Name: 절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 배우세요 뇌 발달 중 H3K79me2 히스톤 수정을 분석하는 ChIP 방법입니다. 소뇌 신경 전구세포를 분리 배양하여 후성유전학적 변화를 연구하고 신경생물학 메커니즘을 규명하는 데 활용됩니다.

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우리 감사 Henriette Bertemes 실험실 내 CGN 재배 프로토콜을 설정 하는 데 도움. 이 방법은 종이 DFG 투자 CRC992 의료 Epigenetics tv 자금으로 지원 했다. 저자 인정 프라이부르크 갤럭시 팀의 지원: Pavankumar Videm, 비 Grüning와 교수 Rolf Backofen, 생물 정보학, Freiburg의 대학, 독일 공동 연구 센터 992 의료 Epigenetics (DFG 부여 SFB 992/1 2012)에 의해 투자 독일 연방 교육부의 교육 및 연구 (BMBF 그랜트 031 A538A 로얄 (드. NBI))입니다.

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심 선언

히스톤 수정, 녹음 방송 요인, 히스톤 코드 독자, 작가, 또는 지우개의 게놈 인 검출 하기 chromatin immunoprecipitation를 수행 하기 위해 두 가지 주요 방법이 있다. 하나는 nuclease 소화, immunoprecipitation에 대 한 네이티브 chromatin를 사용 하 여 네이티브 칩 방법 이며 다른 PFA 고정, 전단 chromatin, 있는 nucleosomes와 다른 DNA 연결 단백질 covalently에 바인딩된 DNA를 사용 하 여 제시 방법 39. 네이티브 칩의 높은 항 체 탐지 레이트와 히스톤 메 틸 화는 염색 질부터 적용 해야 및 히스톤 methylations는 칩에 걸쳐 상대적으로 안정적인. 하지만 시작 물자의 다량이 필요 하 고, 그것에 적용 되지 않습니다 대뇌 나 소 뇌 개발 공부 마우스 두뇌 세포의 수는 일반적으로 제한. 우리는 항 체는 특별히 감소 H3K79me2 신호 칩 정량 분석 및 immunoblots (<strong c...

두뇌의 감각, 모터, 및 인식 함수는 매우 복잡 하 고 물리적, 환경 변화에 취약 합니다. 깊이 연결 되는 3 개의 일반적인 부품은 뒷 다리-, 중간-및 개, 두뇌에 의하여 이루어져 있다. 개, 내는 telencephalon 등 telencephalon (DT)와 복 부 telencephalon (VT)으로 나눌 수 있습니다. 6 대뇌 피 질의 레이어 E11.5와 E18.5 사이 "내부-아웃" 방식으로1에서 형성 되는 쥐의 DT에 의하여 이루어져 있다. 버몬트 나중 형성 기초 중추2,3개발에 절 정령을 포함 합니다. 여러 종류 나눌 수 있다 신경, 이다, 또는 oligodendrocytes4같은 포유류 중추에서5영역 공간으로에서 발전 하는. 첫째, 신경 조상 세포 (Npc)에 게 상승 다른 종류의 뉴런, 버몬트, 및 프로젝션 뉴런 수 DT에서 그리고 glial 세포 (예를 들면, 이다6) 나중에. 대뇌 피 질의 개발, 가장 표면 층 (전 층), 먼저 형성 된다 Cajal Retzius 셀 포함. 다음, E12.5 및 E14.5, 사이 NPCs 더 깊은 신경 층 (VI, V) 동안 14.5, 16.5, 창시자 줄 상승 상위 레이어 (4-II) 신경7,8사이 생성합니다. 신경 정체성 다른 morphogen 유발 영역 공간 transcriptional 프로그램 및 또한 epigenetic 프로그램2에 의해 지정 됩니다.
모터 조정에 연루는, 소 뇌는 hindbrain에 있으며, 쥐9E10 사이 대략 P20 개발. 그것은 소 뇌 피 질과 소 뇌 핵10포함 되어 있습니다. 3 레이어, 가장 뒤쪽 분자 층, Purkinje 세포 층 그리고 포함 하는 세부적인 신경10안쪽 세분화 된 계층 성인 소 뇌 피 질에 의하여 이루어져 있다. 소 뇌과 립 세포 작은 신경 이며11척 추가 있는 두뇌 모든 뉴런의 약 80%를 나타냅니다. 그들은 선구자 외부 새싹 영역에서 개발 하 고 그들의 대상12Purkinje 세포 층을 통해 이동. 처럼 telencephalon에서 소 뇌의 개발은 몇 가지 중요 한 morphogens에 의해 규제 됩니다, 어떤 특정 시간 및 공간 종속 기능을가지고 시작 정의 transcriptional 프로그램10.
대뇌와 소 뇌 레이어의 개발 특정 morphogens의 transcriptional 식으로 하 고, 따라서, DNA의 염색 질 상태에 의해 제어 됩니다. 단순화 된 보기에서 chromatin 상태 transcriptionally 활성화로 euchromatin와 섬으로 transcriptionally 자동 영역으로 나눌 수 있습니다. Chromatin의 기본 단위로 nucleosome의 복사본 두 개가 각 코어 히스톤 H2A, H2B, H3, H4, 둘러싸인 147 기본적인 쌍 DNA13의 포함 되어 있습니다. 히스톤 메 틸 화, acetylation, 인 산화, ubiquitination, sumoylation, ADP ribosylation, 탈, 그리고 프롤린 isomerization14,15post-translationally 높은 수정 됩니다. 히스톤 lysine 메 틸 화 녹음 방송, 복제, 재결합16, DNA 손상 응답17및 게놈 각 인18제어 하는 가장 안정적인 히스톤 수정 될 여겨진다. Lysines 모노, 디, 또는 트라이 갠19 하 고 액세스할 수 히스톤 꼬리에 뿐만 아니라 히스톤20의 구형 도메인 내의 표시 수 있습니다. H3K4 및 H3K36에 특정 methylations euchromatin와 주로 관련 된, 모든 잔류물은 히스톤 꼬리14, 내에 있는 특정 methylations H3K9, H3K27, 또는 H4K20에 주로 heterochromatic 지구에서 발견은 19,21. H3K79 메 틸 화는 히스톤 구형 도메인 내에 있는 이며 transcriptional 활동, 뿐만 아니라 transcriptionally 불활성 게놈 지역22와 연결 되었습니다. 수정이 효 모, 송아지 흉 선, 닭, 및 인간의23에서 관찰 되었습니다 때문에 진화론 보존 됩니다. H3K79 모노, 디, 및 trimethylation (H3K79me1, me2, me3) 히스톤 methyltransferases DOT1L,2425 와26핵 설정된 도메인에 포함 된 단백질 2 (Nsd2) 의해 촉매 된다. DOT1L 확산, DNA 수리, 및27reprograming 휴대에 연루 이다. 쥐에서 Dot1l 의 손실 발달 단계 E10.5,2829주위 태아 죽음에 이르게. 심장 개발 및 myocardiocyte 차별화, DOT1L 유전자 표현 규칙30에 대 한 필수적입니다. 중앙 신 경계에 DOT1L 기능 신경 튜브 개발31에 연루 수 있습니다, 그것은 Tbr1억제에 관여-개 개발32, 중 식 그리고 ER 스트레스의 규정에서 작동 수 있습니다 응답 유전자33. 부분적으로 이해 하는32만 맞는 활성화 또는 억압 작업과 H3K79me의 특히 중앙 신경 시스템의 개발 같은 경우 vivo에서 날짜입니다. H3K79 메 틸 화는 히스톤 3의 구형 도메인에 위치 하 고 있습니다, 이후 그것은 sterically 유연한 히스톤 꼬리23에 수정에 비해 액세스. H3K79 메 틸 화의 기능을 이해 하려면 그것의 위치 및 게놈 환경 결정을 신뢰성과 재현성 분석 방법 필요 합니다. 이 방법 종이에서는 다른 신경 창시자 (피 질에 대 한 Cpc) 및 소 뇌에 대 한 CGNPs, 효과적인 DOT1L 억제제 치료, 및 칩 메서드 분석 정량 또는 다른 시간에 시퀀싱을 통해 메 틸 H3K79를의 격리 방법 소개 대뇌와 소 뇌 개발 하는 동안 포인트입니다. 에 대 한 프로토콜 및 그것의 가능성의, 그림 1을 참조 하십시오.

<table><tbody><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>Category: 항체 약어/코멘트: Immunoblot 희석 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Diagenode</td><td>pAb-051-050</td><td>Category: 항체 약어/코멘트: ChIP 항체</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Abcam</td><td>ab-051-050</td><td>카테고리: 항체 Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-rabbit-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15410206</td><td>분류: 항체 약어/논평: ChIP Ctrl 항체</td></tr><tr><td>Anti-Tubulin alpha</td><td>Abcam</td><td>ab108629</td><td>분류: 항체 약어/논평: Immunoblot 희석 1:3000</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin (1 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td>Category: Cell culture 약어/코멘트: CCM</td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>카테고리: 세포 배양 약어/코멘트: CCM</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent technologies</td><td>G2940CA</td><td>분류: ChIP 약어/논평: 전단 염색질</td></tr><tr><td>Bioruptor NextGen</td><td>Diagenode</td>의 분석을 위해 <td>B01020001</td><td>분류: ChIP 약어/논평: 초음파기</td></tr><tr><td>붕산 pH 8.4</td><td>시그마 알드리치</td><td>B6768</td><td>분류: 세포 배양 약어/논평: CPC 배양 CFX</td></tr><tr><td>Connect RT PCR 검출 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td>분류: ChIP 분석 약어/논평: qPCR</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td> <td>검출 시스템분류: 세포 배양 약어/논평: CGM</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10001D</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Comment: 자성 비드, ChIP</td></tr><tr><td>EPZ-5676</td><td>Selleckchem</td><td>S7062</td><td>Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: 세포 배양에서 DOT1L 억제 에</td></tr><tr><td>틸렌디아민 테트라아세트산</td><td>SERVA</td><td>39760.01</td><td>카테고리: ChIP 약어/코멘트:</td></tr><tr><td>EDTA 소 태아 혈청 10% (v/v)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td>Category: Cell culture Abbreviation/Comment: CPC 분리 및 CGM</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Category: Cell culture Abbreviation/Comment: CGNP 분리</td></tr><tr><td>글루타티온(1.25 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td>분류: 세포 배양 약어/코멘트: CCM</td></tr><tr><td>글리신</td><td>Carl Roth</td><td>3187</td><td>분류: ChIP 약어/논평: 세포 고정용</td></tr><tr><td>GoTaq mastermix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: qPCR 행크용 DNA 중합효소 마스터 믹스</td></tr><tr><td>' s Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025-100</td><td>카테고리: 세포 배양 약어/코멘트: HBSS</td></tr><tr><td>L-글루타민 (200 mM)</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>25030081</td><td>카테고리: 세포 배양 약어/코멘트: CCM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>의 경우L2020</td><td>분류: 세포 배양 약어/코멘트: 염화</td></tr><tr><td>리튬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td>카테고리: ChIP 약어/코멘트: LiCl</td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td>분류: 세포 배양 약어/코멘트: CGM</td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher</td><td>3300</td><td>카테고리: ChIP 약어/코멘트: DNA 정량화를 위한 형광 분광계</td></tr><tr><td>NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645S</td><td>Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Library preparation Kit</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina</td><td>NEB</td><td>E7335</td><td>Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library</td></tr> preparation <tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Category: Cell culture Abbreviation/Comment: CCM</td></tr><tr><td>NP-40 Alternative</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Comment: ChIP 버퍼</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Carl Roth</td><td>335</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Comment: PFA, 세포 고정</td></tr><tr><td>페니실린 - 스트렙토 마이신 - 네오 마이신 1 % (v / v)</td> <td>생명 기술</td><td>15640055</td> <td> 카테고리 : 세포 배양 약어 / 코멘트 : PSN, CCM 및 CGM</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td>Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation</td></tr><tr><td>PicoGreen Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11496</td><td>카테고리: ChIP 분석 약어/코멘트: DNA 정량화를 위한 염료 시각화</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Category: Cell culture 약어/코멘트: CGNP 분리</td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td>카테고리: 세포 배양 약어/코멘트: CPC 배양</td></tr> 염화<tr><td>칼</td>륨 <td>Thermo Fisher</td><td>AM9640G</td><td>분류: 세포 배양 약어/코멘트: KCl, CGM</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td>카테고리: ChIP 약어/코멘트: ChIP</td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td>분류: ChIP 약어/논평:</td></tr><tr><td>ChIP Qiagen MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>분류: ChIP 약어/논평:</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>분류: ChIP 약어 / 코멘트 : ChIP</td></tr><tr><td>SGC0946</td><td>Selleckchem</td><td>S7079</td><td>카테고리 : DOT1L 억제 약어 / 코멘트 : 세포 배양에서 DOT1L 억제</td></tr> 중<tr><td>탄산 나트륨</td><td>Carl Roth</td><td>8551.1</td><td> 카테고리 : ChIP Abbreviation / Comment : 용 용리 완충</td></tr>액 염화<tr><td>나트륨</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>카테고리 : ChIP 약어 / 코멘트 : NaCl, ChIP 버퍼</td></tr><tr><td>나트륨 deoxycholate</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>30970</td><td>카테고리 : ChIP 약어 / 코멘트 : ChIP</td></tr><tr><td>나트륨 dodecylsulfate</td><td>Carl Roth</td><td>183</td><td>카테고리 : ChIP 약어 / 코멘트 : SDS, ChIP</td></tr><tr><td>소닉 고슴도치 (SHH)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>SRP6004</td> <td>< 강한> 카테고리 : 세포 배양 약어 / 코멘트 : CGNP 분리</td></tr><tr><td>용 Superoxide dismutase (1mg / ml)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>S7571</td><td>분류: 세포 배양 약어/코멘트: CCM</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Carl Roth</td><td>9090</td><td>카테고리: ChIP 약어/코멘트: TRIS, ChIP 버퍼</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>X100</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Comment: ChIP 버퍼</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59417C</td><td>Category: Cell culture Abbreviation/Comment: CPC 격리</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Carl Roth</td><td>28320</td><td>Category: ChIP Abbreviation/Comment: 비드 준비용</td></tr><tr><td>기타 실험실 장치: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCM: Cortical cell medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CGM: CGNP 세포 배양 배지</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

절연 및 신경 창시자 chromatin-immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 dimethylation 마크의 뒤의 재배

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

두뇌 개발 transcriptional 프로그램과 다른 morphogens의 기울기로 영역 공간 방식으로 제어 되는 복잡 한 과정 이다. 또한, 히스톤 메 틸 화 처럼 epigenetic chromatin 수정 설치 하 고이 프로세스에서 특정 세포 운명을 유지에 대 한 중요 한 역할이 있다. 대부분 히스톤 메 틸 화는 히스톤 한정자, 지우개, 및 히스톤 리더 단백질 유연한 히스톤 꼬리에 발생 합니다. 대조적으로, H3K79 메 틸 화는 히스톤 3의 구형 도메인에 있으며 다른 발달 기능에 연루. H3K79 메 틸 화 봤을 보존 하 고 찾을 수 있습니다 다양 한 종에서에서 호모 사피엔스 에서 Saccharomyces cerevisiae. 수정 신경 창시자를 포함 한 유기 체 내의 다른 세포 인구에서 발생 합니다. 히스톤 3의 구형 도메인에서 H3K79 메 틸 화의 위치는 평가 하기 어려운 있습니다. 여기, 우리가 격리 하는 방법을 제시 하 고 문화 대뇌 피 질의 조상 세포 (Cpc) 배아 대뇌 피 질의 뇌 조직 (E11.5-E14.5) 또는 소 뇌과 립 상 신경 창시자 (CGNPs)에서 출생 후 조직 (P5-P7), 그리고 효율적으로 immunoprecipitate에서 정량 PCR (정량) 및 게놈 넓은 시퀀싱에 대 한 H3K79me2.

신경 조상 격리, 재배, H3K79me2 칩과 칩 분석 방법의 일반적인 계획: 그림 1 H3K79me2 칩 또는 소 뇌과 립 상 신경 창시자의 미 발달 두뇌 개발 하는 동안 다른 시간 지점에서 대뇌 피 질의 조상 세포의 출생 후 단계에서 수행 하는 순서도 보여 줍니다. 첫 번째 단계로 뇌 격리 하 고 telencephalon (E11.5 E14.5 사이) 또는 소 뇌 (P5-P7)을 검색할 수 있다. DT는 VT로 나누어는 telencephalon의 다른 지구를 분석 가능 이후에 조직 균질 것 이다 고 신경 창시자 차별. 지금, 그것은 뿌리 세포 문화 DOT1L 억제제와 그들을 치료 하입니다. 또 다른 가능성은 창시자를 직접 수정 하 여 칩 절차 그들의 대상이입니다. 칩,는 chromatin 200-500 bp의 조각으로 전단 고 H3K79me2에 대 한 자석 구슬 결합 항 체로 그 후 ...

우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.

절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

이 절차의 전반적인 목표는 뇌 발달 중, 특히 대뇌 피질과 소뇌에서 후성유전학적 변형을 분석하는 것입니다. 이 방법은 H3K79 메틸화와 같은 히스톤 변형이 피질 및 소뇌 층의 발달에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지와 같은 신경 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특정 발달 시점에서 별개의 뇌 영역에서 유전자좌 특이적 또는 게놈 전체의 히스톤 변형을 생체 내에서 연구할 수 있다는 것입니다.P5에서 P7까지의 뇌와 MRI 마우스로 시작합니다. 모든 수막과 혈관을 제거하십시오. 그런 다음 칩당 3-5개의 소뇌를 15ml 튜브로 옮깁니다.원심분리 전에 소뇌를 HBSS 포도당으로 세척합니다. 조직을 수집하기 위해 튜브를 원심 분리하십시오. 최종 세척 후, 단편의 크기가 0.5에서 1 세제곱 밀리미터가 될 때까지 1 밀리리터 피펫으로 2-3회 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 소뇌를 균질화합니다.2.5ml가 남을 때까지 모든 액체를 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 대뇌가 포함된 HBSS 포도당이 있는 튜브에 0.05%트립신을 추가합니다. 그리고 조직을 섭씨 37도의 수조에서 15분 동안 배양합니다.1분에서 3분마다 조직을 뒤집습니다. 배양 후 CGNP 세포 배양 배지(CGM) 5ml를 첨가하여 분해를 중지하고 이전과 같이 원심분리로 조직을 수집합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 1mL CGM을 첨가합니다.1ml 피펫 팁으로 조직을 분쇄하여 기포 형성을 방지합니다. 그런 다음 CGM 5ml를 넣고 얼음 위에서 2분 동안 혼합물을 배양하여 조직 잔여물을 가라앉힙니다. 조직이 안정되면 상층액을 새로운 15ml 튜브로 옮깁니다.그런 다음 잔류 조직에 2ml의 CGM을 추가하고 상층액을 수확하고 조직 잔여물을 버리기 전에 분쇄 절차를 반복합니다. 각 15ml 튜브의 조직과 원심분리기에서 상층액을 모아 소뇌 세포를 수집합니다. 펠릿을 10밀리리터의 CGM에 재현탁합니다.성상세포는 CGNP보다 폴리-D-라이신에 더 빠르고 강하게 부착하기 때문에 폴리-D-라이신으로 코팅된 6-웰 플레이트의 웰에 최대 4ml의 세포 현탁액을 추가하고 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하여 성상세포를 제거합니다. 플레이트를 흔들어 15ml 튜브에 상층액을 모은 다음 이전과 같이 상층액을 원심분리합니다. 펠릿을 10ml의 CGM에 재현탁하고 Neubauer 계수 챔버로 세포를 계수합니다.4-6시간 후에 부착된 CGNP가 둥글게 나타나고 증식합니다. 폴리-L-오르니틴 코팅 플레이트에 CGM으로 세포를 파종하고 섭씨 37도, 5%CO2 및 100% 상대 습도에서 배양합니다. 시험관 내 또는 DIV1 하루 후 대부분의 CGNP는 둥글고 증식합니다.일부 CGNP는 분화를 시작하고 신경 돌기의 성장을 시작합니다. 배양된 세포를 고정하려면 CGNP가 포함된 웰에 최대 1ml의 1%PFA를 직접 첨가합니다. 섭씨 22도에서 5분 동안 배양한 후 53마이크로리터의 글리신을 넣고 얼음처럼 차가운 PBS 3ml로 두 번 세척합니다.세포 스크레이퍼를 사용하여 1ml의 PBS에서 세포를 수확합니다. 세포를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 1, 000 g 및 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. 상층액을 제거한 후 프로테아제 억제제가 함유된 용해 완충액 700마이크로리터를 첨가하고 섭씨 4도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.이 시간 동안 5분마다 샘플을 소용돌이칩니다. 배양 후 샘플 튜브를 나누어 부피가 튜브당 400마이크로리터를 초과하지 않도록 합니다. 그런 다음 최대 전력으로 10분 동안 초음파 처리하여 용해 세포의 염색질을 전단합니다.10 분 후, 샘플을 소용돌이 한 다음 초음파 처리와 소용돌이를 두 번 더 반복합니다. 위상차 현미경 또는 DAPI를 사용한 형광 현미경으로 용해물에 남아 있는 핵을 확인합니다. 13, 000g 및 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 세포 잔여물을 펠릿화합니다.완료되면 사전 세청 단계에 상등액을 사용합니다. 샘플을 사전 세척하려면 먼저 샘플당 20마이크로리터의 비접합 자성 비드를 얼음처럼 차가운 PBS Tween에서 세척합니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 세척물을 제거하십시오.그런 다음 600마이크로리터의 희석 완충액과 20마이크로리터의 세척된 마그네틱 비드를 각 샘플에 추가하여 사전 세정하고 회전체에서 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 제거합니다. 그런 다음 각 용해물의 5%를 입력 샘플로 취하여 섭씨 영하 20도에서 동결합니다.항체 결합은 샘플이 사전 세척되는 동안 수행될 수 있습니다. 이전과 같이 칩당 45마이크로리터의 단백질 A 마그네틱 비드를 얼음처럼 차가운 PBS 트윈으로 세척합니다. 마지막 세척 후 구슬에 얼음처럼 차가운 PBS 1ml를 추가합니다.그런 다음 비드 45마이크로리터당 3마이크로그램의 항체를 추가합니다. 항체를 비드에 결합하기 위해 로테이터에서 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양합니다. 배양 시간이 경과하면 세척된 항체 결합 비드를 얼음처럼 차가운 PBS의 한 비드 부피에 재현탁합니다.사전 세척된 각 추출물을 약 643.5마이크로리터의 튜브 2개로 나눕니다. 동일한 부피의 희석 완충액과 항체 결합 비드를 추가하고 rotator에서 밤새 섭씨 4도에서 샘플을 배양합니다. 다음 날, 섭씨 4도의 로테이터에서 각각 10분씩 얼음처럼 차가운 칩 버퍼로 비드를 1번에서 3번 세척한 다음 TE 버퍼로 5분씩 3번 세척합니다.용리 완충액을 추가하고 실온의 셰이커에서 1, 400RPM으로 1시간 동안 희석합니다. 시간이 경과하면 각 칩 샘플에 10마이크로그램의 Rnase를 추가하고 입력 샘플에 5마이크로그램을 추가합니다. 셰이커에서 샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.마지막으로, 칩 샘플당 100마이크로그램의 Proteinase K와 입력당 50마이크로그램을 추가합니다. 섭씨 65도에서 1, 400 RPM으로 밤새 배양하십시오. H3K79 디메틸화 수준은 SGC 0946에 의한 CPC 배양 및 DOT1L 억제 3일 후에 감소합니다.칩 분석 후 QCPR은 기준선에서 히스톤-3-라이신-79 메틸화 수치가 높은 유전자가 억제제 치료에 가장 잘 반응하는 것으로 밝혀졌습니다. H3K79 디메틸화 범위가 낮은 유전자는 메틸화 수치에 큰 변화가 없었다. 이 히트 맵은 히스톤-3-라이신-79 메틸화 수준이 전사 시작 부위 주변에서 최고조에 달하고 전사 종료 부위로 갈수록 감소함을 보여줍니다.일단 숙달되면 이 기술은 제대로 수행되면 약 일주일 안에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 분리된 뇌 세포의 히스톤 변형에 대해 염색질 면역침전을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

isolation-cultivation-neural-progenitors-followed-chromatin

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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출처: Mendez, F. M. et al., 쥐 뇌 종양 신경구를 사용한 네이티브 염색질 면역침전.J. vis. 특급 (2018). 이 비디오는 천연 염색질 면역침전을 사용하여 마우스 뇌종양에서 유래한 신경구 세포에서 단백질-DNA 복합체를 분리하는 방법을 보여줍니다. 염색질 준비, 면역침전, 세척 및 단백질 분해를 위한 단계를 자세히 설명하여 다운스트림 분석을 위해 DNA를 방출합니다.

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탠덤 chromatin 위한 단계별 프로토콜 설명 immunoprecipitation 시퀀싱 (tChIP-Seq) 셀 형식 관련 게놈 넓은 히스톤 수정의 분석을 가능 하 게.

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