Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

이 절차의 전반적인 목표는 3D 체외 기저 매트릭스에 내장된 장 오가노이드를 분리하고, 이후 세포 및 발달 생물학의 주요 생물학적 문제를 연구하는 데 이상적인 모델인 미세소관과 센트로솜 proteins. 3D in vitro 오가노이드를 고정하고 면역 라벨링하는 것입니다. 그러나 3D 모델에서 내인성 단백질과 구조를 국소화하는 것은 2D 배양보다 더 복잡합니다.

중요한 것은 정착액이 섬세한 3D 구조를 보존하는 동시에 항체 항원성을 보존해야 한다는 것입니다. 제시된 방법에는 분리, 고정 및 3D 체외 장 오가노이드의 면역 라벨링이 포함됩니다. 그러나 고정 및 면역 표지 프로토콜은 생체 외 분리 조직에서도 사용할 수 있습니다.

제시된 포름알데히드 메탄올 고정 프로토콜의 주요 장점은 3D 구조를 보존하는 동시에 항원성을 보존한다는 것입니다. 이를 통해 미세소관, 액틴 필라멘트 및 결합 단백질과 ninein을 포함한 여러 centrosomal 단백질을 효과적으로 표지할 수 있는 post-fixed tevel 항체의 우수한 침투 및 제거를 가능하게 합니다. 제 연구실의 정식 박사후 연구원인 Deborah Goldspink 박사와 공동 저자인 Zoe Matthews 박사가 시연할 것입니다.

장샘(intestinal crypt)과 융모(villi)를 분리한 후, 면역 염색을 위해 분리된 상피 구조를 고정할 수 있습니다. 고립된 crypts는 매트릭스 돔에 번갈아 앉을 수 있으며, 이는 오가노이드를 형성합니다. 약 5일에서 7일의 배양 후 오가노이드가 형성됩니다.

500마이크로리터의 RT-PBS를 사용하여 지하 매트릭스 돔이 포함된 웰을 오가노이드로 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 250마이크로리터의 콜드 셀 회수 용액을 추가합니다. 그런 다음 P1000 마이크로피펫을 사용하여 지하 매트릭스 돔을 긁어내고 웰 전체를 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 플라스틱에서 지하 매트릭스를 분해하고 제거합니다.

매트릭스를 분해하는 데 도움이 되도록 복구 용액이 차가운지 확인하십시오. 긁을 때는 P1000 마이크로피펫만 사용하여 오가노이드가 분해되지 않고 손상되지 않도록 합니다. 1.5ml의 저결합 마이크로 원심분리기 튜브에 상층액을 수집합니다.

그런 다음 튜브를 여러 번 뒤집고 현미경으로 때때로 50배율로 오가노이드가 분리되어 자유롭게 움직이고 덩어리가 아닌지 확인합니다. 5 분 동안 1, 000 g 및 실내 온도에 원심 분리에 의하여 organoids를 펠릿. 그런 다음 회수 시약을 제거하고 즉시 고정을 진행합니다.

이전에 분리된 오가노이드를 포름알데히드와 메탄올로 고정하려면 오가노이드를 섭씨 음의 20도 포름알데히드 메탄올 고착 용액에 재현탁합니다. 영하 20도의 오가노이드를 냉동고에서 15분 동안 배양하고 5분마다 튜브를 뒤집습니다. 다음, 1, 5 분 동안 000 g에 분리기분리에 의하여 organoids를 펠릿

정착액을 제거한 후 1%의 2차 항체 종 혈청이 함유된 PBS 또는 0.1%의 세제와 1%의 혈청이 함유된 PBS로 구성된 세척액을 첨가합니다. 이전과 같이 샘플을 펠릿화한 후 세척 용액을 제거하고 샘플을 새 세척 용액에 다시 현탁시킵니다. 튜브 로테이터를 사용하여 총 1시간 동안 세포를 세척하고, 15분마다 원심분리를 통해 오가노이드를 펠릿화하고 세척 용액을 교체합니다.

장 오가노이드 샘플을 차단하려면 PBS에 10%의 2차 항체 종 혈청을 추가합니다. 1, 000g에서 오가노이드를 5분 동안 펠렛으로 만들고 상층액을 제거합니다. 각 샘플에 1ml의 차단 용액을 추가하여 다른 항체에서 배양합니다.

그런 다음 샘플과 차단 용액을 실온의 튜브 로테이터에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 10%의 혈청과 0.1%의 세제를 함유한 PBS의 1차 항체를 희석합니다. 그런 다음 샘플을 회전시키고 차단 용액을 제거한 후 1차 항체 용액을 사용하여 오가노이드 펠릿을 재현탁합니다.

튜브를 하룻밤 동안 20RPM과 섭씨 4도로 회전시켜 오가노이드를 부유 상태로 유지합니다. 다음 날, 샘플을 튜브 로테이터에서 1시간 동안 실온으로 다시 가져옵니다. 샘플을 회전시킨 후 기본 항체 용액을 제거하고 각 튜브에 1ml의 세척 용액을 첨가한 다음 오가노이드 펠릿을 재현탁합니다.

그런 다음 즉시 원심분리로 용액을 제거하십시오. 1ml의 신선한 세척액을 넣고 튜브 로테이터에서 20RPM으로 2시간 동안 세포를 혼합합니다. 다음으로, PBS의 2차 항체를 1%의 혈청과 0.1%의 세제로 희석합니다.

그런 다음 조직을 펠릿화한 후 펠릿을 200마이크로리터의 2차 항체 용액에 재현탁합니다. 튜브 로테이터의 튜브를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 방사하여 상등액을 제거한 후 펠릿을 세척 용액에 재현탁시키고 즉시 샘플을 원심분리하여 오가노이드를 펠릿화합니다.

그런 다음 상등액을 제거하고 펠릿을 1ml의 신선한 세척 용액에 재현탁시킵니다. 실온에서 1.5-2시간 동안 튜브 로테이터에 샘플을 혼합하고 앞서 설명한 대로 20-30분마다 세척 용액을 교체합니다. 오가노이드를 장착하려면 회전하여 모든 세척 용액을 제거한 후 퇴색 방지 시약이 포함된 하드 세팅 장착 매체 2방울을 펠릿에 추가합니다.

P200 마이크로피펫의 끝을 자르고 펠릿을 장착 매체에 조심스럽게 다시 매달립니다. 장착 매체에 고정되고 염색된 오가노이드를 재현탁할 때 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오. 기포가 있는 경우 기포가 표면으로 떠오르도록 한 다음 슬라이드로 옮기지 마십시오.

마이크로피펫을 사용하여 현미경 슬라이드의 중심을 따라 일렬로 장착 매체가 있는 오가노이드를 분주합니다. 그런 다음 커버 유리를 조심스럽게 위에 놓고 거품이 발생하지 않도록 합니다. 유리 슬라이드를 슬라이드 북에 넣고 컨포칼 현미경에서 분석하기 전에 장착 매체가 설정될 수 있도록 냉장고에 밤새 보관하십시오.

여기에 표시된 것은 융모와 소낭선을 모두 포함하는 분리된 소장 조직의 분획 2와 주로 소낭선을 포함하는 분획 3의 샘플입니다. 이 이미지에서 볼 수 있듯이, 융모와 소돌이 모두에서 미세소관과 액틴의 우수한 보존 및 라벨링은 이 비디오에 설명된 포름알데히드 메탄올 고정 및 면역 라벨링 프로토콜을 통해 달성되었습니다. 소장 오가노이드를 생성하고 지하 매트릭스에서 3주 이상 성장시킨 다음 이 비디오에서 입증된 바와 같이 분리했습니다.

오가노이드 융모 도메인 내의 분화된 세포는 대부분의 경우 잘 표지된 안정적인 apicobasal 미세소관을 포함합니다. EB1은 미세소관 격자를 따라 볼 수도 있습니다. 여기에 보이는 것은 낭종 단계와 소낭선 발달의 초기 단계에 있는 오가노이드입니다.

두 샘플 모두 포름알데히드 메탄올에 고정되고 미세소관 및 나인에 대한 면역 표지되었으며, 이는 정점 비중심 미세소관 조직 센터에서 우수한 미세소관 보존 및 표지를 보여줍니다. 이 기법을 마스터하면 여러 샘플로 이틀에 걸쳐 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 오가노이드를 수집할 때 3D 구조가 손상되지 않도록 우물을 조심스럽게 긁어내는 것이 중요합니다.

또한 염색 절차 전반에 걸쳐 오가노이드의 손실을 방지하기 위해 용액을 추가하거나 제거할 때 주의하십시오. 이 동영상을 시청한 후에는 분리된 오가노이드 및 장샘과 같은 기타 상피 구조를 고정, 면역 라벨링 및 장착하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에서 사용하는 고정성 시약은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

이 절차에 대한 위험 평가를 수행해야 하며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 봉쇄 조치와 PPE를 취해야 합니다.