Name: 정형 외과 수술 후 인지 기능 장애 및 조직 재생 연구의 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 배우세요 정형 외과 수술 후 인지 기능 장애 및 조직 재생 연구를 위한 마우스 패러바이오시스 모델. 노화된 마우스의 뼈 치유와 신경염증을 평가하는 이 방법은 수술 후 합병증 연구에 활용됩니다.

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우리는 편집 지원에 대 한 캐시 게이지, 학사 (취학 부, 듀크 대학 의료 센터, 더 럼, 노스캐롤라이나) 감사합니다. NT 공작 마 취학 및 NIH/NIA R01 AG057525-01 꿈 혁신 보조금 지원을 인정합니다.

모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 국가 학회 건강 가이드에 따라 실시 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 듀크 대학에 의해 승인 했다.
1. 실험 동물
<ol><li>표준 음식과 물에 명암 주기 12 h와 적절 한 액세스 에어컨된 환경에서 마우스를 유지. 더 이상 5 littermates 케이지, 당 하며 싸우는 격려 수 하지 않도록.</li>
	<li>여성 C57BL6/J 쥐를 사용 하 여 3 개월 (젊은) 또는 나이 (오래 된)의 18 개월에서.</li>
	<li>Parabiosis에 대 한 수술을 하기 전에 적어도 2 주 동안 함께 2 쥐를 적응. 마우스는 야생-타입 C57BL6/J 또는 eGFP +.</li>
	<li>몸 상태와 마우스의 전반적인 모양을 매일 확인 합니다.</li>
</ol>2. 수술 전 설치 Parabiosis 및 정형 외과
<ol><li>2 마우스 무게.</li>
	<li>일정 한 속도로 O2 흐름 유도 유도 챔버에 대 한 사용 5% isoflurane 0.2 L/분의 마 취 시스템을 통해 전신 마 취를 관리 합니다. 참고: 마 취의 깊이 확인할 수 있습니다 발가락 핀치를 사용 하 여.</li>
	<li>부정사 위치에 온수 패드에 쥐를 놓습니다. 직장 프로브를 사용 하 여 수술을 통해 체온을 모니터링.</li>
	<li>마 취를 유지 하는 안 면 보호구를 통해 0.2 L/min에 2.0 %isoflurane 흡입된 농도 낮은. 마 취의 적절 한 깊이 보장 하기 위해 모니터링 합니다.</li>
	<li>(호흡 속도, 산소 포화, 그리고 심장 비트)는 펄스 산소 농도계 (옵션)사용 하 여 비 접촉 하는 생리 적인 매개 변수를 모니터링 합니다.</li>
</ol>3. parabiosis 수술 (프로토콜 1A)
<ol><li>무 통 관리 (buprenorphine, SR/느린 릴리스, 0.1 mg/kg 피하) 유도 후와 수술 조작 하기 전에. 개막 직전 옆구리에 bupivacaine (0.25%)를 주사. 눈 윤 활 유를 적용 합니다. 참고: parabiosis 프로토콜 수 있습니다 수행 하지 독립적으로 tibial 골절에서.</li>
	<li>모든 내부 몸 봉합, 4-0 polydioxanone 봉합 재료를 사용 합니다. 모든 외부 봉합에 대 한 4-0 폴 리 프로필 렌 봉합 재료를 사용 합니다.</li>
	<li>팔꿈치, 측면, 그리고 가입에 무릎에서 연속 된 선 따라 2 쥐의 각을 면도. 요오드 소독 + 70% 알코올 피부 절 개에 대 한 준비에 사이클을 번갈아 3 스크럽. 압력가 마로 소독 장비를 사용 하 고 살 균 분야를 유지 한다. 참고: eGFP 마우스 오른쪽 야생-타입 마우스 놓고 수술 (그림 1)에 대 한 야생-타입 마우스의 왼쪽된 측면 및 eGFP 마우스의 오른쪽 측면을 준비 합니다.</li>
	<li>각 마우스 옆구리, 무릎, 팔꿈치 하 고 피부 밑 근육을 방해 하지 않고 단지 인접 근 위까지 따라 피부 절 개를 만들기 위해 한가 위를 사용 합니다.</li>
	<li>2 중단 봉합 동물의 삼각 근에 가입 하세요.</li>
	<li>7-9 패스의 실행, 연속 봉합으로 옆구리를 따라 몸을 벽에 가입 하세요.</li>
	<li>2 중단 봉합 동물의 근육에 가입 하세요.</li>
	<li>중단 봉합 2 parabionts의 피부를 닫습니다.</li>
	<li>주변 공기에 깨어 마우스 수 있습니다.</li>
	<li>이 프로토콜의 성공을 보장 하기 위해, 쌍의 건강을 유지 해야 한다: 매일; 쌍을 모니터링 매주 두 번; 득점 신체 조건 수행 그리고 쌍을 두 번 매주 무게. 참고: 각 쌍은 개별적으로 보관 됩니다. 참고: 경우 일반 buprenorphine (즉 SR/느린 릴리스)를 사용 하 여 다음 관리할 0.1 mg/kg 피하 마우스를 두 번 매일 당 염 분의 1 mL에에서 3 일 동안.</li>
	<li>Parabionts tibial 골절 수술을 수행 하는 경우 사이 공유 순환 되도록 복구 시간 4 주 소요 됩니다.</li>
</ol>4. tibial 골절 수술 (프로토콜 1B)
<ol><li>무 통 관리 (buprenorphine, 0.1 mg/kg 피하) 유도 후와 수술 조작 하기 전에. 개막 직전 무릎 근 외과 사이트에서 bupivacaine (0.25%)를 주사. 눈 윤 활 유를 적용 합니다.</li>
	<li>외과 영역 표시를 마우스의 오른쪽 뒷 다리의 중간 부분을 면도 하 고 교체 주기 3 요오드 + 70% 알코올 피부 스크럽 소독. 절차를 통해 불 임 수술 필드를 유지 관리 합니다. 제한 오염; 압력가 마로 소독 기기 및 장갑;를 사용 하 여 (선택 사항); 해 현미경 수술 완료 그리고가 열 패드를 사용 하 여 체온을 유지. 참고: parabionts에는 프로토콜을 수행 하는 경우만 1 마우스 쌍 (오른쪽 마우스 오른쪽 경골) 골절 이다. Parabionts에 골절의 회로도 그림 1B 를 참조 하십시오.</li>
	<li>한가 위를 사용 하 여 마우스 오른쪽에 근 위 경골의 midshaft 아래로 무릎을 오른쪽 뒷 다리의 중간 양상에 따라 피부 절 개를 만들기 위해.</li>
	<li>경골의 midshaft 하 고 시각적으로 diaphysis 찾습니다. 무릎을 tibial 고원 랜드마크로 슬 개 골 대 퇴 인 대를 사용 하 여 시각화.</li>
	<li>시각화 슬 개 골 힘 줄; 수동으로 25 게이지 바늘을 사용 하 여 intramedullary 운하에 엄지와 검지 손가락 0.5 m m 구멍을 압 연 하 여 드릴. 참고: 드릴된 구멍 통해 실행 됩니다, 경골을 따라 병렬에 tibial 고원.</li>
	<li>저항, 느낌과 플러시 tibial 고원 와이어 커터를 사용 하 여 잘라 때까지 골 수 구멍에 약 15 m m 구멍을 통해 0.38 m m 스테인레스 스틸 핀을 삽입 (3D 재구성에 대 한 보충 비디오 1 참조).</li>
	<li>바로 본이 위를 사용 하 여 골절 경골 midshaft (diaphysis). 골절의 회로도 그림 1 c 를 참조 하십시오.</li>
	<li>시각적으로 관찰 골절 사이트와 인접 한 조직 골절 시력의 안정화에 대 한 검사를 합니다.</li>
	<li>피부 스테이플를 닫습니다.</li>
	<li>깨끗 한 집 케이지를 반환 하기 전에 복구 온수 패드에 쥐를 놓습니다. 유체 교체에 대 한 각 마우스 피하에 1 mL prewarmed (37 ° C) 정상 식 염 수를 주사.</li>
	<li>매일 lameness, 감염, 또는 출혈의 증상에 대 한 마우스를 확인 하십시오. 참고: 경우 일반 buprenorphine (즉 SR/느린 릴리스)를 사용 하 여 다음 관리할 0.1 mg/kg 피하 염 분 매일의 1 mL에에서 3 일 동안.</li>
</ol>

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<li>Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+systemic+GDF11+levels+reverses+age-related+dysfunction+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Restoring systemic GDF11 levels reverses age-related dysfunction in mouse skeletal muscle.</a> Science. 344 (6184), 649-652 (2014).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+plasma+proteins+revitalize+hippocampal+function+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord plasma proteins revitalize hippocampal function in aged mice.</a> Nature. 544 (7651), 488-492 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

골절 일반적인 임상 문제 그리고 사망률, 특히 급속 하 게 성장 하 고 있는 노인 인구에서에서의 주요 원인이 남아. 여기, 우리는 tibial 골절 수술 후 neuroinflammation 및 인지 장애에 대 한 책임 메커니즘 연구의 마우스 모델에 대 한 단계별 프로토콜을 소개 합니다. 이 모델은 parabiosis 수술 신경-면역 작용, 조직 재생, 및 다른 신호 프로세스를 결합할 수 있습니다. 이러한 메커니즘을 이해 하는 것은 수술 후 합병증에 대 한 위험을 최소화 하 고 결과 최적화 하는 전략적 목표 제공할 것입니다.
여러 가지 정형 모델 설치류25뼈 수리 연구 개발 되었습니다. 우리가 채택 하 고 원래 해리 외 에 의해 설명 된이 tibial 골절 절차 수정 8, 뇌 기능에 정형 외과 수술의 효과 연구 한다. 우리는 또한 사용이 골절 모델 조합에 우리의 parabiosis 모델 뼈 치유와 연령에 따라 조직 재생에 대 한 책임은 요인 조사. Tibial 골절 이렇게 동물, (따라 마우스와 기본 유전자 감정의 시대), 최소 사망률 0에는 결과 당 약 15 분을 요구 하 고이 일반적인이 휘발성 전신 마 취하에 수행 하는 경우 긴 뼈 골절 및 정형 외과 외상 관련 된 한 모욕 따라서,이 모델은 생물 학적 경로 심문 하 고 경도 평가 수행에 이상적입니다. 그러나, 그것은 중요 하 고 뼈와 고정 재현, 그리고 부드러운 조직에 손상을 일관성. 연 조직 손상 수 수, 예를 들어로 변조 수술 더 충격적인 수 있도록 주변 근육을 곤란 하 게는 스트립. 고정 되지 않은 무딘 외상 또는 3-포인트 절곡에 의해 유도 된 외상 성 골절의 모델 같은 일관성 또는 정확성 제공 하지 것 이다. 이 절차는 자주 다시 부상, 장기 염증 반응에 리드에 결과. 반대로, 단단한 고정과 관련 된 골절의 모델 정형 외과26,27와 관련 된 피해를 완전히 정리 하지 않는 더 온건한 염증이 있다.
다른 고정 하는 티타늄 합금을 사용 하 여 밀접 하 게 모방 인간의 관절 교체 하도록 개발 된 모델과 족 불안정, osteolysis, 그리고 족 관련 합병증 쥐28,29가 더 관련성이 있을 수 있습니다. . 드릴 구멍 모델와 같은 적절 한 안정화를 제공 하는 여기, 하나의 마우스 등의 작업을 혼동 수 있는 상당한 적자 없이 행동 패러다임에서 시험 될 수 있다 공포 컨디셔닝 또는 오픈 필드 운동/불안6 테스트 ,7,11,15,,1920. 그러나, 회전 기형 고정 제대로 잠겨 있지 않은 경우 발생할 수 있습니다. 일부 모델은 우수한 안정화를 제공 하지만 그것은 마우스 대 퇴 골27에 성공적으로 구현 될 수 있지만 마우스 경골에서 구현 하 도전 된 외부 fixator를 사용 합니다.
정신 착 란 등 수술 후 인지 기능 장애, 인지 장애, 노인, 허약 환자30에 (서) 특히 골절 수리, 대 한 정형 외과 수술 후 일반적인 합병증은. Tibial 골절 수술의 임상 관련 마우스 모델이 보여 그 수술 후 조직의 cytokine 릴리스6,7,17, 손상 혈액-뇌 장벽 기능15,19 그리고 microglial 형태학16,22변경, 메모리 장애에 기여 하 고 정형 외과 수술 후 많은 환자에서 본 수술 후 신경학 적 합병증의 중요 한 기능을 나타낼 수 있습니다. 그것은 다른 외과 절차 생쥐에서 수술 후 인지 기능 장애를 모델링 하는 데 사용 되었습니다 해야 합니다. 피상적인 외상35,36뿐만 아니라 복 부31,,3233 와34 혈관 수술, 포함 됩니다. Parabiosis 기술은 모든 염증, glial 활성화 및 일반적인 메커니즘에 의해 중재 될 수 있는 행동 적자를 포함 하 여 유사한 끝점을 공유 하는이 모델에 적용 됩니다.
Parabiosis를 포함 하는 연구 neuroinflammation, 인지 기능과 세 동물37,,3839,40 회 춘 조직에 영향을 줄 수 있는 순환 요인에 대 한 새로운 역할을 계시 했다 ,,4142. 우리는 parabiosis 여기에 설명 된 재생 경로 조사 하 고 혈액을 매개로 요인 영향 치유와 골절12수리를 포함 하는 메커니즘을 연구 하는 tibial 골절 모델 성공적으로 결합 될 수 있다 나타났습니다. 여기, 우리는 세 동물 젊은 동물에 anastomosed 때 세 동물의 골절-복구 용량에 rejuvenated 수 있습니다 설명 했다. 나이의이 반전 골절 사이트에서 조 혈 모 세포의 engraftment에 뿌리 했다. 흥미롭게도, 이러한 소생 세 쥐로 젊은 골 수 이식 통해 달성 될 또한. 이와 관련, 골 수 이식 parabiosis에 더 직접적이 고 간단 하 게 다른 접근을 간주 될 수 있습니다. 그러나, parabiosis 조사 순환 세포 및 요인의 기능에 대 한 보다 강력한 모델 이다. 우리는 parabiosis와 정형 외과 모델 수술 치료 및 노화 생물학에서 중요 한 질문에 대답에 중요 한 역할을 담당할 것입니다 기대 합니다.
요약 하자면, 우리는 tibial 골절 수술 후 neuroinflammation과 정형 외과 수술 후 인지 장애에 대 한 책임 메커니즘 연구의 마우스 모델에 대 한 단계별 프로토콜을 소개 합니다. 이 모델은 신경-면역 작용, 조직 재생, 및 다른 경로를 parabiosis 절차와 결합할 수 있습니다. 이러한 메커니즘을 정의 하는 것은 수술 후 합병증에 대 한 위험을 최소화 하 고 결과 최적화 하는 전략적 목표 제공할 것입니다.

수술 의료 의료 시스템을 변형 시킨 첨단 기술, 향상 된 안전에 지속적으로 기여 하 고 삶의 질을 유지. 불행 하 게도, 수술도 노인 환자1,2에 특히 상처 감염, 신경학 적 장애, 그리고 심지어 사망을 포함 하 여 수술 후 합병증으로 이어질 수 있는 pathophysiologic 응답을 유도 합니다. 정형 외과 특히 노인 삶의 질을 개선 하 고 일반적인 뼈 부상을 복구 하에서 정기적으로 수행 됩니다. 그러나, 정형 외과 환자 65 세와 수술 후 정신 착 란 등 이전 경험 신경학 적 장애의 50%까지. 이 지속적으로 6 개월, 지속적인 기능 감소, 빈약한 예 지, 즉, 5 사망률에 대 한 위험을 증가와 관계가 증가 환자, 증가 입원의 길이 그리고 요양원 배치의 시간 간호 3 , 4 , 5. 진보 된 나이를 포함 하 여 몇 가지 위험 요소 확인 되었습니다, 하지만 작은 수술 후 신경학 적 장애에 대 한 책임 메커니즘에 대 한 알려져 있다.
우리 주변 외상 neuroinflammation 및 두뇌 건강 (인지 기능)6, 를 포함 하 여 수술 후 회복에 미치는 영향을 확인 하려면 tibial 골절의 마우스 모델을 설정한 골절 노인에서 아주 일반적 이기 때문에, 7. 원래 해리 외 에 의해 설명 된이 모델 8, intramedullary 고정 및 전신 마 취 및 진통, tibial 골절 이루어져 피부 부상, 근육 외상, 따라서 모방 그리고 뼈 일반적인 긴 뼈 골절과 관련 된 수리 및 인 간에 있는 복구. 이 절차 후 쥐 인간9,10, 선언적 메모리에 적자와 관련 있는 해 마에서 microglial 활성화에 관찰 하는 변화에 비슷한 염증 성 마커 변경 내용을 설명 하 고 hippocampal neuroplasticity6,7,11. 우리는 이전 결합이 골절 모델 parabiosis. Parabiosis는 수술 고 모델을 2 마우스 anastomosed는 따라서 순환 시스템을 공유입니다. 이 모델 순환 세포 및 연령과 질병12,,1314의 맥락에서 장기의 기능에 체액 성 요인의 규제 효과의 이해에 돌파구를 제공 했다. 이 방법을 사용 하 여 우리가 최근 연령에 따라 골절 치유12와 관련 된 조직의 요소를 발견 했다.
여기, 뼈-투-두뇌 연령에 따라 메커니즘, 재생 의학 및 neuroimmunology에 관련 된 연구 parabiosis tibial 골절 모델을 결합 하는 프로토콜을 소개 합니다. 프로토콜 1A tibial 골절 절차 (그림 1A) parabiosis 절차 및 프로토콜 1B 세부 사항 설명. 이들은 독립적으로 또는 조합, 심문의 성격에 따라 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-017-25</td><td>기타 휘발성 제제 또는 주사 가능한 마취도 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals</td><td>NDC 12496-6757-1</td><td>선택 사항 및 개별 기관 동물 관리 및 사용위원회 권장 사항에 따라</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td>방부제 처리를위한 70 % 용액 피부 및 청소</td></tr><tr><td>10% 포비돈 요오드</td><td>Dynarex</td><td></td><td>피부 소독 치료용</td></tr><tr><td>SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>저유량; 마취 시스템</td></tr><tr><td>MouseSTAT</td><td>Kent Scientific</td><td>PS1161</td><td>맥박 산소 농도계 & 심박수 모니터</td></tr><tr><td>면도기</td><td>Wahl</td><td>9854L</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들</td><td>미세 과학 도구</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>메스 블레이드 - #11</td><td>미세 과학 도구</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Adson 집게</td><td>미세 과학 도구</td><td>11006-12</td><td>골막을 벗기는 데 필요</td></tr><tr><td>홍채 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11066-07</td><td>국소 근육/연조직 외상을 일으키는 데 유용 (1x2 이빨)</td></tr><tr><td>본 가위 (스트레이트)</td><td>파인 사이언스 툴</td><td>14084-08</td><td>절골술에 좋으며, 무뎌질 때 정기적으로 변경하도록 주의해 주세요</td></tr><tr><td>파인</td><td>사이언스 툴</td><td>14058-09</td><td>봉합사 절단용 날카로운 가위</td></tr><tr><td>22G x 3.5 인치 퀸케&nbsp; 척추 바늘</td><td>BD</td><td>405181</td> 바늘 홀더를 <td>고정하기 위해 내부 막대를 사용하십시오</td></tr><tr><td>.</td><td>고급 과학 도구</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>봉합</td>사 <td>모양</td><td>1079B</td><td></td></tr><tr><td>C57BL6/J</td><td>잭슨 연구소</td><td>&nbsp; 재고 번호 000664</td><td></td></tr><tr><td>eGFP+ (유비쿼터스 강화 녹색 형광 단백질을 발현)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>&nbsp; 재고번호: 003291</td><td></td></tr></tbody></table>

정형 외과 수술 후 인지 기능 장애 및 조직 재생 연구의 마우스 모델

A Mouse Model of Orthopedic Surgery to Study Postoperative Cognitive Dysfunction and Tissue Regeneration

수술은 일반적으로 개선 하 고 삶의 질을 유지 하는 데 사용 됩니다. 불행히도, 노인 등 취약 한 환자에서 합병증 수 있습니다 발생할 고 크게 감소 결과. 실제로, 일상적인 정형 외과 골절 복구, 후 노인 환자의 50%는 정신 착 란 같은 신경학 상 합병증에서 고통. 또한, 치유 하 고 수술 후 조직을 재생 하는 능력, 나 이와 함께 감소 하 고 골절 수리 및 임 플 란 트의 심지어 뼈가 있는 통합의 품질에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서,이 연령에 따라 변화 드라이브 메커니즘의 더 나은 이해 같은 합병증에 대 한 위험을 최소화 하 고 결과 최적화 하는 전략적 목표를 제공할 수 있습니다. 여기, 우리는 tibial 골절의 임상 관련 마우스 모델을 소개합니다. 이 마우스에 수술 후 변화 일반적으로 인 간에 있는 일반적인 정형 외과 수술 후 관찰 하는 인지 장애의 일부 모방. 간단히, 절 개는 엄격 하 게 무 균 조건 하에서 오른쪽 뒷 다리 사지에서 수행 됩니다. 근육 분리 되 고는 0.38 m m 스테인레스 스틸 핀 intramedullary 운하 안에 경골의 상단 문장에 삽입 됩니다. 뼈는 다음 수행, 그리고 상처를 잘라. 수술 후 neuroinflammation 행동 변화에 대 한 수술 외상의 효과 조사 하기 위해이 모델을 사용 했습니다. Parabiosis, 외과 모델에 2 마우스 anastomosed는와 함께에서이 골절 모델을 적용 하 여 우리 세포와 조직으로 부상 후 장기 기능 및 조직 재생을 젊 어지게 하는 분 비 요소를 공부 했다. 우리의 단계별 프로토콜에 따라, 이러한 모델 높은 충실도, 재생 될 수 있다 그리고 많은 생물 학적 경로 수술 외상에 의해 변경 되는 심문을 적용할 수 있습니다.

가로 osteotomies 핀 및 적절 한 봉합의 꾸준한 삽입 무 균 조건 하에서 신중 하 게 수행 했다, 후 마우스 lameness, 감염, 또는 수술 후 왼쪽된 다리에 출혈의 흔적을 보여주었다. 정형 외과 치료 Safranin O 후 방사선 분석 및 histomorphometry를 사용 하 여 평가 했다 (그림 2) 얼룩. 방사선 midshaft 골절된 경골의 골절 굳은 살 세 쥐에서 보다 젊은 쥐의 골절 굳은 살에 더 많은 조직 증 착 표시. 골절 굳은 살 석 그리고 파라핀 조직학 분석을 위한 준비에 포함 된. 섹션 Safranin-O로 얼룩진 했다 그리고 조직 증 착 histomorphometry 분석을 사용 하 여 계량 했다. 젊은 쥐의 골절 굳은 살 더 많은 뼈와 골절 굳은 살 세 쥐에서 보다 덜 거리 조직을 포함.
Tibial 골절 염증 조직 및 중앙6,7,11,,1516유도합니다. 실제로, 주변 수준의 프로 염증 성 cytokines 및 위험 관련 된 분자 패턴 (DAMPs)는 모두 생쥐와 인간7,,1718에서 정형 외과 수술 후 급속 하 게 상승 된다. 이 체액, 세포, 및 신경 통로7,15,,1920, 포함 하는 여러 신호 메커니즘을 통해 두뇌에 있는 microglial 세포의 활성화에 기여 21. 다음 수술, 내 피 기능 장애, 혈액-뇌 장벽 개방, 그리고 주변 대 식 세포 침투 야생 유형 및 Ccr2 급성 hippocampal neuroinflammation 기여할RFP / + Cx3cr1GFP / + 성인 쥐15 , 19, 인간의 정신 착 란, 수술 후 인지 기능 장애15,,1922유사한 후속 메모리 적자와 연결 되었습니다. 이 neuroinflammatory 응답 IBA 1 immunostaining (그림 3)에 의해 감지 microglial 형태학에 있는 중요 한 변화 나이 든된 동물에 악화 됩니다.
여기 설명 tibial 골절 모델을 사용 하 여, 우리는 또한 발견 정도 장애인된 hippocampal 성체가 이랑20에 doublecortin (DCX) immunostaining에 있는 감소에 의해 입증. 장기 potentiation (LTP), 메모리 기능, 대리의 electrophysiologic 측정 postoperatively neuroplasticity에 시간에 따라 중단 발표11. 수술 후 쥐도 hippocampal 종속 메모리 기능, 예를 들어 공포 컨디셔닝 행동 평가 (그림 4)를 사용 하 여 장애를 표시할. 두려움 컨디셔닝, 마우스 챔버에 배치 되며 뒤에 (즉, footshock)는 혐오 자극 청각 큐에 노출. Tibial 수술 후 3 일 마우스 컨디셔닝 챔버에 어떤 청각 또는 혐오 자극 없이이 이번 테스트는 하 고 (자세한 프로토콜 참조23)에 대 한 메모리의 색인 기록 동작 동결.
고급 나이 메모리 감소에 대 한 중요 한 위험 요소 이다. 아직, 우리 시대, 조직 복구 및 재생에 대 한 용량 또한 감소 이러한 메커니즘을 제대로 이해 남아 있지만. 따라서, 우리는 heterochronic parabiosis (쌍 영/오래 된 동물)을 수행 하기 위해 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 고 골절 (대 한 자세한 parabiosis 프로토콜 참조24) 세 마우스 내에서 치유를 평가. Parabiotic 쌍 사이의 혈액 공유 확인 되었고 동등한12발견. 이전 연합 젊음 순환 향상 된 뼈 수리에 노출 증 착 뼈, 증가 하 고 감소 증 (그림 5)12. 뼈 재생의이 회 춘 생 osteocalcin 긍정적인 osteoblasts (그림 5, 갈색 세포)의 독립적인 발생 하지만 오히려 젊은 parabiont (그림 5, 블루 셀)에서 마이그레이션된 CD45-긍정적인 세포 의존 . 이 결과 CD45 긍정적인 조 혈 모 세포 더 활성화 될 그들을 유도 하는 것은 세 osteoblastic 셀에 신호 수 발랄 하 고 건강 한 틈새를 분 비를 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig1.jpg"> 그림 1: parabiosis와 tibial 골절 수술의 도식 대표. (A) 일정 수행 하는 parabiosis와 tibial 골절 (프로토콜 1A) 또는 tibial 골절 혼자 (프로토콜 1B). Isochronic 또는 heterochronic parabiotic 쌍에서 20 개월 된 생쥐의 (B) 경골 골절 했다 (오른쪽 마우스의 오른쪽 다리는 골절, x 표시로). 녹색 쥐 eGFP 쥐를 묘사 하는 동안 회색 쥐 wildtype 쥐 묘사. (C) intramedullary 고정 및 중간 샤프트 골절 tibial 골절 모델의 회로도. 또한 뒷 다리 사지의 3D 개조와 경골의 고정에 대 한 보충 비디오 1 을 참조. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig2v2.jpg"> 그림 2: 젊고 오래 된 마우스 모델 내에서 치유 하는 Tibial 골절. 젊은이 나 늙은 쥐의 경골 골절 했다 고 골절 굳은 살 조사 21 일 게시물 부상 했다. (A) 방사선 이미징 및 조직학 얼룩 (Safranin-O) 골절 굳은 살 21 일 게시물 골절을 평가 하는 데 사용 했다. 얼룩이 collagenous 조직 파란색과 빨간색에서 (연골 포함) proteoglycans 보여줍니다. 파선 골절 굳은 살의 대략적인 위치를 나타냅니다. (B) Histomorphometry의 뼈, 연골, 그리고 거리 조직 골절 굳은 살 21 일 게시물 골절 내 입금 금액을 평가 하기 위해 사용 되었다. 의미 ± 95% 신뢰 간격, 데이터 표현 됩니다 * P &lt; 0.05, 통계적 (일방통행 ANOVA, Dunnett의 시험), 스케일 바 2mm, 나타내고 이미지 현미경, 1.25 x 목표를 사용 하 여 얻은 했다. n = 각 샘플에 대 한 9. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig3.jpg"> 그림 3: 해 마에 연령에 따라 microglial 활성화를 유도 하는 수술. Tibial 골절 수술 세 쥐 (20 개월) 4 개월 C57BL6/J 쥐에 비해 큰 hippocampal neuroinflammation를 유도 합니다. 뇌-섹션 microglial 마커 IBA 1와 얼룩이 더 긍정적인 세포와 형태 론 적 변화 수술 수술 후 24 h 그룹 보여줍니다. 이미지 100 x의 확대와 함께 epifluorescent 현미경으로 얻은 했다.; 눈금 막대를 나타냅니다 10 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig4.jpg"> 그림 4: tibial 골절 수술 후 신생, 장기 potentiation 및 메모리 기능 장애. (A) DCX, 성체에 대 한 양적 마커는 수술 후 24 h에 해 마가 뇌에 현저 하 게 감소 된다. 이미지는 confocal 레이저 스캐닝 현미경 목표 10 배;의 확대와 함께 가져온 스케일 바 대표 10 µ m. 컨트롤 또는 마우스 24 h hippocampal 조각 전기 생리학 (B) 수술 후. 장기 potentiation (LTP)-고주파 자극 (HFS)에 의해 유도 되었다 고 기록 이상 1 h. 필드 흥분 성의 postsynaptic 잠재력 (fEPSPs)는 정기적으로 가득 하는 세포 외 기록 피 펫을 사용 하 여 CA1 지층 radiatum에서 기록 되었다 인공 뇌 척수입니다. 수술 후 24 h, LTP 유도 너무나 통제 쥐에 비해 감소 된다. 데이터는 평균 ± s.e.m. n으로 표현 = 3, * p &lt; 0.05 1 방향 배치법. (C) Hippocampal 종속 메모리 기능 (추적을 사용 하 여 동결의 %로 정의 두려움 컨디셔닝) 컨트롤에 비해 수술과 마 취만 노출 동물 후 생쥐에서 손상. 데이터는 평균 ± s.e.m. n으로 표현 = 9-10, * p &lt; 0.05 1 방향 배치법. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56701/56701fig5.jpg"> 그림 5: Parabiosis 수술 골절 치유, 혈액 공유 및 기증자 세포 engraftment의 회 춘에 이르게. Isochronic 및 heterochronic parabiosis 쌍 설치 되었다 고 각 쌍의 세 마우스는 골절 뼈 치유에 대 한 평가. (A) 골절 굳은 살 방사선 이미징 사용 하 여 조사 했다. 파선 골절 굳은 살의 대략적인 위치를 나타냅니다. (B) Engraftment eGFP + 세포의 골 수 내에서 확인 됐다. (C) Immunohistochemistry 골절 굳은 살의 eGFP+ 기증자 세포 (파란색) 및 osteocalcin+ osteoblastic 셀 (갈색)는 parabiont에서 식별 하기 위해 사용 되었다. 스케일 바 50 µ m 나타내고 이미지 40 x 목표를 사용 하 여 얻은 했다. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/56701fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 비디오 1: 3 차원 재구성 뒷 다리 경골의 고정의. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56701/parte_slow.wmv">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜의 정형 외과 수술 후 neuroinflammation 및 행동 변화, 그리고 노화 중 조직 재생 연구 parabiosis와 결합 메커니즘을 연구 하는 데 사용 되었습니다 마우스 모델을 설명 합니다.

Surgery is commonly used to improve and maintain quality of life. Unfortunately, in vulnerable patients such as the elderly, complications may occur and ...

이러한 수술 방법의 전반적인 목표는 다기관 기능 장애에 대한 외상의 영향을 관찰하는 것이며, 특히 parabiosis는 젊은 쥐와 늙은 쥐를 함께 문합하여 혈액 공급을 공유하는 데 사용됩니다. 그런 다음 이 모델 내의 생쥐 중 하나를 골절하여 젊고 늙은 생쥐의 공유 시스템과 관련하여 재생 효과와 인지 기능에 미치는 영향을 관찰합니다. 이러한 방법은 면역학, 노화, 조직 재생 및 인지 기능 분야와 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.정형외과 절차의 주요 장점은 이러한 결과를 섬망 및 수술 후 인지 기능 장애와 같은 수술 후 일반적인 합병증에 임상적으로 적용할 수 있다는 것입니다. 실험하기 전에 생쥐를 12시간 동안 명암 주기로 에어컨이 설치된 환경에 보관하고 표준 음식과 물을 적절하게 이용할 수 있도록 합니다. 우리당 5마리 이하의 새끼를 수용하고 싸움을 조장할 수 있는 조건을 피하십시오.생후 3개월에 암컷 마우스 1마리와 생후 17개월에 늙은 마우스 1마리를 사용합니다. 기생충증의 경우, 수술 전 최소 2주 동안 두 마리의 쥐를 함께 적응시킵니다. 매일 생쥐의 신체 상태와 전반적인 모습을 확인하십시오.수술을 준비하기 위해 두 마리의 쥐의 무게를 잰다. 전신 마취를 투여한 후, 누운 자세로 가열된 패드에 마우스를 놓습니다. 마지막으로, 각 마우스에 대해 올바른 마취 수준을 유지합니다.다음으로, 두 마리의 쥐를 팔꿈치, 옆구리, 무릎에서 접합할 쪽의 연속적인 선을 따라 각각 면도합니다. 절개 준비를 위해 요오드와 70% 알코올 스킨 스크럽을 3회에 걸쳐 번갈아 가며 소독합니다. 유도 후 및 수술 조작 전에 진통제를 투여하는 것으로 시작하십시오.개봉 직전 측면에 0.25%부피바카인을 주사합니다. 각 마우스에서 메스를 사용하여 무릎 근위부에서 팔꿈치 근위부까지 옆구리를 따라 피부를 절개하고 피부 아래 근육을 방해하지 않습니다. 두 개의 중단된 봉합사로 동물의 삼두근을 결합하십시오.그런 다음 측면을 따라 체벽을 7-9회 동안 연속적으로 봉합하여 연결합니다. 다음으로, 두 개의 중단된 봉합사로 동물의 대퇴사두근을 결합하고 중단된 봉합사로 두 파라바이오언트의 피부를 닫습니다. 엎드린 자세로 마우스를 완전히 중단한 봉합사.쥐가 주변 공기에서 깨어나도록 합니다. 각 쌍을 개별적으로 수용하고 매주 두 번 신체 상태를 평가하고 매주 두 번 쌍의 체중을 측정하여 매일 쌍을 모니터링해야 합니다. 마지막으로, 경골 골절 수술을 시행하는 경우 파라바이오런트 간의 순환을 공유할 수 있도록 4주간의 회복 시간을 허용합니다.다음으로, 마우스의 오른쪽 뒷다리의 내측을 면도하여 수술 부위를 노출시키고 요오드와 70% 알코올 스킨 스크럽으로 3회 교대로 소독합니다. 유도 후 및 수술 조작 전에 진통제를 투여하는 것으로 시작하십시오. 개구 직전 무릎 근위부 수술 부위에 0.25%부피바카인을 주사합니다.오토클레이브 기구를 사용하여 절차 전반에 걸쳐 멸균 수술 영역을 유지합니다. 가위를 사용하여 무릎 근위부를 사용하여 오른쪽 뒷다리의 내측을 따라 왼쪽 마우스의 경골 중간 축까지 절개합니다. 경골의 중간 축을 노출시키고 골관절을 시각적으로 찾습니다.무릎을 구부리고 슬개대퇴 인대를 랜드마크로 사용하여 경골 고원을 시각화합니다. 슬개건을 시각화합니다. 그런 다음 손가락과 엄지 손가락을 굴리는 동작을 사용하여 25 게이지 바늘을 사용하여 골수내관에 구멍을 수동으로 뚫습니다.그런 다음 저항이 느껴질 때까지 약 15mm 길이의 구멍을 통해 0.38mm 스테인리스 스틸 핀을 골수강에 삽입하고 와이어 커터를 사용하여 경골 고원으로 살을 자릅니다. 그런 다음 스트레이트 본드 가위를 사용하여 경골 중축을 골절합니다. 골절 부위와 인접 조직을 육안으로 관찰하여 골절 부위의 안정화를 검사합니다.그런 다음 피부 스테이플을 사용하여 피부를 닫습니다. 마지막으로, 체액 교체를 위해 섭씨 37도의 예열 된 생식염수 1ml를 각 마우스에 피하주사합니다. 깨끗한 가정용 케이지로 되돌리기 전에 회복을 위해 가열된 패드에 쥐를 놓습니다.절뚝거림, 감염 또는 출혈의 징후가 있는지 매일 생쥐를 확인하십시오. 중축 골절 경골의 방사선 사진은 늙은 쥐의 골절 굳은살보다 어린 쥐의 골절 굳은살에서 더 많은 조직 침착을 나타냈습니다. 또한, 어린 쥐의 골절 굳은살은 늙은 쥐의 골절 굳은살보다 뼈가 더 많고 섬유화 조직이 적었습니다.경골 골절 수술은 4개월 된 쥐에 비해 20개월 된 생쥐에서 더 큰 해마 신경염증을 유발했습니다. 또한, 수술 후 생쥐는 해마 의존 기억 기능(예: 공포 조절 행동 평가를 사용)에 장애를 보였다. 젊음의 혈액 순환에 노출되면 뼈 복구가 향상되고 뼈 침착이 증가하며 섬유화가 감소했습니다.이러한 뼈 재생의 회춘은 내인성 오스테오칼신 양성 파골세포와 독립적으로 발생했으며, 오히려 젊은 기생체에서 이주한 CD45 양성 세포에 의존했습니다. 일단 숙달되면, parabiosis 기술은 1-1/2 시간 이내에 수행 할 수 있으며 경골 골절 모델은 15 분 이내에 수행 할 수 있습니다. 필요한 경우 두 절차를 서로 독립적으로 수행할 수도 있습니다.경골 골절 시술을 시도하는 동안 멸균된 수술 부위를 유지하고 핀의 적절한 배치와 적절한 절골술을 보장하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 연구 기간 동안 마우스를 주의 깊게 모니터링하는 것을 잊지 마십시오. 이 비디오를 시청한 후에는 parabiosis 모델과 경골 골절 수술을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

우리는 생쥐의 내측 반월 상 연골 (DMM) 모델, 골관절염 (OA) 연구를위한 효과적인 도구의 불안정에 대한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 progranulin가 OA의 병인에 보호 역할을한다는 것을 나타내는,이 모델을 사용하여 progranulincan 과장 OA 개발 및 진행의​​ 부족을 증명하고있다.

관절염에 Progranulin의 보호 역할을 조사하기 위해 마우스의 수술로 유발 된 모델 구축

마우스 모델은 뼈 조직 공학에 매우 유용한 도구이지만, 긴 뼈 결함 모델은 드뭅니다. 이러한 필요성은 4개의 나사가 있는 잠금 플레이트와 전용 지그를 사용하여 이환율이 낮고 재현 가능한 대퇴골 임계 크기 결함을 수행하고 안정화하는 현재 프로토콜의 개발에 동기를 부여했습니다.

마우스의 분절 대퇴 임계 크기 결함 모델의 설립은 플레이트 고정술에 의해 안정화

이 기사에서는 신생아 마우스에서 재현 가능한 척수 압박 손상(SCI)을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 자발적인 기능 회복의 기초가 되는 적응 가소성의 메커니즘을 연구하는 데 유리한 플랫폼을 제공합니다.

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

지방 유래 기질 세포는 환자 자신의 세포에서 새로운 조직을 엔지니어링하는 데 유용할 수 있습니다. 우리는 골형성 잠재력이 증가된 인간 지방 유래 기질 세포(ASC)의 하위 집단을 분리하기 위한 프로토콜을 제시한 다음 in vivo calvarial healing assay에서 세포를 적용합니다.

BMPR-IB +의 신속한 격리 두개골 결함 치유 모델에서 사용을위한 기질 세포를 지방이는 유래

우리는 출생 후 하루에 일방적인 경 동맥 폐색을 수행 7-10 CD-1 신생아 hypoxic-허 혈 성 (HI) 모델을 만드는 새끼 마우스와 뇌 손상의 영향을 조사. 우리는 운영 되지 않은 정상 쥐에 비해 이러한 마우스 neurobehavioral 함수 공부.

신생아 Hypoxic-허 혈 성 뇌 손상의 마우스 모델에서 Neurobehavioral 평가

우리는 주문 품 선택 항목을 사용 하 여 개발 마우스 tibial 산만 골 모델 제시. 분석 대상으로는 마우스를 사용 하 여 연구 발전에 유리 하다.

마우스 산만 골 모델

현재 프로토콜은 골관절염을 동반하는 형태학적 관절 변화를 정량화하기 위한 엄격하고 재현 가능한 방법을 확립합니다. 이 프로토콜의 적용은 질병 진행을 모니터링하고 골관절염의 치료 적 개입을 평가하는 데 유용 할 수 있습니다.

외과 마우스 모형에 있는 골관절염의 표준화한 조직 형측정 평가

우리는 생쥐의 척추 전 경로를 통해 양측 상완신경총 신경의 직접 문합 프로토콜을 확립하기 위해 임상 수술을 시뮬레이션하여 중추 및 말초 신경계 손상 후 교차 신경 전달 시 재활의 기초가 되는 신경 메커니즘 연구에 기여했습니다.

교차 신경 전달 수술을 위한 척추 전 경로를 통한 직접 문합술의 마우스 모델

여기에 제시된 것은 다양한 정도의 척수 손상 타박상 모델을 정확하게 생성할 수 있는 마우스용 새로운 자동 척수 손상 타박상 장치입니다.

마우스의 Contusive Spinal Cord Injury Model을 위한 자동 임팩터

혈관 인지 장애 및 치매에 대한 마우스 모델을 만들기 위해 비대칭 양측 총경동맥 협착증의 바늘 방법이 제안됩니다. 이는 이전에 확립된 모델에 비해 장기적인 결과를 가져오며 실시간 MRI와 호환됩니다. 절차를 보여주는 시각적 표현은 수술을 마스터하기 위한 지침을 제공합니다.

A Mouse Model for Vascular Cognitive Impairment and Dementia Based on Needle-guided Asymmetric Bilateral Common Carotid Artery Stenosis(바늘 유도 비대칭 양측 공통 경동맥 협착증에 기반한 혈관 인지 장애 및 치매에 대한 마우스 모델)

배우세요 정형 외과 수술 후 인지 기능 장애 및 조직 재생 연구를 위한 마우스 패러바이오시스 모델. 노화된 마우스의 뼈 치유와 신경염증을 평가하는 이 방법은 수술 후 합병증 연구에 활용됩니다.

정형 외과 수술 후 인지 기능 장애 및 조직 재생 연구의 마우스 모델

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