해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사

이 일련의 연속 방법의 전반적인 목표는 시간 분해 컨포칼 형광 현미경 및 주사 전자 현미경을 사용하여 저압 플라즈마 처리 후 Bacillus subtilis 포자를 되살리는 DNA 복구의 활력 매개변수를 시각화하고 모니터링하는 것입니다. 당사의 방법은 미생물 불활성화 및 멸균 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. Bacillus subtilis 포자와 같은 생물학적 지표에 대한 저압 혈장 처리의 해로운 영향을 분석하는 데 도움이 됩니다.

우리 기술의 주요 장점은 저압 플라즈마 치료의 해로운 영향을 확인하기 위해 시간 결과 형광 현미경을 사용하여 DNA 복구를 관찰하고 측정, 주사 전자 현미경 및 모니터링과 같은 여러 방법을 결합한다는 것입니다. 포자 생산을 수행하기 위해서는 적절한 항생제가 보충된 각 B.subtilis 균주의 5ml 하룻밤 배양을 200ml의 이중 강도 액체 셰이퍼 포자 배지로 옮기고 배양액의 95% 이상이 포자화될 때까지 섭씨 37도에서 최소 72시간 이상 격렬한 폭기로 배양합니다. 3000G에서 15분 동안 원심분리하여 15ml 튜브의 포자를 채취하고 멸균 증류된 H2O를 사용하여 반복적인 세척 단계를 통해 샘플을 정제합니다.

얼굴 대비 오크로스코피를 통해 순도 및 발아 상태를 확인하고 포자 현탁액이 위상 밝은 포자의 99% 이상으로 구성되어 있고 식물 세포, 발아 포자 및 세포 파편이 없는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 추가 현미경 검사 실험이 방해받을 수 있습니다. LB 한천에 50마이크로리터의 10배 연속 희석액을 도금하여 포자 역가를 측정하여 CFU를 계산하고 밤새 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. CFU 측정 후 샘플을 농축하거나 멸균수를 사용하여 샘플을 희석하여 ml당 10에서 9번째 포자로 조정합니다.

노즐과 정렬하여 전기로 작동되는 에어로졸 스프레이 장치 내부에 멸균된 현미경 슬라이드 또는 둥근 25mm 커버 슬립 형태의 샘플 캐리어를 놓습니다. 포자 배양물을 노즐 유체 주입구로 옮기고 1.3bar의 압력으로 0.15초 후에 분무를 시작합니다. 분무된 포자 현탁액은 미세한 슬라이드에 박막을 형성하고 몇 초 내에 빠르게 건조되어 균일하게 분포된 포자 단층을 형성합니다.

처리된 시료 캐리어를 실온의 멸균 용기에 보관하십시오. 플라즈마 시스템의 모든 표면을 청소하고 예열하려면 500와트의 아르곤 플라즈마를 사용하여 5파스칼로 5분 동안 시스템을 시작합니다. 전처리는 챔버를 환기하는 동안 질소, 산소 및 물과 같은 주변 공기로부터 분자가 달라붙는 것을 줄입니다.

챔버를 환기시킨 후 샘플을 반응기 용기 중앙의 유리 선반에 조심스럽게 놓습니다. 챔버를 닫고 대피하십시오. 그런 다음 원하는 공정 가스를 사용하여 챔버를 채우고 시스템의 압력을 5파스칼로 조절합니다.

그런 다음 플라즈마 프로세스를 시작합니다. 정의된 공정 시간이 지나면 전원 및 가스 공급을 끄고 시스템을 조심스럽게 환기시켜 샘플 홀더에서 샘플이 끊어지지 않도록 합니다. 환기 후 샘플을 제거하고 멸균 용기에 보관하십시오.

플라즈마를 처리하지 않은 대조군의 경우, 가장 긴 플라즈마 적용 시간에 해당하는 공정 가스가 있는 곳에서만 샘플을 진공 상태에 노출시킵니다. 오토클레이브 10% 폴리비닐 아세테이트 또는 PVA 용액을 준비하고 500마이크로리터를 사용하여 샘플 캐리어를 조심스럽게 덮습니다. 4시간 동안 자연 건조시킨 후 멸균 집게를 사용하여 포자 샘플이 들어 있는 건조된 PVA 층을 벗겨내고 2ml 반응 튜브로 옮깁니다.

튜브에 1ml의 멸균수를 넣고 PVA 층을 용해시켜 발아할 수 있는 포자의 95% 이상을 회수하도록 와류를 일으킵니다. 멸균수를 사용하여 96웰 플레이트에서 샘플을 1에서 10까지 연속으로 희석합니다. LB 한천에 각 희석액을 50마이크로리터씩 도금하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한 후 콜로니 수를 세고 밀리리터당 CFU를 결정합니다.

발아 실험의 경우, 700 마이크로 리터의 배지를 끓여서 1mm 두께의 1.5 LB 한천 패드를 준비하고 멸균 현미경 석화에 피펫으로 넣습니다. 10분 후 멸균 메스를 사용하여 8mm x 8mm x 1mm LB 한천 패드를 잘라내고 이미징 챔버에 이미 장착된 25mm 유리 커버 슬립 위에 놓인 포자 단층 위에 한천을 조심스럽게 옮깁니다. 한천 put 방법은 두 가지 특정 기능을 결합합니다.

레이저 현미경 검사 중에 광학 평면의 샘플을 안정화하고 측면 세포 이동을 제한합니다. 발아 에세이에 사용하는 것 외에도 이 방법은 진핵 세포뿐만 아니라 다른 미생물에도 적용할 수 있습니다. 샘플을 한천으로 덮은 후 유리 커버 슬립을 이미징 챔버로 빠르게 옮깁니다.

전체 이미징 프로세스 동안 가열된 스테이지에서 샘플을 섭씨 37도로 유지하십시오. 각 질환에 대해 최소 3개의 생물학적 복제물을 사용합니다. 자동화된 컨포칼 레이저 스캐닝 및 명시야 현미경으로 샘플을 이미징한 후 2.6%의 레이저 출력으로 타임랩스 시리즈를 기록하고 컨포칼 조리개를 5개의 에어로 설정하고 실험에 따라 0시간에서 5시간까지 30초에 1프레임의 샘플 주파수를 설정합니다.

고량의 단색광을 적용하면 레이저 현미경 검사 중 포자 발아를 완전히 억제할 수 있습니다. 따라서 레이저 강도를 사용하고 단일 프레임을 얻는 더 긴 간격만 사용하십시오. 포자 응집, 다층 포자 분포 또는 먼지 입자에 의한 오염의 경우 플라즈마 처리 또는 그림자 현상이 발생하여 음영 포자의 발아가 가능할 수 있습니다.

주사 전자 현미경을 수행하기 위해 포자 단층이 금 팔라듐으로 스퍼터링된 후 인라인 2차 전자 검출기를 포함하여 5킬로볼트 가속 전압에서 작동하는 전계 방출 SEM으로 샘플을 이미지화하여 지형 대비를 나타냅니다. 이 그래프에서 볼 수 있듯이 B.subtilis 포자의 혈장 처리는 혈장 처리 기간이 증가함에 따라 생존율이 감소합니다. 이러한 SEM 이미지는 특징적인 세로 융기와 같은 구조를 나타내며, 이는 모든 처리된 포자와 처리되지 않은 포자에서 지속적으로 볼 수 있습니다.

최대 30초의 플라즈마 처리는 대조군에 비해 포자 표면 형태의 큰 변화를 유도하지 않습니다. 플라즈마 처리 기간이 길어지면 표면이 더 세분화되고 120초 또는 240초 동안 처리된 포자에서 작은 균열과 균열이 관찰될 수 있습니다. 이 시간이 해결된 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 실험에서 진공을 대조군으로 처리한 거의 모든 포자는 발아하여 개별 세포의 길이가 다소 균일한 막대 모양의 세포 형태를 발달시킵니다.

대조적으로, 혈장으로 15초 동안 처리된 포자는 이미 75% 미만 미만으로 발아 능력이 감소한 것으로 나타났습니다. 또한 세포는 광범위하게 긴 막대로 성장하거나 작게 남아 포자 코트에 달라붙습니다. 30초의 플라스마 처리 후 포자의 25% 이상이나 마이너스 6%만이 발아하고 식물 세포는 성장이 현저히 지연되고 길이가 다양합니다.

이 절차를 시도하는 동안 겹치거나 발아하는 포자가 없는지 확인하기 위해 위상차 현미경을 사용하여 포자 단층의 품질을 확인하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이미지 안정화를 위한 한천 패드 방법은 혈장 멸균 및 생체 세포 현미경 검사의 연구원들을 위한 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 유리 슬라이드에 포자 단층을 준비하는 방법, 포자 불활성화를 위한 플라즈마 처리를 사용한 사용 결정, 라이브 셀 및 주사 전자 현미경 수행 방법에 대해 더 잘 이해할 수 있을 것입니다.

예를 들어 에틸렌 옥사이드 또는 감마선과 같은 다른 오염 제거 방법과 달리 플라즈마 멸균은 거의 모든 종류의 표면에서 원치 않는 미생물을 줄일 수 있는 효율적이고 안전한 접근 방식입니다.