Name: 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 Intramyocardial 주입 및 큰 전 임상 모델에서 셀 배달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 24 s
Description: 배우세요 경피적 심장 초음파 유도 심근 내 주사법으로 토끼 심근에 세포를 정확히 전달하는 방법을. 이 기술은 심장 재생 의학 연구에 필수적인 전임상 모델에서 신규 치료법을 안전하게 테스트하는 데 활용됩니다.

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저자는 EGFP(+) HEK 293 세포를 제공 하기 위한 데이터와 카를로스 부에 노의 수집 하는 동안 제공 하는 우수한 지원 쉴라 Monfort, 브렌다 마르티네스, 카를로스 Micó, 알베르토 Muñoz와 마누엘 몰리 나 감사. 이 작품은 부분적으로 지원 되었다: Fundación Séneca, Agencia 데 많은 y 과학, Región 드 무르시아, 스페인 (JT) (번호 부여: 11935/파이/09); 레드 드 Terapia Celular, ISCIII-서브 성배입니다. Redes, VI PN 데 나 + D + 2008-2011 (no를 부여 합니다. RD12/0019/0001) (JMM), 공동 구조의 유럽 연합 (페더) (JMM); 자금 융자 그리고, 독서 대학, 영국 (AG, GB) (중앙 자금). Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

여기에 설명 된 실험 대학 무르시아, 스페인의 윤리 연구 위원회에 의해 승인 했다 고 유럽 연합 지침 2010/63/유럽 위원회의에 따라 수행 했다. 설명 하는 단계는 작업의 계획의 일부를 전적으로이 종이 동반 비디오 촬영을 위해 수행 되지 표준 작동 프로토콜에서 수행 했다.
1. 셀과 포유류 표정 벡터의 준비
참고: 여기, 우리가 간략하게 설명 준비 및 셀 선 (인간 미 발달 신장 293 (HEK 293));의 transfection에 대 한 프로토콜 그러나, 적절 한 셀의 셀 유형에 대 한 특정 프로토콜 최적화 (예를 들어, 줄기 세포) 이어야 한다.
<ol><li>높은 포도 당 Dulbecco HEK 293 세포는이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 1% 나트륨 pyruvate, 2mm 글루타민, 1% 페니실린/스, 보충 하 고 5%를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 incubated 수정의 유지 CO2 . 일단 셀 하위 confluent 1: 3의 비율로 분할.</li>
	<li>분할 셀 미디어, 발음와 살 균 성 세척 한 번는 식 염 수 (PBS)을 버퍼링 시작 하 고 초과 PBS를 제거 한 다음 트립 신-Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (5 분, 37 ° C) x 0.5 2.5 mL와 함께 품 어.<ol>
<li>DMEM 미디어 (위에서 설명한 대로 보충)의 한 볼륨 추가 반응을, 중지 하 고 다음 천천히 그리고 부드럽게 위아래로 전자 피 펫으로 발음 하 여 세포를 분리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음, 적절 한 컨테이너 (예를 들어, 15-50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브)에 세포 현 탁 액을 전송. Centrifuge 스윙 양동이 (100 x g)에 상쾌한 삭제 하 고, 두 번 살 균 PBS 가진 펠 릿을 세척.</li>
	<li>신선한 문화 플라스 크 또는 로컬 실험실 관행에 따라 큰 요리에 신선한 DMEM 미디어 및 적절 한 셀 밀도 (예를 들어, 75 cm2 플라스 크에 1 x 106 셀)에 씨앗에 펠 렛을 resuspend.<ol>
<li>2 일 마다 신선한 미디어와 기존 미디어를 교체 합니다. 참고: 표정 벡터 pIRES1hyg에서 파생 되었고 제조업체의 지침에 따라 앞에서 설명한21사용. p(EGFP) IRES1hyg로 BamHI + 노트를 BamHI로 pEGFP-n 1에서 삽입 + 노트 소화 pIRES1hyg21EGFP cDNA subcloning 의해 생성 된.</li>
	</ol>
</li>
	<li>transfection, 전에 1 일 0.5 x 12 또는 24 잘 조직 배양 배지에서 105 셀/c m2 의 조밀도에 씨 HEK 293 세포.</li>
	<li>Transfection 당일 별도 1.5 mL microcentrifuge 관 (1 관/잘)에서 DNA 지질 transfection 시 약 단지를 준비 합니다.<ol>
<li>각 튜브에 감소 된 혈 청 매체의 250 µ L을 추가 하 여 시작 하 고 다음 4 µ g의 DNA를 추가 (부드럽게 혼합).</li>
		<li>그 후, 각 관에 10 µ L 지질 transfection 시 약의 이전 준비 믹스 및 감소 된 혈 청 매체의 250 µ L에서 250 µ L을 추가 (다시 부드럽게 혼합).</li>
		<li>마지막으로, transfections, DNA 지질 transfection 시 단지 4 h, HEK 293 세포를 배양 하 여 진행 DMEM 매체 보충 (단계 1.1), 위에서 설명한 대로 대체 하 고 또 다른 48 h. 안정적인 수행 약물 선택에 대 한 품 어 100 µ g/mL hygromycin B.와 transfectants</li>
	</ol>
</li>
	<li>트립 신 (1.2 단계) 위에서 설명한 대로 HEK 293 세포를 분리 합니다. 씻은 후 멸 균 PBS에 셀, 마지막 셀 5 x 106/mL의 농도 달성 하기 위해 (예를 들어, 10 %v / v PBS에 InI), 적절 한 차량에 resuspend.</li>
</ol>2입니다. 토끼의 준비
참고: 최적의 형태 및 동물의 심장의 기능을 평가 하는 IMI에 대 한 토끼와 변환기의 위치. 따라서, 그것은 실험 설계에 의해 정의 된 대로 완전 한 echocardiographic 시험20 IMI (아래 참조), 이전 및 이후의 시간 지점에서 수행 하는 것이 좋습니다. 이것은 특성을 평가 하는 기준 해 부와 기능적인 동물에서 심장의 주사를 받게 되며 또한 심장의 기능에 IMI의 효과 평가 하고자 합니다.
<ol><li>심장 혈관 이미징에 대 한 멀게 패션에서 고 수의 내과 및 심장 초음파/유럽 협회의 미국 사회의 미국 대학 심장 초음파 위원회의 지침에 따라이 검사를 수행 22 , 23 , 24.</li>
	<li>전체 echocardiographic 연구를 통해 동시 1-리드 심전도 (ECG) 추적을 가져옵니다.</li>
	<li>마 취 제와 함께 토끼를 anesthetize 10 mg/kg, medetomidine 200 µ g/k g, 근육 (인스턴트 메신저) 주사와 함께.</li>
	<li>마 취의 관리에 따라 10-20 분 후 마 취의 수준을 확인 합니다.</li>
	<li>널리 가슴 머리를 제거 하는 머리 깎기를 사용 하 여 (예를 들어, 하위 xiphoid 지역 목 아래) (그림 1A).</li>
	<li>오른쪽 forelimb (mediocubital 지역)의 두 뒷 다리 사지 (mediotibial 지역)의 내부 얼굴에 1-2 cm2 의 추가 영역을 면도 (그림 1B).</li>
	<li>접착제 ECG 전극 동기적 과정 (그림 1C) 심장 박동을 모니터링 하는 사지의 면도 영역에 배치 합니다.</li>
	<li>(그림 1C) 테이블에 연결 된 외과 테이프를 사용 하 여 뻗은 팔 다리와 동물 열 담요에 부정사 decubitus 위치에 놓습니다.<ol>
<li>귀는 근육이 수축 거꾸로 뒤는 머리/토끼, 그리고 있기 때문에이 절차를 통해 동물의 흉부의 정확한 위치를 유지 하는 데 도움이 그것의 앞 발 보다 낮은 위치에서 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동물 얼굴 마스크 전체 절차 (100%, 2-3 L/min)에 걸쳐 산소를 관리 하는 동안 자연스럽 게 호흡을 허용 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig1.jpg"> 그림 1입니다. IMI는 토끼의 준비. (A) 흉부;에서 헤어 클립 (B) 사지;에서 헤어 클립 (C) 전극을 연결 하 고 열 담요에 뻗은 다리는 토끼를 위치. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
3. 경 피 적인 대비 IMI 심장 초음파 기반 기술 토끼에
<ol><li>청소 하 고 소독 액체를 기반 솔루션으로 흉부의 피부.<ol>
<li>전체 절차를 통해 무 균 기술을 사용 하 여 현재 모범 사례에 따라.</li>
		<li>가능 하다 면, 그리고 합리적으로 가능한 경우, 포함 하 되이 제한 되지 않음, 가운, 장갑, 외과 상처 커튼, 살 균 초음파로는 테이블에 대 한 자료를 드레싱 살 균 살 균 소재를 사용 하 여 완전히 멸 균 절차 수행 트랜스듀서 커버 및 살 균 초음파 젤. 이 최소 수신 IMI, 동물 병원 균 도입의 위험을 줄일 것 이다 이며 임상 설정 (예를 들어, 심장 찔린 동안)에 표준 연습. 참고: 그것은 항상 로컬 기관에 적용 가능한 동물 연구의 지역 및 국가 규정 및 국가 연습 진행을 권장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가슴 및 변환기, 그리고 실험의 목 변환기 코드 초음파 전송 젤을 적용, 종종 해부학을 시각화 하 고 있는 IMI에 대 한 계획에 도움이 되는 동물의 심장의 빠른 창 스캔 합니다.</li>
	<li>4회-6번째 있는 공간, 2-3 cm는 부각의 각으로 오른쪽 parasternal 라인에서 변환기를 수동으로 배치 ~ 흉 벽 (그림 2A)의 오른쪽에 관하여 90 °.</li>
	<li>있는 공간으로 그것의 anteroposterior 및 젖꼭지 근육의 수준에서 수정 된 짧은 축 보기를 최적화 하기 위해 dorsoventral 각도 변환기의 위치를 조정 합니다. 오른쪽 심 실 (RV), 좌 심 실 (LV), interventricular 심장 (IVS), 후부 벽 (비밀 번호), 뿐만 아니라 anterolateral (알) 및 (그림 2B) posteromedial (오후) 젖꼭지 근육이이 보기에서 확인 합니다.<ol>
<li>(예를 들어, 버튼, 다이얼) 시스템에 적절 한 컨트롤을 사용 하 여 깊이 크게 증가 하 여 넓은 시야를가지고.</li>
		<li>이 보기, 뿐만 아니라 endocardial 및 epicardial 등고선의 적절 한 차별화에 대칭 이미지를 얻기에 특히 주의 하 고, 필요한 경우 이미지 최적화 컨트롤 (예를 들어, 이득)을 통해 조정.</li>
	</ol>
</li>
	<li>일단 최적의 echocardiographic 보기 (그림 2B)을 얻을 두 번째 연산자 IMI (아래 참조)를 수행 하는 동안, 절차의 나머지 부분에 걸쳐이 위치를 유지 합니다.<ol>
<li>변환기를 들고, 하는 동안 은폐 해야 항상 직면 하 고 있을 앞으로, 이후 단계 (그림 2A, C)에 바늘의 정렬 되므로 변환기 방향 표시 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 G 바늘 1 mL 주사기에 연결, 왼쪽된 hemithorax의 피부 근처 바늘 변환기에 관하여 대칭 미러링 위치에 놓습니다. 그런 다음, 수동으로 정렬 바늘의 각도 변환기 방향 마크와 함께 ~ 90 ° (그림 2C), 천천히 바늘을 통해 피부와 흉 강에 진출. 참고:이 위치 및 방향에서 경 피 적인 바늘 삽입을 용이 하 게 초음파 빔 (2D 그림, E)의 비행기에서 바늘의 시각화 되므로 실시간으로 모니터링 하 고, 필요한 경우의 조정 (그림 2 G, H) 심근의 대상 지역 기준으로 바늘의 위치입니다.</li>
	<li>대상 위치에서 팁을 천천히 제공 하는 injectate (최대 사출 사이트 당 0.25 mL) 10-30 s (그림 2E), 치료를 천천히 그리고 부드럽게 주입 심근의 범위를 증가 하는 동안 바늘을 제거 하는 동안 내.<ol>
<li>InI를 사용 하 여 10% (v/v)에 희석 PBS 표준화 기술, 그리고 현장에 추적에 대 한 확인 심근 내의 모든 4 개의 IMI 사이트의 성공적인 대상으로 역량, 또한 취득 하는 동안 심한 병 리와 histopathology (참조 대표 결과)입니다. 역량 달성 되 면 원하는 경우 InI 적당 한 상업적인 초음파 대비 에이전트에 의해 대체 수 있습니다. 참고: 10% (v/v) InI에에서 희석 PBS 또는 셀 없이 과거 hyperechogenicity (즉, 에코 밝은 모양)에서 심근 결과에 주입 (그림 2E, F)의 대상 사이트에서의 배달. 과도 감속 또는 조 숙한 심 실 수축 (예를 들면, 절연 couplets, 세 쌍둥이)와 관련 된 심장 박동의 가속은 epicardium와 바늘의 첫 접촉에서 자주 관찰 된다 뿐만 아니라 동안 또는 IMI 직후. 그러나, 아니 생명을 위협 하는 부정맥, 개발 하 고 심각한 부작용은 거의 IMI 사출 사이트 당 injectate의 최대 0.25 mL (1.25 x 106 셀)를 사용 하 여 관찰 ( 대표 결과 토론을 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>(3 심 실 왼쪽에 무료 벽 (LVFW)와 IVS에서) 4 개의 대상 IMI 사이트의 각각에 0.25 mL의 주입을 완료 하는 데 필요한 바늘의 부각의 각의 미묘한 변화를 수행 합니다.</li>
	<li>경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI 절차를 완료 한 후 (예를 들어, 직렬 ECG 추적 및 24 시간 Holter 심전도 통해), 심장 리듬을 평가 하 고 검사 직렬 창 echocardiographic의 부재를 확인 하 합병증, 동물 완전히 가벼운 주기 룸에 마 취 및 다음 전송에서 복구 될 때까지.<ol>
<li>여기, 우리는 24 h에 대 한 심장 리듬에 InI와 IMI의 효과 모니터링 하는 데 24 시간 Holter ECG 사용 합니다. 이 위해, 우리 정상 표현 형 (일반 그룹)와 6 토끼의 그룹 및 독 소 루비 (cardiotoxic 안트라사이클린 약물, 암;의 처리에 일반적으로 사용의 정 맥 행정을 받은 6 토끼의 그룹 비교 DOX 그룹) 2 mg/kg의 복용량에 / 8 주, 주 다음 두 동료 InI와 IMI를 받았다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56699/56699fig2.jpg"> 그림 2 . 토끼에서 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입. (A)의 각도에서 오른쪽 hemithorax에 변환기의 배치 ~ 90 °. (B) 토끼에 젖꼭지 근육의 수준에서 심장의 parasternal 짧은 축 보기 (PSSX)의 대표 이미지. (C)의 각도에서 바늘의 맞춤 ~ 변환기 방향 표시를 기준으로 90 °. (D) 심장 (참고 바늘 초음파 광속의 평면에 쉽게 시각 이다)의 PSSX 뷰에서 대상 사이트에서 바늘의 위치입니다. (E 와 F) 인도 잉크 (화살촉 강조 과거 hyperechogenicity)와 intramyocardial 주입 시 대상 사이트에서 hyperechogenicity의 데모. (G) LV 챔버에 바늘의 실수로 위치 (화살촉 바늘 샤프트 강조). (H) Repositioning LV 무료 벽에 바늘의 (화살촉 바늘 샤프트 강조). RV를 = 우 심; 라스베가스 = 왼쪽된 심 실; IVS = interventricular 심장; 비밀 번호 = 후부 벽; 알 = anterolateral 젖꼭지 근육; 오후 = posteromedial 젖꼭지 근육. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56699/56699fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
4. 게시물 IMI 분석
<ol><li>토끼에서 심장 조직 샘플의 histopathological 분석을 수행 합니다.<ol>
<li>10% 포름알데히드, 다음과 같이 에탄올 농도 증가 함께 탈수 뒤에 조직 24 h에 대 한 수정: • 1 x 70% (60 분) • 1 x 95 %ethanol/5% 메탄올 (60 분) • 1 x 100% (60 분) • 1 x 100% (90 분) • 1 x 100% (120 분) 참고: 위의 모든 외피는 실 온 (RT)에서 실시 됩니다. 100% 크 실 렌 (1 시간, RT), 두 번 대체 다음, 그리고 마지막으로 두 단계 (60 분, 58 ° C)25에 파라핀에 포함.</li>
		<li>톰25와 4-5 µ m 조직 섹션을 수행 합니다. 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다.</li>
		<li>Masson의 trichrome 방법25,,2627와 hematoxylin에 오신 얼룩이 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조직 섹션에서 이식된 마음에서 immunohistochemistry EGFP(+) HEK 293 세포 (예를 들어, avidin 비타민 b 복합체 복합물 (ABC) 메서드를 사용 하 여), 간단히 검색을 수행.<ol>
<li>드 왁 스 100% 크 실 렌 (10 분, RT)에서 4-5 µ m 두꺼운 심장 섹션. 감소 하는 에탄올 농도 솔루션 (100% (2 분)에 2 배, 2 x 95% (2 분), 70% (2 분)에 1 x; 50% (2 분)에 1 x; 1 x 30% (2 분), 1 x ddH2O (2 분)) 실시간으로 세척 하 여 조직 리하이드레이션</li>
		<li>(준비가 30% H2O2, 고 추가 메탄올의 재고 솔루션의 5 mL와 함께 최대 50 mL의 총 볼륨) 메탄올 (에서 희석 3% H2O2 의 100 µ L로 섹션을 취재 하 여 내 인 성 과산화 효소 억제를 수행 품 어 30 분, RT), 그리고 다음 Tris 버퍼 염 분 (TBS, pH 7.6)와 침수로 세척.</li>
		<li>0.1%의 100 µ L로 섹션을 취재 하 여 효소 처리를 통해 항 원 unmasking 수행 (0.01 g 10 mL TBS에에서 희석 나 준비) 나 (12 분, RT를 품 어), TBS (5 분, RT) 다음 씻어.</li>
		<li>차단 하는 솔루션 (TBS에서 10%에서 정상 염소 혈 청)에서 품 어 (30 분, RT), 슬라이드 당 100 µ L를 사용 하 여 및 TBS (5 분, RT)로 씻어.</li>
		<li>(1 시간, 30 ° C), 1 차적인 항 체 (TBS에서 1: 500)으로 닭 반 녹색 형광 단백질 (GFP)와 incubate 그리고 TBS (5 분, RT)로 씻어.</li>
		<li>(1 시간, 30 ° C), 이차 항 체 biotinylated 염소-안티-닭고기 IgG (TBS에서 1: 250)와 incubate 고 TBS (5 분, RT)와 다음 씻어.</li>
		<li>Avidin 비타민 b 복합체 복합물 (20 분, 30 ° C)와 함께 incubate 및 다음 3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (한 덩어리) (RT, 5-10 분)를 사용 하 여 레이블.</li>
		<li>마지막으로 세척 되며 오신 방법25를 사용 하 여 counterstain 섹션에 RT, 에탄올 농도 (1 x 30% (2 분), 50% (2 분)에 1 x, 70% (2 분)에 1 x; 2 x 95% (2 분), 100% (2 분)에 2 배) 증가 하 여 탈수 하 고 커버 슬라이드를 탑재. 긍정적인, 부정적인 isotype 컨트롤 뿐만 아니라이 포함 됩니다. 참고: 위에서 설명한 간단한 프로토콜은 아닙니다 일반 immunohistochemistry; 관심의 조직에 대 한 최적화는 필요 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

기본 목표는의 사용을 활용 하는 동안 토끼 (대형 크기의 전 임상 동물 모델)17,18, 심근으로 줄기 세포의 배달을 위해 사용 될 수 있는 최소 침 습 기술을 개발 하는 상대적으로 저렴 한 이미징 시스템을 쉽게 사용할 수 많은 임상 연구 센터. 여기, 우리 임상 심장 초음파 시스템을 사용 하 여, 표시 하 고 InI, 추적 기능 제자리에 와 echogenic 속성, 심장 초음파-가이드 성공적인 경 피 적인 대비 널리 사용 가능한 에이전트에 의해 주 었 IMI는 매우 효과적 심장 토끼의 대상 지역에 injectate을 제공 합니다. 우리가 알다시피, 이것은 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI와 셀 배달 토끼18,19등 큰 동물 모델에서의 첫 번째 설명 이다. InI 사용 이전 연구에서 조직<sup...

세포 및 유전자 치료 흥미로운 고도 HFrEF에 부상된 심근 재생/수리에 대 한 전략을 개발. 몇 가지 연구는 지속적으로 intracoronary 또는 정 맥 경로1,2 이상의 IMI의 우수성을 증명 하고있다 셀 배달의 다른 노선의 효과 (예를 들어, 셀 유지 비율)을 비교 , 3 , 4 , 5. 따라서, 그것은 놀라운 부상된 심근의 줄기 세포 치료의 변환 모델에 대 한 연구의 큰 비율 IMI는 오픈 가슴 절차6,7에서에서 직접 보기 아래 수행을 통해 injectate 제공 . 그러나,이 접근 peri 절차 사망률 (자주 아래 보고)8의 위험을 운반 절차의 침략 적인 본질을 포함 한 몇 가지 제한이 있다. 또한, 직접 보기 아래 IMI는 심 실 구멍에 실수로 주입에 대 한 가능성을 제거 하지 않습니다. 임상 연습에서 오픈 가슴 수술 동안 IMI 치료 세포 배달, 예를 들어에 대 한 적절 한 방법이 될 수, 동안 관상동맥 우회 이식 수술 (관상); 그러나,이 방법은 않을 수 있습니다 셀 배달에 대 한 적절 한 비-허 혈 성 근원 (예를 들어, HFrEF 안트라사이클린 유발 심근 (AICM)을 보조)의 글로벌 심근에.
의심의 여지가 그 허 혈 성 심장 질환 (IHD)는 HFrEF의 가장 일반적인 원인입니다 (~ 66%)9,10; 그러나, AICM를 포함 하 여 비-허 혈 성 심근 여전히 영향을 미치는 환자 HFrEF (33%)9 의 상당 비율을 차지 . 실제로, 임상 종양학의 최근 발전 귀착되 유럽, 암 환자12의 향상 된 생존에 대 한 전반적인 트렌드와 비슷한 숫자의 견적 미국 혼자11, 암 10 백만 이상의 생존자 ,13. 따라서, 환자 수가 증가 주어진와 같은 줄기 세포 이식 줄기 세포 전달의 효과적이 고 최소 침 습 루트의 시험 뿐 아니라 비-허 혈 성 심장 근육 병 증에 대 한 최대 중요성은 소설 치료의 혜택을 탐험, cardiotoxicity 보조 항 암 약물에 의해 영향을 받습니다.
노트, 가설 연구 부상된 심근을 자주으로 수리 재생성을 목표로 줄기 세포 치료를 사용 하 여 테스트 (예:마우스, 쥐) 작은 설치류의 사용을 포함. 이러한 모델 종종 일반적으로 일부 연결된 한계 (예를 들면, 반향)14있는 선형 배열 트랜스듀서를 장착 하는 심근 기능의 평가 위한 비싼 높은 주파수 초음파 시스템을 필요로 합니다. 그러나, 토끼, 대표 하는 대형 전 임상 모델을 다른 모델 HFrEF에서 줄기 세포 치료의 가설에 대 한 몇 가지 장점이 있다. 따라서, 쥐 및 쥐, 달리 토끼 유지 Ca+ 2 교통 시스템 및 인간과 기타 큰 동물 (예:개, 돼지)15,16,17의 유사한 세포 생리학 ,,1819. 또 다른 장점은, 심장 초음파 이미징 사용 하 여 상대적으로 저렴 한과 널리 임상 심장 초음파 시스템 상대적으로 높은 주파수 위상 배열 트랜스듀서, 예를 들면, 12mhz와 같은 대 한 그들의 순종은 그 신생아 및 소아 심장에서 자주 사용 됩니다. 이러한 시스템 첨단 기술, 우수한 echocardiographic 이미징 허용 하 고 그들은 고조파 이미징20의 우월의 활용. 또한,에 배달 심장 재생 요법 (예를 들어, 줄기 세포 치료)의 잠재력, 그들의 안전, 효능, cardiomyogenic 잠재력으로 평가 injectate의 운명의 한 번의 광범위 한 가설에 심근, 인간의 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 그리고 그들은 큰 전 임상 동물 모델, 토끼17,19의 사용을 필요로 하기 전에 필수입니다. 여기, 우리는 줄기 세포 이식에 기초를 둔 치료 비-허 혈 성 심근20 대를 겨냥 하는 임상 심장 초음파 시스템을 사용 하 여 경 피 적인 대비-심장 초음파 유도 IMI 통해 셀 배달에 대 한 최소 침 습 기술을 설명합니다 . 우리는 또한 토끼 심장에 injectate의 한 초음파 대비 에이전트와 제자리에서 추적으로 인도 잉크 (InI, 또한으로 알려진 중국 잉크)의 혜택을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>HD11 XE 초음파 시스템</td><td>Philips</td><td>10670267</td><td>심장 초음파 시스템.</td></tr><tr><td>S12-4</td><td>Philips</td><td>B01YgG</td><td>4-12 MHz 위상 배열 트랜스듀서</td></tr><tr><td>초음파 전송 젤 (Aquasone)</td><td>Parket laboratories Inc</td><td>N 01-08</td><td></td></tr><tr><td>Vasovet 24G</td><td>Braun</td><td>REF 381212</td><td>&nbsp; over-the-needle 카테터</td></tr><tr><td>Omnifix-F 1 ml 주사기</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>Imalgene (케타민)</td><td>Merial</td><td>RN 9767</td><td>수의학 처방이 필요합니다</td></tr><tr><td>Domtor (Medetomidine)</td><td>Esteve</td><td>CN 570686.3</td><td>수의학 처방전이 필요합니다</td></tr><tr><td>가열 패드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Faber-Castel TG1</td><td>Faber-Castel</td><td>16 33 99</td><td>인도 (중국) 잉크</td></tr><tr><td>Holter Syneflash</td><td>Ela 의료</td><td>SF0003044S</td><td>24 시간 Holter ECG 시스템.</td></tr><tr><td>전극 블루 센서&reg;</td><td>Ambu (NUMED)</td> <td>VLC-00-S</td><td>홀터 ECG 전극.</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2155</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Olimpus</td><td>CO11</td><td></td></tr><tr><td>ABC Vector Elite</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6200</td><td>Avidin 비오틴 복합체 키트.</td></tr><tr><td>닭 항 GFP 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A10262</td><td>1 차 항체.</td></tr><tr><td>비오틴화 염소-항-닭 IgG 항체</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9010</td><td>2차 항체.</td></tr><tr><td>3,30-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 (DAB)</td><td>DAKO (Agilent)</td><td>S3000</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td>Zeiss AX10 Axioskop</td><td></td></tr><tr><td>Holter ECG</td><td>Elamedical</td><td>Syneflash SF0003044S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 이글 배지(DMEM)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>10% 송아지 태아 혈청(FCS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11573397</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>환원 혈청 배지(Opti-MEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>31985070</tr><tr><td>하이그로마이신 B</td><td>칼바이오켐(MERCK)</td><td>400051</td><td></td></tr><tr><td>크실렌(조직학)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>X3S-4</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 용액(H2O2)</td><td>시그마</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>프로나제</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>53-702-250KU</td><td></td></tr></tbody></table>

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 및 큰 전 임상 모델에서 셀 배달

Percutaneous Contrast Echocardiography-guided Intramyocardial Injection and Cell Delivery in a Large Preclinical Model

세포 및 유전자 치료는 흥분 하 고 심장 마비와의 설정에서 심장 재생을 위해 유망 전략 감소 방출 분수 (HFrEF). 전에 그들은 사용을 위해 고려 하 고 인간에서 구현 수, 광범위 한 임상 연구 필요 큰 동물 모델에서 안전, 효능, 심근에 전달 한 번 injectate (예를들면, 줄기 세포)의 운명을 평가 합니다. 작은 설치류 모델 제공 장점 (예를 들어, 비용 효율성, 유전자 조작에 대 한 순종); 그러나, 이러한 연구 결과 거의 진료소로 변환 이러한 모델의 한계를 감안할 때. 반대로, 토끼, 동물 모델을 큰 장점 (예, 인간 및 다른 큰 동물에 비해 비슷한 심장 전기 생리학), 있다 좋은 비용 효율적인 균형을 유지 하는 동안. 여기는 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 (IMI) 기술, 최소 침 습, 안전 하 고, 잘 용납 하 고 셀을 포함 하 여 injectates의 대상된 배달에 매우 효과적인 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 토끼 모델의 심근 내에서 여러 위치에 이 기술 구현 하기 위한 우리 또한 널리 임상 심장 초음파 시스템의 장점을 촬영 했습니다. 두기 후에 연습에서 여기에 설명 된 프로토콜, 기본 초음파 기술 연구원 실험, 가설의 목적에서 일상적인 사용을 위한이 다양 하 고 최소한 침략 적 기법의 성능에 유능한 될 것 이다는 토끼 모델에서 심장 재생 치료제의 기능. 역량을 달성 하 고, 일단 모든 절차 토끼 anaesthetizing 후 25 분 내에서 수행할 수 있습니다.

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI InI:
위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 고 바늘의 팁의 최적의 위치는 심장 초음파와 시작 하는 주입에 의해 확인 되었다, 일단 과거 hyperechogenicity InI의 전달 중 관찰 되었다 (PBS에 10 %v / v) (그림 2E) 대상 지역 (그림 2F) IMI 뿐만 조금 후에. IMI 안락사 후 바로 심장 제거 때 InI의 심장 (그림 3A)의 외부 검사 시 쉽게 볼 수 있었다. 또한, 심장 조직 섹션, 예를 들어, 짧은 축 부분 (그림 3B), 젖...

심장 재생 의학에 새로운 치료 전략 인 간에 있는 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 전에 큰 전 임상 동물 모델에서 광범위 하 고 상세한 연구를 요구 한다. 여기, 우리는 같은 소설 치료의 효능을 시험 하는 가설에 대 한 귀중 한 토끼, 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 기술을 보여줍니다.

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 Intramyocardial 주입 및 큰 전 임상 모델에서 셀 배달

Cell and gene therapy are exciting and promising strategies for the purpose of cardiac regeneration in the setting of heart failure with reduced ejection ...

이 절차의 전반적인 목표는 토끼 심장의 좌심실 심근에 일정량의 주사를 안전하고 정확하게 전달하는 것입니다. 그리고 이를 위해서는 경피적 조영제 심장초음파(percutaneous contrast cardiography) 안내를 활용해야 합니다. 이것은 먼저 동물을 마취한 다음 절차를 위해 가슴을 준비함으로써 수행됩니다.다음으로, 토끼를 보온 담요에 놓고 ECG 신호가 올바르게 표시되는지 확인한 후 임상 초음파 시스템을 사용하여 적절한 음향 창을 얻고 넓은 시야에서 이미지를 최적화합니다. 그런 다음 적절한 조영제와 혼합된 표시된 세포를 주사기에 넣고 초음파 안내에 따라 바늘을 변환기 반대쪽에 조심스럽게 정렬하고 왼쪽 반흉의 피부에 가깝게 위치시킨 후 바늘이 심근의 목표 영역으로 진행되는 속도를 늦춥니다. 마지막으로, 주사액은 심초음파 영상에서 주사 부위의 경벽 과반향성(transmural hyperechogenicity)에 의해 입증된 바와 같이 안전하게 전달됩니다.궁극적으로, 주사액의 성공적인 전달에 대한 생체 외 확인은 심근 내 염료의 존재에 의해 입증되는 반면, 심근 조직 절편의 단면 면역조직화학 분석은 세포 마커 및 염료가 표적 심근에 성공적으로 전달되는 것을 보여주는 데 사용됩니다. 이 비디오의 목적은 clincal echocardiography 시스템을 사용하여 오늘날의 토끼에서 이 기술을 안전하고 정확하게 수행하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 기계의 최소한의 기본 특성과 조영제 심초음파 유도를 사용하여 주입 대상 부위를 정확하게 시각화할 수 있어 우발적인 챔버 간 전달의 위험을 최소화할 수 있다는 것입니다.심근 주사를 진행하기 전에 케타민과 메데토미딘의 조합을 주사하여 동물을 마취시키는 것으로 시작하십시오. 시연된 바와 같이, 토끼는 머리를 수술용 담요로 덮었을 때 침착함을 유지합니다. 동물이 마취되면 이발기를 사용하여 목 아래에서 시작하여 흉부 피부의 털을 제거한 다음 아흉부 부위로 이동합니다.오른쪽 앞다리 안쪽 면의 1-3cm 영역과 오른쪽 및 왼쪽 뒷다리의 내측 경골 영역을 추가로 면도합니다. 그런 다음 전극에 적절한 전도성 젤을 바르고 팔다리의 면도 부위에 배치합니다. 수술 중 동물을 움직이는 동안 접촉 손실이 발생하지 않도록 수술 테이프로 전극을 고정하십시오.다음으로, 동물을 보온 담요에 눕히고, 시스템 화면에 올바른 ECG 신호가 표시되는지 확인하고, 동물을 욕창 누운 자세로 유지하고, 전체 절차 동안 안면 마스크로 산소를 투여하면서 동물이 자발적으로 숨을 쉴 수 있도록 합니다. 면도한 가슴 피부를 클로르헥시딘 기반 용액으로 철저히 청소하고 소독합니다. 트랜스듀서와의 양호한 피부 접촉을 유지하고 아티팩트를 줄이며 전반적인 이미징 품질을 개선하려면 트랜스듀서에 충분한 양의 초음파 젤을 바르십시오.그런 다음 오른쪽 흉골 선에서 2-3cm 떨어진 4번째에서 6번째 늑간 공간에 변환기를 수동으로 배치하고 흉벽을 기준으로 약 90도의 초음파 빔 입사각으로 배치합니다. 후속 단계에서 바늘과 쉽게 정렬할 수 있도록 변환기 방향 표시가 앞쪽을 향하고 있는지 확인하십시오. 유두 근육 수준에서 심장의 흉골 주위 단축 보기를 얻어야 합니다.그리고 시스템에서 적절한 제어로 깊이를 증가시켜 넓은 시야를 갖는 것이 중요합니다. 필요한 경우, 늑간 공간을 기준으로 변환기의 위치와 전후 및 배복부 각도를 조정하여 이미지를 최적화한 다음 이 보기에서 우심실, RV, 좌심실, LV, 심실 중격, IVS, 후벽, PW, 전방 및 후방 유두 근육을 식별합니다. 이 보기에서 대칭 이미지를 얻고 심내막 및 심외막 뒤틀림을 적절하게 구별하고 필요한 경우 게인 제어와 같은 이미지 최적화 제어를 통해 조정하는 데 특히 주의하십시오.올바른 심초음파를 보면, 두 번째 작업자가 심근 주사를 수행하는 동안 나머지 절차 동안 이 자세를 유지합니다. 이를 위해 바늘이 부착된 사전 로드된 주사기를 사용하여 변환기에 대해 대칭 대칭 위치에서 왼쪽 반흉의 피부 가까이에 배치해야 합니다. 그런 다음 바늘을 변환기 방향 표시에 약 90도 각도로 수동으로 정렬하고 바늘을 피부를 통해 흉강으로 천천히 전진시킵니다.이 위치와 방향에서 경피적 바늘을 삽입하면 초음파 빔 평면에서 바늘을 시각화할 수 있으므로 실시간 모니터링이 가능하고 필요한 경우 여기에 표시된 것처럼 심근의 목표 영역에 대한 바늘 위치를 조정할 수 있습니다. 이 이미지에서 좌심실에 바늘이 있는 것을 주목하십시오. 이것은 바늘을 원하는 위치로 부드럽게 집어넣고 재배치하여 쉽게 재배치할 수 있습니다.팁을 목표 위치에 놓고 20-30초에 걸쳐 천천히 주사액을 투여하면서 바늘을 천천히 부드럽게 집어넣어 심근 치료 범위를 늘립니다. 4개의 심근 주사 부위에서 주사를 완료하기 위해 필요에 따라 바늘의 입사각을 미묘하게 변경합니다. 하나는 뇌실 내 중격에, 3개는 좌심실 자유 벽에 있으며 주사 부위당 250마이크로리터의 주사액을 전달합니다.절차를 완료한 후 동물이 마취에서 완전히 깨어날 때까지 토끼의 양직렬 창 심초음파 스캔과 ECG 추적을 계속 모니터링하여 절차로 인한 부차적인 합병증이 없는지 확인합니다. 24시간 홀터 ECG 모니터링의 사용은 심장 리듬에 대한 심근 주사의 효과를 결정하는 데 도움이 되는 것이 좋습니다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 바늘 끝의 심근 내 위치가 심장 초음파로 확인되고 주입이 시작되면 이 흉골 주위 단축 보기에서 대상 영역에 인도 잉크를 전달하는 동안 흰색 화살촉이 관찰되었습니다.과음파원은 또한 주사 직후에도 관찰되었는데, 이는 심실 중격 흰색 화살촉에서 반향 밝은 이미지를 명확하게 볼 수 있는 심장의 흉골 주위 장축 보기에서 볼 수 있습니다. 심근 주사 직후 안락사가 이루어졌을 때, 이 이미지에서 볼 수 있듯이 심장의 외부 검사에서 인도 잉크의 침전물을 쉽게 볼 수 있었습니다. 검은색 화살촉.마찬가지로, 유두근 수준의 심장 조직 절편에서는 좌심실의 검은색 화살촉의 자유벽에 인도 잉크의 경벽 침전물이 드러났으며, 이는 심근에 주사액이 효율적이고 효과적으로 전달됨을 보여주었습니다. 이 동일한 이미지에서, 인도 잉크의 침전물도 심실 중격에서 볼 수 있었습니다. 흰색 화살표입니다.시술은 일반적으로 내약성이 좋았지만, 시술 중이나 시술 직후 고립된 조기 심실 수축(PVC)과 관련된 심박수의 일시적인 가속 또는 감속이 관찰되는 것은 매우 일반적이었습니다. 실제로, 인디아 잉크로 심근 주사를 맞은 동물을 대상으로 24시간 홀터 ECG로 모니터링한 결과, 부정맥이 매우 흔하며 부정맥의 상대적 빈도가 동물의 기저 생리학적 상태에 영향을 받을 수 있음이 밝혀졌습니다. 이 이미지는 홀터 모니터링 중에 감지된 가장 자주 관찰되는 부정맥인 격리된 PVC의 예를 보여줍니다.정상적인 표현형을 가진 토끼 그룹과 8주 동안 심장 독성 및 암 치료제인 독소루비신(Doxorubicin) 또는 DOX를 정맥 투여한 토끼 그룹을 비교한 것입니다. 인도에서 심근 주사를 하기 전에 잉크는 DOX 그룹에서 분리된 PVC가 훨씬 더 빈번하다는 것을 나타냈습니다. 두 그룹 모두에서 Holter ECG 모니터링으로 감지된 다른 부정맥은 PVC 쌍둥이, PVC 삼중선 및 비지속성 심실 빈맥이었습니다.유의미하게도, 정상 그룹과 DOX 그룹의 평균 심박수는 비슷했지만, 정상에서 정상, R에서 R 간격(심장 건강 상태와 관련된 비선형 역학의 척도인 SDNN)의 표준 편차는 독소루비신 투여 그룹에서 현저한 감소를 보였습니다. 시술에 앞서, 향상된 녹색 형광 단백질인 eGFP 양성 표지 세포의 성공적인 transfection은 in vitro 세포 배양 조건에서 형광 현미경 검사로 확인되었습니다. 그런 다음, 안락사가 뒤따른 심근내 주사를 맞은 후, 심장 조직 절편의 면역조직화학적 분석을 통해 eGFP 양성 표식 세포를 심근으로 성공적으로 전달한 것이 입증되었습니다.따라서, 이 이미지에서 볼 수 있듯이, 풍부한 표식이 있는 세포들이 심근 내에 존재하였다. 검은 화살촉, 인도 잉크 침전물이 산재되어 있습니다. 인도 잉크의 침전물과 풍부한 eGFP 양성 세포, 흰색 화살촉은 심근 주사 후 안락사가 24시간 지연되었을 때 여전히 존재했습니다.주목할 점은 이 시점에서 호중구가 심근에 침투하는 급성 염증 반응이 관찰되었는데, 이는 이식된 이종 세포에 대한 급성 세포 거부 반응을 시사하는 빨간색 화살표입니다. 급성 염증은 또한 인도 잉크만으로 심근 주사 후 24시간 후에 관찰되었습니다. 그러나 이 경우 심근에 침투하는 우세한 세포는 대식세포였습니다.흰색 화살촉. 이 비디오를 시청한 후에는 토끼 심장에서 조영제 심초음파에 의해 안내되는 경피적 심근 주사를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 정지 후 25분 이내에 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

고혈압이나 심근 경색 등의 심혈관 질환의 생쥐 모델에서 심근 내 세포 전달은 널리 재생 연구에서 서로 다른 종류의 세포 치료 가능성을 테스트하는 데 사용됩니다. 그러므로, 상세한 설명이 수술의 명확한 시각화가 작은 설치류의 혈관 세포 치료 분석의 한계와 이점을 정의하는 것을 도울 것이다.

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

심장 초음파 유도 경피적 심근 주입 뮤린 마음에 유전자 전달 제 또는 세포의 전달을위한 효율적인 신뢰성 있고 타겟팅 양상을 나타낸다. 이 프로토콜에 설명 된 단계에 따라, 운전자는 신속하게이 다재 다능 한, 최소 침습 기술에서 경쟁력이 될 수 있습니다.

마우스의 초음파 유도 경 흉부 심근 내 주입

생쥐의 심근 경색 부위 주변의 초음파 유도 세포 전달은 안전하고 효과적이며 편리한 세포 이식 방법입니다.

심근 경색 마우스에서 초음파 유도 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 이식

본 프로토콜은 돼지 모델에서 심장 활성 치료제를 투여하는 세 가지 방법을 설명합니다. 암컷 재래종 돼지는 (1) 개흉술 및 경심막 주사, (2) 카테터 기반 경심 주사 또는 (3) 경정맥 삼투압 미니 펌프 를 통한 정맥 주입을 통해 치료를 받았습니다.

돼지 심근 경색 모델에서 심장 활성 치료제 전달

이 기사에서는 29G x 88mm 바늘을 사용하여 심근경색의 쥐 모델에서 심초음파 유도 심근내 주사를 위한 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 기술은 경색 주위 부위에 직접 치료제를 강력하고 정확하며 재현 가능한 전달을 보장합니다.

심근경색의 쥐 모델에서 표적적이고 신뢰할 수 있는 심근내 줄기세포 전달을 위한 심초음파 유도 주사

수많은 유전자 조작 및 / 또는 유전자, 단백질, 세포 및 / 또는 biomaterials의 intramyocardial 주사는 급성 국소 빈혈 / reperfusion 부상과 생쥐의 만성 리모델링의 연구에 시간의 차원에 따라 겹쳐있다. 이 동영상은 국소 빈혈 / reperfusion에 대한 microsurgical 절차, 영구적인 관상 동맥 내고, 그리고 intramyocardial 사출 공부를 보여줍니다.

경색의 Murine 모델에서 관상 동맥 내고과 Intramyocardial 사출

간 전이 전임상, 뮤린 모델 hemispleen 주입 기법을 통해 수행 하였다.

간 전이의 전임상 쥐과 모델

이 절차의 전반적인 목표는 쥐의 갈비뼈에서 뼈의 일부를 성공적으로 절제하는 것입니다. 이 절차는 대규모의 긴 뼈 복원을 연구하기 위한 모델로 개발되었습니다.

마우스 리브를 절제하는 수술 : 대규모 긴 뼈 수리에 대한 모델

자발적으로 계약 syncytia cardiomyocytes 인간 유도 만능에서 파생 된의 줄기 세포는 인간의 심장 생리학 및 약리학의 유용한 모델. 여기 우리는 구타 주파수, Ca-민감한 형광 염료와 온도 제어 영상 다 잘 플레이트 리더를 사용 하 여 외 인 화합물의 효과 계량 하는 높은 처리량 검열 시스템을 제시.

인간-iPSC 파생 Cardiomyocyte Syncytia의 수축 온도 제어 384-잘 접시에 Ca 민감한 형광 염료와 측정

우리는 고 지 혈 증 및 당뇨병을 가진 토끼에 있는 말 초 허 혈을 유도 하기 위하여 이용 된 외과 절차를 기술 합니다. 이 수술은 환자의 말 초 동맥 질환에서 경험 하는 조건에 대 한 전 임상 모델 역할. 혈관 조 영 법은 또한 관류의 도입 된 허 혈 및 회수의 정도를 측정 하는 수단으로 서 기술 된다.

당뇨병 토끼에서의 뒷 사지의 전 임상 모델

배우세요 경피적 심장 초음파 유도 심근 내 주사법으로 토끼 심근에 세포를 정확히 전달하는 방법을. 이 기술은 심장 재생 의학 연구에 필수적인 전임상 모델에서 신규 치료법을 안전하게 테스트하는 데 활용됩니다.

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 Intramyocardial 주입 및 큰 전 임상 모델에서 셀 배달

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