Name: 해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 배우세요 저압 플라즈마 처리 후 Bacillus subtilis 포자의 생존성 및 DNA 복구 과정을 공초점 형광 현미경과 주사전자현미경으로 분석하는 방법을. 이 기술은 미생물 불활화 및 살균 연구에 활용됩니다.

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저자는 그녀의 도움을 비디오 촬영 하는 동안이 작업 및 Nikea J. 울 리 히의 부분 그녀의 우수한 기술 지원에 대 한 안드레아 슈뢰더를 감사합니다. 우리는 또한 새 균의 subtilis 긴장의 그의 관대 한 기부에 대 한 일 A. 시 몬스를 감사 하 고 싶습니다: LAS72 및 LAS24. 이 작품은 부분에서 교부 금에 의해에서 지원 독일 연구 재단 (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon 박 728) PA (AW 7/3-1) 고 RM (모 2023/2-1)와 DLR DLR-FuW-프로젝트 ISS 생활, 프로그램 RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, M.R. R.M.)를 부여 합니다. F.M.F. (6 년의 기간 동안 헬름홀츠 협회 (헬름홀츠 Gemeinschaft)에 의해 투자 되었다 쾰른, 독일, 독일 항공 우주 센터 (DLR)를에서 헬름홀츠 공간 생명 과학 연구 학교 (SpaceLife)의 박사 학위 장학금에 의해 지원 되었다 부여 번호 VH-KO-300) 항공 집행 위원회와 항공 우주 의학 연구소를 포함 하 여 DLR에서 추가 자금을 받았다. 이 연구의 결과 펠릭스 M. Fuchs의 박사 논문에 포함 될 것입니다.

1. 새 균의 subtilis 포자 생산 및 정화
<ol><li>포자 생산에 대 한 각각의 5 mL 하룻밤 문화 전송 B. subtilis 스트레인, 적절 한 항생제, 200 mL (당 리터 16 g 영양 국물, KCl 2 g, 0.5 g MgSO 더블 강도 액체 쉐 퍼 포자 형성 매체를 보충 4* 7 H2O 2 mL 1 M Ca (3)2, 2 mL의 0.1 m M MnCl2 * • 4 H2O 2 mL 1 m m FeSO4, 2 mL 50% (w/v) 포도 당18) 72 h 또는 문화 &gt; 95%까지 37 ° C에서 활발 한 통 기 통풍으로 육성 sporulated는. 다음 변종 포자 사용 됩니다: B. subtilis PY79 (야생 유형) B. subtilis PY79ΔrecA:: 네오 (DNA 수 선 단백질 RecA의 결핍) B. subtilis PY79 recA yfp:: 고양이 (RecA 융합 노란색 형광 단백질 [YFP]19).</li>
	<li>50 mL 튜브에 3000 x g에서 15 분 동안 원심 분리 하 여 포자를 수확 하 고 반복된 세척 단계 (최대 15 시간) 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 순도 및 발 아 상태에 대 한 멸 균 증류수 H2O와 검사를 사용 하 여 샘플을 정화. 포자 현 탁 액 단계 밝은 포자 (&gt; 99%)으로 구성, 자유롭다 식물 세포 (막대), 세균된 포자 (검정 / 회색 외관)과 세포 파편, 그렇지 않으면 현미경 실험을 방해 수 있습니다 추가 확인 하십시오. 원하는 순도 도달할 때까지 샘플을 씻으십시오.</li>
	<li>50 µ L 파운드 agar에 10 직렬 희석의 밖으로 도금 하 여 포자 titer 결정 (예: 사용 30 µ L 샘플 + 270 µ L 살 균 물 1시 10분 희석. 받아 270 µ L H2O 1: 100 희석에 대 한 특정 희석에서 30 µ L 등등) CFU (콜로 니 형성 단위)을 계산 하 고 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어. CFU 결정 후 집중 또는 살 균 물으로 희석 하 여 mL 당 109 포자를 샘플을 조정 합니다.</li>
</ol>2. 샘플 준비 졸 입금 새 균의 subtilis 포자의
참고: 축적 및 포자의 중첩 발생할 수 있습니다 처리 도중, 효과 그림자 궁극적으로 위조 된 비활성화 속도 론 인. 이 문제를 최소화 하기 위해에 어로 졸 증 착 기술은20여 포자 샘플을 준비 합니다. 간단히, 가압된 캐리어 가스 (여기서 N2)의 흐름으로 콘서트에 액체 처리량을 조절 하는 전기 타이머와 높은 정밀도 2 물질 노즐을 제어 합니다. 질소 가스 흐름을 사용 하 여 노즐 출구를 통해 주입 된 액체 샘플을 분산.
<ol><li>(생존 활동)에 대 한 멸 균된 현미경 슬라이드 형태의 샘플 캐리어 또는 25 mm coverslips 라운드 (DNA 수리의 형광 추적 프로세스/cLSM; confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법) 전자식으로 작동된에 어로 졸 분사 장치 내부 에 노즐 정렬. 사용 된 포자 농도에 해당 하는 데 필요한는 원하는 최종 농도의 백배.</li>
	<li>포자 문화의 1 mL 노즐 액체 입구 전송과 0.1의 살포 과정 시작 1.3 바의 압력에서 s. 분무 포자 현 탁 액 (1 x 107) 균일 하 게 분산된 포자 단층을 형성 하는 초 이내 급속 하 게 말리는 현미경 슬라이드에 얇은 필름을 형성 합니다. 실 온에서 살 균 컨테이너에서 처리 샘플 캐리어를 저장 합니다.</li>
</ol>3. 저압 플라즈마 처리
<ol><li>생물 학적 샘플의 처리를 위한 플라즈마 시스템을 준비 하 고 5에서 시스템을 작동 5 분 동안 500 W에서 아르곤 플라즈마와 Pa. 이것에 의해, 시스템의 모든 표면은 청소 하 고 예 열. 이 시스템을 배출 하는 동안 주위 공기, 질소, 산소, 그리고 물, 즉 분자의 고집을 감소 시킨다. 시스템의 전처리 후 챔버를 환기 하 고 유리 선반의 도움으로 원자로 용기의 센터에 샘플을 신중 하 게 배치 합니다.</li>
	<li>적어도 3 개의 생물 복제를 사용 합니다. 챔버를 닫고 2 아래 철수 아빠 나중, 챔버로 공정 가스를 채우기. 5 시스템에 압력 조절 실바</li>
	<li>정의 된 프로세스 시간 후 전력 및 가스 공급을 해제 하 고 신중 하 게 샘플 홀더에서 샘플을 부을 방지 하기 위해 시스템을 환기. 환기, 후 샘플을 제거 하 고 시스템에서 다음 매개 변수에 대 한 샘플을 배치 합니다. 플라즈마 치료 비 컨트롤 샘플만 진공을 노출에 대 한 (5 Pa) 응용된 플라즈마 긴 시간에 해당 공정 가스의 존재에.</li>
</ol>4. 복구 및 포자 생존의 평가
<ol><li>압력가 10% 폴 리 비닐 아세테이트 (PVA)의 솔루션을 준비 하 고 신중 하 게 약 500 µ L로 샘플 캐리어 커버 그들이 4 h. 스트립에 대 한 공기 건조 소독 집게를 사용 하 여 (지금 포자 샘플을 포함 하는) 말린 PVA 레이어 및 2 mL에 전송 반응 관입니다. 튜브를 살 균 물의 1 mL를 추가 하 고 vortexing 통해 PVA 레이어 디졸브. 이 절차를 리드 &gt; 포자의 95% 회복21그들의 발 아 능력는 영향을 미치지 않습니다.</li>
	<li>직렬 (즉 270 µ L 살 균 H2O + 30 µ L 샘플/전 희석) 96 잘 접시에 메 마른 물에 1시 10분에서 샘플을 희석. 50 µ L 각 희석 Lysogeny 국물 영양 한 천 (파운드)에 밖으로 하십시오, 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어 고 자란된 식민지 (CFU)의 수를 열거.</li>
</ol>5. 라이브 셀 현미경 검사 법, 출 아 포자에서 DNA 복구 프로세스의 추적
<ol><li>발 아 실험에 대 한 준비는 1 m m 두께 1.5% 파운드-한 천 패드, 끓는 700 µ L 매체와 피펫으로 멸 균 현미경 페 트리 접시에 그것. 10 분 후는 8 m m x 8 m m x 1 m m 파운드-한 천 패드 살 균 메스를 잘라 하 고 신중 하 게 25 m m 유리 coverslips에 쉬고 있는 포자 monolayers 위에 agar를 전송. 참고:이 단계 개별 포자의 시각화에 대 한 중요 하 고 영양 한 천에 의해 유도 된 발 아의 활성화 쪽으로 그들의 반응에 따라 허용. 따라서, 파운드-한 두 가지 목적, relocalization 표면을 따라와 광학 초점을 방지, 표면에 포자를 해결 하기 위해 (1) 및 (2) 발 아에 대 한 포자 활성화를 제공 합니다.</li>
	<li>Agar와 샘플, 취재 후 전송 유리 coverslip 빠르게 이미징 챔버 및 현미경으로 자동된 confocal 레이저 스캐닝 현미경으로 샘플 63 X를 사용 하 여 거꾸로 광학 / 1.3 apochromatic 비행기 기름 침수 목표.</li>
	<li>
이미징을 수행 형광 (YFP)는 여기의 514 nm의 방출 파장은 520 및 560 nm 사이 검출 될 수 있다.
	<ol>
<li>스캔 모드 사진 배율 (전송 빛 경로) 중 하나를 사용 하 여 레코드 필드 밝은 이미지.</li>
		<li>2.6%, 레이저 파워와 시간 경과 시리즈를 기록 하 고 5 공기 단위 및 30 초당 1 프레임의 샘플 주파수에서 confocal 조리개 설정 실험에 따라 5 h 0 h에서 s. 그것은 특정 참고 단색의 고용량 514에서 조명 레이저의 nm는 완전히 (그림 1A, B) 발 아를 억제.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전체 이미징 프로세스 동안 난방 단계에서 37 ° C (주변 공기 습도)에서 샘플 계속. 적어도 3 개의 생물 복제를 사용 하 여 각 조건에 대 한. 포자 집계, 다층된 포자 배포 또는 오염 먼지 입자에 의해 발생할 수 있습니다 ("그림자") 플라즈마 처리의 차단 및 (그림 1C, D) 숨겨진된 포자의 발 아를 활성화.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56666/56666fig1.jpg"> 그림 1: 잠재적인 문제 confocal 살아있는 세포 형광 현미경 플라즈마 처리 포자의 동안 관찰. (A, B) 단색의 높은 복용량에 의해 발 아 포자의 억제 (514 nm) 레이저 조명. (A) B. subtilis (LAS72, RecA YFP)의 개요 (3 맞춘된 프레임 x 3) 발 아의 개시 후 180 분 포자. 중간에 프레임 (= 프레임) 주변의 지역 조명 하지 했다 반면 30 s 간격 (514 nm, 70% 레이저 전원), 레이저 빛의 높은 복용량에 노출 되었다 (밝은 분야 채널과 RecA YFP 형광;의 병합 된 이미지 구조 했다 주문 35 mm 이미징 찍힌된 500 µ m 그리드와 요리를 사용 하 여 발생 하는). (B) X 4를 보여줍니다 반면 포자, 단색 레이저 조명의 고용량에 노출 됐다 않았다 하지 발 아 하 고 성장, 보여주는 조명 및 조명 비 지역 사이 국경의 확대 보기에서 포자 비 조명 영역 완전히 밝은 RecA YFP 형광 (녹색 신호)를 표현 하는 무성 한 박테리아를 복구. (C, D) 입자 오염에 의해 덮여 포자 또는 포자 (화살표)의 여러 레이어 플라즈마 처리에 의해 비활성화에서 기본 포자를 보호 하 고 그들의 발 아 및 파생물 ("그림자 효과")를 허용 하는 것 같다. (C) 포자의 발 아 또는 (D)에 개시 후 60 s 한 군데 180 분 플라즈마 처리 했다 120 s 240 분 후 몇 군데와 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56666/56666fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
6. 스캐닝 전자 현미경 (SEM)
<ol><li>스캐닝 전자 현미경을 사용 하 여 치료 컨트롤에 비해 플라즈마 처리 포자의 표면 형태에 대 한 ultrastructural 정보를 제공. 금-팔라듐과 coverslips에 말린된 포자 monolayers 코트 (3 nm) 스퍼터 coater를 사용 하 여. 이미징 샘플, 지형 대조를 계시 하는 렌즈에서 2 차 전자 검출기를 포함 하 여 5 kV 가속 전압에 운영에 대 한 필드-방출 스캐닝 전자 현미경을 사용 합니다.</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>여기서 N은 평균 치료 샘플의 CFU 고 N0 은 치료 진공 컨트롤의 CFU 평균 몫 N/N0에서 포자 생존을 결정 합니다. 시간 (초)의 기능으로 아르곤 플라즈마 처리에 의해 포자 비활성화를 플롯 합니다. 평균 및 표준 편차로 표현 하는 모든 데이터 (n = 3).</li>
	<li>라이브 셀 이미징 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. 포자 발 아의 비율 계량 및 플라즈마 처리 후 빨리 성장, 대표 프레임 4 h 후에 뿐만 아니라 실험의 시작 부분에 있는 포자. 포자 생존 분석 실험의 의미 결정에 대 한 사용 하 여 단방향 ANOVA 테스트 (분산 분석) 통계 소프트웨어와 함께). P 값 &lt; 0.05로 통계적으로 유의 한 것으로 간주 됩니다.</li>
</ol>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언.

낮은 온도 사용 하 여 표면 살 균, 저압 플라즈마는 이온화 방사선, 화학 치료 등 오히려 기존의 살 균 절차를 유망한 대안 (예: 가스 H2O2 와 같은 또는 에틸렌 산화물) 또는 건조 하 고 습 한 열23. 일반 살 균 방법을 주로 효과적인 살 균을 제공 하지만 그들은 치료 재료 영향 및 연산자에 대 한 잠재적인 위험을 나타내는 알려져 있습니다. 저압 플라즈마는 자외선 광자, 자유로운 전자, 이온 등 여러 구성 요소 구성을 사용 하 여 신속 하 고 동종 생물 비활성화를 제공 하 고 원자 또는 분자 (예: 선생님) 종료. 따라서, LPP 같은 열가 소성 고분자 임 플 란 트, 전자 기기 또는 복잡 한 3D-구조에 대 한 열 및 부식 민감한 재료에 적용할 수 있습니다. 현재 신문에서 우리는 테스트 시스템의 응용 프로그램, 스프레이 B. subtilis 의 어떤 monolayers 포자<sup clas...

우주 탐사의 주요 목표는 생명체와 다른 행성 몸과 우리의 태양계에 있는 달에 생체의 서명에 대 한 검색입니다. 미생물의 전송 또는 탐험의 중요 한 영역을 지구 근원의 생체 개발 및 생활 탐지 임무 화성과 유로 파1등 행성의 시체의 무결성을 영향을 미칠 특정 위험입니다. 여는 위원회의 공간 연구 (COSPAR) 1967 년에에서 설립, 행성 보호의 국제 지침 다른 행성, 그들의 위성, 소행성, 및 다른 천체를 유인 하 고 로봇 임무에 대 한 엄격한 규제를 부과 하 고 규제는 청소 및 살 균 지상파 미생물 오염 제거 하 고 천체2의 교차 오염을 방지 하기 위하여 발사 하는 우주선과 이전 중요 한 하드웨어 구성 요소. 지난 10 년간 비 열 플라즈마의 응용 spaceflight 응용 프로그램3,,45뿐만 아니라 생물 의학 및 영양 연구에 광범위 한 관심을 얻고 있다. 신속 하 고 효율적인 미생물 비활성화6을 민감한 부드러운 고 열 불안정 물질 동안 제공 플라즈마 살 균은 기존의 살 균 방법에 유망한 대안 이다. 플라즈마 방전 자유 래 디 칼, 입자, 중립/흥분 원자, 광자 자외선 (UV), 진공 자외선 (VUV) 스펙트럼에 있는 급속 한 미생물 비활성화3반응 요원의 혼합물을 포함 합니다. 이 연구에서 우리는 새 균의 subtilis endospores 유리 테스트 표면에 배포를 비활성화 하 이중 저압 유도 결합된 플라즈마 (DICP) 소스7,8 에 의해 생성 된 저압 플라즈마를 사용 합니다.
가족 Bacillaceae 의 그람 양성 박테리아는 토양, 퇴적 물, 및 클린 룸 시설 등 국제 우주 정거장9,10 비정상적인 환경에서 뿐만 아니라 공기의 자연 서식 지에 널리 배포 ,11. 속 균 의 가장 뚜렷한 특징은 영양소 고갈12등 불리 한 조건, 살아남기 위해 저항력 휴면 endospores (포자 라 함)을 형성 하는 기능 이다. 포자는 일반적으로 훨씬 더 다양 한 트리 트 먼 트 및 환경 스트레스, 열, 자외선, 감마 방사선, 건조, 기계적 장애, 및 강한 산화 제와 같은 독성 화학 물질을 포함 하 여 식물 세포 들 보다 저항 또는 pH 변화 에이전트 (참조13,14에서 검토) 되며 따라서 미생물 비활성화 방법의 효율성을 테스트 하기 위한 이상적인 개체. 때문에 genomic DNA는 박테리아15,16, 병 변의 플라즈마 유도 DNA 수리의 플라즈마 처리의 주요 목표 (예: DNA 이중 가닥 나누기) 포자에 부흥은 박테리아13의 생존을 위해 중요 한 17.
따라서, 우리 연구 포자의 발 아 용량 및 DNA 복구의 역할 포자 발 아 및 파생물 다음 개별 포자에 의해 낮은 압력 아르곤 플라즈마와 포자를 치료 후 하 고 형광 표시 DNA의 그들의 표현을 수리합니다 시간이 해결 공초점 형광 현미경 검사 법으로 단백질 RecA. 우리는 재현할 수 있는 테스트 결과, 저압 플라즈마 살 균에 대 한 포자 monolayers의 처리, 플라즈마 처리 포자에 대 한 준비를 달성 하기 위한 monolayers에 B. subtilis 포자의 준비의 단계 지시를 주고 ultrastructural 평가 모니터링 활성 DNA와 함께에서 개별 포자의 수준에서 스캐닝 전자 현미경 (SEM), 그리고 라이브 셀 현미경 분석을 사용 하 여 셀 내에 플라즈마 처리에 발생 하는 프로세스를 복구 합니다.

<table><tbody><tr><td>2개 물질 노즐(모델 970-8)</td><td>Schlick</td><td>14,404</td>, <td>230V, 50Hz, D, 4.484/8, 0.8mm 보어 직경</td></tr><tr><td>Luria Bertani Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70122-100G</td><td></td></tr><tr><td>튜브 커넥터</td><td>Festo</td><td>n/a</td><td>G 1/8</td></tr><tr><td>마그네트밸브 DO35-3/2NC-G018-230AC</td><td>Bosch Rexroth</td><td>820005100</td><td></td></tr><tr><td>PLN 폴리아미드 튜브</td><td>Festo</td><td>558206</td><td>D = 6 밀리미터</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48300-026</td><td></td></tr><tr><td>전기 타이머 550-2-C</td><td>Gefran</td><td>F000074</td><td>220 V</td></tr><tr><td>attofluor cell chamber</td><td>Menzel, Fisher Ref.</td><td>3406816</td><td>d=25mm, 원형</td></tr><tr><td>MgSO4*7 H2O</td><td>시그마 Aldrich</td><td>13152</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO3)2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202967</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2 * 4 H2O</td><td>시그마 Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4 * 7H2O</td><td>AppliChem</td><td>13446-34-9</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Merck</td><td>215422</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>영양 육수 (NB)</td><td>Merck</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)</td><td>Merck</td><td>110283</td><td></td></tr><tr><td>96-wellplate</td><td>ThermoFisher</td><td>243656</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td>해당 사항 없음</td></tr><tr><td>Leo 1530 Gemini</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2 및 ZEN lite 2012 (소프트웨어)</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software)</td><td>Systat GmbH, Erkrath, Germany</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor cell chamber</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Dish 35 mm, high Grid-500 유리 바닥</td><td>ibidi</td><td>81168</td><td></td></tr></tbody></table>

해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

플라즈마 살 균 산업, 임상, 및 spaceflight 목적으로 기존의 살 균 방법에 유망한 대안 이다. 저압 플라즈마 (LPP) 방전 급속 한 미생물 비활성화 이어질 활성 종의 광범위 한 스펙트럼을 포함. 효율성과 LPP에 의해 살 균의 메커니즘 연구, 우리는 기존의 살 균 절차에 대 한 그들의 특별 한 저항 때문에 새 균의 subtilis 테스트 기체의 포자를 사용 합니다. 우리는 B. subtilis 포자 monolayers, 이중 유도 결합된 플라즈마 반응 기, 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 포자 형태학의 특성에서에서 저압 플라즈마에 의해 살 균 과정의 생산을 설명 하 고는 발 아 및 라이브 셀 현미경으로 포자의 파생물의 분석. 플라즈마의 주요 대상 게놈 소재 (DNA) 이며 포자 부흥 시 플라즈마 유도 DNA 장애의 복구는 생물의 생존을 위해 중요 한. 여기, 우리는 포자의 발 아 능력을 연구 하 고 DNA의 역할 붙일 이라는 DNA 복구 단백질 (RecA) 시간 해결 공초점 형광 현미경 검사 법으로 추적 하 여 LPP와 치료 후 포자 발 아 및 파생물 복구 합니다. 치료 및 치료 포자 monolayers는 발 아에 대 한 활성화 개별 포자의 반응에 따라 시간이 지남에 거꾸로 confocal 라이브 셀 현미경으로 시각. 우리의 관측 공개 출 아 포자를 빨리 성장 하 고 일부 LPP 트리트먼트 120 s. RecA YFP (노란색 형광 단백질) 형광 몇 포자에만 감지 되 고 모두에 개발 되었다 후 최소에 도달의 기간에 따라 달라 집니다. LPP 취급 포자에 약간의 상승으로 빨리 성장 세포. 또한, 일부 식물 박테리아의 세포질에 있는 증가 보여주었다 LPP 취급 포자에서 파생 된 그리고 lyse 경향이. 개별 포자의 분석에 대 한 설명된 방법 포자 발 아 및 파생물의 다른 측면의 연구에 대 한 훌륭한 될 수 있습니다.

플라즈마 처리 B. subtilis 의 생존 포자
B. subtilis 포자의 플라즈마 처리 사용이 연구 보기 생존 감소 (그림 2) 플라즈마 처리의 내구 증가 함께. RecA표현 스트레인의 포자-YFP 융합 유전자 유전 수정 세균 활력에 더 큰 영향을에 나타내는 야생 유형 긴장의 포자와 비슷한 생존 곡선을 보여주었다. RecA 불충분 한 긴장의 포자 RecA 유전자의 존재 활력의 플라즈마 유도 손실 감소는 보여주는 야생 유형 긴장의 포자에 비해 플라즈마 치료 향해 더 높은 감도 전시 한다. 특히 짧은 15의 플라즈마 처리 s (P &lt;0.003) 30 s (P &lt; 0.004) 야생 유형에 비해 RecA 불충분 한 긴장과 Rec...

이 프로토콜 추적에 의해 모니터링 활력 매개 변수 및 저압 플라즈마 처리 후 새 균의 subtilis 포자를 되살리는에서 DNA 복구 프로세스의 관련성을 평가 하는 데 필요한 중요 한 연속 단계를 보여 줍니다. 형광 표시 DNA 복구 시간 해결 confocal 현미경 검사 법 및 전자 현미경 검사를 통해 단백질.

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

이 일련의 연속 방법의 전반적인 목표는 시간 분해 컨포칼 형광 현미경 및 주사 전자 현미경을 사용하여 저압 플라즈마 처리 후 Bacillus subtilis 포자를 되살리는 DNA 복구의 활력 매개변수를 시각화하고 모니터링하는 것입니다. 당사의 방법은 미생물 불활성화 및 멸균 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. Bacillus subtilis 포자와 같은 생물학적 지표에 대한 저압 혈장 처리의 해로운 영향을 분석하는 데 도움이 됩니다.우리 기술의 주요 장점은 저압 플라즈마 치료의 해로운 영향을 확인하기 위해 시간 결과 형광 현미경을 사용하여 DNA 복구를 관찰하고 측정, 주사 전자 현미경 및 모니터링과 같은 여러 방법을 결합한다는 것입니다. 포자 생산을 수행하기 위해서는 적절한 항생제가 보충된 각 B.subtilis 균주의 5ml 하룻밤 배양을 200ml의 이중 강도 액체 셰이퍼 포자 배지로 옮기고 배양액의 95% 이상이 포자화될 때까지 섭씨 37도에서 최소 72시간 이상 격렬한 폭기로 배양합니다. 3000G에서 15분 동안 원심분리하여 15ml 튜브의 포자를 채취하고 멸균 증류된 H2O를 사용하여 반복적인 세척 단계를 통해 샘플을 정제합니다.얼굴 대비 오크로스코피를 통해 순도 및 발아 상태를 확인하고 포자 현탁액이 위상 밝은 포자의 99% 이상으로 구성되어 있고 식물 세포, 발아 포자 및 세포 파편이 없는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 추가 현미경 검사 실험이 방해받을 수 있습니다. LB 한천에 50마이크로리터의 10배 연속 희석액을 도금하여 포자 역가를 측정하여 CFU를 계산하고 밤새 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. CFU 측정 후 샘플을 농축하거나 멸균수를 사용하여 샘플을 희석하여 ml당 10에서 9번째 포자로 조정합니다.노즐과 정렬하여 전기로 작동되는 에어로졸 스프레이 장치 내부에 멸균된 현미경 슬라이드 또는 둥근 25mm 커버 슬립 형태의 샘플 캐리어를 놓습니다. 포자 배양물을 노즐 유체 주입구로 옮기고 1.3bar의 압력으로 0.15초 후에 분무를 시작합니다. 분무된 포자 현탁액은 미세한 슬라이드에 박막을 형성하고 몇 초 내에 빠르게 건조되어 균일하게 분포된 포자 단층을 형성합니다.처리된 시료 캐리어를 실온의 멸균 용기에 보관하십시오. 플라즈마 시스템의 모든 표면을 청소하고 예열하려면 500와트의 아르곤 플라즈마를 사용하여 5파스칼로 5분 동안 시스템을 시작합니다. 전처리는 챔버를 환기하는 동안 질소, 산소 및 물과 같은 주변 공기로부터 분자가 달라붙는 것을 줄입니다.챔버를 환기시킨 후 샘플을 반응기 용기 중앙의 유리 선반에 조심스럽게 놓습니다. 챔버를 닫고 대피하십시오. 그런 다음 원하는 공정 가스를 사용하여 챔버를 채우고 시스템의 압력을 5파스칼로 조절합니다.그런 다음 플라즈마 프로세스를 시작합니다. 정의된 공정 시간이 지나면 전원 및 가스 공급을 끄고 시스템을 조심스럽게 환기시켜 샘플 홀더에서 샘플이 끊어지지 않도록 합니다. 환기 후 샘플을 제거하고 멸균 용기에 보관하십시오.플라즈마를 처리하지 않은 대조군의 경우, 가장 긴 플라즈마 적용 시간에 해당하는 공정 가스가 있는 곳에서만 샘플을 진공 상태에 노출시킵니다. 오토클레이브 10% 폴리비닐 아세테이트 또는 PVA 용액을 준비하고 500마이크로리터를 사용하여 샘플 캐리어를 조심스럽게 덮습니다. 4시간 동안 자연 건조시킨 후 멸균 집게를 사용하여 포자 샘플이 들어 있는 건조된 PVA 층을 벗겨내고 2ml 반응 튜브로 옮깁니다.튜브에 1ml의 멸균수를 넣고 PVA 층을 용해시켜 발아할 수 있는 포자의 95% 이상을 회수하도록 와류를 일으킵니다. 멸균수를 사용하여 96웰 플레이트에서 샘플을 1에서 10까지 연속으로 희석합니다. LB 한천에 각 희석액을 50마이크로리터씩 도금하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한 후 콜로니 수를 세고 밀리리터당 CFU를 결정합니다.발아 실험의 경우, 700 마이크로 리터의 배지를 끓여서 1mm 두께의 1.5 LB 한천 패드를 준비하고 멸균 현미경 석화에 피펫으로 넣습니다. 10분 후 멸균 메스를 사용하여 8mm x 8mm x 1mm LB 한천 패드를 잘라내고 이미징 챔버에 이미 장착된 25mm 유리 커버 슬립 위에 놓인 포자 단층 위에 한천을 조심스럽게 옮깁니다. 한천 put 방법은 두 가지 특정 기능을 결합합니다.레이저 현미경 검사 중에 광학 평면의 샘플을 안정화하고 측면 세포 이동을 제한합니다. 발아 에세이에 사용하는 것 외에도 이 방법은 진핵 세포뿐만 아니라 다른 미생물에도 적용할 수 있습니다. 샘플을 한천으로 덮은 후 유리 커버 슬립을 이미징 챔버로 빠르게 옮깁니다.전체 이미징 프로세스 동안 가열된 스테이지에서 샘플을 섭씨 37도로 유지하십시오. 각 질환에 대해 최소 3개의 생물학적 복제물을 사용합니다. 자동화된 컨포칼 레이저 스캐닝 및 명시야 현미경으로 샘플을 이미징한 후 2.6%의 레이저 출력으로 타임랩스 시리즈를 기록하고 컨포칼 조리개를 5개의 에어로 설정하고 실험에 따라 0시간에서 5시간까지 30초에 1프레임의 샘플 주파수를 설정합니다.고량의 단색광을 적용하면 레이저 현미경 검사 중 포자 발아를 완전히 억제할 수 있습니다. 따라서 레이저 강도를 사용하고 단일 프레임을 얻는 더 긴 간격만 사용하십시오. 포자 응집, 다층 포자 분포 또는 먼지 입자에 의한 오염의 경우 플라즈마 처리 또는 그림자 현상이 발생하여 음영 포자의 발아가 가능할 수 있습니다.주사 전자 현미경을 수행하기 위해 포자 단층이 금 팔라듐으로 스퍼터링된 후 인라인 2차 전자 검출기를 포함하여 5킬로볼트 가속 전압에서 작동하는 전계 방출 SEM으로 샘플을 이미지화하여 지형 대비를 나타냅니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이 B.subtilis 포자의 혈장 처리는 혈장 처리 기간이 증가함에 따라 생존율이 감소합니다. 이러한 SEM 이미지는 특징적인 세로 융기와 같은 구조를 나타내며, 이는 모든 처리된 포자와 처리되지 않은 포자에서 지속적으로 볼 수 있습니다.최대 30초의 플라즈마 처리는 대조군에 비해 포자 표면 형태의 큰 변화를 유도하지 않습니다. 플라즈마 처리 기간이 길어지면 표면이 더 세분화되고 120초 또는 240초 동안 처리된 포자에서 작은 균열과 균열이 관찰될 수 있습니다. 이 시간이 해결된 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 실험에서 진공을 대조군으로 처리한 거의 모든 포자는 발아하여 개별 세포의 길이가 다소 균일한 막대 모양의 세포 형태를 발달시킵니다.대조적으로, 혈장으로 15초 동안 처리된 포자는 이미 75% 미만 미만으로 발아 능력이 감소한 것으로 나타났습니다. 또한 세포는 광범위하게 긴 막대로 성장하거나 작게 남아 포자 코트에 달라붙습니다. 30초의 플라스마 처리 후 포자의 25% 이상이나 마이너스 6%만이 발아하고 식물 세포는 성장이 현저히 지연되고 길이가 다양합니다.이 절차를 시도하는 동안 겹치거나 발아하는 포자가 없는지 확인하기 위해 위상차 현미경을 사용하여 포자 단층의 품질을 확인하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이미지 안정화를 위한 한천 패드 방법은 혈장 멸균 및 생체 세포 현미경 검사의 연구원들을 위한 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 유리 슬라이드에 포자 단층을 준비하는 방법, 포자 불활성화를 위한 플라즈마 처리를 사용한 사용 결정, 라이브 셀 및 주사 전자 현미경 수행 방법에 대해 더 잘 이해할 수 있을 것입니다.예를 들어 에틸렌 옥사이드 또는 감마선과 같은 다른 오염 제거 방법과 달리 플라즈마 멸균은 거의 모든 종류의 표면에서 원치 않는 미생물을 줄일 수 있는 효율적이고 안전한 접근 방식입니다.

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 자동 형광 시간 경과 현미경을 사용하여 시간에 다른 박테리아의 단일 세포의 행동을 모니터하기위한 단계별 절차를 제공합니다. 또한, 우리는 어떻게 현미경 이미지를 분석하는 지침을 제공합니다.

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

출처: Fuchs, FM, et al. 살아있는 세포 현미경을 사용하여 Bacillus subtilis 포자의 생존에 대한 저압 플라즈마 멸균의 해로운 영향을 조사합니다. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 Bacillus subtilis 포자의 생산, 정제 및 에어로졸 기반 증착을 통해 균일한 단층을 생성하여 포자 발아, 생존력 또는 스트레스 반응에 대한 현미경 기반 분석과 같은 다운스트림 응용 분야를 가능하게 합니다.

Bacillus subtilis 포자의 생산 및 에어로졸 기반 증착

우리는 유익한 박테리아로 경구 전처리를 통해 쥐의 열 스트레스 영향을 예방하기 위한 프로토콜을 설명했습니다. 이 프로토콜은 다양한 투여 경로 및 다양한 화합물의 분석에 수정 및 사용할 수 있습니다.

히트의 예방에 의한 흰쥐의 반작용을 스트레스<em&gt; 고초균</em&gt; 스트레인

본 연구는 생물막 억제제와 Bacillus subtilis 다세포성에 미치는 영향을 연구하기 위한 재현 가능한 방법론의 개발을 제시합니다.

유학을위한 방법론<em&gt; B. 서브 틸리</em작은 분자 바이오 필름 억제제를 특성화 모델로&gt; 바이오 필름

액체 및 셀의 높은 처리량 차가운 실제 플라즈마 치료 프로토콜 표시 됩니다. 플라즈마 처리 후 플라즈마의 방출 스펙트럼, 액체 및 세포 활동의 후속 분석 측정 다른 피드 가스 플라즈마 점화에 대 한 구성 설정 포함 됩니다.

플라즈마 의학-세포 액체에서 처리량 접근 기초 연구

우리는 예를 들어 새 균의 subtilis 를 사용 하 여 개별 세균성 세포 계보의 미세 분석 하는 방법을 제시. 메서드를 긴밀 하 게 제어 하 고 균일 한 성장 조건 셀 세대의 수백의 관찰 함으로써 미생물학에 전통적인 분석 방법의 단점을 극복 했다.

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

'Germinosomes' 새 균의 subtilis 포자의 내부 막에서에 germinant 수용 체 단백질 클러스터. 우리는 슈퍼 해상도 현미경 및 형광 기자 단백질 germinosomes 시각화를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 또한 우선적으로 막 염료 FM4-64와 스테인드 포자 내부 막 도메인을 식별 합니다.

Germinosomes과 새 균의 subtilis 포자에 내부 막의 시각화

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

이 프로토콜은 유세포 분석 및 카운팅 비드를 사용하여 에티듐 브로마이드로 표지된 박테리아 포자를 정량화하는 데 중점을 둡니다. 이 방법은 또한 온전한 포자의 표면에서 단백질의 공유 결합을 분석하는 데 효율적입니다.

Bacillus subtilis 포자 계수 및 유세포 분석의 표지 분석 개선

이 프로토콜은 클린룸 환경에서 미생물 바이오버든을 최소화하기 위한 모범 사례를 요약하고 환경 모니터링, 공정 모니터링 및 제품 멸균 테스트와 같은 전략을 포함합니다. 이는 현재 우수 조직 관행 표준 및 현재 우수 제조 관행 표준을 충족하는 데 필요한 제조 및 테스트 시설과 관련이 있습니다.

클린룸 환경 및 세포 치료를 위한 미생물 제어 및 모니터링 전략

접근 가능한 오픈 소스 미세유체(microfluidic) 워크플로우는 박테리아의 플라스미드 보유에 대한 병렬 분석을 위해 제공됩니다. 형광 현미경 검사를 사용하여 겔 미세방울 내 단일 세포 미세군체의 플라스미드 존재를 정량화함으로써 이 방법은 기존 플레이트 카운팅에 대한 정확하고 접근 가능하며 확장 가능한 대안을 제공합니다.

Open-Source Droplet Microfluidics를 이용한 플라스미드 안정성 분석

배우세요 저압 플라즈마 처리 후 Bacillus subtilis 포자의 생존성 및 DNA 복구 과정을 공초점 형광 현미경과 주사전자현미경으로 분석하는 방법을. 이 기술은 미생물 불활화 및 살균 연구에 활용됩니다.

해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사

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