Name: 전송 전자 현미경 검사 법 단층 필터링 에너지에 의해 3D 화학 지도 얻기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 배우세요 에너지 필터링 전자 단층촬영법을 이용하여 나노미터 규모에서 재료의 3D 화학 분포를 시각화하고 정량화하는 방법을. 이 기술은 재료과학, 화학 및 촉매 연구에서 화학적 성분 분석에 활용됩니다.

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우리는 연구, 고 등 교육의 프랑스 내각에 감사 규칙 산업 드 형성 파 라 검색 (CIFRE)와 그들의 재정 지원을 위해 IFP 에너지 새로운.

1. 샘플 준비
<ol><li>박격포에 샘플을 분쇄 하 고 알코올에 분산 또는 증류수; 현미경 검사 법 격자에는 샘플의 작은 물방울을 놓고 말리. 참고: titania 알 루미나 실리 카 알 루미나 등 샘플 수는 분말 또는 압출된 소재, 그리고 짓 눌린 고 초음파를 사용 하 여 솔루션에 분산. 일반적으로, 외 분석에 대 한 그리드 샘플 농도 낮은 샘플 중첩 및 숨김 기울이기 큰 각도에서 그리드 때를 피하기 위해 중요 하다. 200 메쉬 현미경 격자 홀리 탄소 또는 탄소 레이의 영화를 지 원하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>피 펫을 사용 하 여 샘플을 통해 표준 마커를 포함 하는 콜 로이드 해결책의 한 방울 넣어. 초과 하는 모든 솔루션을 흡수 하 고 건조 하 게. 참고: 표준 마커 잘 보정 Au 나노 입자 솔루션에 있습니다. 표준 마커 샘플을 추가 하기 전에 그리드를 통해 또한 분산 수 있습니다. 예를 들어 샘플은 표준 표식으로 비슷한 크기를 가진 나노 입자에서 경우, 입금 표준 마커 그리드를 통해 데이터 세분화 및 정량화 동안 잘 그들을 분리 하기 위하여. 표준 마커는 기울어진된 이미지를 정렬 하는 경우에 사용 하는 위치 참조입니다.</li>
</ol>2. 필터링 된 기울기 시리즈 이미지의 기록
<ol><li>전자 현미경으로 현미경 눈금의 중앙에 고립 된 샘플을 찾아. 참고: 전자 현미경, X 축은 샘플 홀더 따라, Y 축 샘플 홀더에 수직 이며 전자 빔 따라 Z 축이. 최대 기울기 각도에서 샘플을 기울일 수 있을, X 축에 최대한 가까이 위치 하는 샘플을 분석.</li>
	<li>일단 샘플 위치, 검사 샘플의 화학 성분. 에너지 흩어진 엑스레이 분 광 분석 (EDS), 또는 전자 에너지 손실 분 광 분석 (뱀장어)를 사용 하 여 선택한 샘플에는 광속을 집중 하 여 화학 분석을 수행 하 고 스펙트럼을 기록 합니다. 샘플의 화학 요소를 포함, 멀리 이동 하 고 인근 대표 하는 샘플에는 다음 테스트를 실행 합니다.</li>
	<li>전자 빔 강도 샘플, 필터링 된 이미지의 에너지 윈도우의 너비를 통해 각 박람회 시간 필터링 된 이미지 확인 합니다. 빔 손상 사이의 화학 신호 화학 예측12,,1317에 기록 된 샘플에 대 한 좋은 타협을 찾아. 참고: 필터링 된 이미지에 최대 화학 신호를 기록 하기 위해 사용 하 여 최대 빔 강도. 그러나, 방사선 테스트 전자 빔 효과에서 샘플을 모든 변경 내용을 확인을 분석 하기 전에 수행 되어야 합니다. 이 작업을 수행 하려면 기울기 시리즈의 녹음 하는 동안 전자 복용량을 계산 합니다. 또한, 실험 후 전에 이미지와 이미지를 비교 하 여 쉽게 테스트를 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>레코딩 소프트웨어의 EFTEM 모드를 사용 하 여 2D 화학 지도 3-windows 메서드를 사용 하 여 계산 하 고 충분 한 화학 신호 기록 됩니다 확인 합니다. 참고: 소프트웨어 기록 3 필터링 된 이미지; 처음 두 세 번째 이미지에서 배경을 추정 하는 데 사용 됩니다.<ol>
<li>소프트웨어에서 조사 및 그것의 이온화 가장자리에서 화학 요소를 선택 합니다. 노출 시간과 에너지 창의 너비를 설정 합니다. 이미지를 기록 하 고 화학 지도 배경 추출 전원 법을 사용 하 여 계산. 512 x 512 픽셀 32 비트 환경에서 최소 신호 화학 이미지에 기록 하는 픽셀 당 약 300-400 건의입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eucentric 높이와 확인 최소 기울기 각도, 즉,-70 ° 이하의 샘플 및 최대 기울기 각도, 즉, + 70 ° 이상 설정 합니다.</li>
	<li>다시 보기로 분석 (이 인수 하기 전에 이미지를 있을 것입니다) 이미지를 기록 하는 샘플을가지고. 그런 다음 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 필터링 된 이미지의 기울어진된 시리즈 기록. 참고: 전용된 EFTEM tomography 플러그인 동시에 여러 기울기 시리즈를 기록할 수 있습니다. 즉, 각 기울기 각도에서 여러 개의 연속 이미지 기록 될 수 있습니다. 첫 번째 이미지 0 손실에 중심으로 필터링 된 이미지를 수 있으며이 이미지는 전형적인 밝은 필드 이미지입니다. 사전 가장자리 이미지와 다음의 첫 번째 화학 원소 사후 가장자리 이미지는 선행 사전 가장자리 이미지와 두 번째 화학 요소의 후 지 이미지. 화학 성분의 승계는 그들의 선택한 이온화 가장자리에 의해 주어진 다.<ol>
<li>녹음 EFTEM 시리즈 소프트웨어 기울기 각 에너지 창 및 노출 시간, 너비를 선택한 다음 최대 및 최소 기울기 각도 기울기의 각도 단계. 기울기 시리즈에는 이미지의 수와 전자 빔에 샘플의 총 노출 시간 사이 타협 하려면 4 °, 즉, ± 사이 기울기 시리즈 당 51 이미지의 기울기 단계 71 °; 그러나, 작은 기울기 단계 샘플 광선 아래 저하 되지 않습니다 경우 선택할 수 있습니다.</li>
		<li>각 화학 원소에 대 한 기록 3 시리즈 3 windows 메서드를 사용 하 여 화학 프로젝션 계산에 필터링 된 이미지의 기울기. (샘플은 1 분 이상에 대 한 특정 기울기 각도에 남아 수)는 필터링 된 이미지를 기록 하는 동안 각 기울기 각도에서 샘플의 자연 드리프트를 계량, 첫 번째 이미지 수 신호 0 손실에 필터링 된 이미지를 마지막으로 기록 된 이미지는 unfil 수 있도록 입력 이미지에서 모든 에너지 모든 전자에 의해 형성. 그 두 이미지는 샘플의 두께 지도 계산에 사용할 수 있습니다. 따라서, 각 기울기 각도에서 두 성분의 화학 분포를 관찰, 기록 7 필터링 된 이미지 (1 감소, 3 두 번째 화학 요소에 대 한 첫 번째 화학 요소에 대 한 3 0) 그리고 1 필터링 되지 않은 이미지 (총, 8 틸트 시리즈 기록).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 맞춤 및 기울기 시리즈의 재건
<ol><li>3 필터링 된 이미지 각 기울기 각도 대 한 각 화학 요소에 해당 하며 화학 지도 ImageJ의 전문된 EFTEMTJ15,18 플러그인을 사용 하 여 계산 됩니다. ImageJ 소프트웨어에서 파일의 경로 사용 하 여 | 오픈 기울기 시리즈 필터 이미지에 해당 하는 파일을 선택 하 고. 모든 3 개의 필터링 된 기울기 시리즈 열: 두 사전 가장자리와 한 후 가장자리.<ol>
<li>전용된 EFTEMTJ 플러그인을 엽니다. 클릭 + | 이미지 또는 스택 기울기 시리즈는 이미 열려 있는 선택.</li>
		<li>표시 되는 테이블에서 채우기 시리즈에 대 한 각 기울기, 즉, 에너지는 각 에너지 변화 기울기 시리즈 기록 되었다. 또한, 슬릿 폭, 즉, 에너지 창 기입. 각 필터링 된 이미지의 "노출 시간"을 입력 합니다. 모든 3 개의 기울기 시리즈 매핑을확인 합니다. 다음을 클릭 합니다.</li>
		<li>참조 이미지 및 다음 적용을 클릭 합니다 첫 번째 이미지를 선택 했습니다. 다음클릭: 제안 된 정렬의 미리 보기 이미지가 나타납니다. 시각적으로 확인 같은 기울기 각도에서 기록 된 3 이미지 잘 개 (이미지 사이 아무 변화 관찰 해야) 합니다. 참고:이 프로토콜은 EFTEMTJ 플러그인의 버전 0.9에서 수행 되었다. 이 순간, 필터링 된 이미지 기록에서 동일한 기울기 각도 정렬 됩니다.</li>
		<li>EFTEMTJ 창에서 배경 하 고 화학 가장자리에 해당 하는 이미지를 선택 합니다. 전원, 신호 추출의 모델을 선택 하 고 만들기에클릭. ImageJ, 파일 선택 | 저장 이 마지막 파일을 저장할 경로 찾을. 참고: 화학 지도의 기울기 시리즈는 얻어진 다. 플러그인을 사용 하는 방법에 더 많은 정보는 온라인.</li>
		<li>모든 화학 기울기 시리즈 3.1 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>기울기 시리즈에 맞게 아이 모드 소프트웨어19 2009 년에서 발표의 버전을 사용 하 여 0 손실 기울기 시리즈를 맞춥니다. 소프트웨어는 다른 기울기 시리즈 기울기 시리즈에 계산 된 정렬의 응용 프로그램을 있습니다. 참고: 맞춤 소프트웨어는 각 이미지에 적용 된 모든 치환을 포함 하는 디스크 파일에 씁니다. 아이 모드20 를 사용 하 여 정렬 프로시저 다른 검토는 그리고이 문서의 범위 내에서 아니에요.</li>
	<li>정렬 0 손실 기울기 시리즈에 대 한 계산 사용 하 고 이전 계산된 화학 기울기 시리즈에 적용. 참고:이 소프트웨어 버전에서는 파일의 이름을 보존 이전 계산된 변위를 적용 하 여 화학 기울기 시리즈 파일 0 손실 기울기 시리즈 파일을 변경할 수입니다. 그렇지 않으면, 소프트웨어, 파일 같은 이름, 같은 크기의 이미지의 동일한 수를 있을 것 이다 하지만 제로 손실 이미지 하지만 화학 이미지 포함 되지 않습니다.</li>
	<li>첫 번째 기록 된 이미지, 즉, 손실, 그리고 마지막에 센터를 상호 교차 하 여 드리프트를 계량 (필터링 되지 않은 이미지). 샘플 모든 필터링 된 이미지를 기록 하는 동안 모든 기울기 각도에서 몇 초를 보낼 수 있습니다. 이 시간 동안 샘플 자연스럽 게 작은 금액을 나타난다.<ol>
<li>ImageJ 소프트웨어에서 파일에 클릭 | 오픈 손실 없이 정렬 선택 기울기 시리즈, 그리고 화학 지도 오픈 정렬 기울기 시리즈.</li>
		<li>편집 클릭 | 컬러 | 병합 채널. 붉은 색, 녹색에 대 한 첫 번째 화학 요소 그리고 파랑, 그 순서 대로 두 번째 화학 요소에 대 한 손실에 해당 하는 파일을 선택 합니다. 복합 만들기 의 선택을 취소 하 고 유지 소스 이미지를 확인 합니다. 스택 모든 기록 된 이미지에 대 한 각 기울기 각도에서 만들어집니다.</li>
		<li>플러그인을 클릭 | 정렬 RGB 계획21. 레드는 참고 이미지입니다. 그린을 선택 하 고 빨간색 하나 이상의 중복 화살표를 사용 하 여. 다음에 클릭 하 고 모든 각도 대 한 반복.</li>
		<li>편집 클릭 | 컬러 | 분할 채널 와 RGB 스택 3 스택에 분할 됩니다: 빨간색에 해당 하는 손실, 및 녹색 및 파랑에 해당 하는 화학 지도 수정 드리프트로. 파일을 클릭 | 저장 기울기 시리즈를 하기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플러그인을 클릭 | Tomoj,2223 부하 각도 양식 파일을 선택. 모든 틸트 시리즈는 이미 정렬 때문에 재건에 직접 이동 합니다. 예술, SIRT, 처럼 재구성 알고리즘을 사용 하 여 화학 볼륨으로 볼륨 0 손실의 계산 OS-예술, 등. 참고: 그것은 화학 볼륨의 재건에 대 한 반복 알고리즘을 사용 하 여 권장. 이 소프트웨어를 사용 하 여 GPU를 사용 하 여 볼륨을 재구성 가능 하다.</li>
	<li>모든 볼륨은 계산 병합 채널 옵션 사용 하 여 얻은 볼륨에 서로 다른 색상을 적용 하 여 3D 화학 지도를 단일 볼륨에 중복.</li>
</ol>4. 3D 모델링 및 정량화
<ol><li>볼륨 화이트에 있을 것입니다 해당 회색 레벨을 선택 하 여 복원된 ZL 볼륨을 binarize (8 비트에 강렬은 255)과 검은색 (8 비트, 강도 0 이다). ImageJ에서 "선택 임계값" 옵션을 사용 합니다. 샘플에 해당 하는 모든 픽셀을 선택 (어두운 픽셀 샘플에 해당 하는 BF 이미지에 질량) 샘플은 흰색 고 진공 블랙 볼륨 하 고. 참고: 0 손실 볼륨 분석된 샘플, 즉, 모양 및 샘플의 크기의 형태학 정보를 제공합니다.</li>
	<li>255, 0 손실의 이진 볼륨을 나누어 하 고 시료 내 농도 1 하 고 다른 곳은 0 볼륨. 이것은 정규화 된 볼륨입니다.</li>
	<li>화학 정보에 해당 하는 시료 내 농도 이러한 농도 0 다른 곳에서 볼륨을 얻기 위해 계산된 화학 볼륨 (4.1 단계)의 각각에 의해 정규화 된 볼륨을 곱하면 됩니다. 참고: 화학 정보 샘플에서 파생 되 고 따라서 모든 아티팩트는 제외.</li>
	<li>ImageJ, 화학 볼륨의 히스토그램을 계산 하 고 tabulate 소프트웨어에서 히스토그램의 값을 가져옵니다.<ol>
<li>Tabulate 소프트웨어에서 강도 강도 수 0 (이 라인 진공에 해당)의 줄을 삭제 합니다.</li>
		<li>새 열에서 각 강도 볼륨에서의 비율을 계산 합니다. 모든 수의 합으로 각 강도의 수를 분할 하 고 100을 곱하십시오.</li>
		<li>새 열에서 증분 수, 이전 이전 비율 계산의 현재 비율을 추가 하 여 총 볼륨의 강도에 해당 하는 비율을 계산 합니다. 참고: 화학 볼륨에서 높은 농도 화학 정보에 해당합니다. 그러나, 고 농도 낮 및 높은 볼륨에서 잡음. 임계값은 높은 농도 선택 하 여 생성 됩니다.</li>
		<li>뱀장어 스펙트럼에서 계산 하는 샘플에서 화학 원소의 상대 농도 알면, 강도 강도 선택 합니다. (기존) 경우 255에서 시작 하 고 화학 원소 농도에 해당 하는 강도 감소.</li>
		<li>화학 농도에 해당 하는 최저 강도 찾으려면, 255의 강도에 일반적으로 해당 하는 100% 하 전체 볼륨에서 해당 강도의 비율은 계산 하는 열으로 이동 합니다. 100%에서 추출 (뱀장어 스펙트럼)에서 화학 요소의 계산 된 상대적 비율: 결과 임계값의 최소 강도에 해당 합니다. 이 방법에서는, 화학 binarized 볼륨 얻을 수 있습니다, 255의 강도와 화학 원소에 해당 하는 복 및 모든 나머지는 0. 두 번째 요소에 대해 절차를 반복 하 고 두 개의 화학 binarized 볼륨.</li>
	</ol>
</li>
	<li>겹치는 병합 채널 옵션을 사용 하 여 binarized 화학 볼륨 고 RGB 볼륨을 각 요소 볼륨에 다른 색을 할당 합니다. 참고: 두 개의 binarized 화학 볼륨, 겹쳐 있다 복 중복 하 여 두 화학 요소 (코뮌 복)에 속하는 하 고 화학 요소 (무료 복) 중 하나에 속하지 않는 복 강조 표시 됩니다. 예를 들어, 빨간색과 녹색의 binarized 화학 볼륨 노란색 코뮌 복을 만듭니다.</li>
	<li>8 비트 볼륨; RGB 볼륨 변환 색상이 서로 다른 회색 농도가 있을 것 이다. 임계값 옵션을 사용 하 여 두 화학 종 (RGB 볼륨에서 노란색)에 속하는 복을 선택 합니다. 그런 다음 동일한 임계값 옵션을 사용 하 여 (그들은 복 선정 되어 이전 보다 더 낮은 농도) 화학 요소에 속하지 않는 복을 선택 합니다. 강도 0 진공을 선택 하지 마십시오.</li>
	<li>무료 복의 볼륨과 코뮌 복의 볼륨을 정상화. 화학 볼륨에 의해 무료 복의 볼륨을 곱하면 다음 다른 화학 볼륨을 뺍니다. 참고:이 높은 강도 가진 각 복에 화학 원소를 계산 합니다.</li>
	<li>속하는 복과 그 복에 높은 강도 가진 화학 원소의 볼륨에 속하지 않는 복의 볼륨을 추가 합니다. 참고:이 방법에서는, 각 코뮌 복 또는 무료 복 분화 이며 그 복에 높은 강도 가진 화학 원소의 볼륨에 할당 된. 이 "이미지 계산기" 옵션에 의해 수행할 수 있습니다.</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56671/56671eq1v3.jpg">
<ol start="9"><li>샘플을 구성 하는 복의 수 정량, 3 차원 슬라이서 등 표면 렌더링 소프트웨어에 세그먼트 볼륨을 가져옵니다. 그런 다음 nm3 차원에서 샘플의 볼륨을 얻을에 복의 볼륨을 곱하면 됩니다.</li>
	<li>가장자리 찾기 옵션을 사용 하는 샘플의 표면을 형성 하는 복을 계량 고 nm2 샘플의 표면을 얻기 위해 복 지역으로 증식.</li>
	<li>샘플의 질량에 의해 샘플의 표면을 분할 하 여 특정 표면 영역을 계산 합니다. 참고: 샘플의 대량 샘플의 이론적 밀도 사용 하 여 추정 될 수 있습니다. 일반적으로, 동부 표준시 계산 특정 표면적은 10 N2 흡착 탈 착 등 전용된 방법으로 계산 하는 특정 표면 있습니다.</li>
	<li>기 공 크기 분포를 계산 하려면 binarized 양의 손실 (BF 볼륨)를 사용 합니다. BF 재건의 이진 볼륨은 3D를 사용 하 여 열려진 모든 모 공 커버 될 때까지 다음 크기 만큼 3D를 침식 3D 툴킷/Morphological를 사용 하 여 침식 툴킷/Morphological 3D 플러그인 같은데요. 그런 다음 얻은 볼륨 전용된 표면 렌더링 소프트웨어를 사용 하 여 구상 될 수 있다 숨 구멍 유통 볼륨을 binarized BF 볼륨의 거꾸로 볼륨 곱합니다.</li>
</ol>

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<li>MessaoudiI, C., Boudier, T., Sorzano, C., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TomoJ%3A+tomography+software+for+three-dimensional+reconstruction+in+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy.</a> BMC Bioinf. 8 (1), 288(2007).</li>
<li>Saxton, W. O., Baumeister, W., Hahn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+imperfect+two-dimensional+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of imperfect two-dimensional crystals.</a> Ultramicroscopy. 13 (1-2), 57-70 (1984).</li>
<li>Gatan, Inc. Quantum Energy Filters High Throughput Spectrometers. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.gatan.com/products/tem-imaging-spectroscopy/gif-quantum-energy-filters">http://www.gatan.com/products/tem-imaging-spectroscopy/gif-quantum-energy-filters</a> (2018).</li>
<li>Gatan, Inc. Direct Detection 16-Megapixel Camera. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.gatan.com/products/tem-imaging-spectroscopy/k2-direct-detection-cameras">http://www.gatan.com/products/tem-imaging-spectroscopy/k2-direct-detection-cameras</a> (2018).</li>
<li>Direct Electron, LP. DE-Series Cameras. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.directelectron.com/products/de-series">http://www.directelectron.com/products/de-series</a> (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 종이의 목표 EFTEM 단층 촬영을 사용 하 여 3D 화학 지도 얻을 하는 방법을 설명 하는 것입니다. 이 프로토콜은 완전히 원래 고 저자에 의해 개발 되었다.
여기에 설명 된 대로 EFTEM 단층 촬영 몇 가지 단점이 있다: (i)만 샘플을 전자 빔 내성, 필터링 된 이미지를 얻기 위해 필요한 긴 노출 시간이 분석 수 있습니다. (ii) EFTEM tomography는 회절 대조에 민감합니다. (iii)는 정렬의 많은 수동으로 수행 했다. 3D 화학 지도를, 0 손실 볼륨 및 화학 볼륨 좌표의 단일 시스템에 있이 필요 합니다. 이 그 모든 틸트 시리즈 같은 좌표 시스템에 완벽 하 게 정렬 필요로 합니다. 이 샘플 당 적어도 2 주간의 긴 작업 기간을 나타냅니다. 시간이 소요 되 고에 불구 하 고이 프로토콜 nanometric 해상도에 3D 화학 지도의 계산을 허용 한다. 또한, 다른 같은 분 광 분석 기술, x-선 형광, 엑스레이 광전자 분광학과 결합, FTIR 분광학, 또...

기능성 물질의 속성 그들의 3D 매개 변수에 따라 달라 집니다. 완전히 그들의 속성을 이해 하 고 그들의 기능을 향상, 그것은 그들의 형태학과 화학 분배 차원에서 분석 하는 것이 중요입니다. 전자 단층 촬영1 (동부)는 나노미터 스케일2,3에이 정보를 제공 하는 최고의 기술 중 하나입니다. 큰 각도 범위 샘플을 회전 하 고 각 각 단계에서 하나의 이미지를 기록 그것에 의하여 이루어져 있다. 얻은 기울기 시리즈는 라 돈 변환을4,5에 따라 수학적 알고리즘을 사용 하 여 샘플의 볼륨을 재구성 하는 데 사용 됩니다. 3d에서 샘플 모델링 및 계량 입자 지역화6 및 크기 분포7같은 3D 매개 변수, 위치 및 크기 분포8, 등 기 공 수 있습니다 볼륨에서 회색을 선택
일반적으로, 외 최대 각도를 샘플이 선호 어느 방향으로 70 ° 이상 기울 어 서 전자 현미경으로 수행 됩니다. 각 기울기 각도에서 샘플의 투영 한 이미지 기울기 시리즈를 형성 기록 됩니다. 그 기울기 시리즈는 정렬 하 고 있는 세그먼트 되며, 정량 샘플의 볼륨을 재구성 하는 데 사용. 샘플 + 90 °-90 °에서 회전할 수 없습니다, 때문에 복원 된 볼륨은 직교 축9 따라 이방성 해상도 맹인 기록 각도 때문.
외 다른 이미징 모드에서 수행할 수 있습니다. 밝은 분야 가장 모드 (BF 편) 비정 질 재료, 생물 학적 샘플, 폴리머, 공부 하는 데 사용 됩니다 또는 촉매 지원 복잡 한 모양. 이미지 분석 구성 요소10 (조밀한 구성 됩니다 더 라이터 보다 어둠, 즉, 보다 적게 조밀한 구성 요소)의 밀도 특성화 하는 회색 레벨의 차별화를 기반으로 합니다. 스캐닝 가장 모드 (HAADF-줄기)에 높은 각도 환상 어두운 필드 결정 샘플을 분석 하는 데 사용 됩니다. 신호는 원자 번호;의 기능으로 화학 정보를 제공합니다. 샘플의 무거운 구성 요소 밝게 나타납니다 그 라이터 19. 수집 소재11및 에너지에 의해 방출 되는 x 선 에너지 흩어진 엑스레이 분광학 (EDX) 같은 다른 모드 필터링 이미징 모드 (EFTEM)12,13, 3D 화학 분포를 평가 할 수 있습니다. 내 샘플.
EFTEM 영상, 2D 화학 지도 전자 에너지 분석기와는 가장을 사용 하 여 기록 수 있습니다. 마그네틱 프리즘으로 그들의 에너지의 기능으로 전자를 분산 하 여는 분석기 역할을 합니다. 이미지에 따라 특정 원자와 상호 작용에서 손실 에너지 전자에 의해 만들어집니다. 같은 2D 화학 지도 다른 기울기 각도, 화학 예측의 시리즈를 얻은 기울기에서 계산 하는 경우는 3 차원 화학 볼륨 재구성 하 사용할 수 있습니다.
모든 자료는 EFTEM 단층 촬영 하 여 분석할 수 있습니다. 기술은 약한 또는 무질서 재료 샘플에 대 한 예약 되어 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 매우 다른 이미징 기술을 사용 하 여 때를 구분 하기 어려운 빛 요소를 분석 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 신뢰할 수 있는 2D 화학 지도를, 재료의 두께 소재14를 통해 전자의 평균 자유 경로 보다 작은 필요 합니다. 이 조건 하에서 단일 원자와 상호 작용 하는 단일 전자의 확률은 가장 큰. 두 메서드는 2D 화학 지도 계산 하는 데 사용 됩니다. 첫 번째, 및 가장 많이 사용 되 어디 두 필터링 된 에너지 창을 기록 분석, 및 세 번째 요소에 대 한 이온화 가장자리 전에 이온화 가장자리13후 "3-윈도우 방법", 이다. 처음 두 이미지는 배경, 세 번째 창의 위치에 전원 법을 사용 하 고 그것에서 빼고 추정은 추정 하는 데 사용 됩니다. 얻은 이미지는 3D 샘플 볼륨에 분석된 화학 원소 분포의 투영 이다. 두 번째 메서드는 "점프-비율 이라고"; 그것은 두 에너지 필터링 이미지, 사용 전에 한 후 이온화 가장자리. 이 메서드는 질적, 최종 이미지만 그 두 이미지 사이의 비율을 수행 하 여 계산 하 고 배경 에너지 변화에 대 한 고려 하지 않습니다.
동부와 EFTEM을 결합 하 여 필터링 된 에너지의 분석 단층 촬영을 얻을 수 있습니다. EFTEM 단층 촬영 및 원자 조사 단층 촬영 (APT)는 상호 보완적인 기술. APT, 비교 EFTEM 단층 촬영은 복잡 한 샘플 준비를 필요로 하지 않는 비-파괴적인 특성 분석. 그것은 독특한 나노에 다양 한 characterizations을 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다. EFTEM tomography APT 그들을 측정 하는 것은 적어도 레이저 지원에 필요 하는 동안 보 온 재료를 분석할 수 있습니다. APT은 EFTEM tomography 낮은 해상도 함께 적절 하 게 수행 하는 동안 원자 규모에서 실행 됩니다. EFTEM 단층 촬영 샘플을 실험 기간 동안 광속 저하 저항에 대 한 관련입니다. 모든 기울어진된 각도에서 모든 필터링 된 이미지를 기록 하는 샘플 2 시간 만큼에 대 한 전자 빔에 노출 수 있습니다. 또한, 2D 지도에 최대 화학 신호를 기록, 하이 빔 강렬에 더 이상 박람회 기간 필요할 수 있습니다. 같은 조건에서 빔 민감한 샘플 형태학 적이 고 및 화학 변화를 겪고 있습니다. 따라서, 전자 빔에 샘플 감도의 정확한 측정 실험 하기 전에 설정 해야 합니다. 또한, EFTEM 단층 촬영은 많은 tomograms. 샘플에 존재 하는 화학 성분의 자연과 공간 위치를 결정 하는 필요에 따라 녹음의 결과 그럼에도 불구 하 고, EFTEM tomography 촉매 응용 프로그램 모델링에 대 한 새로운 통찰력을 제공 하기 위해 촉매 지원 같은 샘플에 대 한 3 차원 화학 유통에 관한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다.
오늘 그것은 에너지 간격을 선택할 수 있는 전용된 소프트웨어를 사용 하 여, 에너지 창 이미지 필터링 기록과 계산 화학 다른 기울기 각도에서 지도. 기울이기 샘플, 추적, 초점, 및 EFTEM 모드에서 필터링 된 이미지를 기록 수 있습니다. 2D 화학 지도 산출 될 수 있다, 그리고 기울기 시리즈를 정렬할 수 있습니다, 반복적인 알고리즘을 사용 하 여 계산 화학 볼륨 마지막 시리즈 세그먼트 및 정량15,16수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>JEOL 2100f</td><td>JEOL</td><td></td><td>전자 현미경</td></tr><tr><td>Tridiem Gatan 이미징 필터(GIF)</td><td>Gatan</td><td></td><td>포스트 컬럼 에너지 필터</td></tr><tr><td>디지털 현미경 사진</td><td>Gatan</td><td></td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>Gatan EFTEM 단층 촬영 플러그인</td><td>Gatan</td><td></td><td>EFTEM tomograohy Tomoj용 필터링된 틸트 시리즈를 기록하는 전용 소프트웨어</td></tr><tr><td></td><td>Imagej plugin http://www.cmib.fr/en/download/softwares/</td><td></td> <td>전자 단층 촬영</td></tr><tr><td>EFTEM-Tomoj</td><td>Imagej 플러그인 http://www.cmib.fr/en/download/softwares/</td><td></td> EFTEM 이미징 Imod http://bio3d.colorado.edu/imod/ <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>위해 프랑스 파리의 Currie Institute에서 개발 한 무료 소프트웨어전자 단층 촬영을 위해 미국 콜로라도 대학교에서 개발 한 무료 소프트웨어</td></tr><tr><td>Imagej</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td> <td>이미지 처리를 위해 미국 메릴랜드 주 베데스다에있는 국립 정신 건강 연구소에서 개발 한 무료 소프트웨어</td></tr><tr>Imagej의 Fonction <td>https://imagej.net/Color_Image_Processing</td><td></td><td>채널 병합</td>으로 <td>겹치는 동안 볼륨에 다른 색상을 제공 할 수 있습니다</td></tr><tr><td>3D 슬라이서</td><td>https://www.slicer.org/</td><td></td> <td>Ron Kikinis, Harvard Medical School, Boston, MA, SUA Chimera가 이끄는 대규모 컨소시엄에서 개발한 무료 소프트웨어</td></tr><tr><td></td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td><td></td> <td>샌프란시스코 캘리포니아 대학의 Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics에서 개발한 무료 소프트웨어, 3D 모델의 데이터 세분화, 융합 및 시각화를 위해</td></tr> 실<tr><td>리카 알루미나 촉매 지원</td><td></td><td>이 프로토콜의 eleboration을 위해 제조된</td>IFPEN <td></td> 샘플</tr>, <tr><td>티타니아 알루미나, 촉매의 지지</td>체, <td>이 프로토콜의 eleboration을 위해 제조된</td><td>IFPEN</td><td></td> 샘플</tr>, <tr><td>5nm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>BBI 솔루션의<td>Au 나노 입자</td>, <td>BBI 솔루션</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Holey carbn film, 200 mesh microscopy grid</td>, <td>Agar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDX sepctrometer</td><td>옥스포드 기기</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

전송 전자 현미경 검사 법 단층 필터링 에너지에 의해 3d 화학 지도 얻기

Obtaining 3D Chemical Maps by Energy Filtered Transmission Electron Microscopy Tomography

에너지 걸러진된 전송 전자 현미경 검사 법 단층 촬영 (EFTEM tomography) 3 차원 (3D) 화학 물질 nanometric 규모의 지도 제공할 수 있습니다. EFTEM tomography 다른 이미징 기술을 사용 하 여 구별 하기 매우 어려운 화학 요소를 분리할 수 있습니다. 여기에 설명 된 실험 프로토콜 화학 배급과 재료의 형태를 알아야 3 차원 화학 지도 만드는 방법을 보여 줍니다. 샘플 준비 단계 데이터 세분화 되 게 됩니다. 이 프로토콜 nanometric 샘플에서 화학 요소의 3 차원 분포 분석을 허용합니다. 그러나,는 현재, 3D 화학 지도 생성 될 수 있습니다 샘플 하지 않은 민감한, 빔 필터링 된 이미지의 녹화는 강렬한 전자 빔에 긴 노출 시간을 필요로 하기 때문에 주목 한다. 프로토콜은 두 개의 서로 다른 이질적인 촉매 지원의 구성 요소의 화학 유통 계량에 적용 되었습니다. 첫 번째 연구에서 알루미늄과 티타늄 티 타 니 아-알 루미나 지원에서의 화학 유통 분석 했다. 샘플 스윙 pH 메서드를 사용 하 여 준비 되었다. 두 번째, 알루미늄과 솔 분말 및 기계적 혼합 방법을 사용 하 여 준비 된 실리 카-알 루미나 지원에 실리콘의 화학 유통 시험 되었다.

이 프로토콜의 응용 프로그램의 예로 참조13에 표시 됩니다. EFTEM tomography titania 알 루미나 촉매 지원 분석을 위해 사용 되었다. MoS2 나노 hydrodesulfurization (HDS) 같은 응용 프로그램에서의 활성 단계의 촉매 활동을 향상 시키기 위해 titania 우세한 지원 표면에 그리고 접촉 활성화 단계는 중요 하다. Titania는 알 루미나 보다 작은 특정 표면 알려져 있다. 연구의 목표는 titania 알 루미나 지원 구성 (만들고 따라서, 향상 된 특정 표면), 그리고 촉매 지원으로 그것을 테스트. 여기, EFTEM 단층 촬영 titania-알 루미나 이질적인 촉매 지원 스윙 pH 방법에 의해 준비의 분석 하는 데 사용 됩니다. 이 연구에서는 다른 titania 농도의 3 개의 샘플 분석 된다. 샘플 1의 50%로 구성 되며 50 %titania, 샘플 2 구성 7...

이 종이 에너지 필터링 이미징 및 전자 단층 촬영을 결합 하는 3D 화학 지도 달성 하는 프로토콜을 설명 합니다. 다른 이미징 기법에 의해 구별 하기 어려운 요소에 의해 형성 된 2 개의 촉매 지원의 화학 유통 연구 했다. 각 응용 프로그램 매핑 겹친된 화학 요소-각각 간격 이온화 가장자리 이루어져 있다.

전송 전자 현미경 검사 법 단층 필터링 에너지에 의해 3D 화학 지도 얻기

Energy filtered transmission electron microscopy tomography (EFTEM tomography) can provide three-dimensional (3D) chemical maps of materials at a ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 에너지 여과 전자 단층 촬영으로 얻은 3D 화학 지도를 얻고, 시각화하고, 정량화하는 것입니다. 이 방법은 재료 과학, 화학 및 촉매 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다(예: 주어진 재료의 구성 요소가 나노미터 규모로 혼합되는 방법). 이 기술의 주요 장점은 벌크 및 샘플 표면의 화학 물질 분포에 관한 정보를 제공한다는 것입니다.에너지 필터링 이미징은 다른 이미징 기술을 사용하여 구별하기 매우 어려운 화학 원소를 분리할 수 있습니다. 여기에 설명된 실험 프로토콜은 3D 화학 지도를 얻는 방법을 보여주지만 일부 3D 화학 매개변수를 정량화하기 위한 아이디어를 제공하려고 합니다. 3D 화학 맵은 필터링된 이미지를 기록하려면 상대적으로 강렬한 전자빔에 대한 긴 노출 시간이 필요하기 때문에 빔에 민감하지 않은 샘플에 대해서만 생성할 수 있습니다.시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 실리카 알루미나 또는 티타니아 알루미나와 같은 샘플을 준비하십시오. 다음으로 전자 현미경을 사용하여 에너지 필터링 틸트 시리즈를 기록합니다. 이 이미지는 검색 화학 원소의 각 화학 지도를 계산하는 데 사용됩니다.분석을 위해 이미지 J에서 두 개의 pre-edge series와 하나의 post-edge series로 구성된 세 개의 filered tilt series를 엽니다. 이제 특수 EFTEMTomoJ 플러그인을 열고 를 클릭한 다음 이미지 또는 스택을 클릭하여 틸트 시리즈를 선택합니다. 나타나는 표에 틸트 시리즈가 에너지 이동으로 기록된 에너지를 입력합니다.또한 필터링된 각 이미지의 슬릿 너비와 노출 시간을 입력합니다. 매핑에서 세 가지 기울기 시리즈를 모두 확인하고 전력 법칙을 사용하여 화학 맵을 계산하는 데 사용되는지 확인합니다. 그런 다음 다음을 클릭합니다.첫 번째 이미지를 참조 이미지로 선택한 다음 Apply(적용)를 클릭하고 Next(다음)를 클릭합니다. 이 시점에서 제안된 선형의 미리보기 이미지가 나타납니다. 동일한 기울기 각도에서 기록된 3개의 영상이 잘 중첩되어 영상 간의 이동이 없는지 육안으로 확인합니다.이 프로토콜은 EFTEMTomoJ 플러그인 버전 0.9에서 수행되었습니다. 이 순간 동일한 틸트 각도에서 기록된 필터링된 이미지가 정렬됩니다. 다음으로 배경 및 화학적 가장자리에 해당하는 이미지인 EFTEMTomoJ 창을 선택합니다.그런 다음 신호 추출 모델을 전원으로 선택하고 Create Map을 클릭합니다. 화학 물질 맵의 틸트 시리즈를 저장한 다음 다른 모든 화학 틸트 시리즈에 대해 이 프로세스를 반복합니다. 이 드리프트를 정량화하려면 먼저 Zero Loss Aligned Tilt Series를 엽니다.그런 다음 정렬된 틸트 시리즈를 위한 화학 맵을 열고 이미지, 색상으로 이동한 다음 채널 병합을 선택합니다. 빨간색에 대한 제로 손실에 해당하는 파일, 녹색에 대한 첫 번째 화학 원소를 선택하십시오. Create Composite를 선택 취소하고 Keep Source Image를 선택합니다.이 시점에서 기록된 모든 이미지에 대해 각 틸트 각도에 스택이 생성됩니다. 그런 다음 플러그인으로 이동하여 RGB 계획 정렬을 선택합니다. 여기서 빨간색은 참조 이미지입니다.녹색을 선택하고 화살표를 사용하여 빨간색 항목과 겹칩니다. 위치에 있으면 다음을 클릭하고 다른 모든 각도에 대해 이 과정을 반복합니다. Image(이미지)로 이동하여 Color(색상)로 이동한 다음 Split Channels(채널 분할)를 선택하여 RGB 스택을 견인 스택으로 분할합니다.빨간색은 제로 손실에 해당하고 녹색은 드리프트가 수정된 화학 맵에 해당합니다. 마지막으로 틸트 시리즈를 저장한 다음 두 번째 화학 원소에 대한 작업을 반복하고 파일을 저장하는 것을 잊지 마십시오. 3D 화학 매핑을 위해 다시 컴퓨터 앞에 앉아서 이미지 J.Open을 엽니다.플러그인으로 이동하여 TomoJ를 선택하여 TomoJ 플러그인을 엽니다.그러면 하중 각도 양식 파일이 선택됩니다. 모든 틸트 시리즈가 이미 정렬되어 있기 때문에 재구성으로 직접 이동하여 재구성 알고리즘을 사용하여 제로 손실의 부피와 화학적 부피를 계산합니다. 대화식 알고리즘을 사용하여 화학 부피를 재구성하는 것이 좋습니다.또한 이 소프트웨어를 사용하면 컴퓨터의 GPU를 사용하여 볼륨을 재구성할 수 있습니다. 모든 볼륨이 계산되면 Merge Channels 옵션을 사용하여 얻은 볼륨에 다른 색상을 적용하고 단일 볼륨으로 겹쳐서 3D 화학 맵을 얻습니다. 마지막으로, 3D 모델링 및 화학 정보, 표면적 및 기공 크기 분포의 정량화에 대한 추가 세부 정보를 보려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따르십시오.여기에서 EFTEM 단층 촬영은 구성 비율이 다른 티타니아 알루미나 촉매 지지체의 세 가지 다른 샘플을 분석하는 데 사용되었습니다. 고농도의 티타니아는 알루미나에 내장된 클러스터를 형성하는 것으로 밝혀졌습니다. 이 모델은 샘플 표면의 티타니아와 알루미나의 화학적 분포를 보여줍니다.샘플에서 티타니아와 알루미나의 비율과 무관하게 샘플의 표면은 약 30%의 비율로 티타니아로 덮여 있으며, 알루미나는 표면에 대한 특이성이 높으며 목표는 알루미나에 의해 티타니아가 지지되는 것을 목표로 하는 것으로 나타났습니다. 모델링 후 10% 티타니아를 함유한 샘플의 표면 두께가 약 10나노미터에 불과한 층이 있는 것으로 나타났습니다. 이러한 분산은 샘플의 촉매 응용 분야에서 중요한 역할을 할 수 있습니다.에너지 여과 전자 단층 촬영은 시간이 많이 걸리는 기술이라는 점을 언급하는 것이 중요합니다. 이 절차를 시도하는 동안 에너지 필터링 이미징은 분획 대비에 민감하지만 샘플의 두께와 전자빔에 대한 저항도 확인해야 한다는 점을 기억하십시오. 개발 후 이 기술은 재료 과학 분야의 연구자들이 형태학적 및 화학적 매개변수를 연구된 재료의 특성과 더 잘 연관시킬 수 있는 길을 열었습니다.우리는 이 프로토콜을 따른 후 전자 단층 촬영의 새로운 사용자가 따라야 할 단계와 부피를 재구성하고 모델을 분할하고 매개변수를 정량화할 때 직면하는 어려움에 대해 더 잘 이해할 수 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

주사 투과 전자 현미경에서 에너지 분산 형 X 선 단층 촬영을 사용하여 단일 나노 입자 내의 원소 분포를 3 차원으로 특성화하는 방법에 대해 설명합니다.

개별 나노 입자의 3D 원소 매핑에 대한 에너지 분산 X 선 단층 촬영

우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

우리는 스캐닝 전자 현미경의 자동화 된 이미징 절차와 함께 배열 단층 촬영 샘플로 사용하기 위해 대형 전송 지원에 직렬 섹션의 리본과 컬렉션의 준비를 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 로컬, 희귀 한 이벤트의 스크리닝, 검색 및 표적 이미징및 대량 데이터 볼륨을 수집 할 수 있습니다.

스캐닝 전자 현미경 을 사용하여 대량 정보의 표적 수집을위한 배열 단층 학워크

여기서, 25 nm 하프 피치의 해상도로 전체 냉동 보존된 세포의 초구조를 이미지화하기 위해 냉동 소프트 X선 단층촬영(SXT)에 필요한 샘플 준비 및 데이터 수집 단계를 기술하는 프로토콜이 제시된다.

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

이 프로토콜은 구조적으로 보존된 크로마틴에서 복제 부위의 고해상도 매핑을 위한 기술을 제시하며 , 이 기술은 사전 임베딩 EdU-스트렙타비딘-나노골드 라벨링과 ChromEMT의 조합을 사용합니다.

전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징

본 프로토콜은 Tomo5를 사용한 고분해능 초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집과 emClarity를 사용한 후속 데이터 처리 및 서브 단층 촬영 평균화를 설명합니다. 아포페리틴은 2.86 Å 분해능에서 cryo-ET 구조를 달성하기 위한 자세한 단계별 프로세스를 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

이 비디오 프로토콜은 바이러스 표본의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여줍니다. 최적의 결과를 위해 샘플은 고압 냉동 및 후속 동결 대체를 통해 준비됩니다.

바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

흡착제 충진 열탈착 튜브에 수집 TNT 및 RDX의 폭발성 증기 트레이스 전자 포획 검출기 (GC)에 결합 된 온도 프로그래밍 탈착 시스템을 이용하여 분석 하였다. 기기 분석은 계측 드리프트 및 손실에 대한 샘플의 변화와 계정을 줄이기 위해 직접 액체 증착 방법과 결합됩니다.

프로그램 된 온도 탈착 가스 크로마토 그래피 - 전자 캡처 검출기에 의해 추적 폭발성 증기의 양이 감지

배우세요 에너지 필터링 전자 단층촬영법을 이용하여 나노미터 규모에서 재료의 3D 화학 분포를 시각화하고 정량화하는 방법을. 이 기술은 재료과학, 화학 및 촉매 연구에서 화학적 성분 분석에 활용됩니다.

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