Name: Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 배우세요 장 오가노이드에서 미세소관 및 중심체 단백질의 면역형광 라벨링 방법을. 포름알데히드-메탄올 고정법으로 3D 구조를 보존하며 항원성을 유지하여 세포 및 발달 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자 폴 토마스 현미경 조언과 도움 감사합니다. 여기에 관련 된이 작품은 BBSRC에 의해 지원 되었다 (no를 부여 합니다. M.M.M. 및 T.W. BB/J009040/1).

<ol><li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li>
<li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li>
<li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-organizing+centers%3A+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+self-renewal%2C+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li>
<li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Colorectal+Cancer+Rep%22%5BJournal%5D)">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li>
<li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042(2015).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765(2014).</li>
<li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIS1%2C+CLIP-170%27s+key+to+the+dynein%2Fdynactin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li>
<li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li>
<li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Physiol+Educ%22%5BJournal%5D)">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

장 조직의 절연 작은 장 지하실과 villi 저 승 지하실의 분리 막 표면, EDTA 솔루션 셀 연락처, 분류 (동요) 및 원심 분리를 완화 하는 치료를 노출 포함 됩니다. 제시 장 villi/토 굴 격리 프로토콜 Belshaw 외. 화이트 헤드 외 에서 수정 되었습니다. 17 , 18
점 막 표면 노출 우리가이 절차의 개발에 장내 관의 점 막 표면 노출 방법의 번호와 실험을 했습니다. 기존의 방식 (안쪽 바깥쪽으로 회전) evert 것 세그먼트 약 100 m m 긴, 보통 튜브 튜브19위로 미끄러져 한쪽 끝 그리고 나머지 튜브에 조직의 배에 잡은 금속 막대를 사용 하 여. 마우스 조직에 대 한 끝부분을 금속 막대 (2.4 m m 직경)는 이상적 이다. 이 방법은 PBS와 EDTA에 대 한 더 나은 액세스를 허용 하는 점 막 표면 확대의 이점이 있습니다. 우리는 처음이 접근 방식을 사용 하지만 짧은 길이 (약 5cm)으로 튜브를 절단 하 고이 쉽게 입증가 위를 해 부와 각 섹션을 열고로 이동. 이 방식은 적절 한 경우에 몇 가지 내장이 필요; 경우 더 많은 동물을 했다 그러나 사용 실험에서 다음 목적 장치 절단 열기 튜브 경도, 요네다 외 설명 14 더 효율적일 것 이다입니다.
Villi와 근육 층에서 지하실의 분리 처음 우리 느슨하게 기본 조직17,18점 막 표면에 3 mM EDTA PBS에 비교적 긴 보육 시간 최대 60 분의 사용. EDTA의이 농도에서 우리는 보육 시간 30 분의 마우스 콜론 으로부터 지하실을 풀고 충분 한 발견. 그러나, 소장 토 굴/모 격리에 대 한 효율적인 접근 입증 짧은 시간에 대 한 더 많은 집중된 EDTA를 사용 하 여 것이 보았습니다. 모든 후속 작업 생성 villi 또는 지하실에 대 한 관련 분수 30 mM EDTA 기법을 사용 하 여 추출 하는 조직으로 착수 했다. 지하실, 우리가 일반적으로 고정 하기 전에 분수 3-5을 풀링된 하지만 타이밍 창 자 위치 등 요인의 숫자, 마우스, 염증, 이전 다이어트의 나이에 따라 달라 집니다로이 적절 한 분수 지 확인 하는 것이 중요 하다 등 유사 하 게, 시간 조직 EDTA 치료 효과 따라 흔들릴 필요가 다른 조건 하에서 다를 수 있습니다. 격리 된 조직 분수 villi 지하실 또는 주로 villi 및 지하실 (그림 2)의 혼합물을 포함 하는. 콜론 없는 villi로 토 굴 추출 수 있습니다 달성 한 단계에 30에 대 한 튜브에 조직을 떨고 하 여 s. 이 분수 다음 고정 하 고 면역 라벨에 대 한 처리 수 있습니다.
지 매트릭스에서 장 organoids의 격리 절연 지 매트릭스 돔에서 organoids의 세포 복구 솔루션을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. Depolymerizing gelled 지하실 매트릭스 하지만 온도 필요 2-8 ° c.에 의해 작동 하는 솔루션 주의의 참고는 동적 microtubules 유지 되지 않을 수 있습니다. 따라서, 동적 microtubules의 면역 라벨에 대 한과 + EBs 셀 등 팁, 고정 이전 지 매트릭스에서 복구 권장 하지 않습니다. 그러나, 차별화 organoid 셀에 microtubules의 대부분은 상대적으로 안정적인 고이 (그림 6)를 보존 했다. 그것은 또한 세포 마커 뿐만 아니라 centrosomal 및 접합 단백질의 면역 라벨에 대 한 잘 일했다.
기정 프로토콜 포름알데히드 (PFA에서 만든 갓) 가역 형성 하는 상대적으로 빠른 연기 정착 액 크로스 링크 이며 4 %PFA 등 면역 라벨 microtubules 및 감마-tubulin Phalloidin 얼룩 걸 필 라 멘 트를 위해 잘 작동 합니다. 더 잘 근무 등 면역 라벨 토 굴 줄기 세포 틈새 시장 내에서 줄기 세포 마커 Lgr5 및 Paneth 세포 마커 CD24와 PFA의 높은 농도 작동 하지 않았다 동안 1 %PFA 솔루션을 희석.
도의 추가 제공 microtubules 3.7 %PFA, 0.05%도 및 PHEMO 버퍼 (68 m m 파이프, 25mm HEPES, 15mm EGTA 및 3mm MgCl2)2 에서 0.5% 세제의 혼합물로 구성 된 이른바 PHEMO 고정의 더 나은 보존 antigenicity을 타협 하지 않고 microtubules의 우수한 보존을 제공 합니다. 그것은 또한 면역 라벨 감마-tubulin, β-catenin, 그리고 E-cadherin, phalloidin 착 걸 필 라 멘 트에 대 한 잘 작동합니다. 그러나, 3 차원 조직, organoid 문화 PHEMO 고정 일관성 없는 결과 생산 하 고 그러므로 사용 하지.
메탄올은 상대적으로 잘 침투를 제공 하 고 antigenicity을 보존 하는 경향이 응집 정착 액. 100% 메탄올 (-20 ° C)와 고정 어떤 수축 량을 소개 하 고 적당 한 형태 보존을 제공 microtubules, + 팁, 그리고 ninein를 포함 하 여 2 차원 세포 배양에 많은 centrosomal 항 체에 대 한 작동 합니다. 그러나, 일부 organoids이 고정 방법을 사용할 때 쓰 러 졌다. 또한, 전체 지하실, villi, 또는 organoids를 통해 항 체의 보급률은 처음에 문제가 있지만 0.1% 세제 세척 솔루션을 장기간된 세척의 추가 더 나은 결과 달성.
포름알데히드와 메탄올의 조합이 Rogers 그 외 여러분 에 의해 사용 이전 했다 20 에 면역 레이블 EB1 초파리. 포 름 알 데히드의 혼합물을 기반으로 고정 프로토콜 및 메탄올 따라서 개발 장 조직 및 organoids 3% 포름알데히드와 97% 메탄올-20 ° C에 냉장 하지만 로저스에 의해 사용 되었다 혼합물에서 탄산 나트륨 5 m m를 생략에 따라 외. 20 또한, 샘플-20 ° c.에 냉장고에서 수정 된 이 특히 면역 라벨에 대 한 잘 + 클립-170 등 EBs, 팁, 근무 하지만 또한 우수한 고정 및 면역 라벨 microtubules 및 조직 및 3D organoids 내 걸 입증 했다. 아주 좋은 구조 보존 되었다 분명 하 고 메탄올으로 더 일관 되 게 일 ninein에 대 한 라벨 비록 antigenicity 감마-tubulin 등 ninein, centrosomal 단백질 뿐만 아니라 여러 cytoskeletal와 관련 된 단백질에 대 한 보존 되었다 고정입니다.

Apico 기초 극성으로 epithelia의 형성 개발에서 기본 과정 이며 microtubules centrosomal 단백질의 극적인 개편을 포함 한다. 방사형 microtubule 배열 위치 centrosomal microtubule 센터 조직에서 나오는 (MTOC) 많은 동물 세포에서 저명한 이며 이것이 비교적 평평한 세포에 적합. 반면, 원주 상피 세포, 소장의 그들과 같은 더 나은 모양 및 이러한 셀의 특수 기능을 지 원하는 비 방사형 transcellular microtubule 배열 조립. microtubules의이 극적인 개편 transcellular microtubules1,2 의 앵커리지에 대 한 책임 되는 centrosome 꼭대기와 꼭대기 비 centrosomal MTOCs (n MTOCs) 형성, 이동에 의해 이루어집니다. , 3 , 4 , 5.
상피 분화와 관련된 microtubule 개편의 우리의 지식을 많은 2D 체 외에서 세포 층 vivo에서 조직 아키텍처를 표시 하지 않는의 조사에서 왔다. 6Clevers와 동료 의해 개척 organoid 문화, 3 차원 생체 외에서 개발 그들은 모방 vivo에서 아키텍처 및 개발 주요 기술적 진보를 나타냅니다. 상피 분화의 계층은 분명 소장; 지하실의 하단에 줄기 세포 미 숙 이동 증폭 세포를 증식 하 고 점차적으로 그들은 완전히 이전 되 고 분화 되는 작은 장 모 또는 저 승 표면에 토 굴을 마이그레이션할로 차별화를 일으키합니다 루멘7에 창. 중요 한 것은,이 장 organoids 줄기 세포 틈새에서 셀 이후에 아래와 낭종 지역으로 점차적으로 진행 하는 차별화에 줄기 세포와 토 굴 같은 싹을 생성 하는 형성 cysts을 증식에 복제 됩니다. 이 모 같은8된다. 장 organoid 따라서 microtubule 상피 분화 하지만 다른 수많은 단백질 뿐만 아니라, 의약품 및 식품의 심사에 대 한 이상적인 플랫폼을 제공 하는 동안 centrosomal 개편 뿐만 아니라 공부 하 고 강력한 모델을 나타냅니다. 화합물의 잠재적인 치료 혜택9,10.
Organoids 형광 태그 단백질의 라이브 이미징에 대 한 적합은 둘 다 노크-에서 노크 아웃 organoids11,12편집 CRISPR/Cas9 유전자를 사용 하 여 생성 될 수 있습니다. 그러나, 식 및 공부 생 단백질의 지역화 설정 태그 단백질의 동작을 확인 하기 위해 특히 중요 하다. 면역 라벨 3D organoids 지 매트릭스 또는 전 비보 고립에서 성장 조직 차원에서 문화 요리에서 성장 하는 세포 보다 더 복잡 하다. 기정 프로토콜 (즉, 항 체 바인딩을 위한 epitopes) 항 체 antigenicity 유지 하면서 organoids의 섬세 한 3D 건축을 보존 해야 합니다. 예를 들어 4 %paraformaldehyde (PFA) 일반적으로 정착 액으로 사용 하지만 상대적으로 빠른 행동 정착 액은 그것 좋은 형태 보존을 제공 하는 동안 우리의 경험에 그것 자주 antigenicity의 손실 귀착되 고 많은 적합 하지 않습니다. centrosomal 항 체입니다. 3 차원 구조와 조직에 침투 하는 정착 제와 항 체의 능력 또한 고려 되어야 한다. 이 위해, 우리 수정 하 고 조직 격리 및 간접 면역 3 차원 생체 외에서 organoids 및 전 비보 의 라벨에 대 한 개발된 프로토콜 고립 장 조직. 우리는 작은 장 지하실과 villi 조직과 저 승, 격리 하 고 해결 하 고 지하실 매트릭스 내에서 면역 라벨 대신 3D organoids의 격리에 대 한 프로토콜을 포함 하는 방법을 설명 합니다. 선물이 microtubules와 centrosomal, ninein, 등 단백질과의 microtubule 플러스-엔드 추적 단백질 (+ 팁), EB 단백질 및 클립-170 (참고 참조8, 같은 면역 라벨에 대 한 세 가지 대안 기정 프로토콜 13). 우리는 또한 각 프로토콜 관련 된 장단점 토론.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td>세척 및 PFA</td></tr><tr><td>세포 회수 용액</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>분리 오가노이드</td></tr><tr><td>lobind 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td>세포 고착</td></tr><tr><td>방지 0.5 M EDTA 용액, pH 8.0</td><td>Sigma</td><td>03690-100ML</td><td>Crypt isolation</td></tr><tr><td>70 &mu; m 세포 여과기</td><td>Fisher Scientific</td><td>11517532</td><td>융모에서 crypts 분리</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>세제</td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td>차단제</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td></td><td>는 붙지 않는 제제로</td></tr><tr><td>사용되며 Paraformaldehyde, PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>고정제</td></tr><tr><td>에서 4 %포름알데히드 용액 (36.5&ndash; H2O)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td>에서 <td>38%가 고정성</td></tr><tr><td>메탄올로 사용됨 99.9% 분석 등급</td><td>Fisher</td><td>M/4000/17</td><td>이 고정식</td></tr><tr><td>MaxFluor Mouse on Mouse Immunofluorescence Detection Kit</td><td>Maxvision Biosciences</td><td>MF01-S</td><td>상용 면역형광 키트로 사용됨; 비특이적 라벨링 감소</td></tr><tr><td>Rotator SB2 또는 SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td>마이크로 원심분리기 튜브 로테이터</td></tr><tr><td>구연산</td><td></td><td></td>나트륨 <td>항원 회수</td></tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>마운트제</td></tr><tr><td>DABCO - 1,4-디아자비사이클로[2.2.2]옥탄</td><td>Sigma</td><td>D27802</td><td>페이드 방지제</td></tr><tr><td>영구 양전하, 사전 세척, 90도 접지 가장자리</td><td>투명도</td><td>N/C366</td><td>슬라이드</td></tr><tr><td>유리 커버슬립 - 두께 번호 1, 22 x 50 mm</td><td>Clarity</td><td>NQS13/2250</td><td>커버슬립</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>3D 오가노이드 배양을 위한 베이스먼트 매트릭스</td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td> 조직<td>/오가노이드 처리용</td></tr><tr><td>15 mL 코니컬 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td>조직/오가노이드 프로세싱</td></tr><tr><td>1.5 mL LoBind 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td>분리된 오가노이드</td></tr><tr><td>마우스 단클론 항-E-cadherin 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>1차 항체 1:500</td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti-tubulin YL1/2 항체</td><td>Abcam</td><td>ab6160</td><td>1차 항체 1:100</td></tr><tr><td>토끼 알파-튜불린 항체</td><td>Abcam</td><td>ab15246</td><td>1차 항체 1:100</td></tr><tr><td>토끼 항-베타-액틴 항체</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td>1차 항체 1:100</td></tr><tr><td>Rat monoclonal anti-p150Glued antibody</td><td>BD Bioscience</td><td>610473/4</td><td>primary antibody 1:100</td></tr><tr><td>Rat monoclonal EB3KT36 항체</td><td>Abcam</td><td>ab53360</td><td>1차 항체 1:200</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal EB1 항체</td><td>BD Bioscience</td><td>610535</td><td>1차 항체 1:200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Lgr5 항체</td><td>Abgent</td><td>AP2745d</td><td>1차 항체 1:100</td></tr><tr><td>Dylight anti-rat 488</td><td>Jackson</td><td></td><td>112545167 seconday 항체 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-mouse 488</td><td>Jackson</td><td></td><td>ST115545166 seconday 항체 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-rabbit 647</td><td>Jackson</td><td>111605144</td><td>seconday 항체 1:400</td></tr></tbody></table>

microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 organoids 3 차원 생체 외에서 centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

Vivo에서 조직 아키텍처와 morphogenesis 모방 3D 생체 외에서 organoids의 출현 크게 세포 및 개발 생물학에서 중요 한 생물 학적 질문을 공부 하는 능력을 고급 있습니다. 또한, 유전자 편집 및 바이러스 성 유전자 전달에 최근의 기술 진보와 함께 organoids 의료 연구 및 질병의 처리를 위한 새로운 약물의 개발을 약속 드립니다. Organoids에서 생체 외에서 지 매트릭스에서 성장 문제를 연구 하 고 다양 한 단백질의 기능에 대 한 강력한 모델 시스템을 제공 하 고 형광 태그 단백질의 라이브 이미징에 대 한 적합. 그러나, 설립 식 및 생 단백질의 지역화 ex vivo 조직에 생체 외에서 organoids는 태그 단백질의 동작을 확인 해야 합니다. 이 위해 우리 개발 하 고 조직 분리, 고정, 및 전 비보 장 조직 및 체 외에 장 organoids microtubules, centrosomal, 및 관련 단백질의 지역화에 대 한 면역 라벨 프로토콜 수정. 또한 항 체 antigenicity을 보존 하 고 좋은 침투 및 정착 액 및 항 체의 사용 하는 동안 organoids/조직의 3 차원 구조를 보존 하기 위해 정착 제에 대 한 목표가 이었다. 안정적인 microtubules 제외한 모든 감기에 노출 depolymerizes 그리고 다양 한 프로토콜을 수정할 때 중요 한 요소 했다. 우리는 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 농도 3 밀리미터에서 30 밀리미터에 증가 했다 villi 및 소장에 있는 지하실의 효율적인 분리 3 mM EDTA가 저 승 지하실에 대 한 충분 한 발견. 개발 된 포름알데히드/메탄올 기정 프로토콜 antigenicity microtubules, 말라와 최종 바인딩 (EB) 단백질의 효과적인 라벨에 대 한 보존 하는 동안 아주 좋은 구조 보존을 했다. 그것은 또한 centrosomal 단백질 ninein 메탄올 프로토콜 일 더 일관 되 게 비록 근무. 우리는 더 고정 및 microtubules과 관련 된 단백질의 면역 라벨 organoids에서 격리 또는 지 매트릭스 내 남아 있는과 달성 될 수 있었다 설립.

선물이 vivo에서 조직에서 장 3 차원 구조의 절연에 대 한 프로토콜 및 지하실 매트릭스 생체 외에서 organoids, 및 세부 다른 정착 immuno-microtubule의 라벨에 대 한 최적화 된 프로토콜을 얼룩이 지 포함 centrosomal, 그리고 접합 단백질도로 표식 줄기 세포 단백질 Lgr5를 포함 하 여 셀.

Microtubules 및 전 비보 장 조직 및 장 Organoids 3 차원 생체 외에서 Centrosomal 단백질의 면역 형광 라벨

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

이 절차의 전반적인 목표는 3D 체외 기저 매트릭스에 내장된 장 오가노이드를 분리하고, 이후 세포 및 발달 생물학의 주요 생물학적 문제를 연구하는 데 이상적인 모델인 미세소관과 센트로솜 proteins. 3D in vitro 오가노이드를 고정하고 면역 라벨링하는 것입니다. 그러나 3D 모델에서 내인성 단백질과 구조를 국소화하는 것은 2D 배양보다 더 복잡합니다.중요한 것은 정착액이 섬세한 3D 구조를 보존하는 동시에 항체 항원성을 보존해야 한다는 것입니다. 제시된 방법에는 분리, 고정 및 3D 체외 장 오가노이드의 면역 라벨링이 포함됩니다. 그러나 고정 및 면역 표지 프로토콜은 생체 외 분리 조직에서도 사용할 수 있습니다.제시된 포름알데히드 메탄올 고정 프로토콜의 주요 장점은 3D 구조를 보존하는 동시에 항원성을 보존한다는 것입니다. 이를 통해 미세소관, 액틴 필라멘트 및 결합 단백질과 ninein을 포함한 여러 centrosomal 단백질을 효과적으로 표지할 수 있는 post-fixed tevel 항체의 우수한 침투 및 제거를 가능하게 합니다. 제 연구실의 정식 박사후 연구원인 Deborah Goldspink 박사와 공동 저자인 Zoe Matthews 박사가 시연할 것입니다.장샘(intestinal crypt)과 융모(villi)를 분리한 후, 면역 염색을 위해 분리된 상피 구조를 고정할 수 있습니다. 고립된 crypts는 매트릭스 돔에 번갈아 앉을 수 있으며, 이는 오가노이드를 형성합니다. 약 5일에서 7일의 배양 후 오가노이드가 형성됩니다.500마이크로리터의 RT-PBS를 사용하여 지하 매트릭스 돔이 포함된 웰을 오가노이드로 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 250마이크로리터의 콜드 셀 회수 용액을 추가합니다. 그런 다음 P1000 마이크로피펫을 사용하여 지하 매트릭스 돔을 긁어내고 웰 전체를 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 플라스틱에서 지하 매트릭스를 분해하고 제거합니다.매트릭스를 분해하는 데 도움이 되도록 복구 용액이 차가운지 확인하십시오. 긁을 때는 P1000 마이크로피펫만 사용하여 오가노이드가 분해되지 않고 손상되지 않도록 합니다. 1.5ml의 저결합 마이크로 원심분리기 튜브에 상층액을 수집합니다.그런 다음 튜브를 여러 번 뒤집고 현미경으로 때때로 50배율로 오가노이드가 분리되어 자유롭게 움직이고 덩어리가 아닌지 확인합니다. 5 분 동안 1, 000 g 및 실내 온도에 원심 분리에 의하여 organoids를 펠릿. 그런 다음 회수 시약을 제거하고 즉시 고정을 진행합니다.이전에 분리된 오가노이드를 포름알데히드와 메탄올로 고정하려면 오가노이드를 섭씨 음의 20도 포름알데히드 메탄올 고착 용액에 재현탁합니다. 영하 20도의 오가노이드를 냉동고에서 15분 동안 배양하고 5분마다 튜브를 뒤집습니다. 다음, 1, 5 분 동안 000 g에 분리기분리에 의하여 organoids를 펠릿.정착액을 제거한 후 1%의 2차 항체 종 혈청이 함유된 PBS 또는 0.1%의 세제와 1%의 혈청이 함유된 PBS로 구성된 세척액을 첨가합니다. 이전과 같이 샘플을 펠릿화한 후 세척 용액을 제거하고 샘플을 새 세척 용액에 다시 현탁시킵니다. 튜브 로테이터를 사용하여 총 1시간 동안 세포를 세척하고, 15분마다 원심분리를 통해 오가노이드를 펠릿화하고 세척 용액을 교체합니다.장 오가노이드 샘플을 차단하려면 PBS에 10%의 2차 항체 종 혈청을 추가합니다. 1, 000g에서 오가노이드를 5분 동안 펠렛으로 만들고 상층액을 제거합니다. 각 샘플에 1ml의 차단 용액을 추가하여 다른 항체에서 배양합니다.그런 다음 샘플과 차단 용액을 실온의 튜브 로테이터에서 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 10%의 혈청과 0.1%의 세제를 함유한 PBS의 1차 항체를 희석합니다. 그런 다음 샘플을 회전시키고 차단 용액을 제거한 후 1차 항체 용액을 사용하여 오가노이드 펠릿을 재현탁합니다.튜브를 하룻밤 동안 20RPM과 섭씨 4도로 회전시켜 오가노이드를 부유 상태로 유지합니다. 다음 날, 샘플을 튜브 로테이터에서 1시간 동안 실온으로 다시 가져옵니다. 샘플을 회전시킨 후 기본 항체 용액을 제거하고 각 튜브에 1ml의 세척 용액을 첨가한 다음 오가노이드 펠릿을 재현탁합니다.그런 다음 즉시 원심분리로 용액을 제거하십시오. 1ml의 신선한 세척액을 넣고 튜브 로테이터에서 20RPM으로 2시간 동안 세포를 혼합합니다. 다음으로, PBS의 2차 항체를 1%의 혈청과 0.1%의 세제로 희석합니다.그런 다음 조직을 펠릿화한 후 펠릿을 200마이크로리터의 2차 항체 용액에 재현탁합니다. 튜브 로테이터의 튜브를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 방사하여 상등액을 제거한 후 펠릿을 세척 용액에 재현탁시키고 즉시 샘플을 원심분리하여 오가노이드를 펠릿화합니다.그런 다음 상등액을 제거하고 펠릿을 1ml의 신선한 세척 용액에 재현탁시킵니다. 실온에서 1.5-2시간 동안 튜브 로테이터에 샘플을 혼합하고 앞서 설명한 대로 20-30분마다 세척 용액을 교체합니다. 오가노이드를 장착하려면 회전하여 모든 세척 용액을 제거한 후 퇴색 방지 시약이 포함된 하드 세팅 장착 매체 2방울을 펠릿에 추가합니다.P200 마이크로피펫의 끝을 자르고 펠릿을 장착 매체에 조심스럽게 다시 매달립니다. 장착 매체에 고정되고 염색된 오가노이드를 재현탁할 때 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오. 기포가 있는 경우 기포가 표면으로 떠오르도록 한 다음 슬라이드로 옮기지 마십시오.마이크로피펫을 사용하여 현미경 슬라이드의 중심을 따라 일렬로 장착 매체가 있는 오가노이드를 분주합니다. 그런 다음 커버 유리를 조심스럽게 위에 놓고 거품이 발생하지 않도록 합니다. 유리 슬라이드를 슬라이드 북에 넣고 컨포칼 현미경에서 분석하기 전에 장착 매체가 설정될 수 있도록 냉장고에 밤새 보관하십시오.여기에 표시된 것은 융모와 소낭선을 모두 포함하는 분리된 소장 조직의 분획 2와 주로 소낭선을 포함하는 분획 3의 샘플입니다. 이 이미지에서 볼 수 있듯이, 융모와 소돌이 모두에서 미세소관과 액틴의 우수한 보존 및 라벨링은 이 비디오에 설명된 포름알데히드 메탄올 고정 및 면역 라벨링 프로토콜을 통해 달성되었습니다. 소장 오가노이드를 생성하고 지하 매트릭스에서 3주 이상 성장시킨 다음 이 비디오에서 입증된 바와 같이 분리했습니다.오가노이드 융모 도메인 내의 분화된 세포는 대부분의 경우 잘 표지된 안정적인 apicobasal 미세소관을 포함합니다. EB1은 미세소관 격자를 따라 볼 수도 있습니다. 여기에 보이는 것은 낭종 단계와 소낭선 발달의 초기 단계에 있는 오가노이드입니다.두 샘플 모두 포름알데히드 메탄올에 고정되고 미세소관 및 나인에 대한 면역 표지되었으며, 이는 정점 비중심 미세소관 조직 센터에서 우수한 미세소관 보존 및 표지를 보여줍니다. 이 기법을 마스터하면 여러 샘플로 이틀에 걸쳐 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 오가노이드를 수집할 때 3D 구조가 손상되지 않도록 우물을 조심스럽게 긁어내는 것이 중요합니다.또한 염색 절차 전반에 걸쳐 오가노이드의 손실을 방지하기 위해 용액을 추가하거나 제거할 때 주의하십시오. 이 동영상을 시청한 후에는 분리된 오가노이드 및 장샘과 같은 기타 상피 구조를 고정, 면역 라벨링 및 장착하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에서 사용하는 고정성 시약은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.이 절차에 대한 위험 평가를 수행해야 하며 이 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 봉쇄 조치와 PPE를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 온전한 전립선암 오가노이드의 면역형광 염색 기술과 전체 마운트 컨포칼 현미경에 의한 이미징에 대해 설명합니다. 이 기술은 기저 및 내강 전립선 상피 세포의 생체 외 분화 능력을 평가하는 것을 목표로 합니다.

전체 마운트 면역형광 이미징: 온전한 오가노이드를 평가하기 위한 고정 및 염색 기법

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향상된 이미징 기술은 발달 중에 장기의 3차원 이미징을 가능하게 합니다. 여기에서는 태아 쥐의 장에서 발달 중인 융모의 실시간 이미징을 허용하는 전체 장기 배양 시스템에 대해 설명합니다.

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장 신경계(ENS)는 장 반사를 제어하는 장 벽에 위치한 뉴런과 신경교세포의 네트워크입니다. 이 프로토콜은 Ca2+ 이미징을 사용하여 ENS의 실시간 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 기록하는 방법을 설명합니다.

장용 신경계의 제자리 칼슘 이미징에서

투명 한 선 충 C. 소장"vivo에서 조직 챔버를" 다세포 tubulogenesis 동안 단일 세포 및 subcellular 수준 apicobasal 막과 루멘 속 공부에 대 한 될 수 있습니다. 이 프로토콜 표준 라벨을 결합 하는 방법을, RNAi/손실의 기능 유전자 및 분자 수준에서이 프로세스를 해 부 현미경 접근에 설명 합니다.

C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

이 프로토콜 상피 장벽 침투성 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 인간의 창 자 organoids에서 실시간 다음 약리학 적인 치료에서의 측정을 설명 하 고 라이브 셀 현미경 검사 법.

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

구가 외 인 산화 상태는 말라 바인딩 단백질 girdin 티로신 1798 (pY1798)에 phosphorylated에 대 한 특정 항 체 술 셀 (TCs)을 사용할 수 있습니다 발견. 이 프로토콜의 부동성 공장 cryosections pY1798 항 체와 immunofluorescent 얼룩을 사용 하 여 TCs의 강력한 시각화 수 있습니다.

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