Name: 일시적인 수용 체 잠재력 Vanilloid 타입-1의 Ultrapotent 주 작동 근의 순수한 작은 섬유 신경 병 마우스 모델 수립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 학습하세요 RTX를 이용한 소형 섬유 신경병 마우스 모델 수립 방법을. 50 µg/kg 용량으로 감각 신경 손상 메커니즘을 연구하고 통증 병태생리학을 탐구할 수 있습니다.

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이 작품은 사역의 과학 및 기술 (106-2320-B-037-024), 카오 슝 의과대학 (KMU-M106028, KMU-S105034) 및 상위 대학 그랜트 (TP105PR15), 카오 슝 의과대학, 대만 대 한 목표에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

설명 하는 모든 절차는 실험실 동물30에 대 한 윤리 지침에 따라 그리고 프로토콜 동물 위원회의 가오슝 의학 대학, 가오슝, 대만 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 설립 RTX 신경의
주의: RTX은 신경 하 고 위험한. 접촉, 그것은 상부 호흡기, 점 막, 눈 자극 역할. 흡입을 방지 하 고 RTX 준비 하는 동안 실험실 안경, 코트를 착용. 충분 한 피부 접촉 또는 처리 후 물으로 씻어.
<ol><li>트윈 80 및 절대 에탄올 (각 용 매에 대 한 100 µ L)의 동등한 양의 혼합물의 200 µ L를 RTX 분말의 1 밀리 그램을 추가 합니다.</li>
	<li>약 수 RTX 솔루션 (12 µ L/유리병) 최대 3 개월 동안-20 ° C에서 저장. 이 구성 RTX 주식; 만료에 나머지 RTX 솔루션을 삭제 합니다.</li>
	<li>RTX 주식 600 µ L의 최종 볼륨을 일반적인 염 분을 희석. RTX 솔루션의 최종 농도 0.01%, 10 µ L 차량 솔루션에서 1 µ g RTX와 같은 이어야 한다.</li>
	<li>8 주 오래 된 성인 남성 ICR 마우스 (35-40 g)를 사용 하 여 실험 동물로 RTX 솔루션의 단 하나의 복용량을 관리 하 고 (복용량: 200, 50, 및 10 µ g/k g, 각각) intraperitoneally (i.p.) 쥐에 microinjection 주사기. 마우스 깊은 마 취에 대 한 5 %isoflurane 흡입기에 의해 anesthetized 되었습니다. 마우스 RTX 주입 중 사지의 철수 작업 면, 쥐 더 이상 흡입 마 취의를 취해야 한다. 예: 마우스 무게 40 g, 경우 다음 그것은 받을 것 이다 50 µ g/kg의 복용량을 나타내는 RTX 솔루션의 20 µ L.</li>
	<li>컨트롤 1 쥐 그룹이 차량 (10% 트윈 80 및 10% 절대 에탄올에 염 분 해결책)의 동일한 볼륨을 줄.</li>
	<li>RTX 주입 후는 12 h 빛/12-h에 어두운 플라스틱 케이지를 마우스 주기 및 음식을 제공 및 광고 libitum물 반환 합니다.</li>
</ol>2입니다. Neuropathic 행동의 평가
참고: 주사 후 복구를 허용 하도록 편안한 환경 (단계 1.6)에서 동물을 유지 한다. 7 일 게시물 RTX 주사 (D7), 각 동물 행동 테스트의 효율성을 증진을 시간을 줄이고 같은 날에 핫 플레이트와 폰 Frey 머리 필 라 멘 트 테스트를 수행 합니다. 동물 순응을 최적화 하 고 행동 테스트 하는 동안 환경에 미치는 영향을 감소에 대 한 조용한 방에 안정적인 습도 (40%)와 온도 (27 ℃)에서 유지 관리 하는 동물을가지고. 테스트 기간; 동물을 방해 하지 마십시오 행동 테스트는 매주 계획 하 고 있다.
<ol><li>핫 플레이트 테스트와 열 대기의 측정<ol>
<li>투명 한 유리 야 케이지로 부드럽게 금속 핫 플레이트 (27 cm × 29 cm)에 동물을 배치 (길이 × 너비 × 높이: 22 cm × 22 c m × 25 cm; 그림 1A)입니다. 52 ° c 금속 열판의 온도 설정</li>
		<li>일단 동물의 hindpaws 핫 플레이트를 터치 하 고 동물의 hindpaws의 응답을 관찰 핫 플레이트의 단계에, 내장 된 타이머와 함께 핫 플레이트에 동물의 열 대기 기간을 측정 시작. 동물 경우 떨고, hindpaws의 사슬 또는 뜨거운 접시에 그것을 제거 하 고 동물 뜨거운 접시에 남아 있는 기간을 기록. 이 기간 개별 동물의 열 대기 시간을 정의합니다. 가장 가까운 0.1 열 대기 시간 기록 s.</li>
		<li>각 테스트 세션에 대 한 응답 정규화 후 마지막 핫 플레이트 테스트에 대 일 분 간격으로 3 개의 시험을 수행 합니다. 25 후 세션을 중지 하는 동물 핫 플레이트에 응답이 없을 경우, 잠재적인 조직 손상을 방지 하는 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>폰 Frey 머리 필 라 멘 트와 함께 기계적 임계값의 측정 테스트<ol>
<li>사용자 지정 된 금속 메쉬에 동물을 넣어 (메쉬 크기: 5mm × 5mm) 반투명 실린더 유리 야 케이지로 (직경: 13 cm, 높이: 12cm) (그림 1B) 적어도 2 시간에 대 한 순응에 대 한.</li>
		<li>폰 Frey 머리 필 라 멘 트의 다른 구경 위아래 메서드31hindpaw의 발바닥의 영역에 적용 됩니다. 5-8 s의 필 라 멘 트 적용 기간에 대 한 폰 Frey 머리 필 라 멘 트의 세트의 중간 힘에서 초기 응용 프로그램을 시작 합니다.</li>
		<li>동물 정규화를 최적화 하기 위해 응용 프로그램 필 라 멘 트 사이 2 분 간격을 사용 합니다. 동물의 마지막 응답에 따라 적용 된 필 라 멘 트 힘을 변경 합니다. 참고: 폰 Frey 머리 필 라 멘 트의 집합 0.064, 0.085, 0.145, 0.32, 0.39, 1.1, 및 1.7 g 강제로 응용 프로그램의 구성 됩니다. 예를 들어 hindpaw 철수 0.32 g의 초기 힘으로 발생 한 경우 다음 0.145 g 적용 됩니다. 발 철수의 부재, 0.39 g 힘 적용 됩니다. 이전 응답에 따라 적용 되는 다양 한 힘의 4 개의 추가 필 라 멘 트 그리고 기계적인 임계값31게시 수식 따라 계산 됩니다.</li>
		<li>각 테스트 세션에 대 한 양국간 hindpaws를 포함 합니다. 각 hindpaw에 대 한 세 가지 실험을 수행 합니다. 각 동물의 의미 기계 임계값 (mg)으로이 6 개의 기계적인 임계값의 평균을 표현 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56651/56651fig1.jpg"> 그림 1입니다. Resiniferatoxin (RTX)의 마우스 모델에 neuropathic 고통의 평가 위한 맞춤 유리 야 케이지 및 금속 메쉬-작은 섬유 신경 병 유발. (A, B) 이러한 그래프 표시 (A)를 측정 하는 데 사용 되는 장비와 투명 한 유리 야 케이지 금속 핫 플레이트 (27 cm × 29 cm)에 의해 열 대기 (길이 × 너비 × 높이: 22 cm × 22 c m × 25 cm) 및 (B) 사용자 지정된 메타에 의해 기계적 임계값 평가 l 메시 (메쉬 크기: 5 m m × 5 m m) 반투명 실린더 유리 야 케이지로 (직경: 13 cm, 높이: 12cm) RTX 유도 작은 섬유 신경와 쥐에서. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56651/56651fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
3. 피부 생 검 준비 및 IENFs 신경 분포의 평가
<ol><li>동작 테스트 후 5 %isoflurane 동물을 anesthetize 하 고 0.1 M 샌드위치에 4 %paraformaldehyde (4 P) 다음 0.1 M 인산 버퍼 (PB) (pH 7.4) intracardiac 관류에 의해 동물 희생.</li>
	<li>재 관류 후 두 hindpaws의 첫 번째 올리십시오 고 후 다른 6 h. 전송 노상 강도 조직 장기 저장을 위한 4 ° C에서 0.1 M PB에 대 한 4 P에 그들을 흥분.</li>
	<li>PB 하룻밤에 30% 자당과 30 µ m 두꺼운 조각에 발바닥 표면 방식으로 수직 컷 Cryoprotect 올리십시오. 노상 강도 섹션을 순차적으로, 라벨 그리고-20 ° c.에 부동 액에 저장 참고: 부동 액 조성은 다음과 같습니다: 증류수, 에틸렌 글리세롤, 글리세롤, 그리고 3:3:3:1 비율에 2 x PB.</li>
	<li>을 보장 하기 위해 적절 한 샘플링은 노상 강도의 모든 세 번째 섹션을 선택 합니다.<ol>
<li>코팅된 유리 슬라이드에 선택한 노상 강도 섹션을 넣어 하 고 그들을 건조.</li>
		<li>슬라이드 및 표준 immunostaining 절차와 과정에 플라스틱 coverplate 커버.<ol>
<li>메탄올 30 분에 1% H2O2 와 노상 강도 섹션을 냉각 하 고 트라이 톤 X-100 0.5 M Tris 버퍼 (Tris) 1 시간에에서 0.5% 무 지방 건조 우유와 0.1% 차단 합니다.</li>
			<li>4 ° c.에 하룻밤 팬 axonal 마커, PGP 9.5 (제기에 토끼; 1:1, 000)에 대 한 antisera 노상 강도 섹션을 품 어</li>
			<li>노상 강도 biotinylated 염소-토끼 IgG 이차 항 체 상 온 (RT) 1 시간에 대 한 섹션을 품 어 그리고 45 분 동안 RT에서 avidin 비타민 b 복합체 복합물으로 품 어.</li>
			<li>0.05% 반응 제품 시각화 45 3, diaminobenzidine (DAB)-3' 솔루션 s. 다음 증류수와 노상 강도 섹션을 세척 하 고 설치를 위해 그들을 건조. 참고: 기본 및 보조 antisera 0.5 M Tris에서 0.5% 무 지방 건조 우유 희석 됩니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DRG 섹션 준비 및 부상 작은 직경의 평가
<ol><li>4번째 및 5번째 해 부 요 추 DRG와 다른 2 h에 대 한 사후 수정.</li>
	<li>샌드위치에 30% 자당 Cryoprotect DRG 조직 하룻밤 8 µ m 두께 순차적으로 잘라, 현미경 슬라이드 및 라벨에. -80 ° C 냉장고에 DRG 섹션을 저장 합니다.</li>
	<li>적절 한 샘플링 되도록 80 µ m 간격에 Immunostain DRG 섹션입니다.<ol>
<li>이중 라벨 immunofluorescent 절차를 제외 하 고는 노상 강도 섹션의 DRG immunostaining 절차를 수행 합니다. 또는, ATF3 포함 (제기에 토끼; 1: 100), 부상 마커, 그리고 peripherin (에 올려진된 마우스; 1:800), 기본 antisera에 작은 직경 신경 마커.</li>
		<li>DRG 섹션 4 ° c.에 하룻밤 기본 antisera의 혼합물을 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>DRG 섹션 중 텍사스 레드 또는 fluorescein isothiocyanate (FITC)을 품 어-보조 antisera (1: 200), 해당 1 h, RT에서 적절 한 기본 antisera 하 활용 한 정량화에 대 한 다음 탑재.</li>
</ol>

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</ol>

저자 공개할 게 없다

병원에서 작은 섬유 신경 병의 효과적 치료는 기능 복구 및 환자의 삶의 질 증진을 위한 필요 합니다. 현재, 거기에 작은 직경 신경 상해 기본 분자 메커니즘의 포괄적인 이해의 부족으로 인해 작은 섬유 신경와 관련 된 감각 장애를 대상으로 치료 가이드의 부족이 이다. 신경의 이전 모델 일반적으로 영향을 모두 큰 및 작은-직경 감각 신경; 예를 들어, 화학요법 유도 신경12,,3233 및 기계 유도 신경34,35의 모델. 따라서, 모터 약점 및 큰 직경 감각 신경 손상의 기여 수 제외할 수 없습니다 완전히 이러한 신경 모델의 행동 테스트. 현재 프로토콜 IENFs 변성의 병 적인 기능 증거를 제공 하 여 작은 직경 감각 신경에만 영향을 마우스에 작은 섬유 신경의 ...

Neuropathic 고통, IENFs의 변성에 의해 분명 하다를 포함 하는 작은 섬유 신경 병은 다양 한 화학요법 에이전트1,2,의 neurotoxic 효력 결과로 및 DM, 같은 조건에서에서 일반적 이다 3,,45. IENFs 지 루트 신경 절 (DRG)에 있는 작은 직경의 주변 단말기 이며 IENF 변성6의 경우에 동시에 영향을 받습니다. 예를 들어 신경 somata의 변경 된 업스트림 유전자 녹음 방송은 활성화 녹음 방송 요인 3 (ATF3)6,7의 upregulation에 의해 증명 되었습니다. 또한, 피부 생 검으로 IENFs 신경 분포의 평가 작은 섬유 신경5,,89의 진단에 유용 합니다. 전통적으로, 피부 생 검에 IENFs의 프로필 9.5 (PGP 9.5)1,,1011단백질 유전자 제품의 immunohistochemical 데모에 의존 했습니다. 함께 찍은, DRG와 IENFs의 병 적인 프로필 기능 조건 기본 작은 섬유 신경 병을 반영 하 고이 유형의 작은 직경 뉴런에서 신경 기능 결과 대 한 표시기를 있을 수 있습니다.
이전에 몇 가지 실험 모델 IENF 변성 부상의 화학요법 유도 신경12,13 및 신경 압축 또는 transection14,15 로 인 한 경우의 문제 해결 , 16. 이러한 실험 모델 또한 영향을 큰 직경 신경; 그것은, 따라서, 불가능; 관찰된 작은 섬유 신경에 영향을 받는 큰 직경 신경의 기여를 제외 하 예를 들어, 유해 철수에 의해 thermosensation 장애의 검사 기능 모터 신경 섬유17,,1819에 따라 달라 집니다. 따라서, 순수한 작은 섬유 신경 모델을 수립 하 고 체계적으로 작은 직경 신경에 있는 그들의 주변 피부 신경 섬유와 신경 somata의 병 적인 상태를 조사 하 고 필요 하 고 긴급 있습니다.
RTX는 capsaicin 아날로그 및 일시적인 수용 체 잠재력 vanilloid 수용 체 1 (TRPV1), nociceptive 처리20,,2122중재는 강력한 길 항 제 이다. 최근, 주변 RTX 치료 안심 neurogenic 통증23,,2425 와 intraganglionic 주사 RTX의 유도 DRG 뉴런22의 돌이킬 수 없는 손실. 주변 RTX 관리의 효과 복용량-의존20,26,27, 과도 둔감 또는 IENFs의 퇴보 귀착되는. 글, 체계적인 높은 복용량 RTX 치료 neuropathic 고통을28, 작은 섬유 신경 병의 증 후에 지도 했다. 이 발견은 건의 한다 치료 방식과 RTX의 복용량 생산 뚜렷한 병 적인 효과 신경 응답; 즉, 주변 관리 지역 효과29 에 의해 고통 전송 방해 하 고 개발 neuropathic 동작6신경 somata를 영향을. 샨 다, 이러한 결과 나타냅니다 RTX multipotency 효과가 RTX 체계적으로 주변 IENFs 및 중앙 신경 somata 같은 주변 신경에 영향을 미칠 수 있는 특정 복용량 인지 문제를 제기. 그렇다면, RTX 특히 작은 직경 뉴런에 영향을 하 고 병원에서 작은 섬유 신경 모방 잠재적인 에이전트 수 있습니다. 예를 들어 병원에서 DM 대사 장애 등 neuropathology 작은 섬유 신경 병의 주요 특성은 주변 신경의 복잡 한 문제입니다. DM 관련 작은 섬유 신경 병의 메커니즘은 주변 신경에 영향을 미치는 주요 에이전트를 되지 않을 수 있습니다 대사 장애의 기여를 제외 하지 수 없습니다. 따라서, DM 관련 작은 섬유 신경 체계적인 대사 장애의 영향을 제외 수는 순수한 동물 모델을 필요 합니다. 이 프로토콜 수정된 immunostaining 분석에 의해 증명으로 IENF 변성 및 작은 직경 신경 상해를 포함 하 여 전형적인 작은 섬유 신경 모델을 개발 하는 RTX의 작업 복용량을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Chemical reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resiniferatoxin</td><td>Sigma</td><td>R8756</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-diaminobenzidine</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>avidin-biotin complex</td><td>Vector</td><td>Vector PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>Primary Antisera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peripherin</td><td>Chemicon</td><td>MAB-1527</td><td></td></tr><tr><td>ATF3</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-188</td><td></td></tr><tr><td>PGP9.5</td><td>UltraClone</td><td>RA95101</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Secondary Antisera</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated goat anti-rabbit IgG</td><td>Vector</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-conjugated goat anti-mouse</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-075-146</td><td></td></tr><tr><td>이소티오시아네이트(FITC)-활용 당나귀 항토끼</td><td>잭슨 면역연구</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>IITC</td><td>모델 39</td><td></td></tr><tr><td>폰 프레이 필라멘트</td><td>Somedic Sales AB</td><td>10-600-0001</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon 커버 플레이트</td><td>Thermo 과학</td><td>72110017</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 랙</td><td>Thermo scientific</td><td>73310017</td><td></td></tr></tbody></table>

일시적인 수용 체 잠재력 vanilloid 타입-1의 ultrapotent 주 작동 근의 순수한 작은 섬유 신경 병 마우스 모델 수립

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

당뇨병 mellitus (DM) 또는 화학요법 대리인의 신경 효과 발생 환자 변성 및 작은 직경 감각 뉴런, 작은 섬유 신경으로의 부상으로 인해 감각 장애를 개발할 수 있습니다. 작은 섬유 신경 병의 현재 동물 모델 모두 큰 및 작은-직경 감각 섬유에 영향을 하 고 따라서는 neuropathology 제대로 부상된 작은 직경 감각 섬유의 효과 평가 하기 위해 너무 복잡 한 만듭니다. 따라서, 그것은 순수한 작은 섬유 신경 적절 하 게 이러한 문제를 조사 하는 실험 모델을 개발 하는 데 필요한입니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 특히 작은-직경 resiniferatoxin (RTX) 유형의 일시적인 수용 체 잠재력 vanilloid 1 (TRPV1) 단일 투여를 통해 ultrapotent 주 작동 근과 감각 신경에 영향을 미치는 작은 섬유 신경 병의 실험 모델을 RTX 신경의 복 주입이 하 라고. 병 적인 발현 및 intraepidermal 신경 섬유 (IENF) 변성, 특히에 상해를 포함 하 여 작은 섬유 신경 병을 가진 환자의 임상 특성을 모방 행동 이상이이 RTX 신경 병 작은 직경 뉴런, 그리고 열 hypoalgesia 및 기계적 용어인 유도. 이 프로토콜 테스트 RTX의 3 개의 복용량 (200, 50, 및 10 µ g/k g, 각각)와 결론을 RTX의 중요 한 복용량 (50 µ g/k g)는 전형적인 작은 섬유 신경 병 발현의 개발에 필요한 고 수정된 immunostaining 절차를 준비 IENF 변성 및 신경 소마 상해 조사. 수정된 절차는 빠르고, 체계적, 경제. Neuropathic 고통의 행동 평가 작은-직경 감각 신경의 기능을 중요 합니다. 실험적인 설치류에 기계적 임계값의 평가 특히 도전 그리고 설치류에 평가의이 유형에 적합 한 사용자 지정된 금속 메쉬가이 프로토콜에 설명 합니다. 요약 하자면, RTX 신경 분자와 개입 neuropathic 통증 치료제의 개발에 대 한 기본 평가를 쉽게 설립 하 고 새로운 실험 모델입니다.

이 프로토콜 RTX 신경 장 해, 특히 IENF 변성, 감각 장애 (그림 2)와 관련 된 포함 하는 작은-직경 신경에 영향을 미치는의 소설 마우스 모델을 설명 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜에 따라 동물 전시 열 hypoalgesia와 D7 게시물 RTX 주사 기계 용어인. 이 작은 섬유 신경 모델, RTX의 3 개의 복용량을 설정 하려면: 200, 50, 및 10 µ g/k g i.p. 경로 의해 관리 되었다. RTX 복용량 (50 µ g/k g)이 중요 한 것으로 간주 됐다 고 예비 연구는 높은 복용량 RTX (200 µ g/k g) 발생 높은 마우스 치 사 율 (그림 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/f...

이 연구는 resiniferatoxin (RTX)와 순수한 작은 섬유 신경 병의 실험 모델을 설정합니다. RTX의 독특한 복용량 (50 µ g/k g)은 환자 특성을 모방 하는 작은 섬유 신경 모델을 개발 하기 위한 최적의 neuropathic 고통을 기본 nociceptive 분자 의미를 조사 하는 것을 도울 수 있었다.

일시적인 수용 체 잠재력 Vanilloid 타입-1의 Ultrapotent 주 작동 근의 순수한 작은 섬유 신경 병 마우스 모델 수립

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

생쥐를 위한 이 감각 특이적 신경독 전달 절차의 전반적인 목표는 소동물 감각 신경병증 모델을 확립하는 것입니다. 이 기술은 감각 신경 병증에서 작은 감각 섬유의 손상 법칙을 드러내는 데 도움이됩니다. 주요 장점은 빠르고 쉽다는 것입니다.이 마우스는 어떤 경로가 큰 감각 섬유에 결정적인 기여를 하는지와 같은 감각 신경병증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 개인 보호 장비를 착용하고 Resiniferatoxin 또는 RTX 스톡 용액을 만드는 동안 적절한 예방 조치를 취하십시오. 실험을 위해 600마이크로리터의 분취액 1개를 식염수로 희석하고 나머지는 저장을 위해 12마이크로리터 분취액으로 나눕니다.테스트 마우스의 경우 체중이 35-40g 인 8 주 된 성인 수컷 ICR 마우스를 사용하십시오. RTX 용액을 마이크로 주사기로 복강내 1회 투여합니다. 다음으로, 두 번째 그룹의 마우스에 동일한 부피의 비히클을 주입하여 대조군 역할을 합니다.모든 주사를 맞은 후에는 쥐를 집 우리에 수용하고 음식과 물을 즉석에서 사용할 수 있는지 확인하십시오. 7일이 지나면 일주일에 한 번 행동 테스트를 시작합니다. 안정적인 환경의 조용한 시험장에서 같은 날 두 테스트를 모두 수행합니다.핫 플레이트 테스트로 동물의 열 대기 시간을 측정하는 것으로 시작하십시오. 금속 핫플레이트를 섭씨 52도로 설정합니다. 그런 다음 동물을 핫 플레이트의 투명한 플렉시 유리 케이지에 부드럽게 넣습니다.동물의 뒷발이 뜨거운 케이지에 닿자마자 타이머를 시작하십시오. 동물이 몸을 떨거나 뒷발을 핥거나 점프하기 시작하면 동물을 제거하고 열판을 얼마나 오래 견뎌냈는지 가장 가까운 10분의 1초까지 기록하십시오. 동물이 핫플레이트에서 반응을 보이지 않으면 잠재적인 조직 손상을 방지하기 위해 25초 후에 세션을 중지하십시오.동물 한 마리당 3번의 시도를 수행하고, 시도 사이에 30분의 휴식 시간을 갖습니다. 나중에 세 가지 테스트의 평균 시간을 동물의 최종 점수로 사용합니다. 다음으로, 동물의 기계적 감각 역치를 측정합니다.동물을 투명하고 둥근 우리에 넣고 바닥에는 금속 그물망을 만듭니다. 적응 후, 위아래 방법을 사용하여 뒷발의 발바닥 부위에 다양한 구경의 폰 프레이 헤어 필라멘트를 바릅니다. 첫 번째 자극을 위해 5-8초 동안 중간 강도 필라멘트를 적용합니다.각 자극 후 2분 동안 기다린 후 동물의 이전 반응에 따라 다음 힘을 가합니다. 뒷발이 물러나면 다음 낮은 구경의 필라멘트를 사용하십시오. 그리고 뒷발이 물러나지 않으면 다음으로 큰 필라멘트를 사용하십시오.마우스를 여섯 번 찔릴 때까지 이 과정을 계속합니다. 그런 다음 설정된 공식을 사용하여 기계적 임계값을 계산합니다. 각 검사일마다 각 뒷발에 대해 세 번의 시험을 수행합니다.이 6가지 기계적 임계값의 평균을 각 동물의 평균 기계적 임계값으로 표현합니다. 안락사의 경우 5% 이소플루란을 사용한 다음 심장 내 관류를 사용합니다. 그런 다음 두 뒷발의 첫 번째 발 패드를 제거하고 6시간 동안 4% PFA로 고정합니다.고정 후 섭씨 4도에서 0.1 몰 인산염 완충액으로 옮깁니다. 이것은 장기 저장 솔루션 역할을 합니다. 냉동 절편 전에 PBS의 30% 자당에 발 패드를 밤새 담그십시오.다음 날, 저온 유지 장치를 사용하여 30미크론 조직 조각을 발바닥 표면까지 수직으로 절단합니다. 풋 패드 섹션에 순차적으로 라벨을 붙인 다음 섭씨 영하 20도의 안티 페즈 용액에 보관하십시오. 단면을 샘플링할 때 세 번째 섹션마다 선택하고 코팅된 유리 슬라이드로 옮겨 자연 건조합니다.다음으로, 각 면을 커버 플레이트로 덮고 표준 면역염색 절차로 처리합니다. 먼저 메탄올에 1%의 과산화수소를 넣은 발바닥 부분을 30분 동안 담금질합니다. 그런 다음 실온, 0.5 몰 트리스 완충액을 사용하여 조직을 세 번 씻습니다.다음으로, 블록 용액에서 조직을 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 밤새 범축삭 마커에 대한 항혈청으로 섹션을 배양합니다. 다음 날, Tris buffer로 절편을 세 번 세척한 다음 실온에서 한 시간 동안 비오틴화 항토끼 IgG로 절편을 배양합니다.나중에 Tris 버퍼로 세 번 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 그런 다음 avidin 비오틴 복합체가 있는 조직을 실온에서 45분 동안 배양합니다. 반응 생성물을 염색하려면 DAB 용액을 45초 동안 짧게 도포한 다음 발판 부분을 증류수로 세척하고 자연 건조시킨 후 장착합니다.안락사된 동물의 발 패드를 제거한 후 네 번째와 다섯 번째 요추 DRG를 절개합니다. 그런 다음 절개된 DRG 조직을 실온에서 4% PFA에 2시간 동안 사후 고정합니다. 다음으로, PBS에서 30% 자당이 함유된 DRG 조직을 하룻밤 동안 동결 보호합니다.다음 날, 그것들을 8미크론 섹션으로 자른다. 슬라이드에 놓고 레이블을 지정합니다. 이 섹션은 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.발 패드 절편에 사용된 것과 동일한 방법을 사용하되, ATF-3, 부상 마커, 손상 마커, 1차 항혈청에 있는 작은 직경의 뉴런 마커를 포함하는 라벨을 부착하고 해당 반응을 밤새 실행합니다. 단면을 세척한 후 적절한 2차 항혈청으로 배양합니다. 그런 다음 또 다른 일련의 세척 후 정량화를 위해 섹션을 장착합니다.이 프로토콜은 감각 장애와 관련된 IENF 변성을 포함한 소구경 뉴런에 특이적으로 영향을 미치는 Resiniferatoxin 신경병증의 새로운 마우스 모델을 설명합니다. 킬로그램당 50마이크로그램 투여는 중요한 것으로 간주되었으며 더 높은 용량은 종종 치명적이었습니다. RTX 주입 후 7일 후, 동물들은 열 통각저하증과 기계적 이질통각을 보였습니다.임계 선량에서 IENF 변성이 있었고 ATF-3 유도가 표시되었습니다. 손상된 뉴런은 peripherin 양성, 작은 직경의 뉴런이었습니다. 대조적으로, RTX의 저용량은 소섬유 신경병증을 일으키지 않았으며 신경 분포에 변화가 없었습니다.또한 저선량에서는 신경 손상의 지표인 ATF-3 유도가 나타나지 않았습니다. 따라서, 킬로그램당 50마이크로그램의 RTX의 임계 용량은 설명된 방법의 적용을 위해 제안됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 순수한 감각 신경병증 모델을 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.개발 후,이 기술은 작은 감각 신경 병증 분야의 연구를위한 길을 열었으며, 부상 작은 감각 신경의 제품 기여, 신경 병성 통증 개발의 길을 열었습니다. RTX는 신경독성이 있고 위험하며 눈, 점막, 상부 호흡기에 자극제로 작용할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. RTX를 취급하는 동안 흡입을 피하고 실험실 안경과 코트를 착용하십시오.피부에 닿은 경우와 취급 후에는 다량의 물로 헹굽니다.

establishing-mouse-model-pure-small-fiber-neuropathy-with-ultrapotent

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 수술로 한쪽을 제거하고 다른 쪽은 대조군으로 남겨두어 마우스 모델의 감각 신경 기능을 테스트하는 방법을 보여줍니다. 기계적 자극에 대한 반응은 감각 신경의 역할을 확인시켜줍니다.

Testing Sensory Nerve Function in a Surgically Denervated Mouse 모델

이 비디오는 TRPV1 작용제 레시니페라톡신(RTX)을 사용하여 마우스에서 소섬유 신경병증 모델을 설정하는 방법을 보여줍니다. RTX를 마우스에 투여하는 단계를 간략하게 설명하고, RTX가 어떻게 직경이 작은 감각 뉴런에서 뉴런 사멸을 유도하여 신경병증 모델을 확립하는지 설명합니다.

Resiniferatoxin을 이용한 소섬유 신경병증의 마우스 모델 구축

신경 병증 성 통증은 체성 시스템에 영향을 미치는 장애 또는 질병의 결과이다. 생쥐의 신경 병증 성 통증의 "팔목 모델은"좌골 신경의 주요 지점 주위에 폴리에틸렌 커프스의 주입으로 구성되어 있습니다. 기계적 이질통은 본 프레이 필라멘트를 사용하여 테스트된다.

마우스의 신경 병증 성 통증의 좌골 신경의 바지를 접 모델

이 보고서는 성공적으로 유도 실험 자가 면역 신경 염 (EAN) myelin 단백질을 사용 하 여 0 (P0)180-199 펩타이드 Freund의 완전 한 보조 및 백 일 해 독 소와 함께 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 우리는 정확 하 게 기능적인 적자와이 상품에서 발생 하는 neuropathology의 정도 평가 정교한 패러다임 제시.

기능과 Neuropathological 평가 대 한 C57BL/6 쥐에 실험 자가 면역 신경 염을 유발 하는 간단한 방법

신경 유도의 측정 neurodegeneration의 마우스 모델을 평가 하는 유용한 도구 이지만 그것은 자주 hindlimbs에 좌 골 신경을 자극에 적용 됩니다. 여기, 복합 근육 활동 전위 (CMAP) vivo에서 상 완 신경 총에 의해 innervated 마우스 forelimb 근육에서 측정 하는 기술을 설명 합니다.

Vivo에서 모터 신경 퇴보의 마우스 모델에서 앞 발에서 복합 근육 활동 전위의 electrophysiological 측정

이 기법의 목표는 murine 척수에서 기본 motoneurons (MNs)의 매우 풍부한 문화를 준비. 설명만 질병을 일으키는 돌연변이의 결과 평가 하려면 여기 이러한 격리 절연 MNs 및 그들의 transfection magnetofection에 의해.

마우스 기본 Motoneurons Transfecting으로 Charcot Marie이 질병에서 체 외에서 모델링

풋패드 접종 모델은 생체 내에서 바이러스 유발 신경 염증 반응을 특성화하는 데 중요한 도구입니다. 특히, 말초 신경계에서 시작된 바이러스 운동 및 관련 면역 병리학 적 과정에 대한 명확한 평가를 제공한다.

바이러스 유발 신경 염증 반응을 연구하는 마우스 풋패드 접종 모델

수정된 수술은 생쥐 또는 쥐 보존 신경 손상 모델에 대한 단순화된 방법으로, 일반 비골 신경과 천성 신경을 모두 손상시키기 위해 한 번의 결찰과 한 번의 절개만으로 됩니다.

마우스의 신경병증성 통증에 대한 수정된 보존 신경 손상 수술 모델

부분 좌골 신경 결찰술은 열 및 기계적 자극에 대한 과장된 반응을 특징으로 하는 오래 지속되는 만성 신경병성 통증을 유발합니다. 이 신경병성 통증 마우스 모델은 일반적으로 통증 관리를 위한 혁신적인 치료법을 연구하는 데 사용됩니다. 이 기사에서는 표준화 및 재현성을 개선하기 위한 수술 절차에 대해 자세히 설명합니다.

부분 좌골 신경 결찰: 새로운 치료법의 항통각수용 효과를 연구하기 위한 만성 신경병성 통증의 마우스 모델

생쥐에서 원위 안와하부 신경의 만성 수축 손상은 촉각 자극에 대한 반응으로 자발적 행동(얼굴 손질 활동 증가)과 통각 행동(von Frey 모발 자극에 대한 과민성)의 변화를 유발하며, 이는 지속적인 통증 및 이질증의 징후이며 삼차신경병증성 통증의 모델 역할을 합니다.

삼차신경병증성 통증을 연구하기 위한 마우스의 원위 안와하부 신경(DIoN-CCI)의 만성 수축 손상

이 프로토콜은 인간 신경종 통증을 모방하고 외과적 치료를 평가하기 위해 감각 신경을 사용하는 재현 가능한 쥐 모델을 제시하여 중개 신경종 연구를 위한 귀중한 도구를 제공합니다.

복재 신경을 통한 표적 근육 재신경 분포를 사용하여 신경종 통증 치료 옵션을 연구하기 위한 새로운 외과적 설치류 모델

학습하세요 RTX를 이용한 소형 섬유 신경병 마우스 모델 수립 방법을. 50 µg/kg 용량으로 감각 신경 손상 메커니즘을 연구하고 통증 병태생리학을 탐구할 수 있습니다.

일시적인 수용 체 잠재력 Vanilloid 타입-1의 Ultrapotent 주 작동 근의 순수한 작은 섬유 신경 병 마우스 모델 수립

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