a), 나트륨 칼슘 교환기 (NCX), 등.] 또는 비 변경 electroneutral 이온 운송업 자 [예를 들면, 나트륨-양성자 교환기 (NHE), 염화 나트륨 공동 전송, NaPi2c, 등.]. 전송기의 두 클래스의 활동의 방사성 동위 원소를 사용 하 여 광범위 하 게 연구 하 고 막 permeant 형광 염료2. 두 가지 방법을 특정 세포질 이온의 대량 농도 변화를 측정 하 여 전송기의 활동을 예측 하 고 두 메서드 모두 제한이, 온건한 감도 및 시간 해상도 세포내의 부적절 한 제어 등 환경입니다. 실제로, 많은 전송기의 활동 (예를 들어, NHE3, NCX), 월된 이온의 세포질 농도에 따라 달라 집니다 및 이러한 이온 농도에 변화 전송 활동2 를 조절에 중요 한 역할을 할 것으로 예상 된다 , 3 , 5. 이러한 규정적 메커니즘의 정확한 측정은 고전적인 방법을 사용 하 여 제한.
이러한 한계를 극복 하기 위해 패치 클램프 방법 전송 활동2,6를 공부 하는 데 사용 됩니다. 특히, 클램핑 시스템 패치를 함께 자체 참조 이온 선택적인 전극 (ISEs)7,8 최근 있었습니다 electroneutral 운송업 자 활동3,4 의 측정을 , 5. ISEs는 운송업 자 활동 생성 이온 기온 변화도 세포 막에 가까운 근접에서 사실에 근거한. 이 세 하 고는 반복에 세포 막에서까지 이동, 진동 패션 (µ V)의 전압 차이 기록 합니다. 전압 차이 보급2,9Fick의 첫번째 법률을 적용 하는 교정 메서드를 사용 하 여 이온 플럭스 값으로 변환할 수 있습니다. ISEs는 사용의 밖으로 이동 하는 이온의 유출을 감지 하 세포, 두 전체 셀에 패치 클램프 방법 또는 내부 구성 막 잠재력과 세포내 이온 구성을 제어 하는 데 사용 됩니다. 또한, 응용 프로그램의 거 대 한 패치 클램프 기술 이온 뿐만 아니라 지질과 단백질3,5의 세포내 구성의 수정 수 있습니다.
요약, 패치 클램프 방법의 다양성에 비해 그 공부는 다른 방법의 운송업 자 활동 했다 패치 클램핑 다른 이러한 방법의 일반적인 한계를 극복 하기 위해 적당 한. 자체 ISEs 및 패치 클램프 기술 참조의 조합 electroneutral 전송기 긴밀 하 게 통제 된 실험 환경에서의 활동을 측정 하 고 소설 생물 분자를 독특한 가능성을 제공 합니다. 세포 막의 수송3,,45. 이 접근은 NHE의 활동 공부를 성공적으로 사용 되었습니다. 포유류 NHE 단백질 가족 세포내 양성자 (H+)10,11 안으로 나+ 그라데이션 활용에 대 한 세포 외의 나트륨 (Na+)의 electroneutral net 교환 catalyzes. 포유류, NHE 단백질 가족 11 관련된 단백질 (NHE1-9 및 NHA1-2)와 정자 특정 NHE10,,1213포함 됩니다.
NHEs (SLC9a 가족) 편 높은 진핵생물에 간단한 원핵생물에서 대부분 살아있는 유기 체에서 발견 되 고 중요 한 셀 함수10,11에 셀 염 방어 제어 등의 다양 한 참여 원핵생물, 산 기초 항상성 및 셀 볼륨을 유지 하 고 다양 한 전문된 epithelia10,12,,1415에 소금과 물을 흡수 조절 NHEs의 주요 생물학 역할 및 그들의 기능의 중요성; 여러 연구를 통해 결정 그러나, 몇 가지 연구 방법론 한계4때문에 포유류 NHEs의 속성과 분자 생물 조사 했습니다. 최근, 자체 ISEs 전체 셀 패치 클램핑 하는 동안 참조의 응용 NHE isoforms 이온, 단백질, 인지질3의 세포내 농도 있는 변화에 의해 규제의 새로운 분자 메커니즘을 밝혔다합니다 4.
특히,이 원고에 제공 된 프로토콜 설명 방법 및 활동을 연구 하 고 규제 NHE isoform 3의 (NHE3) 나+, Cl-, HCO3- 및 액체의 흡수에 중요 한 선수에 대 한 접근은 솔 국경 막 신장 및 장 epithelia14,16. 세포내 phosphoinositides에 NHE3 활동의 감도에 차이에 대 한 새로운 통찰력 (phosphatidylinositide 4, 5 bisphosphate [PI (4, 5) P2] 및 phosphatidylinositide 3,4,5 3 인산 염 [PI(3,4,5]P3]) 보고. 채널 및 전송기, 같은 세포 수송 단백질 phosphoinositides17에 의해 통제 되 고 NHE3는 직접 PI (4, 5) P2 및 P3 파이 (3,4,5)18를 바인딩합니다. 현재 문학을 바탕으로, 어느 phosphoinositide NHE35,,1819의 생리 적 또는 병 태 생리 규제에 대 한 관련 수 있습니다. 우리의 연구 결과 PI (4, 5) P2와 파이 (3,4,5) P3 NHE3 활동의 규칙에 대 한 별도 역할을 지원합니다. 이 구별이 세 기술 함께 전체 셀 패치 클램프 기록의 응용 프로그램 때문에 가능 했다. 이 기술에는 또한 NHE3 활동의 측정 하는 동안 다른 phosphoinositides의 세포내 관류를 통해 phosphoinositide 세포 내용 제어할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>패치 클램프 증폭기</td><td>분자 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이중 채널 차동 전위계(HiZ-223)</td><td>Warner</td><td>Instruments 64-1650</td><td></td></tr><tr><td>차동 증폭기(DP-301)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>MatLab 기반 패치 클램프 소프트웨어</td><td>수집 도구 상자</td><td></td> 포함 <td>커패시터 미터 소프트웨어 권장</td></tr><tr><td>ThermoClamp-1 온도 제어 시스템</td><td>&nbsp; AutoMate Scientific</td><td>03-11-LL</td><td>인라인 히터</td></tr><tr><td>단일 채널 온도 컨트롤러 (TC-324C)</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>싱글-배럴 표준 보로실리케이트 유리 튜빙</td><td>월드 정밀 Instruments</td><td>1B120F-3&nbsp; &nbsp;</td><td>이온 선택성 전극에 사용</td></tr><tr><td>마이크로피펫 보관 항아리</td><td>World Precision Instruments</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Bis(dimethylamino)dimethylsilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>탄소 테트라클로라이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319961-500ML</td><td></td></tr><tr><td>수소 이오노포어 I - 칵테일 B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td>얇은 벽 보로실리케이트 튜빙</td><td>&nbsp; Sutter Instrument</td><td>B200-156-15</td><td>패치 클램프 피펫에 사용&nbsp;</td></tr><tr><td>소프트 글라스 (Corning 8161 패치 유리)</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>실리카 캐필러리 튜빙 (150um OD/75um ID)</td><td>Molex (Polymicro Technologies)</td><td>106815-0018</td><td>피펫 내 관류 시스템에 사용됨</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 아스파르테이트&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>A6558</td><td></td></tr>, <tr><td>EGTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>M4880</td><td></td></tr>, <tr><td>mg-ATP</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>A9187</td><td></td></tr>, <tr><td>헤페스,</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>파이프</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>P6757</td><td></td></tr>, <tr><td>걸레,</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>포스파티딜이노시톨(4,5) 비스포스페이트 diC8</td><td>Echelon 생명과학</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

전기 중립 전송기의 활동을 연구 전기 생리학 측정의 응용

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

세포 세포 막을 통해 이온의 수송 이온 콘텐츠 내부 및 외부 셀을 셀 생존을 위한 필수 불가결의 정밀한 제어를 보장 합니다. 이러한 전송 메커니즘 전문된 운송업 자 단백질의 활동에 의해 중재 됩니다. 특히, pH 역학 가늘게 나+같은 플라즈마 멤브레인 양성자 (H+) 압출 시스템에 의해 제어 됩니다 /H+ 교환기 (NHE) 단백질 가족. NHE 레 귤 레이 션을 기본 메커니즘을 연구를 광범위 한 노력에도 불구 하 고 NHE 가족의 속성과 분자 생물의 우리의 현재 이해 부족 하다 NHE 활동을 효과적으로 측정 하는 방법의 한정 된 가용성 때문에 . 이 원고에서는 사용 하는 H+-전체 셀 중 선택적 전극 패치 NHE 유도 H+ 플럭스 측정을 클램핑 기록. 우리는 일반적으로의 약간의 한계를 극복 하기 위해이 방법은 방사성 글귀 등 형광 막 permeants NHE 활동을 측정 하 방법을 사용을 제안 했다. 설명한 메서드를 사용 하 여 NHE 활동의 측정에는 높은 감도 및 시간 분해능 및 세포내 H+ 농도의 효율적 제어 수 있습니다. H+-선택적 전극은 운송업 자 활동 생성 이온 기온 변화도 세포 막에 가까운 근접에서 사실에 근거한. H+-선택적 전극까지 이동 및 반복, 진동 방식에서 세포 막에서 멀리 기록 전압 차이 H+ 유량에 따라 달라 집니다. 동안 H+-선택적 전극 전체 셀 구성에서 패치 클램프 방법 세포내 이온 구성을 제어 하는 셀을 이동 하는 H+ 플럭스 감지 하는 데 사용 됩니다. 또한, 거 대 한 패치 클램프 기술 적용의 이온 뿐만 아니라 지 질의 세포내 구성의 수정 수 있습니다. NHE isoform (NHE3) 3의 운송업 자 활동 phosphoinositides에 의해 NHE3 규정의 분자 기초 연구이 기술 접근을 사용 하 여을 측정 했다.

전체 셀 패치 클램프 기록 중 자체 참조이 세는 phosphoinositides에 의해 NHE3 활동의 규칙을 공부에 적용 되었습니다. PS120 구와 같은 셀24, 생 플라즈마 멤브레인 NHEs의 표현 부족, 사용 되었다. NHE3 야생-타입 (NHE3 wt) 또는 NHE3 돌연변이 하지 않는 바인딩 phosphoinositides [티로신 501, 503 아르기닌과 리 505 알라닌, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)로 대체 했다] PS120 구와 같은 셀18에 안정적으로 표현 했다.
자취는 그림 2에 표시 됩니다. 셀 heldin 패치 클램핑, 피 펫에 의해 전체 셀 구성 되었고 ISE 셀 앞에 배치 했...

이 원고는 양성자 교통 시스템의 활동을 측정 하 양성자-선택적 전극 및 패치 방법 클램핑의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이러한 메서드는 일반적으로 양성자 수송 활동, 적당 한 감도, 시간 해상도 및 부족 한 세포내 환경 제어 등을 연구 하는 데 사용 하는 기술의 몇 가지 제한 사항이 극복.

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

이온 선택성 미세전극과 결합된 거대 패치 방법은 이온 플럭스를 검출하고 정량화하는 데 사용되는 다목적 방법입니다. 구체적으로, 세포막에서 발현되는 전기 중성 이온 수송체, 나트륨-수소 교환기 또는 NHE의 활성에 의해 생성된 양성자 플럭스를 측정하는 데 사용됩니다. 나트륨-수소 교환기는 원형질막에 매우 근접한 양성자의 구배를 생성하며, 여기에 주황색 고리로 표시됩니다.세포막을 가로지르는 이러한 양성자의 구배는 양성자 선택적 미세전극을 사용하는 기술과 결합된 전체 세포 패치 클램프 기록으로 측정됩니다. 양성자 선택성 미세전극은 세포 표면 가까이로 이동하며, 여기서 세포 표면으로부터 멀리 떨어진 위치 A.And 에 표시된 세포로부터 이동하는 양성자의 플럭스를 기록하고, 여기서 위치 B.그리고 나서, 위치 A로 표시된 용액에 존재하는 자유 양성자 농도를 기록하고, 세포막에 가까운 위치 A로 돌아가서, 반복적이고 진동하는 움직임으로. A에서 B까지의 전압 차이가 기록되며 NHE 활동의 대표자에 따라 달라집니다.세포막을 가로지르는 양성자와 같은 수송 이온은 생명에 필수적인 과정에 영향을 미칩니다. 따라서 pH의 변화는 원형질막 양성자 배제 시스템인 나트륨-양성자 교환기를 포함한 분자 배열에 의해 엄격하게 조절됩니다. 전체 세포 패치 클램핑과 결합된 진동 pH 미세전극은 나트륨-양성자 교환기 활성에 의해 매개되는 양성자 플럭스를 연구하는 새로운 접근 방식입니다.이 방법의 적용은 적당한 감도 및 시간 분해능 및 세포 내 환경의 또 다른 우수한 제어와 같은 나트륨-양성자 교환기 활성을 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 기술의 주요 제한 중 일부를 극복합니다. 저는 공동 연구자인 Victor Babich 박사와 함께 이 방법을 시연할 것입니다. 매튜 헨리(Matthew Henry) 박사가 해설을 맡습니다.우리는 장과 신장 상피를 가로질러 물에서 염을 흡수하는 주요 조절자인 나트륨-양성자 교환기 동형 3의 활성을 측정하여 이 방법의 적용을 시연할 것입니다. 양성자 농도 측정을 위한 양성자 선택성 미세 전극은 표준 붕규 유리 튜브로 제작됩니다. 외경이 1.2mm이고 필라멘트가 없는 붕규산 유리 전극은 기존의 이중 당김 프로토콜을 사용하여 수직 풀러로 당깁니다.직경이 2-3마이크로미터인 피펫 팁이 얻어집니다. 피펫은 피펫 팁이 위를 향하도록 하여 용기 홀더에 넣습니다. 다음으로, 피펫을 실리콘화하기 위해 혼합물을 준비합니다.항아리에 붓고 뚜껑을 단단히 닫습니다. 피펫은 24 - 48시간 동안 실리콘화 혼합물과 함께 배양됩니다. 주의를 기울이고, 혼합물을 준비하고 환기가 잘 되는 화학 연기 후드에서 실온에서 피펫을 실리콘화하십시오.피펫에 적절한 이온 선택성 수지를 다시 채우고 피펫 팁이 아래를 향하도록 하여 용기 홀더에 수직으로 조심스럽게 놓습니다. 패치 클램핑을 준비하려면 먼저 기존의 이중 풀 프로토콜을 사용하여 수직 풀러에서 외경이 2mm이고 내부 직경이 1.4mm인 얇은 벽의 붕규산 유리에서 패치 클램핑 피펫을 당기는 것으로 시작합니다. 도립 현미경의 스테이지에 장착된 마이크로포지를 사용하여 넓은 피펫 팁을 만듭니다.피펫을 마이크로포지의 두꺼운 백금 와이어 가까이에 놓습니다. 전류를 켜고 끄는 것을 제어하는 풋 스위치를 사용하여 난방을 켭니다. 마이크로포지의 두꺼운 백금선 중간을 덮고 있는 저융점 유리를 가열한 다음 피펫 팁을 용융된 연질 유리에 가깝게 이동합니다.가열은 백금 와이어를 중심쪽으로 약간 이동합니다. 백금 와이어가 초기 위치로 돌아가고 파이펫 팁이 파손됩니다. 원하는 팁 직경을 얻을 때까지 절차를 반복하고 마지막으로 열을 가하여 팁을 매끄럽게 만듭니다.피펫 팁은 마이크로포지로 연마한 후 직경이 10마이크로미터입니다. 두꺼운 백금선을 사용하면 전기를 켠 후 팽창이 적고 과도한 전류로 전선과 피펫이 과열될 가능성이 적다는 장점이 있습니다. 트립신을 사용하여 세포를 해리하고 트립신화를 차단한 후, 세포는 덩어리 형성을 방지하기 위해 흔들림이 있는 셰이커에서 유지됩니다.이 작업은 트립신화 후 최대 2시간 동안 수행됩니다. 전기 생리학 설정은 관류 시스템에서 용액의 온도를 조절하는 온도 컨트롤러로 구성됩니다. 모든 실험은 약 섭씨 37도에서 수행됩니다.및 형광 이미징을 위한 필터 휠을 제어하는 광학 필터 스위처. 관류 시스템 밸브의 개폐를 조절하는 관류 시스템 밸브 컨트롤러. 및 온도 조절기는 기록 챔버의 온도를 조절합니다.파형을 관찰하기 위한 오실로스코프와 패치 클램프 증폭기. 이 Capmeter 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터입니다. 및 이온 선택성 미세전극 신호를 기록하는 전위계를 포함한다.및 전위계의 신호를 증폭하는 차동 증폭기를 포함한다. 전기 생리학 설정에는 스테이지 컨트롤러가 있는 도립 현미경, 현미경의 왼쪽과 오른쪽 위치에 배치된 컨트롤러가 있는 두 개의 마이크로 매니퓰레이터, 인라인 용액 히터가 있는 관류 시스템도 장착되어 있습니다. 이온 선택성 미세전극 피펫을 미세조작기에 장착한 후 패치 클램핑 피펫을 세포 내 용액으로 다시 채웁니다.용액이 피펫 끝에 도달하는지 확인하십시오. 피펫 끝의 기포를 제거하기 위해 몇 번의 부드럽게 두드려야 할 수도 있습니다. 그런 다음 패치 클램핑 피펫을 전기생리학 설정의 헤드 스테이지에 장착합니다.건강하게 보이는 세포를 정의된 부피의 수조 용액으로 채워진 기록 챔버로 부드럽게 옮깁니다. 헤드 스테이지를 수평축과 45도 각도로 유지하는 것이 중요합니다. 이는 고내성 밀봉 형성에 적합한 피펫의 진입 각도를 보장합니다.패치 클램프 피펫이 수조 용액에서 내려져 있는 동안 피펫에 소량의 양압을 가하여 팁이 막힐 가능성을 줄입니다. 셀을 선택하고 소량의 양압으로 접근합니다. 팁이 세포에 가까워지면 패치 클램프 피펫의 이동을 중지합니다.수조 용액의 이온 선택성 미세전극을 패치 클램프 피펫 팁과 동일한 초점면이 될 때까지 내립니다. 피펫이 셀 중앙에 위치할 때 소량의 음압을 가하여 밀봉을 시작합니다. 몇 초 내에 메가 옴 밀봉을 얻을 수 있습니다.유지 전위가 증폭기에 의해 유지되는지 확인하십시오. 마지막으로, 일련의 짧은 흡입 펄스로 세포막을 파열하고 기록을 시작합니다. 자이언트 패치 기록 방법을 사용하면 피펫 내 관류 시스템을 통해 유리 피펫에서 용액을 빠르게 관류하여 이온, 지질 및 단백질의 세포 내 함량을 수정할 수 있습니다.이온 선택성 미세전극 피펫을 패치 클램프 피펫이 고정하는 셀 가까이에 배치하고 이온 선택성 미세전극 피펫을 셀 안팎으로 이동하여 발진을 시작합니다. 이 기술을 적용하면 나트륨-수소 교환기의 분자 조절을 연구할 수 있습니다. 자이언트 패치(giant patches) 방법을 활용하여 ATP와 지질의 세포 내 조성을 피펫 내 관류 시스템에 의해 수정했습니다.세포 내 ATP를 가수분해하고 포스포이노시티드 함량을 감소시키는 아피라제의 세포 내 관류는 NHE 동형 3 활성을 50% 감소시켰습니다. NHE3 활성에 대한 아피라제 효과는 포스포이노시티드, PIP2의 세포 내 관류에 의해 역전되지 않았습니다. 그러나 포포이노시티드(phophoinositide, PIP3)의 세포 내 관류에 의해 역전되었습니다.NHE 활성의 측정은 양성자 선택성 미세전극과 패치 클램핑 방법을 결합하는 이점을 활용합니다. 이를 통해 포스포이노시티드와 다운스트림 신호 캐스케이드에 의한 NHE의 차등 조절 뒤에 있는 분자 기초를 연구할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 모든 세포 패치 클램핑과 결합된 진동 pH 미세 전극을 사용하여 나트륨-양성자 교환기의 활성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.그리고 방법의 가능한 적용의 예.

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오세영, K와 H, K-ATPase에 의해 양이온 교통 측정<em&gt; Xenopus</em원자 흡수 분광 광도법에 의한&gt; Oocytes : 방사성 동위 원소의 Assays에 대한 대안

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이온 선택적 자체 참조 미세 전극 기술을 이용하여 세포 외 이온 플럭스 측정

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