Autoantibody N-메 틸-D-Aspartate (NMDA) 수용 체에 대 한 혈액에서 검출 하는 간단한 세포 기반 면역 형광 분석 결과

이 분석의 전반적인 목표는 자가면역 뇌염이 의심되는 환자의 혈액에서 NMDA 수용체에 대한 자가항체를 검출하는 것입니다. 이 측정은 급성 신경-정신과적 증상이 있는 환자의 감별 진단에서 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 간단하고 신뢰할 수 있는 선별 방법이라는 것입니다.

젤라틴으로 코팅된 배양 플레이트를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 200마이크로리터의 2% 젤라틴 용액을 48웰 배양 플레이트의 각 웰에 분취하고 플레이트를 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양합니다. 30분 후 웰에서 젤라틴 용액을 흡입합니다.

10%FBS를 함유한 200마이크로리터의 세포 배양 배지에 4번째 HEK293 세포를 5배 10회 파종합니다. 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소가 공급되는 플레이트를 밤새 배양합니다. 다음 날, 각 웰에서 사용한 배양 배지를 10% FBS를 함유한 200마이크로리터의 신선한 배양 배지로 교체합니다.

실험에서 well의 총 수에 따라 확장, NR1-GFP 플라스미드를 배양 배지와 혼합하여 용액 A를 준비합니다. transfection 시약을 배양 배지와 혼합하여 용액 B를 준비합니다. 용액 A와 용액 B를 혼합하고 혼합물을 실온에서 20-30분 동안 배양하여 용액 C를 준비합니다.

다음으로, 40마이크로리터의 용액 C를 HEK293 셀을 포함하는 각 웰에 분취합니다. 플레이트를 부드럽게 휘젓고 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 밤새 5%의 이산화탄소를 배양합니다. 세포 기반 면역형광 분석을 진행하기 전에 40배에서 200배 배율로 형광 현미경으로 숙주 세포에서 NR1-GFP 재조합 단백질의 발현을 확인합니다.

이 분석을 시작하려면 먼저 배양 플레이트의 웰에서 사용한 배지를 흡입한 다음 200마이크로리터의 PBS로 각 웰을 세 번 세척합니다. 각 웰에 200마이크로리터의 4%파라포름알데히드 용액을 추가하고 플레이트를 실온에서 15분 동안 배양합니다. 우물에서 파라포름알데히드 용액을 흡인하고 각 우물을 200마이크로리터의 PBS로 세 번 세척합니다.

다음으로, PBST 용액에 10% 탈지유 200마이크로리터를 각 웰에 넣고 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 실온에서 플레이트를 배양합니다. 우물에서 PBST 용액에 10% 탈지유를 흡입하고 200마이크로리터의 PBST로 우물을 한 번 세척합니다. PBST에서 1에서 100까지 희석된 혈장을 1차 항체로 웰을 배양하고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 줍니다.

1시간 후 웰에서 희석된 플라즈마를 흡입하고 200마이크로리터의 PBST로 각 웰을 세 번 세척합니다. 각 웰에 Alexa Fluor 594와 결합된 염소 항인간 IgG 200마이크로리터를 추가하고 배양 플레이트를 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 다음으로, Alexa Fluor 594 용액과 접합된 염소 항인간 IgG를 흡인하고 200마이크로리터의 PBST로 각 웰을 3회 세척합니다.

세 번째 PBST 세척 후 DAPI가 함유된 글리세롤 용액 100마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 각 염료에 맞는 필터와 4배, 10배 및 20배 대물렌즈가 있는 10배 접안렌즈를 사용하여 형광 현미경으로 세포를 관찰하고 이미지화합니다. transfection 후 24-30시간 후에 촬영된 이러한 대표적인 이미지는 NR1-GFP를 발현하는 HEK293 세포를 보여줍니다.

세포의 약 30%가 형광 현미경에서 녹색 신호를 보였습니다. 해당 Alexa Fluor 594 이미지에서 패널 B의 빨간색 신호는 HEK293 세포에서 발현된 NR1에 대한 항-NMDA 수용체 자가항체의 결합을 나타냅니다. 패널 E의 약한 빨간색 신호는 Alexa Fluor 594 이미지의 배경 잡음을 나타냅니다.

NR1-GFP를 발현하는 세포는 인간 혈장 샘플에서 항-NMDA 수용체 자가항체의 존재를 스크리닝하는 데 사용되었습니다. 이러한 병합된 이미지에서 노란색은 NR1-GFP 및 항-NMDA 수용체 자가항체의 공동 국소화를 나타냅니다. 화살표는 두드러진 공동 국소화(colocalization)가 있는 세포의 예를 나타냅니다.

이 경우 녹색 신호와 빨간색 신호가 30% 이상 겹치는 것을 보여주는 플라즈마 샘플은 양수로 해석됩니다. 음성 대조군의 병합된 이미지에는 녹색과 빨간색 신호가 거의 겹치지 않으며, 이는 분석에서 항-NMDA 수용체 자가항체가 NR1-GFP에 특이적으로 결합하는 것을 확인합니다. 일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 기술을 시도하는 동안 이것이 선별 조치일 뿐이라는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 절차에 따라 웨스턴 블롯 분석 및 조직 기반 분석과 같은 다른 조치를 수행하여 양성 사례의 특이성과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 정신 의학 분야의 연구자들이 급성 정신 건강 응급 상황 환자의 감별 진단을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 혈액 내 NMDA 수용체에 대한 자가항체를 스크리닝하기 위해 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.