합성 및 올리고 peptoids의 질량 분석 분석

이 절차의 궁극적인 목표는 올리고-펩토이드를 수동으로 합성하는 방법과 질량분석법을 이용해 그 단량체 서열을 분석하는 방법을 시연하는 것입니다. 이 방법은 초보자들이 펩토이드 분야의 핵심 질문들, 예를 들어 펩토이드 제조 방법과 단량체 서열의 특성화 방법에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 특수 단량체 잔기를 가진 펩토이드를 표준 분석 화학 실험실에서 합성하고 분석할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 올리고 펩토이드에 초점을 맞추고 있지만, 펩타이드나 올리고 뉴클레오타이드 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 기술에 익숙하지 않은 사람들은 시각적 시연 없이는 최적의 질량분석법 조건을 달성하기 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법을 처음 생각한 것은 덩어리의 구조적 특징을 병렬 질량분석법으로 특성화하고자 했을 때였습니다.

먼저 84밀리그램의 Rink 아마이드 수지를 저울질하여 10밀리리터 폴리프로필렌 고상 반응 용기에 넣습니다. 그 다음 플런저를 용기에 삽입하세요. 그 다음, 반응 용기에 2밀리리터의 TMF를 추가하고 압력 캡으로 용기를 덮습니다.

상온에서 셰이커 위에서 약 12도의 움직임 각도와 분당 385회 진동으로 30분 동안 저어줍니다. 캡을 제거한 후, 반응 용기의 플런저를 밀어 용액을 폐기물에 배수합니다. DMF에 20% 피페리딘 2밀리리터를 넣고 용기를 덮으세요.

용기를 2분간 저은 후 용액을 폐기통에 빼냅니다. 과정을 반복하여 20%Pep DMF 용액 2밀리리터를 혈관에 추가하고 캡을 씌우세요. 셰이커에서 12분간 저은 후 용액을 폐기통에 빼세요.

수지를 세척한 후, 비커 내에서 0.8몰 브로모아세트산 1밀리리터와 DMF에 0.8몰 DIC를 혼합하여 브로모 아세틸화 반응을 수행합니다. 혼합물을 반응 용기로 옮기고 용기를 덮습니다. 셰이커 위의 용기를 실온에서 20분간 저어줍니다.

교반 후에는 용액을 폐기물에 배수하세요. 수지를 세척한 후, DMF에 1밀리리터 1몰 2 메톡시에틸아민을 삽입하여 변위 반응을 수행합니다. 용기를 뚜껑을 닫은 후 실온에서 60분간 저어줍니다.

그 후 용액을 폐기통에 배수하세요. 단량체 첨가 사이클이 완료되면 비커에 아세트 무수물 92마이크로리터, DIPEA 43.5마이크로리터, DMF 2밀리리터를 섞어 아세틸화 칵테일을 만듭니다. 아세틸화 칵테일을 수지가 담긴 용기에 추가하세요.

용기를 뚜껑을 닫은 후 실온에서 60분간 저어줍니다. 완성되면 용액을 폐기통에 배출하세요. 수지를 DCM으로 세척한 후, 비커에 TFA 3.8밀리리터, 트리이소프로필실란 100마이크로리터, HPLC 등급 물 100마이크로리터를 섞어 절단 칵테일을 만듭니다.

절단 칵테일을 즉시 수지가 담긴 용기에 넣으세요. 용기를 상온에서 2시간 교반한 후 캡을 제거하고 여과 용액을 50밀리리터 폴리프로필렌 원심분리관에 수집합니다. 용기에 TFA 1밀리리터를 넣고 뚜껑을 덮으세요.

1분간 교반한 후 여과액을 같은 원심분리관에 모으세요. 다음으로 질소 가스를 부드럽게 증발시켜 약 1밀리리터의 점성 용액이 남을 때까지 합니다. 점성 용액에 디에틸 에테르 15밀리리터를 넣고 원심분리관을 막으세요.

혼합물을 영하 20도 냉동고에서 최소 2시간 배양하여 흰색 고체 침전물을 얻으세요. 배양 후, 원심분리기 튜브를 냉각한 상태로 4427 G 원심분리기로 10분간 고체를 펠릿 넣습니다. 완성되면 튜브 뚜껑을 열고 디에틸 에테르를 조심스럽게 비커에 옮기세요.

디에틸 에테르로 고체를 세척한 후 부드러운 질소 가스로 건조시킵니다. 다음으로, HPLC 등급의 물 10밀리리터를 넣어 건조된 고형물을 녹입니다. 용액을 포트 크기가 0.45 마이크론인 나일론 주사기 필터를 통과시키고, 여과액을 미리 무게가 나온 50밀리리터 폴리프로필렌 원심분리관에 수집합니다.

액체 질소가 들어 있는 12온스 이중 층층 팽창 폴리스티렌 컵에서 원심분리관을 회전시켜 펩토이드 용액을 냉동합니다. 그 후 냉동 용액을 하룻밤 동안 동성건조하여 고체 펩토이드를 만듭니다. MS 분석을 위해 펩토이드 샘플 용액을 준비한 후, 희석된 용액 내 불용성 입자를 4427 x G로 3분간 원심분리하여 제거합니다.

용액 상단 약 700마이크로리터를 다른 1.5밀리리터 원심분리관에 옮기면 약 10의 마이너스 5몰 농도의 펩토이드 MS 작동 용액을 만듭니다. MS 기기 매개변수가 설정되면, 약 300마이크로리터의 펩토이드 MS 작동 용액을 1밀리리터 주사기에 추가하세요. 그리고 주사기를 모세관 폴리에테르케톤 튜브로 ESI 입구에 연결하세요.

그 후 주사기를 주사기 펌프 아래에 놓고 분당 10마이크로리터의 유량을 설정하여 샘플 용액을 ESI 입구에 주입합니다. ESI 니들 전압을 켜서 ESI 프로세스를 활성화한 후 감지기를 켭니다. 디스플레이를 프로파일 모드로 설정하고, 마스터 충전 비율(M/Z)의 범위는 100에서 1500 사이로 설정하세요.

프로필 창에 표시된 프로파일 질량 스펙트럼을 확인하세요. 메서드 창에서는 실행 시간을 2분으로 사용하세요. 그 다음 녹화 창을 열고 적절한 파일 이름을 입력한 후 스펙트럼 녹음을 시작하세요.

M/Z 1265에서 단백질화된 펩토이드 피크의 강도를 최적화하세요. M/Z 범위를 1150에서 1350으로 설정하고, 프로파일 창에 표시된 밀리볼트 단위의 최대 세기를 확인하면서 모세관 전압을 조절하세요. 이제 방법 창에서 기기를 MSMS 모드로 전환하고, 1265를 Q1의 첫 번째 질량으로 사용하고, Q1의 마지막 질량은 비워둡니다.

Q3의 첫 번째 질량으로 100을, 마지막 질량으로 1400을 사용하세요. 그다음 CID 가스를 켜세요. 그 다음, 충돌 에너지를 45볼트로 설정하세요.

충돌 가스 압력은 1.5밀리터입니다. 프로파일 창에 표시되는 프로파일 질량 스펙트럼을 확인하며, M/Z 1265의 펩타이드 이온 피크와 전구체 펩토이드 이온의 조각 이온을 나타내는 낮은 M/Z 값의 피크들을 관찰합니다. 이제 충돌 에너지와 충돌 가스 압력을 조정하여 파편화 스펙트럼의 표시를 최적화합니다.

메서드 창에서는 2분을 런타임으로 사용하세요. 그 다음 녹화 창을 열고 적절한 파일 이름을 입력한 후 스펙트럼 녹음을 시작하세요. n개의 말단 아세틸화를 가진 합성된 노아머 펩토이드의 구조는 다음과 같다.

여기 펩토이드의 예측 단편화 방식이 표시되어 있으며, 점선 원 안의 양성자는 CID 실험 중 펩토이드 단편화를 유도할 수 있는 이동성 양성자를 나타냅니다. 만약 모든 사용 가능한 아미드 결합에서 분쇄가 일어나면, 총 8개의 n-말단 조각과 8개의 C-말단 조각이 형성됩니다. 예를 들어, B4 이온과 Y5 이온의 구조와 해당 마스터 전하 값은 여기 나와 있습니다.

V1에서 V8, 그리고 Y1에서 Y8까지의 모든 조각 이온의 계산된 마스터 전하 값이 여기 나열되어 있습니다. 단백질화된 펩토이드 이온의 전체 스캔 질량 스펙트럼은 단백질화된 종에 해당하는 M/Z 1265의 피크와 펩토이드의 나트륨 이온 적응에 해당하는 M/Z 1287의 피크를 보여줍니다. M/Z 633과 644의 두 봉우리는 각각 이중 단백질 및 혼합 단백질 소디테이션 펩토이드에 해당합니다.

단백질화된 펩토이드 MSMS 스펙트럼은 단백질화된 종에 해당하는 M/Z 1265에서 피크를 보이고, 낮은 질량에서는 펩토이드 이온의 조각 이온에 해당하는 전하 값으로 피크를 보입니다. 일단 숙달되면 합성 기술은 1일에서 이틀 만에 끝낼 수 있고, 질량분석법은 제대로 수행된다면 1시간에서 2시간 만에 끝낼 수 있습니다. 질량분석법을 시도할 때는 기기의 성능을 확인하는 것이 중요합니다.

필요 시 악기의 오토튠을 할 수도 있습니다. 이 절차 이후에는 밀크인 모델링과 같은 다른 방법도 수행하여 펩토이드가 적응할 수 있는 가능한 확인 사례에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술이 개발된 후, 연구자들이 고급 질량분석기법과 구조 특성 분석을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 영상을 보면 펩토이드를 수동으로 합성하는 방법과 질량분석법을 이용해 단량체 서열을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 화학물질 작업은 매우 위험할 수 있으니 이 과정을 수행할 때는 반드시 개인 보호 장비를 착용해야 한다는 점을 잊지 마세요.