Cre lox 재결합 Electroporation Utero에 통해 마우스 대뇌 피 질에서 유도

이 절차의 전반적인 목표는 자궁 내 전기천공법을 통해 Cre-Lox 재조합을 유도하여 쥐 대뇌 피질에서 유전적 모자이크를 생성하는 것입니다. 유전자 모자이크를 생성하는 이 방법은 신경생물학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 주어진 뉴런 표현형에 유전자가 필요한지 여부를 세포 자율적 방식으로 결정하는

이 기술의 주요 이점은 효과적인 Cre-Lox 재조합 시스템이 자궁 전기천공법에서 동등하게 효과적인 유전자 전달 기술과 결합된다는 것입니다. 이 방법은 레이어 2-3 피질 뉴런을 표적으로 삼는 데 중점을 두고 있지만 다른 피질 층 깊이의 뉴런을 표적으로 삼는 데 사용할 수 있습니다. 우리가 우리의 뇌 조직에 유전자 모자이크를 만들려고 했을 때, 우리는 실험 동물이 출생 후 생존하도록 하는 데 몇 가지 문제에 부딪혔고, 그래서 우리는 우리의 기술에 몇 가지 단순화와 개선을 도입했습니다.

배아 줄기 세포 주입 또는 핵 이식을 위한 피펫의 일반적인 매우 긴 테이퍼와 매우 미세한 팁이 있는 피펫을 먼저 유리 모세관을 피펫 풀러에 삽입하여 준비합니다. 클램프를 고정한 후 프로그램을 당겨 프로토콜을 활성화하여 유리 모세관에 테이퍼를 만듭니다. 복합 광학 현미경을 사용하여 테이퍼 길이가 10mm에서 15mm 사이인지 확인합니다.

다음으로, 파이펫 중앙의 끝을 부수기 위해 50mL 비커를 한 겹으로 닦고 한 손으로 팽팽하게 잡아당깁니다. 다른 손으로 당겨진 피펫을 테이퍼 면이 아래로 향하게 하여 와이프 중앙을 수직으로 밀어 테이퍼가 깨끗하게 파손되도록 합니다. 복합 광학 현미경으로 개구부의 크기를 확인하십시오.

그런 다음 0.4%Trypan blue 및 PBS의 1mcL를 부분적으로 채워진 피펫에 흡입하여 피펫을 보정하고 피펫의 1mcL 높이를 기준으로 1mcL 표시로 피펫을 눈금화합니다. 교정된 피펫을 사용하여 폐기하기 전에 뽑힌 다른 피펫을 눈금을 만듭니다. 먼지 및 기타 입자가 없는 피펫 홀더에 피펫을 놓습니다.

E-15.5에서 임신한 쥐를 깊이 마취한 후, 유도실을 부드럽게 기울이고 마우스의 반응을 관찰하여 우측 반사를 테스트합니다. 오른쪽 반사가 없는 경우, 마우스를 수술 준비 구역으로 옮기고 콧방울을 통해 흡입된 이소플루란을 투여하여 수술 마취면을 유지합니다. 집게를 사용하여 페달 반사를 테스트하고 마취를 확인합니다.

호흡 속도를 모니터링하면서 깊고 규칙적인 호흡을 하고 점막이 분홍색이고 촉촉한지 확인합니다. 건조를 방지하기 위해 눈을 완전히 덮을 수 있도록 수의학 안과 연고를 충분히 바르십시오. 복부 털이 녹을 때까지 면봉으로 복부에 제모 크림을 마사지합니다.

그런 다음 복부 털을 닦아냅니다.70% 에탄올과 면봉으로 남아 있는 잔여물과 제모 크림을 조심스럽게 닦아냅니다. 요오드 기반 스크럽 용액을 복부에 원을 그리며 바릅니다.

그런 다음 수술용 드레이프를 사용하여 수술 부위를 격리하고 멸균 상태를 유지합니다. 피부에 2cm 복부 정중선을 절개한 후 복직근의 정중선을 시각화하기 위해 알바선을 찾습니다. 근육을 복부에서 위로 당기고 무균 기술을 사용하여 복강을 노출시키기 위해 2cm 정중선을 절개합니다.

멸균 10mcL 마이크로피펫 팁을 사용하여 진통제를 위해 카프로펜을 복강에 분배합니다. 다음으로, 복직근 절개 부위의 왼쪽 가장자리에 Hartmann 모기 집게 하나를 고정합니다. 절개 부위의 왼쪽을 열어 두고 뒤집힌 페트리 접시에 집게를 올려 놓습니다.

비슷한 방법으로 절개 부위의 오른쪽을 조인 후 절개 부위 주위에 거즈 스펀지를 놓습니다. 제한 나사가 부착되지 않은 링 집게를 사용하여 조직을 부수거나 손상시키지 않고 인접한 두 배아 사이의 자궁을 당깁니다. 절개 부위를 통해 모든 배아를 꺼내기 시작하여 거즈 스펀지 위에 놓습니다.

보정된 피펫을 흡인기 튜브 어셈블리에 연결하고 자궁벽을 통해 준비된 DNA 용액을 정확히 1mcL를 각 배아의 측심실에 주입합니다. 엄지와 검지를 사용하여 배아를 조작하여 주입하는 동안 배아가 자궁벽에 부드럽게 밀릴 수 있도록 합니다. 외측심실(lateral ventricles)은 배아의 등쪽 뇌실(dorsal telencephalon)에 두 개의 더 어두운 반점으로 나타납니다.

외심실을 채우고 있는 Trypan blue를 관찰하여 성공적인 주입을 확인합니다. 모든 배아를 주입한 후, 핀셋 전극의 음극을 자궁에 배치하고, 내측 및 꼬리 피질 바로 위에 놓아 시각 피질을 표적으로 삼습니다. 양극을 배아의 머리보다 바로 아래쪽과 앞쪽에 놓습니다.

풋 페달을 사용하여 950ms 간격으로 분리된 50볼트의 550ms 펄스 전달을 트리거합니다. 모든 배아를 전기천공한 후, 자궁을 발견된 방향과 동일한 방향으로 복강으로 되돌립니다. 식염수를 사용하여 자궁을 윤활하는 동시에 자궁에서 배아를 옮겨지지 않도록 주의하면서 수동으로 매우 부드럽게 안내합니다.

흡수성 봉합사로 복부 근육을 닫습니다. 간단한 단속 스티치를 사용하여 끝을 외과 의사의 매듭으로 묶습니다. 흡수성 봉합사로 피부층을 닫습니다.

상처를 봉합하기 위해 소량의 조직 접착제를 바르십시오. 풀리지 않도록 매듭에 티슈 접착제를 바르십시오. 마이크로피펫을 사용하여 흡인될 수 있는 상처 주변의 조직 접착제를 제거합니다.

조직 접착제가 마르면 동물을 이소플루란에서 제거하고 암컷이 따뜻한 케이지에서 혼자 회복할 수 있도록 합니다. 마우스가 완전히 복구되어 정상적으로 작동할 때까지 마우스를 계속 모니터링하십시오. 제거되면 암컷을 수컷과 함께 우리에 다시 넣습니다.

1-x PBS를 적신 단일 플라이 작업용 물티슈로 두개골을 평평한 표면에 놓습니다. 핀셋을 사용하여 먼저 후두골을 제거합니다. 그런 다음 두정골을 조심스럽게 제거하고 핀셋을 제거하여 뇌 표면에서 멀리 떨어뜨립니다.

피질의 손상을 방지하기 위해 수막을 조심스럽게 제거하십시오. 핀셋의 뒷면을 두개골을 따라 뇌 아래에 끼워 뇌 신경을 절단하고 뇌를 제거합니다. 외날 면도날을 사용하여 관상공을 브레그마까지 약 0.5mm 절단하고, 다른 관상날로 관심 조직의 꼬리를 약 0.5mm 절단합니다.

이제 조직 블록을 절단할 준비가 되었습니다. 1mcL의 2mg/mL의 GFP Cre를 주입하면 표지된 세포가 희박하게 분포하며, 그 중 일부는 밝을 수 있습니다. 조직이 100미크론으로 절단되어 있기 때문에 대부분의 수지상 가지는 보존됩니다.

배아 15.5일에 자궁 내 전기천공법이 수행되면 피질층 2층과 3층에 걸쳐 표지가 발생합니다. 수지상 가시는 고배율에서 관찰할 수 있습니다. 1.5mcL의 2mg/mL의 GFP Cre를 주입하면 매우 조밀한 라벨링이 발생하며, 이는 신경돌기 및 수지상 가시의 출처를 추적하기 어렵기 때문에 차선책이 될 수 있습니다.

그러나 표지된 영역의 주변부에 있는 밝은 세포를 선택하면 여전히 뉴런과 그 과정을 이미지화할 수 있습니다. 또는 SuperNova 구조체를 주입하면 매우 밝게 표시된 레이어 2-3 뉴런이 희박하게 분포합니다. 자궁 내 전기천공술은 제대로 시행되면 30분

다른 DNA 구조로 이 절차를 시도하는 동안 다양한 농도와 부피를 시도하는 것을 기억하는 것이 중요하며, 이는 모자이크 분석에 필요한 라벨링의 원하는 희소성을 달성하는 데 도움이 됩니다. 우리의 대표적인 결과는 단일 구조 또는 최근에 발명된 SuperNova 구조를 사용했습니다. 후자에서 우리는 뉴런의 밝기를 최대화하면서 우수한 희소 라벨링을 달성할 수 있음을 발견했습니다.

이 기술은 다른 방법으로 모자이크 뇌 조직을 만드는 데 적용할 수 있습니다. 예를 들어, CRISPR 및 Cas9 유전자 편집은 자궁 내 전기천공법과 결합될 수 있으며, Cre-Lox 재조합은 바이러스 벡터의 뇌실 내 주입과 결합될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 희소 유전자 모자이크를 달성하는 데 사용되는 몇 가지 단순화되고 세련된 기술을 잘 이해하여 Cre-Lox 재조합과 자궁 내 전기천공법을 함께 결합할 수 있습니다.

행운을 빌며