Name: 후에 쥐에 있는 정액 액의 측정 및 여성 재생산 지역에서 정액 짝짓기의 컬렉션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 배우세요 쥐의 교배 후 정액을 여성 생식기에서 채취하고 액화 시간을 측정하는 방법을. 이 기술은 정자 해방 메커니즘 연구와 생식 생물학 이해에 필수적입니다.

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이 작품은 ww 수의학 대학 (WSU) 시작 기금에 의해 지원 됩니다. 저자는이 논문의 중요 한 독서에 대 한 시에라 올 슨 (WSU) 감사합니다.

모든 동물 및 절차가이 연구에 사용 된은 WSU 승인 동물 프로토콜 #4702 # 4735과 워싱턴 주립 대학 (WSU) 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 처리 합니다.
1입니다. 마우스
<ol><li>
사용 하 여 표준 C57BL/6J 성인 남성 쥐 또는 관심의 다른 긴장. 물과 음식 광고 libitum 액세스와 온도 및 습도 제어 환경에서 동물을 유지 한다.
	<ol>
<li>8 주 정도에서 10 개월에 이르기까지 남성 브리 더를 사용 합니다. 실험에서 입증 된 종만을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
재생산 지역 스 트로 겐 수용 체 α ( Esr1 유전자 인코딩)의 조직 선택적 삭제와 성인 여성 쥐를 사용 하 여 상피 세포10 (Wnt7aCre / +; Esr1f/f, 녹아웃 또는 "코" 라고)이이 연구에서 littermates (Esr1f/f, "CTRL" 라는) 제어.
	<ol>
<li>8 주 된 여성을 사용 합니다. 여성의 연령대의 실험에 따라 다양합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아침 08시 h에 estrous 사이클의 단계를 결정 합니다. 주기의 발 정기 단계에서 여성만을 사용 합니다. 질 번짐 및 cytological 분석의 자세한 방법에 대 한 이전 게시 절차11를 참조 하십시오.</li>
</ol>2. 짝짓기와 Copulatory 플러그를 평가
<ol><li>발 정기 (16시 h) 일에서 남자의 감 금 소에 여성을 집.</li>
	<li>다음날 아침 (08시 h), 남성 마우스에서 여성을 구분 합니다.</li>
	<li>짝짓기의 표시로 질 또는 copulatory 플러그의 유무를 이전에 게시 방법12 의 적응을 사용 합니다.</li>
	<li>짧게 뒷 다리 사지를 들어 꼬리의 기지에서 여성 마우스를 잡아.</li>
	<li>이쑤시개를 사용 하 여 질 오프닝에서 하얀 정액 coagulum의 존재에 의해 copulatory 플러그를 찾아. 있으면 copulatory 플러그, 이쑤시개 질 운하에 삽입할 수 없습니다.</li>
</ol>3입니다. 조직 컬렉션 전에 준비
<ol><li>10 mL Leibovitz의 L-15 미디어, 보충 1% 태아 둔감 한 혈 청의 준비 (라고 L15 미디어 + 1 %FBS) 15 mL 튜브에. waterbath에 15 분 동안 37 ° C에서 미디어를 품 어.</li>
	<li>조직 및 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 정자의 생존을 위해, 미리 데워 진 L15 미디어 + 1%의 aliquot 2 mL 2 mL microcentrifuge에서 FBS 조직 컬렉션에 대 한 관.</li>
	<li>37 ° c.에 stereomicroscope의 단계를 따뜻한 37 ° C로 열 블록을 설정 하 고 블록에는 빈 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 배치.</li>
	<li>다운스트림 응용 프로그램에서는 정자의 운동 성, 따뜻한의 37 ° c 유리 슬라이드 이미징 하는 경우</li>
</ol>4. 조직 컬렉션
<ol><li>조직 컬렉션 영역에 미리 따뜻하게 L15 미디어 + 1 %FBS 약 수를가지고.</li>
	<li>여성 안락사 (~ 08:30 h) 자 궁 경관 탈 구 다음 이산화탄소 질 식을 사용 하 여. 참고: 이것은 대략 8 h 짝짓기 후 가정 자정에 일어난 짝짓기입니다.</li>
	<li>복 부 영역을 노출 하는 부정사 위치에 동물을 놓습니다.</li>
	<li>복 부 뒷 다리 사지 근처에 70% 알코올을 스프레이.</li>
	<li>낮은 복 부의 피부에 작은 상처 (~ 1 cm)을 해가 위를 사용 합니다.</li>
	<li>지배적인 손을 꼬리 (및 필요한 경우 뒷 다리 사지)를 사용 하 여 비 지배적인 손을 당긴 다 피부 (머리)를 향해 반대 방향으로 복 부 근육을 노출 하는 동안. 이 메서드는 내장 장기에 머리 오염의 최소화 하는 데 사용 됩니다.</li>
	<li>V-모양에 인접 한 질, 복 부의 기지에서 내장 장기를 노출 하는 복 부 근육을 잘라.</li>
	<li>내장 및 복 부 지방 노출 재생산 지역 쪽으로 이동 합니다.</li>
	<li>방광과 질 영역 위에 다른 조직에서 트림.</li>
	<li>음모 관절 질 조직에 대 한 액세스를 얻기 위해 떨어져 잘라.</li>
	<li>질에 질 직물 들어올린 직장 조직에서 질 운하를 분리 하는 위를 사용 하 여.</li>
	<li>신중 하 게 봄이 위를 사용 하 여 자 궁의 양쪽에서 mesenteric 지방에서 트림. 주의: 자 궁 안에 정액 매우 깨지기 쉬운입니다. 자 궁을 찔린 하지 않도록 주의 하십시오 또는 다른 정액 손실 됩니다.</li>
	<li>더 낮은 재생산 지역 들어올리고 양쪽의 난소 지방 패드를 잘라 합니다.</li>
	<li>미리 따뜻하게 Leibovitz L-15 미디어 + 1%의 관에는 전체 생식 기관 전송 FBS.</li>
</ol>5. 자 궁 콘텐츠 컬렉션에서 정액 액 화 (점도)의 측정
<ol><li>stereomicroscope의 열띤된 무대에서 35mm 무 균 조직 문화 접시에 조직 3.5 mL 가득 전송 사전 예 열 L-15 미디어 + 1 %FBS 혈액과 다른 오염 물질의 조직 청소. 주의: 세척, 동안 지방, 아니라 자 궁 조직을 잡아. 정액이 시점에서 예상 되는 자 궁 안에 그대로 수.</li>
	<li>실험실 물티슈를 사용 하 여 초과 미디어의 조직 오 점.</li>
	<li>미리가 열된 microcentrifuge 관에서 난소 끝을 배치 하면서 조직 질 끝에 잡으십시오. 질 끝을 잡고, 자 궁, 자 궁 뿔 microcentrifuge 튜브에 빠지게 할 수 있도록의 기지에서 자 궁 뿔을 잘라.</li>
	<li>정액 하 게 튜브에 자 궁 뿔에서 흐름. 한적한 포 셉을 사용 하 여 부드럽게 질 끝, 남은 정액 밖으로 추방 하는 난소에서 자 궁 뿔을 짠 다.</li>
	<li>생물 학적 가방에서 티슈를 삭제 하 고 소 각.</li>
	<li>짧게는 minicentrifuge에 정액 아래로 회전 (1 ~ 2 s).</li>
	<li>튜브, 열띤된 무대에 평행 하다-정액 밖으로 유출 하지 않습니다.</li>
	<li>타이머를 준비 하 고 '을 계산 하 는'로 설정.</li>
	<li>(튜브 벽에 평행) 180 ° 각도로 정액 샘플으로 25 µ L 모 세관 튜브를 삽입 합니다. 이것은 다른 각도에서 모 세관 튜브를 잡고 각 조사 사이 가변성을 최소화 하는 것입니다.</li>
	<li>모 세관 튜브 게 타이머를 누르면 정액과 접촉.</li>
	<li>정액 25 µ L 라인에 도달 하는 데 걸리는 시간 (s)를 기록 합니다.</li>
	<li>측정 완료 되 면 바로 추가 기능 분석, 정자 운동 성의 비디오 영상 등을 위해 건조 열 블록에 다시 정액을 포함 하는 튜브를 넣어.</li>
	<li>20 분 동안 10% 표 백제 솔루션에서 튜브를 immersing 하 여 정액을 포함 하는 모 세관 튜브를 소독 하 고 세관 sharps 컨테이너에서 삭제.</li>
</ol>6. 비디오 이미징 정자 운동 성의
<ol><li>현미경 및 비디오 이미징 소프트웨어 설정.</li>
	<li>유리 슬라이드 온수 스테이지에 배치 하는 동안 미리 데워 진된 유리 슬라이드에 남은 정액의 20 µ L를 플라스틱.</li>
	<li>유리 coverslip 커버.</li>
	<li>현미경 슬라이드 coverslip 측면을 내려 놓습니다.</li>
	<li>20 X 렌즈를 사용 하 여 관심 영역을 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>100 X 객관적 렌즈 비디오 영상에 대 한 변경 합니다.</li>
	<li>30 12 프레임/s (fps)에서 비디오 s.</li>
	<li>임의로 동물 당 적어도 3 개의 다른 영역에 동영상을 기록 합니다.</li>
	<li>이미징 수행 신속 하 고 정자의 운동 성 및 생존 능력을 유지 하기 위해 슬라이드에 빛 노출을 최소화. 참고:이 이미징 절차는 2-3 분 내에서 행해져야 한다.</li>
	<li>앞에서 설명한8ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 데이터 분석을 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Suarez, S. S., Pacey, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+transport+in+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod+Update%22%5BJournal%5D)">Sperm transport in the female reproductive tract.</a> Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).</li>
<li>Bedford, J. M., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+sperm+motility+after+mating+in+the+rat+and+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Androl%22%5BJournal%5D)">Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster.</a> J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).</li>
<li>Lilja, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+semenogelin%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Cell biology of semenogelin.</a> Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).</li>
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<li>Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seminal+fluid+characterization+for+male+fertility+and+prostate+cancer%3A+kallikrein-related+serine+proteases+and+whole+proteome+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches.</a> Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).</li>
<li>Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+role+of+human+KLK14+in+seminal+clot+liquefaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction.</a> J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).</li>
<li>Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+kallikrein+on+sperm+motility%2C+capillary+tube+test%2C+and+pregnancy+rate+in+an+AIH+program%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Androl%22%5BJournal%5D)">Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program.</a> Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).</li>
<li>Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+estrogen+for+the+mammalian+female+in+regulating+semen+coagulation+and+liquefaction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (4), e1006743(2017).</li>
<li>Elia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+semen+hyperviscosity%3A+prevalence%2C+pathogenesis+and+therapeutic+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects.</a> Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).</li>
<li>Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uterine+epithelial+estrogen+receptor+alpha+is+dispensable+for+proliferation+but+essential+for+complete+biological+and+biochemical+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).</li>
<li>McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+vaginal+lavage%2C+crystal+violet+staining%2C+and+vaginal+cytological+evaluation+for+mouse+estrous+cycle+staging+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification.</a> J Vis Exp. (67), e4389(2012).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/10293">Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning.</a> JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+therapeutic+potential+of+human+kallikrein-related+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).</li>
<li>Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+functions+of+tissue+kallikrein-related+peptidases+in+vaginal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid.</a> Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

같이 전 수 정액 및 여성 재생산 지역. 에서 분 비 물 간의 생리 적인 상호 작용 정액 분석에서 생체 외에서 이점을 제공할 수 있습니다 마우스 uteri에서 정액을 수집 이 연구에서 제시 하는 기술 연구원 정액 품질과 정자 생존으로 이상적인 생리 조건에서 운동 성을 확인 하 수 있습니다. 또한, 정액은 uteri에서 수집 된를 사용 하 여 수행할 수 있는 다양 한 다운스트림 분석, 예를 들어 정자 자 궁 및 정자 입력 실제 정자 수는 또한 운동 성 분석에 대 한 몇 군데 수 결정 계산 하실 수 있습니다. 수정 기능에 대 한 정액을 수집 하도록 이상적인 시간 포인트1짝짓기 후 1 ~ 2 h 이내 이어야 한다.
이전에 언급 한 다운스트림 응용 프로그램 뿐만 아니라 조사 또한 정자 수송에 억제제/화합물 관심의 효과 평가 수 처리, 정액 액 화 (또는 정액 점도), 정자 수, 정자에 운동 성, 또는 다른 지역 ...

여성 재생산 지역 상위 및 하위 책자의 구성 됩니다. 위 재생산 지역에는 나 팔 관, 자 궁 그리고 endocervix는 포함 되어 있습니다. 낮은 재생산 지역에는 ectocervix 및 질 포함 됩니다. 인간에서는, ejaculated 정액 ectocervix1에 인접 한 질 앞쪽 벽에 입금 됩니다. 그러나 쥐,, 정액은 휩 쓸 자 궁으로2짝짓기 후 분 이내.
정액 침투 수를 정자를 일으키는 루의 초 이내에 경화 되 고3움직일 정액 젤을 포함 합니다. 액 화 물 일관성에 젤 같은에서 정액을 변경 하 여 고정된 정자를 해제 합니다. 이 과정은 정자의 운동 성 및 포유류 복제에 대 한 필수적입니다. 정액 액 화의 지식은 주로 어디 정액 문화 접시에 액 화 된다 생체 외에서 연구 기반으로 합니다. 인간에서는, 전립선 특정 항 원 또는 PSA (일컬어 kallikrein 관련 peptidase 3 또는 KLK3)의 효소 활동은 semenogelins (젤 형성 단백질 정액에 존재)4 의 가수분해를 통해 액 화에 대 한 주요 기여자 ,56. Semenogelins의 정자 이동성 증가 정액 coagulum에서 정자를 줘 라. 계란을 기름 지 게 나 팔 관으로 정자 수영을 해제. 액 화 (또는 정액 점도) 테스트는 불 임 클리닉 남성 불 임7평가에서 정액 분석을 위한 표준 초기 검 진 중 하나.
최근에 출판 된 기사를 정액 액체 여성 마우스 생식 관 후 짝짓기에서 수집 된의 분석 이후에 다 산 결함8를 일으킬 수 있는 액 화 결핍을 설명 하기 위해 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 결함이 액 정액 hyperviscosity 같은 남자9, 일반 액 화는 포유류 복제를 위한 불가결 제안에 불 임 사례의 11.8 32.3%에 기여 한다. 그러나, 연구 및 치료 액 결함의 남성7에 독점적으로 집중 했다. 여성 재생산 지역 정액 액 화에서 역할을 담당 하는 가능성은 탐구 하지. 따라서, 정액 수집 및 액 화 시간 측정 방법 연구 액 관심의 모델 생물에서 불 임의 원인 중 하나 될 수 있는지 여부를 결정 하는 새로운 진단 도구를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>이쑤시개</td><td>Diamond</td><td>750-Flat</td><td>오토클레이브 멸균, 무딘 이쑤시개 사용. 뾰족한</td></tr><tr><td>해부 가위를</td> 사용하지 마십시오 <td>Fisher</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위</td><td>Roboz</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>25-&mu; L 유리 모세관</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 media</td><td>Life Technologies</td><td>11415064</td><td>1% FBS</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td> 보충제<td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>2mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-A</td><td></td></tr><tr><td>디지털 드라이 블록 히터</td><td>VWR</td><td>13259-052</td><td>마이크로 원심분리기 튜브 가난용 정액 채취 전</td></tr><tr><td>미니 원심분리기</td><td>Corning</td><td>LSE 6765</td><td></td></tr><tr><td>35mm 배양 접시</td><td>VWR</td><td>10861-656</td><td></td></tr><tr><td>15mL 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>10025-686</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>정밀</td><td>TSGP05</td><td></td></tr><tr><td>가열 스테이지 실체 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ10F</td><td>조직을 따뜻하게 유지하기 전에 조직을 따뜻하게 유지하기 위해 정액 채취</td></tr><tr><td>명시야 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td>옵션. 정자 운동성의 비디오 이미징을 위해</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMC2900</td><td>옵션입니다. 정자 운동성의 비디오 이미징용</td></tr>: <tr><td>유리 슬라이드</td>, <td>Fisher</td><td>12-552-3</td>, <td>옵션. 정자 운동성의 비디오 이미징용</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>VWR</td><td>48393-059</td><td>옵션. 정자 운동성의 비디오 이미징을 위해</td></tr><tr><td>표백제를</td><td></td><td></td><td>dH2O에서 10% 농도로 희석</td></tr></tbody></table>

후에 쥐에 있는 정액 액의 측정 및 여성 재생산 지역에서 정액 짝짓기의 컬렉션

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

마우스에 ejaculated 정액은 자 궁에 입금 됩니다. 사정 후 정액에서 젤 같은 일관성을 변경 물, 프로세스 라는 액 화. 이 연구에서 우리는 마우스 모델에서 여성 재생산 지역에서 후 ejaculated 정액을 수집 하는 방법을 보여줍니다. 첫째, 성인 여성 쥐 발 정기 단계에서 남자의 감 금 소에 하룻밤 보관 되어 있었다. 다음날 아침, 결합 질에 copulatory 플러그의 존재에 의해 확인 됐다. 여성 쥐 copulatory 플러그와 안락사 했다 고 각 생식 관 (질, 자 궁, oviducts, 난소), 전체적으로 수집 된 정액을 포함 하는 닫힌된 시스템을 보장. 튜브에 정액을 풀어 질 렸와 생식로 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 배치 되었다. 분석에 대 한 최대 정액 볼륨을 보장 하기 위해, 한적한 집게는 나머지 정액을 추방 하는 질 끝에 난소에서 자 궁 뿔을 집어넣은 사용 되었다. 전체 생식 관은 다음 삭제 됩니다. 정액에 포함 된 튜브는 잠시 내려 냈 지. 25 μ 모 세관 피 펫 (튜브 벽에 평행) 180 ° 각도로 튜브에 배치 했다. 25 μ 라인에 모 세관 튜브를 작성 하는 데 사용 하는 시간을 기록 했다. 검증 된 남성 종 축에서 정액은 일반적으로 25 μ 모 세관 튜브를 채우기 위해 약 60-180 s를 걸립니다. 이 정액 컬렉션 기술은 또한 정자 이미징 및 운동 성 분석 등 다른 다운스트림 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.

정액은 비옥한 CTRL 남성과 짝짓기 후 ctrl 키와 코 여성 약 8 h에서 수집 되었다. 액 화 (또는 정액 점도) 정액 25 μ 모 세관 튜브를 작성 하는 데 걸린 시간에 의해 정량 이다. 정액에서 CTRL uteri 수집 했다 2.06 ±0.12 분 (mean±S.E.M, n = 5) 모 세관 튜브 (그림 1)을 채우기 위해. 그러나, 정액 코 uteri에서 수집 했다 60 분 이상 (60.0 ±0.0, mean±S.E.M, n = 5) 실험 시간. 이러한 데이터 정액은 크게 더 액 화 또는 CTRL에 보다 적게 점성 코 uteri에 비해 좋습니다.
여성 재생산 지역에서 정액을 모으기의 다운스트림 응용 프로그램 중 하나를 설명 하기 위해 정자 운동 성 비디오 이미지를 사용 하 여 평가 했다. 정액 그림 2A에서 스냅숏에서 미세한 필드 ...

정액 액 화는 정액 젤에서 해방 될 정자에 대 한 필요 합니다. 이 연구는 여성 재생산 지역 포스트 성교에서 정액을 수집 하 고 정액 액 화 시간을 측정 하기 위한 절차를 제공 합니다.

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

이 연구의 목표는 암컷의 생식관에서 짝짓기 후 정액을 수집하는 방법과 생쥐의 정액 액화를 측정하는 방법을 결정하는 것입니다. 이 연구에 사용된 동물은 워싱턴 주립 대학 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 WSU가 승인한 동물 프로토콜 4702 및 4735에 따라 처리되었습니다. 인간에서 사정된 정액은 자궁경부외(ectocervix)에 인접한 질의 전벽에 축적됩니다.그러나 생쥐의 경우 짝짓기 후 몇 분 이내에 정액이 자궁으로 쓸려 들어갑니다. 정액에는 사정 후 몇 초 이내에 굳어지는 정액이 포함되어 있어 정자를 고정할 수 없습니다. 액화 과정은 정액을 젤 같은 농도에서 묽은 농도로 변화시킵니다.이 과정은 정자 운동성과 포유류 생식에 필수적입니다. 전립선 특이 항원(Prostate Specific Antigen, PSA)의 효소 활성은 정액에 존재하는 정액 겔 또는 겔 형성 단백질의 가수분해를 통한 액화의 주요 원인입니다. 겔 형성 단백질의 분해는 정자를 정액 응고로부터 해방시켜 정자의 이동성을 증가시켜 정자가 상부 여성 생식관을 향해 헤엄쳐 나팔관에서 난자를 수정하도록 합니다.여성 생식관에서 정액을 채취하는 방법과 이 연구에서 제시된 액화 시간 측정은 연구자들에게 액상화가 관심 모델 유기체의 불임 원인 중 하나가 될 수 있는지 여부를 결정하기 위한 새로운 진단 도구를 제공할 것입니다. 다음은 생쥐가 짝짓기를 하고 질 마개를 결정하는 절차입니다. 표준 C57BL/6 성체 수컷 마우스 또는 기타 관심 균주를 사용할 수 있습니다.주기의 발정 단계에 있는 암컷만 사용되었습니다. 질 도말 및 세포학적 분석에 대한 자세한 방법은 이전에 발표된 절차를 참조하십시오. 오후 4시.발정한 날, 암컷은 수컷의 우리에 갇혔다. 다음날 아침 여덟 시가 되면, 암컷은 수컷의 우리에서 분리된다. 멸균된 편평한 이쑤시개를 사용하여 질 또는 교미 플러그의 침착 유무를 이전에 발표된 방법에서 채택된 절차를 사용하여 짝짓기의 표시로 평가했습니다.다음은 조직 채취 전 준비 절차입니다. 15ml 튜브에 1%의 소 태아 혈청 또는 L-15 배지와 1%FBS가 보충된 Leibovitz의 L-15 배지 10ml를 준비합니다. 미디어를 섭씨 37도에서 15분 동안 데웁니다.다운스트림 응용 분야에서 조직과 정자의 생존력을 보존하려면 조직 채취를 위해 2ml 튜브에 2ml의 배지를 분취합니다. 실체 현미경의 스테이지를 섭씨 37도로 따뜻하게하십시오. 가열 블록을 섭씨 37도로 설정합니다.열 블록에 빈 튜브를 놓습니다. 또한 다운스트림 응용 분야에서 정자 운동성 이미징이 필요한 경우 유리 슬라이드를 섭씨 37도까지 가열합니다. 다음은 조직 채취 절차입니다.조직 수집에 사용되는 도구는 다음과 같습니다. 암컷은 플러그를 확인한 직후 이산화탄소 질식과 자궁경부 탈구를 사용하여 안락사시킵니다. 동물을 누운 자세로 눕혀 복부 부위를 노출시킵니다.복부에 70% 에탄올을 분사합니다. 하복부 피부에 약 1cm를 작게 자릅니다. 꼬리와 피부를 반대 방향으로 당겨 복부 근육을 노출시킵니다.복부 기저부에서 복부 근육을 V자 모양으로 자릅니다. 장과 복부 지방을 옆으로 움직여 생식관을 노출시킵니다. 방광과 질 부위 위의 다른 조직을 잘라냅니다.질 조직에 접근하기 위해 치골 교감대를 잘라냅니다. 튜브 집게를 사용하여 치골 교감이 결합된 부분을 당겨 질관을 노출시킵니다. 질 입구에서 질 조직을 들어 올리고 가위를 사용하여 질관과 아래의 직장 조직을 분리합니다.용수철 가위를 사용하여 자궁 양쪽의 장간막 지방을 조심스럽게 잘라냅니다. 자궁은 내부에 정액이 있어 매우 연약합니다. 따라서 조사자는 자궁에 구멍을 뚫지 않도록 주의해야 하며 그렇지 않으면 정액을 잃게 됩니다.난소 양쪽에서 난소 지방 패드를 잘라냅니다. 전체 생식관을 예열된 매체의 튜브로 옮깁니다. 다음은 정액 액화의 측정 방법입니다.다음은 정액 채취를 위한 도구입니다. 따뜻한 매체 3ml를 3.5cm 접시에 옮깁니다. 티슈를 접시에 옮깁니다.뚱뚱한 패드를 잡고 티슈를 여러 번 씻으십시오. 이 시점에서 정액은 여전히 자궁 내부에 손상되지 않아야 합니다. Kimwipes의 조직을 닦아내어 과도한 매체를 제거합니다.질 말단의 조직을 잡고 빈 튜브 내부의 난소 끝을 들어 올려 예열된 튜브에 조직을 넣습니다. 질과 자궁 사이의 양쪽 자궁 뿔을 자릅니다. 정액이 자궁 뿔에서 튜브로 흘러 들어가도록 합니다.이가 없는 집게를 사용하여 자궁 뿔에 남은 정액을 부드럽게 짜서 배출합니다. 1-2초 동안 정액을 짧게 회전시킵니다. 튜브를 가열된 stage와 평행하게 놓습니다.25마이크로리터의 모세관 튜브를 180도 각도로 정액 샘플에 삽입합니다. 이는 각 조사자가 모세관 튜브를 다른 각도로 유지하는 것으로부터 차이를 최소화하기 위한 것입니다. 정액이 25마이크로리터 라인에 도달하는 데 걸리는 시간을 기록하십시오.액화 시간은 25마이크로리터 모세관 튜브를 정액으로 채우는 데 걸린 시간으로 정량화됩니다. 대조 자궁에서 채취한 정액이 모세혈관을 채우는 데 약 2분이 걸렸습니다. 그러나 녹아웃 자궁에서 채취한 정액은 60분 이상의 실험 시간이 걸렸습니다.이러한 데이터는 정액이 녹아웃 자궁에 비해 대조군에서 훨씬 더 많이 액화되어 있음을 시사합니다. 다음은 정자 운동성의 비디오 이미징을 사용한 다운스트림 애플리케이션의 예 중 하나입니다. 유리 슬라이드를 히터 스테이지에 놓고 피펫 팁을 사용하여 남은 정액 25마이크로리터를 예열된 유리 슬라이드에 피펫으로 주입합니다.유리 커버슬립으로 슬라이드를 커버슬립합니다. 슬라이드 커버슬립을 아래로 내려 놓아 슬라이드를 현미경으로 옮깁니다. 20X 대물 렌즈를 사용하여 정자를 찾으십시오.그런 다음 비디오 이미징을 위해 100X 대물 렌즈로 변경합니다. 30초 동안 초당 12프레임으로 비디오를 녹화합니다. 대조 자궁에서 채취한 정액은 미시적 영역 내에서 정자가 자유롭게 헤엄치는 것을 보여줍니다.그러나 녹아웃 자궁에서 채취한 정액은 대부분의 정자가 최소한의 이동성으로 함께 모여 있음을 보여주었습니다. 이러한 발견은 짝짓기 후 8시간 후에 암컷의 생식관에서 채취한 정액이 추가 분석에 사용될 수 있음을 시사한다. 이러한 다운스트림 응용 프로그램 외에도 연구자는 정자 수송의 다양한 과정, 정자 액화, 관내 정자 수, 정자 운동성 또는 여성 생식관의 다른 영역에서의 정자 이동과 같은 과정을 방해하는 억제제 또는 관심 화합물의 효과를 평가할 수도 있습니다.이 화합물은 짝짓기 전에 암컷 생식관에 적용할 수 있습니다. 그런 다음, 이러한 억제제 또는 화합물의 영향은 짝짓기 후 정액 샘플에서 평가할 수 있습니다. 이 방법은 정자 수송을 억제하는 피임약의 실용성을 테스트하는 데 유용할 수 있습니다.

collection-post-mating-semen-from-female-reproductive-tract

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 프로토콜은 남성의 testes에서 정자를 추출 후 여성 쥐를 inseminating하는 방법을 보여줍니다. 정확한 시간 발달 연구에서뿐만 아니라 유전자 변형 작업 필요한 경우이 절차는 유용합니다.

수확 정자와 마우스의 인공 수정

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

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여기에서는 마우스에서 ROSI(round spermatid injection)를 수행하는 방법, 유망한 임상 응용 기술을 가진 기술이며 배아 발달의 기전을 조사하기 위한 유용성을 소개합니다.

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Stable Isotope In-Vivo Labeling for Mass-Spectrometry Identification of Paternal Metabol Ites Transport to Spermation During fertilization (수정 중 정자에서 난모세포로 전달된 부계 대사산물의 질량 분광법 식별을 위한 안정 동위원소 생체 내 라벨링)

조직을 생성 하는 매우 유망한 기술 없이 문화 셀 시뮬레이션된 microgravity 조건에는 매트릭스를 사용 하 여 구성 합니다. 로타리 문화 시스템을 사용 하 여, 우리 난소 여 포 성장과 oocyte 성숙 여 포 생존, 형태학, 성장, 및 시뮬레이션된 microgravity 조건 oocyte 기능을 검사 합니다.

생체 외에서 마우스 시뮬레이션된 Microgravity에서 Preantral 모 낭의 성장

배우세요 쥐의 교배 후 정액을 여성 생식기에서 채취하고 액화 시간을 측정하는 방법을. 이 기술은 정자 해방 메커니즘 연구와 생식 생물학 이해에 필수적입니다.

후에 쥐에 있는 정액 액의 측정 및 여성 재생산 지역에서 정액 짝짓기의 컬렉션

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