Name: Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 학습하세요 마우스 대뇌 피질에서 Cre-Lox 재결합을 유도하는 자궁내 전기천공 기법을 통해 유전자 모자이크를 생성하는 방법을. 이 기술은 신경생물학 연구에서 세포 자율적 유전자 기능을 규명하는 데 필수적입니다.

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저자는 제임스 매디슨 대학 생물학 부와 제임스 매디슨 대학교 빛 현미경 이미징 시설의 관대 한 지원을 감사합니다. 닥터 마크 L. 가브리엘 젊은 출생 후 조직 준비, 에 관한 유용한 조언 및 박사 저스틴 W. 브라운 코리 L. Cleland 수술 재료와 공간의 관대 한 조정에 대 한. 이 연구 4-VA, 전진 하는 연방의 버지니아 (G.S.V.)에 대 한 공동 제휴 및에 의해 버지니아 아카데미의 과학 작은 프로젝트 연구 부여 (G.S.V.) 공동 연구 교부 금에 의해 부분적으로 투자 되었다. 지원이 아낌없이 제공 되었습니다 베티 조 사랑 버틀러 ' 58 기부금으로 학부 연구 장학금 (K.M.B.), 파렐 여름 연구 장학금 (K.M.B.)을, (에 K.M.B.), 제임스 매디슨 대학 두 번째 세기 장학금에 대 한 한 제임스 매디슨 대학 센테니얼 장학금 (C.J.H.), 제임스 매디슨 대학 루시 로빈슨 검색 ' 30 기념 장학금 (Z.L.H.)을 및 과학 및 수학 교수 지원 그랜트 (G.S.V.)에 제임스 매디슨 대학 대학.

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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

여기, electroporation utero에 모자이크 뇌 조직의 생성을 floxed 마우스에 Cre recombinase와의 조합을 소개 합니다. 이 방법의 장점은 새로운 마우스 선 다른 셀룰러 하위는 타겟이 될 때마다 생성 될 필요는 없습니다: electroporation utero에서 흥분 성의 뉴런, 신경 억제, 또는 시간에 따라 명과 대상으로 사용할 수 있습니다 그리고 electroporation15,,1617,18,19,20,21,<sup class="x...

유전 모자이크를 생성 하는 것은 관심사의 유전자의 기능을 이해 하기 위한 고전적인 실험 패러다임 이다. 프로그램 유전자 세포 표현 형에 필요한 지 확인 하려면 가장 간단한 방법은 유기 체 (예 마네)에 걸쳐 유전자의 기능의 손실을 일으키는 것입니다. 그러나, 확인 하려면 유전자 특정 셀 종류에 특히 필요한 경우, 유기 체 전체 유전자의 녹아웃이 아니다 유효한 접근. 대신, 메서드는 필요한 wildtype (즉 유전자 교란) 조직으로 둘러싸여 동안 주어진된 셀에 유전자의 기능의 손실을 발생 합니다는-즉, 모자이크 조직 만들기. 만약 돌연변이 세포 돌연변이 표현 형을 표시 하지만 주변 wildtype 세포 안, 세포 자치 방법으로 유전자 기능. 돌연변이 세포 wildtype 조직에 의해 포위 된다 모자이크 조직의 분석 유전자, 특히 신경 및 명과 조직의 광대 한 상호 네트워크를 형성 하는 뇌의 세포 자치 기능을 이해 하는 데 이상적입니다.
여러 형태의 모자이크 뇌 조직의 강력한 모델 조사 유전자의 세포 자치 기능을 제공 합니다. 연구 신경 이식1, 여성 X 연결 mosaicism2,3,4에 집중 하 고 내 생 신체적인 mosaicism5,6 그린 모자이크에 따라 그들의 결론 뇌 조직입니다. 조건부 삭제 Cre lox 재결합 시스템을 통해 유전자의 유전자 변형 마우스 라인의 좋은 가용성을 최대한 활용 하는 방법입니다. 이 방법에서는, 2 개의 loxP 사이트 loxP 사이트 같은 방향으로 ("floxed")에서 두 얼굴을 있는 그것을 떠나 (예:는 exon), 유전자의 필요한 시퀀스의 양쪽에 소개 된다. Cre recombinase loxP 사이트7사이 시퀀스 excises. Cre 중재 재결합 Cre recombinase 셀 ("Cre 기자 선")의 하위 집합에서 형광 표식 함께 표현 하는 또 다른 마우스 라인을 건너 floxed 마우스에 의해 얻을 수 있습니다. 이 다양 한 방법으로 흥분 성의 뉴런 등 이다8셀의 하위 집합에서 유전자의 기능을 밝히기 위해 입증 되었습니다. Cre 기자 라인 Cre 중재 재결합 마약을 유도할 수 있는 (단일 신경 라벨 유도할 수 있는 Cre 중재 녹아웃 또는 매끄러운) 될 수 있도록 있다T2 를 표현할 수 있습니다9. 다른 전략 이라는 이중 표식 (MADM)10,11모자이크 분석, Cre 중재 interchromosomal 재결합 homozygous 돌연변이 heterozygous 조직 함께 만들 수 있습니다. 이러한 방식에서 쥐의 새로운 라인 각 후보 유전자 또는 세포 하위 테스트에 대 한 각 시간 제작 될 필요가 있다. 또는, Cre recombinase 소개 될 수 있다 postnatally 또는 바이러스 성 벡터 (예를들면 adeno 관련 바이러스13 또는 lentiviruses14 셀룰러 하위 형식 관련 운반 iontophoresis12 통해 발기인)입니다. 이 전략 강력 하 고 산 후 라벨을 만듭니다. 대뇌 피 질 뉴런을 띄엄띄엄 prenatally 개발 대상으로 이상적인 전략의 형광 표시와 함께 Cre recombinase electroporation utero에 입니다.
Cre lox 재결합 electroporation utero에서 생성을 통해 결합 뿐만 아니라 vivo에서조직 모자이크, 다른 게시 프로토콜15,,16에서 프로시저에 여러 각 색 한 소개 17,,1819,,2021. 우리는 사육 타임-임신 여성에서 성공을 개선 하는 정보를 제공 합니다. 우리 또한 우리의 두 전략 스파스 하 고 밝은 대뇌 피 질의 조직에서 뉴런의 라벨을 소개 하는 개요: 하나의 전략 Cre recombinase 및 형광 마커22단일 구문을 코딩의 수준을 적정 하는 것입니다. 또 다른 전략 마음23,24에 이러한 매개 변수를 특별히 설계 된 "초신성" 시스템을 사용 하는 것입니다. 또한, 생산 하는 일관 된 microinjection 펫 및 단순화에 utero electroporation 수술에 개선을 제공 합니다. 마지막으로, 우리는 더 얼룩 또는 immunohistochemistry 없이 모 수석 등뼈와 수지상 및 axonal 아 버의 분석을 허용 하는 간단한 조직학 준비에서 중요 한 단계를 개요.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td>"1. 마우스 설정"(1.1단계, "야생형 마우스")GFP</td></tr><tr><td>. Cre empty vector</td><td>AddGene</td><td>#20781</td><td>"2. DNA 설정"(2.1단계 "Cre 재조합효소 및 형광 마커를 암호화하는 단일 DNA 구성물"). GFP입니다. Cre empty vector는 Tyler Jacks의 선물이었습니다.</td></tr><tr><td>pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69138</td><td>"2. DNA 설정"(2.1단계 "초신성" 시스템") 및 http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)는 이와사토 타쿠지의 선물입니다.</td></tr><tr><td>pK031.TRE-Cre (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#69136</td><td>"2. DNA 설정"(2.1단계 "초신성" 시스템") 및 http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova)는 이와사토 타쿠지의 선물입니다.</td></tr><tr><td>pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)</td><td>AddGene</td><td>#85006</td><td>"2. DNA 설정"(2.1단계 "초신성" 시스템") 및 http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova)는 이와사토 타쿠지의 선물입니다.</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>#12362</td><td>"2. DNA 셋업"(단계 2.3 "내독소가 없는 플라스미드 정제 키트")</td></tr><tr><td>트리판 블루 파우더, 바이오시약 등급</td><td>시그마</td><td>T6146-5G</td><td>"2. DNA 셋업"(2.5단계 "트리판 블루")</td></tr><tr><td>염화나트륨, ACS, 2.5kg</td><td>VWR</td><td>BDH9286-2.5KG</td><td>"2. DNA 설정"(단계 2.5 "NaCl")</td></tr><tr><td>염화칼륨, ACS, 500g</td><td>VWR</td><td>#97061-566</td><td>"2. DNA 설정"(2.5단계 "KCl")</td></tr><tr><td>인산나트륨이염기성, ReagentPlus, 100g</td><td>시그마-알드리치</td><td>S0876-100G</td><td>"2. DNA 설정"(단계 2.5 "Na2HPO4")</td></tr>인<tr><td>산칼륨 모노염기성, ReagentPlus, 100g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100G</td><td>"2. DNA 셋업"(단계 2.5 "KH2PO4")</td></tr><tr><td>염산, ACS 시약, 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>참조 "2. DNA 설정"(단계 2.5 "HCl")</td></tr><tr><td>P-97 마이크로피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-97</td><td>"3. 피펫 설정"(3.1단계 "유리 모세관 풀러")</td></tr><tr><td>3.0mm 너비의 트로프 필라멘트</td><td>셔터 기기</td><td>FT330B</td><td>"3. 피펫 설정"(3.1단계 "유리 모세관 풀러")</td></tr><tr><td>얇은 벽 유리 모세관, 4", 1 / 0.75 OD/ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>"3. 피펫 설정"(3.1.1단계 "유리 모세관")</td></tr><tr><td>단일 플라이 소프트 테크 물티슈, 4.5"</td><td>Phoenix</td><td>LW-8148</td><td>"참조 3. 피펫 설정"(3.2.1단계 "단일 플라이 작업 지우기"); 다른 단일 플라이 와이프(예: Kimwipes)를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Graefe 집게, 7cm, 직선, 0.7mm 1x2 치아</td><td>World Precision Instruments</td><td>#14140</td><td>"4. 자궁 전기천공법"(단계 4.1 "Graefe paps")</td></tr><tr><td>홍채 가위, 11.5cm, 스트레이트, 12팩</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503708-12</td><td>"4. 자궁 전기천공법" (step 4.1 "홍채 가위")</td></tr><tr><td>Hartman 모기집게, 9 cm, 스트레이트, 12팩</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503728-12</td><td>"4. 자궁 내 electroporation" (단계 4.1 "Hartman 모기집게")</td></tr> <tr><td>범용 부직포 스폰지, 2" x 2", 4-ply</td><td>Medrepexpress</td><td>#2204-c</td><td>"4. 자궁 전기천공법"(단계 4.1 "부직포 거즈 스폰지")</td></tr><tr><td>링 팁 집게, 10cm, 직선, 2.2mm ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>#503203</td><td>"4. 자궁 electroporation" (단계 4.1 "ring-tipped forceps")</td></tr><tr><td>Pyrex 페트리 접시 완료, O.D. &times; H 100mm &시간; 20mm</td><td>시그마-알드리치</td><td>CLS3160102-12EA</td><td>"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.1 "페트리 접시")</td></tr><tr><td>평판 기구 트레이, 스테인리스강, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8"</td><td>Amazon</td><td>B007SHGAHA</td><td>"4. 자궁 전기천공법"(단계 4.1 "스테인리스 스틸 트레이")</td></tr><tr><td>백금 핀셋, 5mm</td><td>BTX</td><td>#45-0489</td><td>"4. 자궁 전기천공법"(단계 4.3 및 4.16 "핀셋 형 전극")</td></tr><tr><td>ECM 830 풋 페달</td><td>BTX</td> <td># 45-0211</td><td>"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.3 및 4.17 "풋 페달")</td></tr><tr><td>ECM 830 발전기</td><td>BTX</td><td>#45-0052</td><td>"4. 자궁 내 전기천공법" (단계 4.3 "발전기")</td></tr><tr><td>단일 동물 이소플루란 마취 시스템 소형 유도 상자</td><td>Harvard Apparatus</td><td>#72-6468</td><td>참조 "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.4 및 4.6 "노즈 콘", 단계 4.4 "유도 챔버")</td></tr><tr><td>안과 연고</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co</td><td>#0536108691</td><td>"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.7 "수의학 안과 연고")</td></tr><tr><td>스페이스 젤(AIMS)</td><td>VWR</td><td>#95059-640</td><td>"4. 자궁 전기천공법"(단계 4.8 "과포화 소금 용액으로 채워진 밀봉된 파우치")</td></tr><tr><td>헤어 리무버 젤 크림, 민감성 포뮬러</td><td>Veet</td><td>#062200809951</td><td>"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.9 "제모 크림")</td></tr><tr><td>10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk)</td><td>Phoenix Research Products</td><td>TSP-10LKIT</td><td>참조 "4. 자궁 내 electroporation" (단계 4.12 "sterile 10 &micro; L 마이크로피펫 팁")</td></tr><tr><td>보정된 마이크로모세관 피펫용 흡인기 튜브 어셈블리</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td>"4. 자궁 전기천공법"(단계 4.15 "흡인기 튜브 어셈블리")</td></tr><tr><td>꼰 흡수성 봉합사, 4-0, 바늘 NFS-2(FS-2), 27"</td><td>Medrepexpress</td><td>MV-J397</td><td>"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.19 "흡수성 봉합사")</td></tr><tr><td>" LiquiVet 급류" 티슈 접착제</td><td>Medrepexpress</td><td>VG3</td><td>"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.20 "조직 접착제")</td></tr><tr><td>피하 주사기, 폴리프로필렌, 루어 잠금 팁, 용량 1.0mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z551546-100EA</td><td>"4. 자궁 내 electroporation" (단계 4.21 "1 mL 주사기")</td></tr><tr><td>BD Precisionglide 주사기 바늘 게이지 26, L 1/2 in.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192392-100EA</td><td>참조 "4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.21 "26G, &frac12; &rdquo; 바늘")</td></tr> <tr><td>Nestlets 중첩 재료</td><td>Ancare</td><td>NES3600</td><td>"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.24 "중첩 재료")</td></tr><tr><td>해바라기씨, 검은 기름, 멸균</td><td>Bio-Serv</td><td>S5137</td><td>"4. 자궁 내 전기천공법"(단계 4.24 "해바라기씨")</td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td>"5. 조직학"(단계 5.1.1 "PFA")</td></tr><tr><td>이코노미 핀셋 #3, 11cm, 0.2 x 0.4mm 팁</td><td>World Precision Instruments</td><td>#501976</td><td>"5. 조직학" (단계 5.5 "핀셋")</td></tr><tr><td>한천 분말</td><td>Alfa Aesar</td><td>#10752</td><td>참조 "5. 조직학"(단계 5.8.1 "한천")</td></tr><tr><td>단일 가장자리 면도날, #9 블레이드</td><td>Stanley Tools</td><td>#11-515</td><td>"5. 조직학"(단계 5.9 "단일 가장자리 면도날")</td></tr><tr><td>시편 디스크 S D 50 mm</td><td>Leica</td><td>#14046327404</td><td>참조 "5. 조직학"(단계 5.9 "진동 마이크로톰 표본 디스크")</td></tr><tr><td>버퍼 트레이 S 어셈블리</td><td>Leica</td><td>#1404630132</td><td>"5. 조직학"(단계 5.10 "버퍼 트레이")</td></tr><tr><td>VT1000 S Vibratome</td><td>Leica</td><td>#14047235612</td><td>"5. 조직학"(단계 5.10 "진동 마이크로 톰")</td></tr> <tr><td>양날 면도</td>날 <td>Personna</td><td>BP9020</td><td>"5. 조직학"(단계 5.10 "블레이드")</td></tr><tr><td>나이프 홀더 S</td><td>Leica</td><td>#14046230131</td><td>"5. 조직학"(5.10단계 "나이프 홀더")</td></tr><tr><td>Studio Elements Golden Taklon 짧은 손잡이 라운드 브러시 세트</td><td>아마존</td><td>B0089KU6XE</td><td>참조 "5. 조직학"(단계 5.12.1 "미세한 팁 페인트 브러시")Superfrost</td></tr> <tr><td>Plus 슬라이드</td><td>전자 현미경 서비스</td><td>#71869-11</td><td>"5. 조직학"(5.12.1 단계 "현미경 슬라이드")</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml</td><td>Thermofisher</td><td>P36970</td><td>참조 "5. 조직학" (단계 5.12.3-5.12.4 "mountant")</td></tr><tr><td>커버 유리, 24 x 50 mm, No. 1</td><td>Phoenix Research Products</td><td>MS1415-10</td><td>참조 "5. 조직학"(단계 5.12.4 "커버슬립")</td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>"5. 조직학"(단계 5.13.1 "DAPI")</td></tr><tr><td>고정 스테이지 정립 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>"5. 조직학"(단계 5.15 "광학 현미경")</td></tr><tr><td>레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td>TE2000/C2si</td><td>"5. 조직학"(단계 5.15 "컨포칼 현미경")</td></tr><tr><td>4x 대물렌즈, NA = 0.20</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 4X</td><td>"5. 조직학"(단계 5.15 "저전력 목표")</td></tr><tr><td>20x 대물렌즈, NA = 0.75</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo Lambda 20X</td><td>"5. 조직학" (단계 5.15 "중간 전력 목표")</td></tr><tr><td>60x 목표, NA = 1.40</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td><td>참조 "5. 조직학"(단계 5.15 "고출력 목표")</td></tr></tbody></table>

cre lox 재결합 electroporation utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

유전자의 세포 자율 신경 기능 손실이 발생 하 여 계시 될 수 있다 또는 뉴런의 작고 부족 인구에 있는 유전자의 기능을 얻을. 이렇게 하려면 손실 또는 이득 유전자의 기능의 신경 유전자 교란된 조직에 의해 포위 된다 모자이크를 생성 해야 합니다. 여기, 우리가 결합 Cre lox 재결합 시스템 electroporation utero에 모자이크 뇌 조직 신경에 있는 유전자의 세포 자치 기능을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다을 생성 하기 위하여. DNA 구조 (저장소를 통해 사용 가능), 형광 라벨 및 Cre recombinase 코딩 유전자에 utero 를 사용 하 여 마우스 태아의 두뇌에 loxP 사이트와 측면을 포함 하는 대뇌 피 질의 뉴런 개발에 도입 electroporation입니다. 또한, 우리는 utero에 electroporation 메서드에 생존 및 재현성을 증가 하는 다양 한 적응을 설명 합니다. 이 방법은 또한 titer Cre 중재 재결합 뉴런의 스파스 또는 조밀한 인구에 대 한 설정 포함. (필요 하지 않습니다 하지만)을 적용할 수 있습니다 레이블이 뇌 조직의 조직학 준비 immunohistochemistry. 사용 하는 구문을 붙일 뉴런 수행 Cre recombinase에 대 한 유전자 표시 보장 합니다. 조직학 준비 수지상 및 axonal 아 버 및 모 수석 등뼈의 confocal 영상 통해 뉴런의 형태소 분석 허용. 있으므로 손실 또는 함수의 이득 스파스 모자이크 조직에서, 세포 자치 필요성의 연구와 유전자 제품에서 vivo에서의 자족이이 방법을 허용 합니다.

단일 GFP를 구성 합니다. Cre는 E15.5에서 electroporated 이었고 P14에서 시각 (재료의 목록 참조). 구성의 농도 주입의 볼륨에 따라 스파스 또는 밀도 결과22,26얻어질 수 있다. 예를 들어, 2 mg/mL GFP의 1 µ L의 주입. 레이블이 지정 된 셀, 일부는 밝은 (그림 1A), 그리고에서 지역화 레이어 II/III (그림 1B) 수의 스파스 유통 Cre 결과. 조직 때문에 두께가 100 µ m, 수지상 아 버의 대부분 (그림 1C) 유지 됩니다. 모 수석 등뼈 높은 배율 (60 X;에서 관찰 될 수 있다 그림 1D)입니다....

두뇌에 있는 유전자의 세포 자치 기능 손실을 유도 하 여 공부 될 수 있다 또는 셀의 스파스 인구에 있는 기능을 얻을. 여기, Cre recombinase 함수 비보의 손실에 floxed 유전자와 대뇌 피 질의 뉴런 개발의 부족 인구에 제공 electroporation utero에서 설명 합니다.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

이 절차의 전반적인 목표는 자궁 내 전기천공법을 통해 Cre-Lox 재조합을 유도하여 쥐 대뇌 피질에서 유전적 모자이크를 생성하는 것입니다. 유전자 모자이크를 생성하는 이 방법은 신경생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 주어진 뉴런 표현형에 유전자가 필요한지 여부를 세포 자율적 방식으로 결정하는 것과 같습니다.이 기술의 주요 이점은 효과적인 Cre-Lox 재조합 시스템이 자궁 전기천공법에서 동등하게 효과적인 유전자 전달 기술과 결합된다는 것입니다. 이 방법은 레이어 2-3 피질 뉴런을 표적으로 삼는 데 중점을 두고 있지만 다른 피질 층 깊이의 뉴런을 표적으로 삼는 데 사용할 수 있습니다. 우리가 우리의 뇌 조직에 유전자 모자이크를 만들려고 했을 때, 우리는 실험 동물이 출생 후 생존하도록 하는 데 몇 가지 문제에 부딪혔고, 그래서 우리는 우리의 기술에 몇 가지 단순화와 개선을 도입했습니다.배아 줄기 세포 주입 또는 핵 이식을 위한 피펫의 일반적인 매우 긴 테이퍼와 매우 미세한 팁이 있는 피펫을 먼저 유리 모세관을 피펫 풀러에 삽입하여 준비합니다. 클램프를 고정한 후 프로그램을 당겨 프로토콜을 활성화하여 유리 모세관에 테이퍼를 만듭니다. 복합 광학 현미경을 사용하여 테이퍼 길이가 10mm에서 15mm 사이인지 확인합니다.다음으로, 파이펫 중앙의 끝을 부수기 위해 50mL 비커를 한 겹으로 닦고 한 손으로 팽팽하게 잡아당깁니다. 다른 손으로 당겨진 피펫을 테이퍼 면이 아래로 향하게 하여 와이프 중앙을 수직으로 밀어 테이퍼가 깨끗하게 파손되도록 합니다. 복합 광학 현미경으로 개구부의 크기를 확인하십시오.그런 다음 0.4%Trypan blue 및 PBS의 1mcL를 부분적으로 채워진 피펫에 흡입하여 피펫을 보정하고 피펫의 1mcL 높이를 기준으로 1mcL 표시로 피펫을 눈금화합니다. 교정된 피펫을 사용하여 폐기하기 전에 뽑힌 다른 피펫을 눈금을 만듭니다. 먼지 및 기타 입자가 없는 피펫 홀더에 피펫을 놓습니다.E-15.5에서 임신한 쥐를 깊이 마취한 후, 유도실을 부드럽게 기울이고 마우스의 반응을 관찰하여 우측 반사를 테스트합니다. 오른쪽 반사가 없는 경우, 마우스를 수술 준비 구역으로 옮기고 콧방울을 통해 흡입된 이소플루란을 투여하여 수술 마취면을 유지합니다. 집게를 사용하여 페달 반사를 테스트하고 마취를 확인합니다.호흡 속도를 모니터링하면서 깊고 규칙적인 호흡을 하고 점막이 분홍색이고 촉촉한지 확인합니다. 건조를 방지하기 위해 눈을 완전히 덮을 수 있도록 수의학 안과 연고를 충분히 바르십시오. 복부 털이 녹을 때까지 면봉으로 복부에 제모 크림을 마사지합니다.그런 다음 복부 털을 닦아냅니다.70% 에탄올과 면봉으로 남아 있는 잔여물과 제모 크림을 조심스럽게 닦아냅니다. 요오드 기반 스크럽 용액을 복부에 원을 그리며 바릅니다.그런 다음 수술용 드레이프를 사용하여 수술 부위를 격리하고 멸균 상태를 유지합니다. 피부에 2cm 복부 정중선을 절개한 후 복직근의 정중선을 시각화하기 위해 알바선을 찾습니다. 근육을 복부에서 위로 당기고 무균 기술을 사용하여 복강을 노출시키기 위해 2cm 정중선을 절개합니다.멸균 10mcL 마이크로피펫 팁을 사용하여 진통제를 위해 카프로펜을 복강에 분배합니다. 다음으로, 복직근 절개 부위의 왼쪽 가장자리에 Hartmann 모기 집게 하나를 고정합니다. 절개 부위의 왼쪽을 열어 두고 뒤집힌 페트리 접시에 집게를 올려 놓습니다.비슷한 방법으로 절개 부위의 오른쪽을 조인 후 절개 부위 주위에 거즈 스펀지를 놓습니다. 제한 나사가 부착되지 않은 링 집게를 사용하여 조직을 부수거나 손상시키지 않고 인접한 두 배아 사이의 자궁을 당깁니다. 절개 부위를 통해 모든 배아를 꺼내기 시작하여 거즈 스펀지 위에 놓습니다.보정된 피펫을 흡인기 튜브 어셈블리에 연결하고 자궁벽을 통해 준비된 DNA 용액을 정확히 1mcL를 각 배아의 측심실에 주입합니다. 엄지와 검지를 사용하여 배아를 조작하여 주입하는 동안 배아가 자궁벽에 부드럽게 밀릴 수 있도록 합니다. 외측심실(lateral ventricles)은 배아의 등쪽 뇌실(dorsal telencephalon)에 두 개의 더 어두운 반점으로 나타납니다.외심실을 채우고 있는 Trypan blue를 관찰하여 성공적인 주입을 확인합니다. 모든 배아를 주입한 후, 핀셋 전극의 음극을 자궁에 배치하고, 내측 및 꼬리 피질 바로 위에 놓아 시각 피질을 표적으로 삼습니다. 양극을 배아의 머리보다 바로 아래쪽과 앞쪽에 놓습니다.풋 페달을 사용하여 950ms 간격으로 분리된 50볼트의 550ms 펄스 전달을 트리거합니다. 모든 배아를 전기천공한 후, 자궁을 발견된 방향과 동일한 방향으로 복강으로 되돌립니다. 식염수를 사용하여 자궁을 윤활하는 동시에 자궁에서 배아를 옮겨지지 않도록 주의하면서 수동으로 매우 부드럽게 안내합니다.흡수성 봉합사로 복부 근육을 닫습니다. 간단한 단속 스티치를 사용하여 끝을 외과 의사의 매듭으로 묶습니다. 흡수성 봉합사로 피부층을 닫습니다.상처를 봉합하기 위해 소량의 조직 접착제를 바르십시오. 풀리지 않도록 매듭에 티슈 접착제를 바르십시오. 마이크로피펫을 사용하여 흡인될 수 있는 상처 주변의 조직 접착제를 제거합니다.조직 접착제가 마르면 동물을 이소플루란에서 제거하고 암컷이 따뜻한 케이지에서 혼자 회복할 수 있도록 합니다. 마우스가 완전히 복구되어 정상적으로 작동할 때까지 마우스를 계속 모니터링하십시오. 제거되면 암컷을 수컷과 함께 우리에 다시 넣습니다.1-x PBS를 적신 단일 플라이 작업용 물티슈로 두개골을 평평한 표면에 놓습니다. 핀셋을 사용하여 먼저 후두골을 제거합니다. 그런 다음 두정골을 조심스럽게 제거하고 핀셋을 제거하여 뇌 표면에서 멀리 떨어뜨립니다.피질의 손상을 방지하기 위해 수막을 조심스럽게 제거하십시오. 핀셋의 뒷면을 두개골을 따라 뇌 아래에 끼워 뇌 신경을 절단하고 뇌를 제거합니다. 외날 면도날을 사용하여 관상공을 브레그마까지 약 0.5mm 절단하고, 다른 관상날로 관심 조직의 꼬리를 약 0.5mm 절단합니다.이제 조직 블록을 절단할 준비가 되었습니다. 1mcL의 2mg/mL의 GFP Cre를 주입하면 표지된 세포가 희박하게 분포하며, 그 중 일부는 밝을 수 있습니다. 조직이 100미크론으로 절단되어 있기 때문에 대부분의 수지상 가지는 보존됩니다.배아 15.5일에 자궁 내 전기천공법이 수행되면 피질층 2층과 3층에 걸쳐 표지가 발생합니다. 수지상 가시는 고배율에서 관찰할 수 있습니다. 1.5mcL의 2mg/mL의 GFP Cre를 주입하면 매우 조밀한 라벨링이 발생하며, 이는 신경돌기 및 수지상 가시의 출처를 추적하기 어렵기 때문에 차선책이 될 수 있습니다.그러나 표지된 영역의 주변부에 있는 밝은 세포를 선택하면 여전히 뉴런과 그 과정을 이미지화할 수 있습니다. 또는 SuperNova 구조체를 주입하면 매우 밝게 표시된 레이어 2-3 뉴런이 희박하게 분포합니다. 자궁 내 전기천공술은 제대로 시행되면 30분도 채 걸리지 않습니다.다른 DNA 구조로 이 절차를 시도하는 동안 다양한 농도와 부피를 시도하는 것을 기억하는 것이 중요하며, 이는 모자이크 분석에 필요한 라벨링의 원하는 희소성을 달성하는 데 도움이 됩니다. 우리의 대표적인 결과는 단일 구조 또는 최근에 발명된 SuperNova 구조를 사용했습니다. 후자에서 우리는 뉴런의 밝기를 최대화하면서 우수한 희소 라벨링을 달성할 수 있음을 발견했습니다.이 기술은 다른 방법으로 모자이크 뇌 조직을 만드는 데 적용할 수 있습니다. 예를 들어, CRISPR 및 Cas9 유전자 편집은 자궁 내 전기천공법과 결합될 수 있으며, Cre-Lox 재조합은 바이러스 벡터의 뇌실 내 주입과 결합될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 희소 유전자 모자이크를 달성하는 데 사용되는 몇 가지 단순화되고 세련된 기술을 잘 이해하여 Cre-Lox 재조합과 자궁 내 전기천공법을 함께 결합할 수 있습니다.행운을 빌며.

inducing-cre-lox-recombination-mouse-cerebral-cortex-through-utero

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

E15 마우스 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

이 문서에서는 자세히 utero에서 대뇌 피질과 생쥐의 E14.5에서 해마를 electroporate하는 프로토콜을 설명합니다. 또한이 두 대뇌 지역에서 dendrites 및 쪽이을 연구하는 귀중한 방법임을 보여줍니다.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

이 비디오에서는 loxP 부위와 에스트로겐 수용체에 융합된 Cre 재조합효소 옆에 있는 Ccm2 유전자를 가진 유전자 변형 쥐 강아지가 뇌 해면체 기형(CCM)을 유도하는 데 사용됩니다. 4-하이드록시타목시펜의 투여는 내피 세포에서 Cre를 활성화하여 Ccm2의 결실과 뇌의 CCM 형성으로 이어집니다.

마우스 모델에서 대뇌 해면상 기형의 Cre-LoxP 매개 유도

출처: Denaxa, M., el al., 초기 출생 후 마우스 뇌에 화학유전적으로 조작된 피질 중간 뉴런 전구 세포의 이식. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 관심 유전자를 운반하는 플라스미드 벡터를 배아 뇌 절편의 중간 뉴런 전구 세포에 주입한 후 플라스미드 진입 및 유전자 발현을 위한 전기천공법을 시사하는 절차를 보여줍니다. 이러한 변형된 전구 세포는 나중에 뇌 장애 치료에 사용될 수 있습니다.

마우스 피질 중간 뉴런 전구세포에서 아가로스 포매 전기천공 보조 유전자 전달

뉴런 이동은 수많은 세포 자율 및 비세포 자율 요인에 의해 조절됩니다.  이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 표현형이 세포 고유 메커니즘의 파괴 또는 뉴런과 환경 간의 상호 작용 손상으로 인한 것인지 여부를 결정하기 위해 자궁 내 전기천공법을 사용하는 방법을 보여줍니다.

단백질 삭제의 유도를 통해 자궁 내 일렉트로는 형질 전환 모델에서 신경 세포의 마이그레이션에 적자를 정의하려면

이진 유전 전략을 활용하여 Cre 매개 재조합 후 상보적 시냅스 경진 추적자를 발현하는 마우스의 신경 회로 추적을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 세포 특이적 추적자 생산은 유전적으로 암호화되기 때문에 당사의 실험적 접근 방식은 단일 세포 해상도에서 쥐 배아 뇌 발달 중 신경 회로의 형성 및 성숙을 연구하는 데 적합합니다.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

이 프로토콜은 자궁 내 전기천공법을 통해 C57BL/6 중추신경계의 다른 영역을 구체적으로 transfection하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에는 피질, 해마, 시상, 시상하부, 외측 중격 핵 및 선조체로 발달하는 영역의 형질주입에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

성상 세포는 대뇌 피질을 균일하게 타일로 만들어 세포 수준에서 복잡한 형태에 대한 분석을 어렵게 만듭니다. 여기에 제공된 프로토콜은 자궁 전기포레이션을 기반으로 하는 다색 라벨을 사용하여 피질 성상신구를 선별하고 사용자 친화적인 이미지 분석 파이프라인을 사용하여 볼륨 및 형태를 분석합니다.

피질 마우스 성상세포를 개별화하기 위해 다각형 게놈 통합 색상(MAGIC) 마커의 자궁 전기포게에서

학습하세요 마우스 대뇌 피질에서 Cre-Lox 재결합을 유도하는 자궁내 전기천공 기법을 통해 유전자 모자이크를 생성하는 방법을. 이 기술은 신경생물학 연구에서 세포 자율적 유전자 기능을 규명하는 데 필수적입니다.

Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

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