유방암에서 HER2 유전자 증폭의이 질을 평가 하기 위해 높은 처리량 검열 플랫폼을 구축

이 실험실 절차의 전반적인 목표는 고처리량 은 제자리 혼성화를 통해 이질적으로 처리된 대규모 유방암에서 HER2 종양 내 유전적 이질성을 동시에 정의, 정량화 및 비교하는 것입니다. 이 방법은 주요 유방암 번역 및 HER2 유전자 증폭 이질성 연구, 병리학 아카이브에서 검색된 대규모 사례 코호트와 같은 연구를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다발성 및 이질적으로 처리된 유방암의 다양한 지형 영역에서 고처리량 HER2 분열분석을 가능하게 한다는 것입니다.

일반적으로 현장 혼성화를 처음 접하는 개인은 후향적 연구가 일반적으로 다른 고정, 처리 및 보관 절차를 거친 보관 샘플의 분석을 요구하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 2003년 이후 기관 데이터베이스에서 모든 유방암을 재분류하기로 결정했을 때 처음 떠올랐습니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 기술자인 Giulia Ercoli가 될 것입니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 환자 및 조직 표본을 선택하여 이 프로토콜을 시작합니다. 새 스프레드시트 파일을 만들고 열어 각 사례의 고유한 영역에 대한 레코드를 통합합니다. 사례 ID, 블록 ID, 영역 ID, 조직 유형, 지형, 형태, 바이오마커 상태 및 사용 가능한 기타 모든 면역조직화학적 특징에 대한 별도의 열을 포함합니다.

TMA 프로젝트를 만듭니다. 파일, 새로 만들기, 블록으로 이동하여 PMA 수신자 블록을 정의합니다. 채울 첫 번째 필드를 클릭하고 파라핀 블록의 치수를 입력합니다.

다음으로 파일, 새로운, 조직 배열로 이동하여 조직 배열 프로젝트를 만듭니다. 가져오기 아이콘을 클릭한 다음 이전에 만든 수신자 블록의 템플릿 파일을 선택합니다. 다음을 클릭합니다.

그런 다음 둥근 버튼을 클릭하여 스폿 크기로 1mm를 선택합니다. 인접 스폿의 두 중심 사이의 공간인 스폿 간격으로 500미크론을 선택합니다. 그런 다음 계산기 아이콘을 클릭하여 생성된 총 스폿 수(231)를 계산합니다.

그런 다음 define 버튼을 클릭하여 그리드와 하위 그리드를 만듭니다. 8열과 15열, 그리고 중심선을 삭제합니다. 방향을 위해 라인 1의 세 지점을 유지합니다.

최종 지도에는 총 183개의 지점이 포함되어야 합니다. 조직 유형 목록(file, new, list of tissue types)으로 이동하여 조직 유형 목록을 정의합니다. 그런 다음 파일, 새로운, 부스터 프로젝트로 이동하여 프로젝트를 정의합니다.

다음으로 수용자 블록을 준비합니다. 세척된 금속 주형을 섭씨 65도의 탄성화된 파라핀으로 채웁니다. 파라핀 블록을 금속 주형 내부의 필름 온도에서 밤새 식히십시오.

다음 날, 금속 주형에서 파라핀 블록을 추출합니다. 먼저 arrayer를 켠 다음 arrayer 캐러셀에 accepter 블록을 삽입하여 자동 또는 반자동 arrayer를 사용하여 TMA를 구성합니다. 화살표 키를 사용하여 레이저 광을 이동하고 수신자 블록의 파라핀에 있는 왼쪽 상단 가장자리에 정렬하여 각 수신자 블록의 시작 위치를 정의합니다.

다음을 클릭하고 수직 정렬에 대해 반복합니다. 다음을 다시 클릭하면 수신자 블록의 이전에 정의된 좌표에 자동으로 구멍이 만들어집니다. 펀치를 비우십시오.

샘플링을 위해 기증자 블록을 배치하고 이전에 주석이 달린 관심 영역에서 조직 코어를 제거합니다. 기증자 조직 코어를 수용자 블록의 구멍에 삽입합니다. 그런 다음 어레이에서 도너 블록을 제거합니다.

TMA가 완료될 때까지 이 단계를 반복합니다. 새로 생성된 TMA 블록의 조직 면을 멸균 블랭크 슬라이드에 놓고 섭씨 45도의 실험실 오븐에 5분 동안 넣습니다. 슬라이드의 블록을 5초 동안 부드럽게 눌러 조직 코어를 평평하게 만듭니다.

총 두 번 한 번 반복합니다. 다음으로 TMA 조직 표면을 섭씨 65도에서 탄성화된 파라핀의 얇은 층으로 덮습니다. TMA 블록을 실온에서 2시간 동안 그대로 둡니다.

마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 조직화학 및 면역조직화학 분석을 수행하기 전에 24시간 동안 섭씨 4도에서 TMA 블록을 전송합니다. TMA 슬라이드를 배치하여 섭씨 60도에서 10분 동안 분석합니다. 그런 다음 면역염색기 기기와 소프트웨어를 시작합니다.

홈 보기에서 protocols 버튼을 클릭한 다음 create/edit protocols를 클릭합니다. 이중 ISH 칵테일 절차를 선택하여 기본 템플릿을 수정합니다. 상자 목록에서 베이킹에 플래그를 지정하고 온도를 섭씨 63도로 20분 동안 설정합니다.

그런 다음 탈파라핀화를 표시합니다. 다음 플래그 : 상자 목록의 셀 조절. 그런 다음 셀 컨디셔닝 CC2에 플래그를 지정하고 온도를 섭씨 86도로 설정하고 배양 시간을 4분으로 설정합니다.

경증 CC2는 8분, 표준은 12분, 연장은 8분으로 표시합니다. 상자 목록에서 ISH-Protease 3에 플래그를 지정하고 배양 시간을 16분으로 설정합니다. 프로브의 HER2 디니트로페닐 및 염색체 17 디곡시게닌을 선택합니다.

16분 동안 배양한 다음 섭씨 80도에서 20분 동안 변성을 설정합니다. 프로브의 배양 시간을 6시간으로 설정합니다. 그런 다음 SISH multimer 배양 시간을 32분으로 설정합니다.

실버 크로메이트와 배양 시간을 4분으로 설정합니다. 다음으로 빨간색 멀타이머 배양 시간을 24분으로 설정합니다. 빨간색 크롬산염과 배양 시간을 8분으로 설정합니다.

그런 다음 상자 목록에서 counterstaining을 표시하고 hematoxylin two를 선택한 다음 배양 시간을 8분으로 설정합니다. 상자 목록에서 포스트 counterstaining에 플래그를 지정하고 bluing 시약을 선택하고 배양 시간을 4분으로 설정합니다. 마지막으로 HER2에 대한 분열분석을 수행합니다.

HER2 염색체 계수 프로브 17 비율이 2.0 이상이고 평균 HER2 복제 수가 세포당 4.0 신호 이상인 경우 HER2 유전자 증폭을 양성으로 평가합니다. HER2 염색체 계수 프로브 17 비율이 2.0 미만이고 평균 HER2 복제 수가 세포당 4.0 신호 미만인 경우 음성으로 평가합니다. 여기에 표시된 것은 HER2 이질성 유방암의 은 제자리 혼성화 분석을 보여주는 대표적인 현미경 사진입니다.

이 패러다임 예에서, 특별한 유형이 없는 고급 침습성 유방암의 두 가지 뚜렷한 영역은 빨간색 점으로 시각화된 중심체 계수 프로브 17과 비교하여 검은색 점으로 시각화된 HER2 유전자 증폭 측면에서 다른 결과를 보여줍니다. 특히, 종양 코어에 속하고 사이토케라틴 7개의 불규칙 염색 패턴을 보이는 한 영역은 HER2가 증폭된 반면, 침습성 정면의 한 지점은 야생형 HER2 패턴을 나타냈습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 여러 이질적으로 처리된 유방암을 통합한 조직 표시 배열에 대해 읽을 수 있는 분열 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 마스터하면 케이스 선택 후 영업일 기준 2일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 방법은 유방암에 최적화되어 있지만, 위암과 같이 HER2 이질성이 결정적으로 중요한 다른 유형의 암에도 적용될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 HER2의 간단한 평가로 확장되는데, 이는 더 큰 일련의 유방암에서 여러 지형 영역의 포괄적인 매핑을 위해 설계되었기 때문입니다.

이 절차를 수행하는 동안 TMA 블록에 균열이 생기지 않도록 하는 것이 중요합니다. 파라핀의 균열이 최소한으로 있어도 in situ hybridization의 품질, 재현성 및 전반적인 투명도를 추론할 수 있습니다. 이 절차에 따라, MALDI 질량 분석 이미징은 특히 종양 내 및 종양 간 이질성 측면에서 유방암의 단백질체학에 대한 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다.

TMA 펀치와 뜨거운 파라핀 왁스로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 일회용 니트릴 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.