Name: 세포 외 산 성 pH 문화 체계의 설립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 배우세요 산성 종양 미세환경에서 암세포의 악성화 메커니즘을 규명하는 체외 배양법을. DMEM 배지와 중탄산나트륨을 활용한 이 방법은 pH 안정성과 다양한 산성 조건 비교가 가능하여 종양생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

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우리 시스템 생물학 및 의학, RCAST, 도쿄의 대학에 대 한 게놈 과학의 부 및 연구실의 회원을 감사합니다. 우리는 특히 박사 H. 油, 박사 토니 고다마, (LSBM, RCAST, 도쿄의 대학), 감사 박사 K. 富, 박사 토니 요시다, 및 박사 대답 유용한 토론 및 지원에 대 한 Kunisato (쿄와 Hakko 기린 (주)). 이 작품 일부에 의해 지원 되었다 특정에 대 한 젊은 과학자 (A) (26710005, 방법), 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (26116711 16 H 01567, 방법), 그리고 도전에 대 한 특정 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 일본, 다케다 과학 재단 (러브), 암 연구 (러브), 고바야시 재단 및 암 연구에 대 한 프로젝트의 예비 연구 (16 K 14605, 방법) 및 치료 진화 (P-만들기) 그리고 의료 연구 및 개발, 아메드 (러브) 일본 기관에서 혁신적인 암 제어에 대 한 실질적인 연구.

1입니다. 산 성 문화 매체의 준비
<ol><li>
제어 (pH 7.4)의 준비 및 낮은 pH (pH 6.8) 문화 매체
	<ol>
<li>4.75 g을 물 500 mL에 L-글루타민 없이 DMEM 분말의 분해.</li>
		<li>압력 꽉 병에서 0.33 M NaHCO3 솔루션을 준비 합니다. 주의: 그것은 이후 NaHCO3 CO2 가스가 열 하 고 열 분해 방출 압력 꽉 병을 사용 하는 것이 중요.</li>
		<li>압력솥 매체 고 솔루션입니다. 이러한 버퍼를 25 ° c에 냉각을 허용합니다</li>
		<li>200 mM L-글루타민, 페니실린 스의 5 mL의 5 mL을 추가 및 태아의 소 혈 청 중 탄산염 없이 DMEM의 500 mL 50 mL.</li>
		<li>제어 (pH 7.4) 매체에 대 한 중 탄산염 없이 DMEM의 100 mL 당 0.33 M NaHCO3 솔루션의 2.4 mL를 추가 합니다. 낮은 pH (pH 6.8) 매체에 대 한 중 탄산염 없이 DMEM의 100 mL 당 0.33 M NaHCO3 솔루션의 0.6 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>5% 미만 37 ° C에 외피의 24 h 후 중간 pH를 확인 CO2. 참고: NaHCO3 솔루션의 금액 인큐베이터와 공기 압력의 CO2 내용에 따라 다를 수 있습니다 중간 pH에 따라 조정 될 필요가 있다. 이상적으로, 처음으로 그것은 DMEM 추가 하려면 NaHCO3 솔루션의 적절 한 금액을 결정 하기 위해 다양 한 중 탄산염 농도와 중간 pH를 측정 하는 더 나은.<ol>
<li>CO2 배양 기에서 문화 접시를 제거한 후 바로 문화 매체를 수집 하 고 pH 미터를 사용 하 여 pH를 측정. 필요한 경우 물 목욕을 사용 하 여 37 ° C에 중간 온도 유지. 측정 하지 중간 산도 세 번 독립적으로. 참고: NaHCO3 솔루션 4 ° C에서 저장 되어야 하 고 각 미디어를 신선 하 게 준비 한다. 이 연구에 사용 될 수 있는 상용 제품 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
젖 산 유도 또는 HCl을 이용한 산 성 문화 매체 준비
	<ol>
<li>제어 매체 (단계 1.1.5에서에서 준비) 100 mL를 74 µ L 젖 산 솔루션의 또는 1 M HCl의 125 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>5% 미만 37 ° C에 외피의 24 h 후 중간 pH를 확인 CO2. 참고: 젖 산 또는 HCl 솔루션의 금액 또한 필요가 CO2 콘텐츠 인큐베이터와 공기 압력에 따라 다를 수 있습니다 중간 pH에 따라 조정할 수 있다. 이상적으로, 그것은 직렬 젖 또는 매체의 원하는 pH를 조정 하기 위해 적절 한 크기를 결정 HCl 농도 중간 pH를 측정 하기 위해 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 수확 및 세포 치료
<ol><li>37 ° C 미만 5% CO2 를 수행 하기 전에 적어도 1 주 실험에서 세포 배양을 시작 합니다. 참고:이 연구에 사용 된 셀 라인 자료의 테이블에에서 나열 됩니다.</li>
	<li>70-90 %confluency 도달할 때 세포를 통과. Confluent 될 셀을 허용 하지 않습니다. 매체 매일 재배 중 2-3 일 마다 변경 합니다.</li>
	<li>5 mL PBS를 추가 하 여 셀을 씻어. PBS를 발음 하 고 파견 효소 1 mL 트립 신 등을 추가 합니다.</li>
	<li>셀은 분리를 시작 때까지 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>분리 된 세포 배양의 5 mL을 추가 하 고 효소 비활성화. 15 mL 튜브와 300 x g. Aspirate는 상쾌한에 3 분 동안 원심 분리기에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 다시 문화 매체와 셀을 일시 중단.</li>
	<li>Hemocytometer 고 Trypan 파랑을 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>씨 5.0 x 105 셀/잘 매체의 10 mL에 10 cm 접시의. 37 ° C에서 5%에서 24 h에 대 한 셀을 품 어 CO2.</li>
	<li>문화 매체를 발음, 5 mL PBS 가진 세포를 세척 하 고 제 1에서 준비 산 성 문화 매체의 10 mL를 추가. 37 ° C에서 5%에서 24 h에 대 한 셀을 품 어 CO2.</li>
</ol>3. RNA 격리
<ol><li>문화 매체를 발음 하 고 5 mL PBS로 세포를 씻어. RNA 추출 시 약을 추가 하 여 셀을 방해 ( 테이블의 자료를 참조).</li>
	<li>짧게 접시를 긁어, 다음 한 피 펫으로 RNA 추출 시 약을 제거 하 고 1.5 mL 튜브에 lysate RNA 추출 시 약/셀 입금. 5 분 동안 실 온에 둡니다.</li>
	<li>250 µ L 클로 프롬을 추가 하 고 5 분 동안 실 온에서 약 15 미 허가 및 ≥8, 5 분 동안 000 x g에서 원심 분리기 튜브를 적극적으로 악수.</li>
	<li>수성 단계는 피 펫을 사용 하 여 조심 스럽게 제거. 수성 단계 중 일부를 남겨두고. 또 다른 1.5 mL 튜브에 배치 합니다.</li>
	<li>수성 단계에 550 µ L 소 프로 파 놀을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 4 ° c.에 20 분 동안 5 분 원심 분리기 (≥20, 000 x g) 최대 속도에 대 한 실 온에 두고</li>
	<li>소 프로 파 놀을 부 어와 DEPC에 1 mL 75% 에탄올 처리 물 추가. 부드럽게 혼합. 5 분 동안 8000 x g에서 원심.</li>
	<li>에탄올과 펠 릿 건조 하자 플라스틱.</li>
	<li>약 15-25 µ L (에 따라 수율) DEPC의 RNA 펠 릿에 물 치료를 추가 합니다. 철저 하 게 혼합.</li>
	<li>260에 OD를 측정 하 여 절연된 RNA의 농도 측정 nm는 분 광 광도 계를 사용 하 여.</li>
</ol>4입니다. cDNA 합성
<ol><li>PCR 반응 관에는 다음 구성 요소를 결합: 최대 5 µ g 총 RNA, 1 µ L 올리고 dT (50 µ M) 또는 무작위 뇌관 믹스 (60 µ M), 1 µ L 10 mM dNTP와 14 µ L의 총 볼륨 nuclease 무료 물.</li>
	<li>짧게 원심 작은 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 구성 요소와 혼합 (5 ~ s). 65 ° c.에 5 분에 대 한 샘플 RNA/뇌관 변성 짧게 스핀 (5 ~ s) 원심 작은 벤치탑 사용 하 고 적어도 1 분 동안 얼음에 신속 하 게 샘플을 넣어.</li>
	<li>다음 구성 요소 추가: 역방향 전송 버퍼 x 4 µ L 5, 1 µ L 역전사 (200 U / µ L), 1 µ L RNase 억제제 (40 U / µ L). 참고: 상용 키트의 예제 자료의 테이블에 에서 표시 됩니다.
</li>
	<li>캡 튜브, 혼합, 그리고 다음 간단히 작은 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 내용을 원심 (5 ~ s). 10 분 동안 50-55 ° C에서 결합된 반응 혼합물을 품 어.</li>
	<li>10 분 동안 80 ° C에서 배양 하 여 반응을 비활성화.</li>
</ol>5. 실시간 PCR를 사용 하 여 산 성 반응 유전자 발현의 측정
<ol><li>384 잘 반응 판에 다음 구성 요소를 결합: 1 µ L 템플릿 cDNA, 0.75 µ L 10 X N',N'-dimethyl-N-[4-[(E)-(3-methyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)methyl]-1-phenylquinolin-1-ium-2-yl]-N-propylpropane-1,3-diamine, 0.3 µ L 50 µ M 앞으로 뇌관, 0.3 µ L 50 µ M 반전 뇌관, 1 µ L Taq 중 합 효소, Taq 중 합 효소 버퍼, 2.5 µ L 20 mM dNTP, 16.65 µ L 물 2.5 µ L 10. 참고: 상용 키트의 예는 테이블의 자료에 표시 됩니다. 뇌관의 목록 표 1에 표시 됩니다. 96-잘 반응 접시는 또한이 단계에서 사용할 수 있습니다. 다른 조사 (예를 들어, Taqman 프로브)도 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>실험 및 실시간 PCR 시스템에 다음 PCR 프로그램 설정: 2 분, 1 개 주기; 50 ° C 95 ° C 10 분, 1 개 주기; 95 ° C 15 s와 1 분, 40 사이클; 60 ° C 95 ° C 15에 대 한 s, 1 개 주기; 15 60 ° C s, 1 개 주기; 95 ° C 15에 대 한 s, 1 주기.</li>
	<li>정량 Pcr 장비에서 접시를 놓습니다. 프로그램을 시작 합니다. 참고: 전화 응답 유전자 MSMO1의 Upregulation, INSIG1및 IDI1 는 단백질 수준에 의해 측정할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cancer+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li>
<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li>
<li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue%3A+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li>
<li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Why do cancers have high aerobic glycolysis?</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li>
<li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li>
<li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752(2015).</li>
<li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293(2008).</li>
<li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li>
</ol>

저자 아야 노 콘도 쿄와 Hakko 기린 (주)의 직원

여기, 우리는 간단한 산 성 pH 문화 시스템 및 그것의 평가 과정을 설명. 중간 산성화, 즉, 감소 된 중 탄산염 농도, 젖 산 추가, 및 HCl 또한의 세 가지 방법의 조합을 사용 pH-응답 메커니즘을 철저 하 게 조사 하 고 다른 종양 세포 응답을 비교 하 산소 또는 양분 기아 같은 microenvironmental 조건.
이 방법의 키 문화 매체에서 중 탄산염, 젖 산, 그리고 HCl의 적절 한 농도 결정 하는. 처음으로이 방법을 수행할 때 다양 한 중 탄산염 농도와 중간 pH 측정 NaHCO3 매체에서의 적절 한 크기를 결정 중요 하다. 이 과정 동안, 그것은 37 ° C에 외피의 24 h 후 중간 pH를 측정 하는 데 필요한 아래 5% CO2, CO2 의 중간 온도 평형 상태로 크게 영향을 미칠 중간 pH. 중 탄산염의 압력가 마로 소독은 자주 권장, 중 탄산염 쉽게 플랫 하 게 된다. 셀 밀도...

종양 microenvironment 종양 진행과 암 세포 물질 대사1,2,3에 중요 한 역할을 재생합니다. 암 세포는 저 산소 증, 영양 부족, 세포 외 산 성 pH (페) 등 조건에 자주 노출 됩니다. 그러나, 종양 진행에 pHe의 역할은 하지 명확히으로 광범위 하 게 산소 또는 양분 기아에서. 종양 조직에 페 산 성, 약 산도 6.84,5에 도달 될 수 있다. 산 성 pH에서 양성자 (H+)의 호 기성 및 혐 기성 glycolytic 배설 발생 하 고 확산 암에 의해 젖 산 세포5,6.
최근 연구 결과 밝혀 그 산 성 페 유도 히스톤 deacetylation, 지방산 산화 및 심한 산 성 환경7,8,,910에 적응에 대 한 산 성 리소좀의 exocytosis. 그러나, 어떤 세포 외 산성화를 통해 장치 암 동작 및 산 성 pH 종양 microenvironment 레 귤 레이 터 완전히 결정 되지 않은 키의 id 영향을 줍니다. 또한, 몇 가지 보고서 중 탄산염, 트리 스, 파이프와 HEPES 버퍼 또는 젖 산 및 HCl, 불분명 한 농도 사용 하 여 다양 한 산 성 pH 미디어 설명 하지만 중간도 포괄적인의 조정 안정성을 설명 하기 위해 몇 가지 보고서 여러 독특한 산 성 문화 미디어7,8,,910 의 비교
키 레 귤 레이 터 및 extracellular 산성화의 맥락에서 암 세포의 대사 변화를 명료 하 우리 산 성 페를 유지 하기 위해 간단한 생체 외에서 문화 모델을 설립 하 고 암 세포11페의 역할을 조사 했다. 우리 37 ° C에서 5%에서 6.8의 pHe와 산 성 문화 매체를 유지 하는이 메서드를 사용 하 여 CO2, 문화 매체에서 감소 중 탄산염 농도 사용 하 여. pH 7.4 정상적으로 사용 하 고 매체를 제어. 중간 pH는 적어도 24 시간 동안 되었고 PANC-1과 AsPC 1 췌장암 세포의 문화 중 72 h에 의해 점차적으로 감소. 향상 된 분해 가속 양성자 뿐만 아니라 젖 산7,,89의 배설, 때문에 우리 또한 감소 하는 것 보다 젖 산을 추가 하 여 유도 하는 젖 산 증을 흉내 낸 문화 메서드를 설립 합니다 중 탄산염 농도입니다. 또한, 매체에서 HCl을 이용한 산 성 페 산 성 pH 배양 세포 응답 하지 않은 중 탄산염의 감소 된 농도 때문 가능성을 제외 수 있습니다. 또한, 다양 한 미디어를 사용 하 여 다른 중 탄산염 농도와 7.4을 6.4의 ph, 우리 세포 응답에 페 효과의 정도 평가할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 변형된 독수리 배지" 닛수이" 2</td><td>Nissui</td><td>05919</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermo Fisher</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 용액</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 혼합 용액(안정화)</td><td>Nacalai</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA 용액, 페놀 레드 함유</td><td>Nacalai</td><td>32778-05</td><td></td></tr><tr><td>0.5%-Trypan 블루 염색 용액</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>젖산 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td></td></tr><tr><td>염산 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV First-Strand Synthesis System</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR 마스터 믹스&nbsp;</td><td>어플라이드 바이오시스템</td><td>즈 4368702&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr><tr><td>KMS-6</td><td>JCRB 세포 은행</td><td></td><td></td>JCRB0432</tr><tr><td>TIG</td><td>JCRB 세포 은행</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC9</td><td>ATCC</td><td>CCL-212</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolume UV-Vis 분광광도계(Wi-Fi 포함)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 외 산 성 ph 문화 체계의 설립

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

종양 microenvironment 영양 기아, 저 산소 증 등의 암 진행 및 암에 중요 한 역할을 한다. 그러나, 종양의 적극성 및 그것의 기본 메커니즘에 산 성 세포 외 산도의 역할은 하지 광범위 하 게 연구 되었습니다 hypoxic 또는 영양소 고갈 조건에 비해. 또한, 산 성 세포 외 종양 microenvironment을 모방 하는 잘 정의 된 문화 방법 하지 완전히 보고 되었습니다.
여기는 간단한 생체 외에서 문화 메서드 중 탄산염 및 젖 산 증가 또는 문화 매체에서 HCl 농도 감소 산 성 세포 외 산도 사용 하 여 유지 하기 위해 선물이. 중간 pH는 적어도 24 시간 동안 되었고 72 h PANC-1과 AsPC 1 췌장암 세포의 문화에 따라 점차적으로 감소. 이 연구에서는 3 가지 산 성 미디어 조건 매우 upregulated pH 반응 유전자 MSMO1, INSIG1, 및 IDI1 와 같은 산소 또는 영양 기아. 에 비해 이 유전자의 upregulation 산 성 pH의 표식으로 사용할 수 있습니다. 이 간단한 기술은 microenvironment 산 성 종양에서 종양 악성의 기본 메커니즘을 명료 하 게 도움이 됩니다. 따라서, 우리의 세포 외 산 성 pH 문화 시스템 셀룰러 산 성 pH 응답 암 세포 뿐만 아니라 1 차 셀, 신장 관 세포는 다른 산 성 장애, 당뇨병 ketoacidosis, 관계 등에서 발견을 통해 유산 증, 신장 관 산 성 증, 그리고 호흡 증.

적절 한 중 탄산염 농도 결정 하려면 우리 0-8 m m NaHCO3 (문화 매체에서 최종 농도)의 범위에서 DMEM을 준비 하 고 ph 6.4-7.4 (그림 1)에서 이르는 문화 미디어를 준비 하는 데 성공 했다. 우리는 extracellular pH pH 6.8 단단한 종양4,5에 도달 하면 주장 이전 보고서에 따르면 8 m m NaHCO3 (pH 7.4) 제어 매체, 그리고 산 성 ph 2 mM NaHCO3 (pH 6.8) 매체로 DMEM을 준비. 산 성 매체의 pH 24 시간 동안 되었고 점차 약 pH 6.6 문화 중 72 h PANC-1 및 AsPC-1 셀 (그림 2)로 감소. 다음, 젖 산 또...

산 성 종양 microenvironment 종양 진행에 중요 한 역할을 담당합니다. 암 세포 생체 외에서 에 산 성 세포 외 산도의 효과 평가 하기 위해 간단한 산 성 문화 시스템을 설립 했습니다.

세포 외 산 성 pH 문화 체계의 설립

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

이 간단한 체외 배양 방법의 전반적인 목표는 산성 종양 미세환경 하에서 종양 악성 종양의 기전을 밝히는 것입니다. 이 방법은 종양 미세환경에 대한 반응으로 암 진행 및 악성 종양의 기본 메커니즘과 같은 종양 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매체 pH의 안정성과 여러 산성 pH 매체를 비교할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 암뿐만 아니라 산성 질환의 치료로 확장되었는데, 그 이유는 산증이 다양한 유형의 질병과 관련될 수 있기 때문입니다. 먼저 4.75g의 DMEM 파워를 L-글루타민과 함께 500ml의 물에 녹입니다. 또한 압력이 가해지지 않는 병에 0.33몰의 중탄산나트륨 용액을 준비합니다.매체 및 용액을 오토클레이브합니다. 이러한 완충액을 섭씨 25도까지 냉각시킨 후 중탄산염이 없는 500ml의 DMEM에 200밀리몰의 L-글루타민 5밀리리터, 페니실린-스트렙토마이신 5밀리리터, 소 태아 혈청 50밀리리터를 첨가합니다. 대조 매체의 경우, 중탄산염이 없는 DMEM 100ml당 2.4ml의 0.33몰 중탄산나트륨 용액을 추가합니다.pH가 낮은 매체의 경우, 중탄산염이 없는 DMEM 100ml당 0.6ml의 0.33몰 중탄산나트륨 용액을 추가합니다. 다음으로, 74마이크로리터의 젖산 용액을 100ml의 제어 배지에 첨가하여 젖산 유도 산성 배지를 제조합니다. HCl 유도 산성 배양 배지를 준비하려면 125마이크로리터의 1몰 HCl을 100ml의 대조 배지에 추가합니다.섭씨 37도에서 24시간 배양 후 이산화탄소 5% 미만에서 중간 pH를 확인하십시오. 인큐베이터에서 배양 접시를 꺼낸 직후 배양 배지를 수집하십시오. 필요한 경우 수조를 사용하여 매체 온도를 섭씨 37도로 유지하십시오.pH 측정기를 사용하여 pH를 독립적으로 세 번 측정합니다. 실험을 수행하기 최소 일주일 전에 섭씨 37도 이하에서 5% 이산화탄소에서 세포 배양을 시작하십시오. PBS 5ml를 첨가하여 세포를 세척합니다.PBS를 흡인하고 트립신과 같은 분리 효소를 추가합니다. 그런 다음 세포가 둥글고 분리되기 시작할 때까지 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 다음으로, 분리된 세포에 5ml의 배양 배지를 추가하고 효소를 비활성화합니다.세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 300 회 g에서 3 분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 흡입하고 배양 배지로 세포를 재현탁시킵니다. 혈구계와 Try

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포외 산성 pH 배양 시스템 구축

미생물 eukaryotes 모두 영구 얼음으로 덮인 남극 호수에서 photosynthetically 파생 카본과 최고의 육식 종의 원천입니다. 이 보고서는 남극 호수, 호수 Bonney에서 metabolically 다양한 미생물의 eukaryotes를 분리하기 위해 농축 문화 접근법을 설명하고 Ribulose-1 ,5-bisphophate carboxylase의 oxygenase (RubisCO) 활동을 위해 방사성 동위 원소 분석을 사용하여 무기 탄소 고정 가능성을 평가합니다.

탄소 고정 가능성 화학 층상 남극 호수 및 평가에서 미생물 진핵 농축 문화의 확립

현재 문서 곰팡이 독성 메커니즘에 대한 우리의 지식을 향상 할 수있는 유용한 도구가 될 것입니다 인간 대 식세포와 통성 세포 내 인간의 곰팡이 병원균 칸디다 글라 브라의 상호 작용을 연구하는 체외 세포 배양 모델 시스템을 구축 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

박테리아는 그들의 일생 도중 해롭거나 유익한 돌연변이를 축적할 수 있습니다. 유익한 돌연변이를 축적한 세포 개인의 인구에서 그들의 동료를 급속하게 능가할 수 있습니다. 여기서 우리는 형광으로 표시된 개별을 사용하여 시간이 지남에 따라 세균성 세포 인구에 있는 종 경쟁을 구상하는 간단한 절차를 제시합니다.

형광표균의 세균세포 인구에 대한 종 내 경쟁 모니터링

이 글의 첫 번째 부분에서는 원형질막에서 소포성 Na+/H+ 교환체를 발현하는 돌연변이 세포주를 선택하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 부분에서는 세포 내 pH 측정 및 빠른 이온 흡수를 기반으로 하는 프로토콜을 제공하며, 이는 이러한 교환기의 이온 선택성과 운동 파라미터를 결정하는 데 사용됩니다.

나의 기능적 특성<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; 선택을 양자가 살해 사용하여 세포 내 구획의 교환기는 플라즈마 막에서 그들을 표현하는

해당작용은 여러 생물학적 시스템에서 정의하는 대사 마커입니다. H+의 세포외 플럭스를 측정하여 해당과정을 모니터링하는 것은 일반적이지만, 정량적이고 명확한 보정이 필요합니다. 여기에서는 세포 외 산성화의 호흡기 및 해당작용 원인을 구별하기 위해 세포 외 플럭스 데이터를 수집하고 수정하는 방법을 보여줍니다.

세포 외 산 생산의 측정 및 분석은 당분 속도를 확인하는

창 자 미생물 호스트 상호 작용은 합성 구두 커뮤니티, 생체 외에서 위장 소화, 그리고 소장 상피의 모델을 결합 하 여 새로운 접근 방식을 사용 하 여 평가 됐다. 우리 세포 침입 병원 체와 다중 종 biofilms의 평가 또는 테스트 probiotic 정립 생존 적응 될 수 있는 방법 제시.

생체 외에서 직감 호스트 미생물 인터페이스에 합성 세균 컨소시엄의 생존 능력을 평가

여기 우리가 준비 하 고 유지 하는 메 다카 (Oryzias latipes)에서 기본 뇌 세포 배양 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에 최적화 된 조건을 고려 온도, osmolality, pH 등의 중요 한 매개 변수 흉내 낸 함으로써 생리 적으로 더 의미 있는 결과 물고기의 생리 적 조건에 의해.

물고기 Pituitaries에서 높은-품질 기본 세포 배양의 준비

우리는 치과 플라크를 필터링하고 숙주 박테리아와 공동 배양하여 새로운 세균 성 물리, 사카리박테리아의 성장하기 어려운 구성원을 격리하는 방법을 보여줍니다.

구강에서 공생 사카리박테리아의 안정적인 이진 문화 구축

여기에서는 저비용의 에너지 효율적인 벤치탑 열혼합기를 인큐베이터로 활용하는 호열성의 적응을 위한 실험적 진화 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 최적 성장 온도가 75 °C인 고세균인 Sulfolobus acidocaldarius의 온도 적응 특성화를 통해 입증되었습니다.

삶의 극한에서의 적응 : 극한 고령 Archaeon Sulfolobus acidocaldarius를 사용한 실험적 진화

여기에서는 3전극, 2챔버 생전기화학 시스템을 사용하여 젖산 박테리아의 매개 세포외 전자 전달(EET)을 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. Lactiplantibacillus plantarum 과 산화환원 매개체 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid를 사용하여 이 방법을 설명하고 매개 EET를 평가하는 데 사용되는 전기화학적 기술에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

Characterizing Mediated Extracellular Electron Transfer in Lactic Acid Bacteria with a Three-Electrode, Two-Chamber Bioelectrochemical System

배우세요 산성 종양 미세환경에서 암세포의 악성화 메커니즘을 규명하는 체외 배양법을. DMEM 배지와 중탄산나트륨을 활용한 이 방법은 pH 안정성과 다양한 산성 조건 비교가 가능하여 종양생물학 연구에 필수적인 도구입니다.

세포 외 산 성 pH 문화 체계의 설립

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