Name: Autoantibody N-메 틸-D-Aspartate (NMDA) 수용 체에 대 한 혈액에서 검출 하는 간단한 세포 기반 면역 형광 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 배우세요 NMDA 수용체 자가항체를 검출하는 세포 기반 면역형광 분석법을 HEK293 세포를 이용하여. 이 방법은 자가면역 뇌염 환자의 조기 진단에 활용될 수 있습니다.

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이 작품은 장 공 의료 재단 (보조금 번호 CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632, 및 CMRPG3E0633)에 의해 지원 되었다.

연구 기관 검토 위원회의 장 공 기념 병원 Linkuo, 타오 위 엔, 대만 (102-2577A3)에 의해 승인 되었다.
1. NR1 GFP 식 플라스 미드의 준비
<ol><li>살 균 1.5 mL에 대장균 유능한 세포 변형 DH5α의 100 µ L로 NR1 GFP 플라스 미드의 믹스 10 ng까지 부드럽게 튜브를 피펫으로 혼합물을 원심 및 아래쪽 4-6 시간, 20 분 동안 얼음에 튜브를 품 어 고.</li>
	<li>물 욕조에 1 분 동안 42 ° C에 튜브를 품 어 물 탕에서 튜브를 제거, 튜브에 1 mL lysogeny 국물 (파운드) 매체를 추가 하 고 1 시간 동안 흔들어와 인큐베이터에서 37 ° C에서 튜브를 품 어.</li>
	<li>50 µ L 암 피 실린 (0.1 mg/mL)를 포함 하는 파운드 한 천 배지 위에 혼합물의 확산과 하룻밤 인큐베이터에서 37 ° C에서 파운드 천 배지를 품 어.</li>
	<li>멸 균 팁을 사용 하 여 하룻밤 파운드 한 천 배지에서 단일 식민지를 선택 하 고에서 팁을 소용돌이 파운드 매체와 암 피 실린 (0.1 mg/mL) 5 mL를 포함 하는 세균성 문화 관에서. 37 ° c 하룻밤 떨고와 인큐베이터에서 튜브를 품 어.</li>
	<li>Aliquot 3 mL 250 mL 살 균 파운드 매체와 암 피 실린 (0.1 mg/mL)에 포함 된 500 mL 플라스 크에 하룻밤 세균성 문화. 떨고와 37 ° C에서 플라스 크를 품 어. 600의 파장에서 세균성 문화 광학 밀도 (OD)를 정기적으로 확인 nm는 OD600 0.6-1.0에 도달할 때까지 한 분석기를 사용 하 여. 참고: 글리세롤 재고를 준비 하 여 글리세롤 재고 미래 사용을 위한-80 ° C이 하 저장 200 µ L 글리세롤과 잘 800 µ L의 하룻밤 세균성 문화를 혼합.</li>
	<li>NR1 GFP 식 플라스 미드 250 mL 세균성 문화에서 준비<ol>
<li>4 ° c.에 15 분 동안 6000 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수집</li>
		<li>10 mL 물의 resuspension 버퍼 RNase A;를 포함 하는 박테리아 펠 릿 resuspend 와 동 없는 덩어리를 볼 때까지 철저 하 게</li>
		<li>세균 현 탁 액을 10ml 세포의 용 해 버퍼를 추가, 부드럽게 반전 혼합물, 4-6 시간 하 고 lysate 5 분 실 온 (RT)에서 품 어.</li>
		<li>10 mL 미리 냉장된 강수량 버퍼는 lysate를 추가, 부드럽게 반전 혼합 4-6 시간.</li>
		<li>Lysate의 모자와 필터 카트리지를 통에 부 어 실시간에서 10 분 동안 대기</li>
		<li>카트리지 출구 노즐에서 뚜껑을 제거, 카트리지에 플런저를 삽입 하 고 플런저를 조심 스럽게 누릅니다. 수집 하는 필터링 된 50 mL 튜브에 lysate.</li>
		<li>2.5 mL 독점 버퍼 제조 업체에서 하는 필터링 된 lysate를 추가 하 고 약 10 배, 튜브를 거꾸로 하 여 혼합물을 섞어 30 분 동안 얼음에 혼합물을 품 어.</li>
		<li>필터 열을 미리 equilibrated 10 mL 평형 버퍼 필터링된 lysate 혼합물을 적용 합니다. 중력에 의해 배수를 열을 수 있습니다.</li>
		<li>30 mL 워시 버퍼 열 두 번 세척 후 15 mL 차입 버퍼를 사용 하 여 열에서 DNA을 elute.</li>
		<li>10.5 mL (0.7 볼륨) 소 프로 파 놀 eluted DNA 버퍼에 추가, 잘, 그리고 20000 x g 4 ° c.에 30 분 동안에 혼합물을 원심</li>
		<li>신중 하 게는 상쾌한 가만히 따르다, 한 번, 5 mL도 무료 70% 에탄올과 DNA 펠 릿을 세척 하 고 10 분 20000 x g에서 원심.</li>
		<li>상쾌한 가만히 따르다, 화학 후드, 5-10 분 동안 펠 릿 건조 하 고도 무료 버퍼의 300-500 µ L에 펠 릿을 녹.</li>
		<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 UV 260/280 nm에 해결책의 흡수를 측정 하 여 플라스 미드 농도 결정 합니다. 참고: 식 플라스 미드 GFP 동일한 프로토콜을 사용 하 여 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NR1 GFP 식 플라스 미드와 HEK293 세포의 transfection
<ol><li>각각 2% 젤라틴 솔루션의 aliquot 200 µ L 48-잘 문화 판의 고 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	<li>세포 배양 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 각 잘 포함 하의 200 µ L에 잘, 그리고 씨앗 5 x 104 HEK293 세포에서 젤라틴 솔루션 발음 37 ° c 하룻밤 5% CO2 와 함께 제공 된 습도 인큐베이터에서 접시를 품 어. 참고: 셀을 hemocytometer를 사용 하 여 계산 했다.</li>
	<li>다음 날, 바꿉니다 소비 문화 중간 10%를 포함 하는 신선한 문화 매체의 200 µ L FBS 잘 당.</li>
	<li>각 단일, 100를 혼합 하 여 솔루션 A를 준비 20 µ L 문화 매체, 및 0.8 µ L transfection 시 약 20 µ L 문화 매체와 혼합 하 여 솔루션 B NR1 tGFP 플라스 미드의 ng. 각 실험에 대 한 전체 볼륨을 준비 하는 데 필요한 우물의 수를 곱하면.</li>
	<li>솔루션 및 솔루션 B, 혼합 하 여 솔루션 C를 준비 하 고 20-30 분에 대 한 실시간에 혼합물을 품 어.</li>
	<li>C 솔루션 필요 각 잘 포함 하는 HEK293 세포의 aliquot 40 µ L 플레이트를 부드럽게, 소용돌이 그리고 하룻밤 5% CO2 와 함께 제공 된 습도 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	<li>NR1 GFP 40 X-200 X 확대와 함께 형광 현미경 호스트 세포에서 재조합 형 단백질의 표정을 확인 (여기/방출: 482/502 nm), 세포 기반 면역 형광 분석을 진행 하 고. 참고: 동일한 프로토콜을 사용 하 여 HEK293 세포로 식 플라스 미드 GFP Transfect.</li>
</ol>3. 세포 기반 면역 형광 분석 결과
<ol><li>우물에서 보낸된 중간 발음, 다음 세척의 인산 염 200 µ L 각 잘 버퍼링 염 분 (PBS) 3 번.</li>
	<li>각 잘;에 4 %paraformaldehyde 솔루션의 200 µ L를 추가 15 분에 대 한 실시간에 접시를 품 어.</li>
	<li>우물에서 paraformaldehyde 솔루션을 발음 하 고 각각 씻어 PBS의 200 µ L 세 번 잘.</li>
	<li>PBST에 10% 탈지 우유의 200 µ L를 추가 (0.1 %PBS 트윈-20) 솔루션을 각각 잘 고 부드러운 진동으로 1 시간에 대 한 실시간에 접시를 품 어.</li>
	<li>잘에서 PBST 솔루션 10% 탈지 우유를 발음 다음 200 µ L PBST와 웰 스를 한 번 세척.</li>
	<li>1 시간에 대 한 실시간에 부드러운 동요와 1 차 항 체로 희석된 플라즈마 (PBST에 1: 100)와 웰 스를 품 어. 참고: 플라즈마 면역 뇌염이 있기 위하여 의심 되는 환자의 혈액에서 얻은 것입니다.</li>
	<li>우물에서 희석된 플라즈마를 발음 하 고 각각을 씻어 PBST의 200 µ L 세 번 잘.</li>
	<li>염소 안티 인간 IgG 각 음에 알 렉 사 Fluor 594 (1:1, PBST에서 000 희석)와 활용의 200 µ L을 추가 하 고 1 시간 동안 부드러운 흔들어와 RT에서 문화 접시를 품 어.</li>
	<li>IgG 알 렉 사 Fluor 594 솔루션 활용 된 염소 항 인간의 발음 및 각 세척 PBST의 200 µ L 세 번 잘.</li>
	<li>각 잘을 100 µ L 글리세롤 솔루션 (PBS와 1:100,000의 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)에 50% 글리세롤)를 추가 합니다.</li>
	<li>관찰 하 고 형광 현미경 접 안 렌즈, 그리고 4 배, 10 배, 20 X 목표 X 10을 사용 하 여 셀을 이미지. 참고: 각 염료에 대 한 올바른 필터를 사용 하 여: NR1 GFP에 대 한 (여기/방출 = 482/502 nm), 알 렉 사 Fluor 594 대 한 (여기/방출 = 561/594 nm), DAPI에 대 한 (여기/방출 358/461 = nm). 같은 방식으로 표현 하는 GFP HEK 세포를 사용 하 여 부정적인 제어를 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+surface+antibody-mediated+autoimmune+encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis.</a> Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).</li>
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<li>Jézéquel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-+and+single+molecule-based+methods+to+detect+anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+autoantibodies+in+patients+with+first-episode+psychosis+from+the+OPTiMiSE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project.</a> Biol Psychiatry. , (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

라이브 세포 기반 면역 형광 분석 결과11, 고정 세포 기반 면역 형광 분석 결과9 포함 하 여 문학에서 보고 된 NMDA 수용 체에 대 한 신경의 존재를 화면에 여러 세포 기반 면역 분석을 있다 , cytometry 기반 흐름 시험14및. 라이브 세포 기반 면역 형광 분석 결과 흐름 cytometry 기반 분석 결과 훈련 된 인력과 특수 장비를 요구 하면서 ectopically NR1 단백질을 표현 하는 세포의 준비 후 수행 되어야 한다. 고정된 셀 기반 면역 형광 분석 결과 더 편리한 분석 결과 임상 설정에 대 한 수행할 수 있습니다. 따라서, 많은 연구 상업 간접 고정된 세포 기반 면역 형광 분석 결과 화면 안티 NMDA 수용 체 autoantibody 혈 청 및 CSF 표본12,15를 사용....

안티 NMDA 수용 체 면역 뇌염 새로 인식 된 질병 엔터티는 모든 연령대의 환자에서 발생할 수 있으며 주로 여성 환자1,2에 영향을 미치는입니다. 그것은 가장 자주 진단된 뇌염 뇌염3의 초기 알 수 없는 병을 가진 환자 들 중 하나입니다. 일반적으로 안티-NMDA 수용 체 뇌염으로 영향을 받는 환자는 두통이 나 발열, 의식 수준의 변화 및 다양 한 동요, 과민성을 포함 한 급성 정신병 증상의 빠른 발전에 의해 다음의 prodromal 증상이 불안, 불면증, 환각, 망상, 침략, 기괴 한 행동, 운동 이상, 자율 dysregulation, 그리고 발작 공격4,5. 이 조건과 immunotherapy 적시 치료의 초기 인식 더 나은 결과 영향을 받는 환자6전체 복구에 대 한 중요 하다. 따라서, 안티-NMDA 수용 체 면역 뇌염 환자 급성 또는 새로운 발병 정신병 특징7,8제시의 중요 한 감 별 진단으로 고려 되어야 한다 건의 된다.
임상 기능 외 autoantibody CSF 또는 혈액에 NMDA 수용 체에 대 한의 안티 NMDA 수용 체 면역 뇌염9의 정확한 진단을 위해 필수적 이다. 안티-NMDA 수용 체 autoantibody 감지 하 면역 테스트의 대부분은 몇 가지 연구 실험실10,의11, 사용할 수 거기 이며 심사에 대 한 단 하나의 상용 세포 기반 면역 형광 분석 결과 안티-NMDA 수용 체 신경12. 이 연구의 목표는 사용할 수 있는 편리 하 게 실험실에서 안티 NMDA 수용 체의 임상 연구를 촉진 하기 위하여 안티 NMDA 수용 체 신경의 존재를 화면에 간단한 사내 세포 기반 면역 형광 분석 결과 개발 하는 뇌염은 면역 NMDA 수용 체는 heterotetramer 이온 채널 단백질 복잡 한 두뇌에서 구체적으로 표현. 그것은 두 개의 필수 NR1 소 단위, 및 NR2A, NR2B, NR2C, 또는 NR2D13의 하나 또는 두 개의 소 단위 조합의 만들어진다. 이전 연구는 항 체에 의해 대상 주요 epitope NR1 소 단위5의 extracellular N 맨끝 도메인에는 보고. 따라서,이 프로토콜에 우리 인간 미 발달 신장 상피 세포 라인 (HEK293), 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그로 NMDA 수용 체의 인간 재조합 형 NR1 소 단위 단백질을 표현 하 고 개발 감지 하는 세포 기반 면역 형광 분석 결과 안티-NMDA 수용 체 신경에 혈액의 IgG 클래스.

<table><tbody><tr><td>GRIN1 (GFP-tagged) - 인간 글루타메이트 수용체, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1</td><td>Origene (Rockville, MD, USA)</td><td>RG219368</td><td>C-terminal tGFP sequences</td></tr><tr><td>pCMV6-AC-GFP</td><td>Origene (Rockville, MD, USA)</td><td>PS100010</td><td>C-terminal tGFP tag</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen (Hilden Germany)</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection 시약</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 환원 혈청 매체</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 피루브산</td><td>Thermo Fisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>특성화된 소 태아 혈청, 미국 원산지</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-인간 IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11014</td><td></td></tr><tr><td>양성 대조군: 항-글루타메이트 수용체 (type NMDA)</td><td>Euroimmun AG, L&uuml; beck, 독일</td><td>CA 112D-0101</td><td></td></tr><tr><td>Euroimmun 분석 키트</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

autoantibody n-메 틸-d-aspartate (nmda) 수용 체에 대 한 혈액에서 검출 하는 간단한 세포 기반 면역 형광 분석 결과

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

안티-NMDA 수용 체 autoantibody의 존재 안티 NMDA 수용 체 면역 뇌염 되 나 영향을 받는 환자에서 다양 한 정신병 증상을 일으킬 수 있습니다. 혈액 또는 뇌 척추 액체 (CSF)에 NMDA 수용 체에 대 한 특정 autoantibody의 검출은이 조건의 정확한 진단을 위해 필수적 이다. NMDA 수용 체는 이온 채널 단백질 복잡 한 두 필수 NMDA 수용 체 소 단위 1 (NR1)와 하나 또는 두 개의 NMDA 수용 체를 포함 하 여 4 개의 소 단위를 포함 하는 소 단위 2A (NR2A), NMDA 수용 체 소 단위 2B (NR2B), NMDA 수용 체 소 단위 2 C (NR2C), 또는 NMDA 수용 체 소 단위 2D (NR2D). 안티-NMDA 수용 체 autoantibody epitope NMDA 수용 체의 NR1 소 단위의 extracellular N 맨끝 도메인에 있어야 보고 되었다. 이 연구의 목표는 NMDA 수용 체의 NR1 소 단위에 대 한 신경의 임상 및 기초 연구를 촉진 하기 위하여 혈액에서 검출 하는 검사로 사용할 수 있는 간단한 세포 기반 면역 형광 분석 결과 개발 하는 안티-NMDA 수용 체 면역 뇌염

평균적으로, 우리는 프로토콜의 섹션 1에서에서 설명한 절차에 따라 250 mL 세균성 문화에서 200-300 µ g 내 무료 식 플라스 미드 NR1 GFP와 GFP를 얻을 수 있습니다. 프로토콜의 섹션 2에에서 설명 된 대로 48-잘 접시에 배양 HEK293 세포의 transfection는 양의 식 플라스 미드의 100 ng/잘 사용 되었다. transfection 후 24-30 h, 셀 표현 NR1 GFP 그리고 GFP 재조합 단백질 형광 현미경에서 검출 될 수 있습니다. 그림 1A 는 그림 1D GFP를 표현 하는 셀을 표시 하는 동안 NR1 GFP를 표현 하는 호스트 셀의 이미지를 보여 줍니다. 녹색 신호 분석 결과의 품질 컨트롤러로 사용할 수 있습니다: 셀의 약 30%는 형광 현미경에서 녹색 신호를 했다. 그림 1A</s...

우리는 ectopically NMDA 수용 체에 대 한 자가 면역 뇌염으로 의심 되는 환자의 혈액에서 검출 하는 항으로 인간 배아 세포 (HEK293)에서 녹색 형광 단백질 태그로 NMDA 수용 체의 NR1 소 단위를 표현. 이 간단한 방법 임상 설정에서 심사 적합 있을 수 있습니다.

Autoantibody N-메 틸-D-Aspartate (NMDA) 수용 체에 대 한 혈액에서 검출 하는 간단한 세포 기반 면역 형광 분석 결과

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

이 분석의 전반적인 목표는 자가면역 뇌염이 의심되는 환자의 혈액에서 NMDA 수용체에 대한 자가항체를 검출하는 것입니다. 이 측정은 급성 신경-정신과적 증상이 있는 환자의 감별 진단에서 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 간단하고 신뢰할 수 있는 선별 방법이라는 것입니다.젤라틴으로 코팅된 배양 플레이트를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 200마이크로리터의 2% 젤라틴 용액을 48웰 배양 플레이트의 각 웰에 분취하고 플레이트를 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양합니다. 30분 후 웰에서 젤라틴 용액을 흡입합니다.10%FBS를 함유한 200마이크로리터의 세포 배양 배지에 4번째 HEK293 세포를 5배 10회 파종합니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소가 공급되는 플레이트를 밤새 배양합니다. 다음 날, 각 웰에서 사용한 배양 배지를 10% FBS를 함유한 200마이크로리터의 신선한 배양 배지로 교체합니다.실험에서 well의 총 수에 따라 확장, NR1-GFP 플라스미드를 배양 배지와 혼합하여 용액 A를 준비합니다. transfection 시약을 배양 배지와 혼합하여 용액 B를 준비합니다. 용액 A와 용액 B를 혼합하고 혼합물을 실온에서 20-30분 동안 배양하여 용액 C를 준비합니다.다음으로, 40마이크로리터의 용액 C를 HEK293 셀을 포함하는 각 웰에 분취합니다. 플레이트를 부드럽게 휘젓고 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 밤새 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 세포 기반 면역형광 분석을 진행하기 전에 40배에서 200배 배율로 형광 현미경으로 숙주 세포에서 NR1-GFP 재조합 단백질의 발현을 확인합니다.이 분석을 시작하려면 먼저 배양 플레이트의 웰에서 사용한 배지를 흡입한 다음 200마이크로리터의 PBS로 각 웰을 세 번 세척합니다. 각 웰에 200마이크로리터의 4%파라포름알데히드 용액을 추가하고 플레이트를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 우물에서 파라포름알데히드 용액을 흡인하고 각 우물을 200마이크로리터의 PBS로 세 번 세척합니다.다음으로, PBST 용액에 10% 탈지유 200마이크로리터를 각 웰에 넣고 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 실온에서 플레이트를 배양합니다. 우물에서 PBST 용액에 10% 탈지유를 흡입하고 200마이크로리터의 PBST로 우물을 한 번 세척합니다. PBST에서 1에서 100까지 희석된 혈장을 1차 항체로 웰을 배양하고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.1시간 후 웰에서 희석된 플라즈마를 흡입하고 200마이크로리터의 PBST로 각 웰을 세 번 세척합니다. 각 웰에 Alexa Fluor 594와 결합된 염소 항인간 IgG 200마이크로리터를 추가하고 배양 플레이트를 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 다음으로, Alexa Fluor 594 용액과 접합된 염소 항인간 IgG를 흡인하고 200마이크로리터의 PBST로 각 웰을 3회 세척합니다.세 번째 PBST 세척 후 DAPI가 함유된 글리세롤 용액 100마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 각 염료에 맞는 필터와 4배, 10배 및 20배 대물렌즈가 있는 10배 접안렌즈를 사용하여 형광 현미경으로 세포를 관찰하고 이미지화합니다. transfection 후 24-30시간 후에 촬영된 이러한 대표적인 이미지는 NR1-GFP를 발현하는 HEK293 세포를 보여줍니다.세포의 약 30%가 형광 현미경에서 녹색 신호를 보였습니다. 해당 Alexa Fluor 594 이미지에서 패널 B의 빨간색 신호는 HEK293 세포에서 발현된 NR1에 대한 항-NMDA 수용체 자가항체의 결합을 나타냅니다. 패널 E의 약한 빨간색 신호는 Alexa Fluor 594 이미지의 배경 잡음을 나타냅니다.NR1-GFP를 발현하는 세포는 인간 혈장 샘플에서 항-NMDA 수용체 자가항체의 존재를 스크리닝하는 데 사용되었습니다. 이러한 병합된 이미지에서 노란색은 NR1-GFP 및 항-NMDA 수용체 자가항체의 공동 국소화를 나타냅니다. 화살표는 두드러진 공동 국소화(colocalization)가 있는 세포의 예를 나타냅니다.이 경우 녹색 신호와 빨간색 신호가 30% 이상 겹치는 것을 보여주는 플라즈마 샘플은 양수로 해석됩니다. 음성 대조군의 병합된 이미지에는 녹색과 빨간색 신호가 거의 겹치지 않으며, 이는 분석에서 항-NMDA 수용체 자가항체가 NR1-GFP에 특이적으로 결합하는 것을 확인합니다. 일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다.이 기술을 시도하는 동안 이것이 선별 조치일 뿐이라는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 절차에 따라 웨스턴 블롯 분석 및 조직 기반 분석과 같은 다른 조치를 수행하여 양성 사례의 특이성과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 정신 의학 분야의 연구자들이 급성 정신 건강 응급 상황 환자의 감별 진단을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.이 동영상을 시청한 후에는 혈액 내 NMDA 수용체에 대한 자가항체를 스크리닝하기 위해 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

a-simple-cell-based-immunofluorescence-assay-to-detect-autoantibody

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 쥐 해마 신경 세포 배양을 사용하여 샘플에서 특정 항원에 대한 항체를 식별하는 기술을 보여줍니다. N-Methyl-D-aspartate receptor(NMDAR)를 표적으로 하는 자가항체가 포함된 환자 샘플에 배양된 뉴런을 노출시킴으로써, 면역염색을 통해 뉴런 표면에 결합된 자가항체의 존재를 밝힙니다.

해마 신경 배양을 이용한 인간 혈청에서 자가항체를 검출하기 위한 분석

최근 몇 년 동안, 살아있는 세포 기반 분석은 표면과 형태 적 항원에 대한 항체를 검출하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 여기서, 우리는 많은 환자 코호트의 분석을 가능 계측법 높은 처리량의 흐름을 사용하는 방법을 설명한다. 새로운 항체의 검출은 면역 매개 질환의 진단과 치료를 향상시킬 것입니다.

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

여기에서는 인간과 생쥐의 혈청 IgG 및 IgM 자가항체를 동시에 검출하는 데 사용할 수 있는 맞춤형 항원 마이크로어레이를 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 어레이를 통해 관심 항원 또는 항원결정기에 대한 항체를 고처리량 및 정량적으로 검출할 수 있습니다.

의 IgG 및 IgM의자가 항체의 동시 검출을위한 2 색 항원 마이크로 어레이의 생성

DFS70 자가 기존의 형 간염-2 기질을 사용 하는 경우 정확한 해석을 도전 만드는 일반적인 반핵 항 체 질병 관련 된 패턴을 모방. 프로토콜에서는 기존의 형 간염-2 검사 및 monospecific 및 혼합된 아나 긍정적인 경우에 높은 신뢰와 DFS70 패턴을 구별 아나 소설 조작된 형 간염 2 기판의 이점을 설명 합니다.

Monospecific 및 소설 형 간염-2 엘리트/DFS70 녹아웃 기판으로 아나 심사 중 혼합된 DFS70 패턴의 동시 구별

이 프로토콜의 목표는 더 큰 규모에 NMDA 수용 체 (NMDAR)의 연구를 촉진 하기 위하여 작은 분자의 modulatory 효력의 검사 및 치료 응용 프로그램입니다.

글리신/D-떠들고와 조미료에 감도와 NMDA 수용 체를 공부 하는 높은 처리량 칼슘-플럭스 분석 결과

세포 기반 분석 결과 세럼 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 g.를 검출 하기 위하여 널리 사용 방법은 이 메서드는 임상 진단 및 neuromyelitis 광학 스펙트럼 장애의 과학적 연구에 적용할 수 있습니다.

세포 기반 분석 결과 의해 인간의 혈 청 안티-aquaporin-4 면역 글로불린 G 검출

7개의 자가항체 분석을 함께 결합하는 간단한 멀티플렉스 ECL 분석을 모델링합니다. 이 분석은 체강 질병,자가 면역 갑상선 질환 및자가 면역 다선 증후군 1을 포함하여 T1D 및 여러 다른자가 면역 질환을 동시에 스크리닝 할 수 있습니다.

고처리량 전기화학발광 7-Plex 분석으로 제1형 당뇨병 및 다발성 자가면역질환 동시 스크리닝

자가 면역 뇌염은 중추 신경계의 항체 매개 질환의 새로운 범주입니다. 해마 뉴런은 이러한 항체를 발견하고 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 논문은 환자의 혈청 및 뇌척수액에서 자가항체를 결정하기 위한 일차 세포 배양 및 면역염색을 위한 프로토콜을 제공한다.

자가면역뇌염과 관련된 새로운 병원성 항체를 검출하고 연구하기 위한 해마 신경 배양

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)의 동물 모델로, 인간 질병과 강력한 체액성 자가면역 반응을 공유합니다. 여기에서는 EAE 면역 마우스의 혈청에서 자가항체를 정량화하기 위한 간단하고 유연한 ELISA 프로토콜을 보고합니다.

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice on Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (실험적 자가면역 뇌척수염 시 마우스의 자가반응성 항체 정량화)

우리는 항-MDA5를 검출하기 위한 단계별 면역세포화학(ICC) 방법론을 제공합니다. 이 접근법에는 세포 고정, 투과화, 항체 배양 및 이미징 기술이 포함되며, 이를 통해 항-MDA5 자가항체를 정확하게 검출할 수 있어 근염 환자에서 빠르게 진행되는 간질성 폐질환의 진단에 도움이 됩니다.

HeLa 세포를 이용한 항-MDA5 자가항체 검출 및 광학 현미경을 이용한 면역세포화학(Immunocytochemistry)

우리는 cell-free 합성 생물학의 원리와 인간 및 동물 혈청에서 항체 반응의 맞춤형 검출을 위한 dot-blot 기술을 기반으로 최근에 개발된 면역분석 플랫폼에 대해 설명합니다.

Cell-free Dot Blot은 인간 및 동물 혈청에서 항체 반응을 검출하기 위한 실용적이고 적응 가능한 면역분석 플랫폼입니다.

배우세요 NMDA 수용체 자가항체를 검출하는 세포 기반 면역형광 분석법을 HEK293 세포를 이용하여. 이 방법은 자가면역 뇌염 환자의 조기 진단에 활용될 수 있습니다.

Autoantibody N-메 틸-D-Aspartate (NMDA) 수용 체에 대 한 혈액에서 검출 하는 간단한 세포 기반 면역 형광 분석 결과

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