Name: 지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 학습하세요 지리적 위축의 큰 눈 모델에서 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식 및 광학 일관성 단층 촬영을 통한 세포 통합 평가 방법. 이 기술은 재생 의학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 시각 장애, 안과 연구, 스웨덴 눈 재단, 임금 Gustav V 재단, ARMEC는 에드윈 요르단 재단 재단법인 크라운 공주 Margareta 카롤 린스 카 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다 Lindeberg 재단, 그리고 Cronqvist 재단입니다.

다음 프로토콜 카롤 린스 카 Instituet의 동물 보호 지침을 따릅니다. 뉴질랜드 백 변종 토끼 (자료 테이블)를 사용 하 여 모든 동물 실험 지역 동물 윤리 위원회 (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd)에 의해 승인 되었습니다 (허용: dnr 56/15). HESC (dnr 2011/745-31/3)의 사용 및 전송 hESC RPE (dnr 2013/813-31/2)의 조작 또한 스웨덴 입법 및 카롤 린스 카 Institutet 규정 이며 지역 인간의 윤리 위원회 (에 의해 승인 되었습니다. Regionala Etikprövningsnämnden 나 스톡홀름).
1. subretinal 주입 나트륨 요오드 산 염 (NaIO3) 눈 큰 동물 모델
<ol><li>동물 마 취 제 35 mg/kg의 혼합물으로 허벅지에 근육 관리와 30 G 주사기를 사용 하 여 식 염 수에 5 mg/kg xylazine anesthetize 그리고 0.75 %cyclopentolate 및 2.5 %phenylephrine 혼합 사용 안 하는 국 소 약으로 학생 같은데요. 적절 한 anesthetization 확인 동물 그것의 뒤 다리의 하드 핀치에 반응 하지 않는 경우.</li>
	<li>외과 의사 (그림 1A)를 직면 하 고 머리와 수술 현미경 토끼를 놓습니다. 뚜껑 견인을 사용 하 여 오염 위험을 최소화 하기 위해 살 균 헝겊으로 눈 꺼 풀과 nictitans 멤브레인을 제거. 사용 소금 솔루션 (BSS) 양쪽 눈에 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 균형.</li>
	<li>
미세, 2 포트 사용 (또는 옵션 3-포트)에 대 한 25 G transvitreal는 플 기술 microsurgical 악기 (그림 1B)의 삽입에 대 한 비 밸브 trocars와 함께 갈 거 예요. 다기능 vitrectomy 기계는 주입 정, endoillumination, vitrector, 및 endolaser를 연결 하는 포트. Subretinal 주사만 endoillumination은 필수, 2-포트 설정을 충분 하 게 하. 상단 왼쪽된 trocar를 통해는 endoillumation를 삽입 하 고 위 오른쪽 trocar subretinal 주입 정에 대 한 사용.
	<ol>
<li>3-포트 설정에 대 한 BSS 주입 정에 대 한 낮은 임시 trocar를 사용 합니다. 경우 (예: vitrector) 옵션 악기는 상단 오른쪽 trocar를 통해 그들을 삽입, 사용.</li>
		<li>Limbus를 잡아 삽입 사이트 overlying 결 치환 발톱된 집게를 사용 하 여에서 위 2 trocars 1-2 m m를 삽입 합니다.</li>
		<li>trocars는 30-45 ° 각도로 limbus 병렬, 삽입 된 transsclerally는 그리고는 trocar 끝의 중간 다는 것을 확인 하십시오. 다음 trocar 90 °를 돌아서 눈의 후부 극에 눈으로 미리. 이 절차는 sclerotomies에서 수술 후 누설을 방지 하 고 또한 endophthalmitis (즉, 눈에 세균 감염)의 위험을 감소. Trocar 위치 또한 그림 2B 참조.</li>
		<li>눈과 콘택트 렌즈 (그림 1A) 사이의 연락처 젤으로 합성 눈물으로 망막을 시각화 하기 위해 각 막에 단일 사용 평면 콘택트 렌즈를 넣어.</li>
		<li>확장 튜브 (도우미 운영)에 연결 된 1 mL 주사기와 38 G polytip 정 (외과 의사에 의해 운영)으로 NaIO3 의 500 µ L를 그립니다.</li>
		<li>상단 왼쪽된 trocar 통해 endoillumination 프로브와 상단 오른쪽 trocar 통해 주입 정을 삽입 하 고 망막, 시 신경 머리 바로 아래 지역에 대 한 목표로 향해 유리 공간을 통해 정 미리.</li>
		<li>정 초점 화이트닝 표시 될 때까지 천천히 망막을 터치의 팁을 수 있습니다. 자체 사출 subretinal 납품을 허용 하는 망막에 침투 합니다. 이 출혈 될 수 있으므로 망막, 관통 정 맥을 하지 마십시오.</li>
		<li>5 s 동안 subretinally NaIO3 의 50 µ L를 주사. 기본 맥락 막과 망막 사이 자연 분열 비행기 때문에, 명확 하 게 보이는 반투명 bleb 주사 동안 점차적으로 형성 한다.</li>
		<li>주입, 동안 천천히 바늘을, 철회 하지만 팁 역류를 최소화 하기 위해 bleb 내에서 유지 됩니다.</li>
		<li>Endoillumation 및 주입 정 맥의 제거 후, 발톱된 집게를 사용 하 여 trocars를 제거 하 고 30에 대 한 가벼운 압력 끝 이나는 집게의 무뚝뚝한 끝을 사용 하 여 자체 봉인 봉합 덜 sclerotomies s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Post-surgically 10 mL 피하 탈수를 방지 하기 위해 염 분을 제공 합니다. 수술 후 국 소 스테로이드 나 항생제를 주지 않는다. 진통제에 대 한 수술 후 하루 buprenorphine 0.3 mg/ml 피하 후 수술의 0.5 mL를 제공 합니다.</li>
	<li>사용 후, 그들 immersing 몇 초에 대 한 첫째 70% 에탄올에 둘째 45% 에탄올에 의해 모든 악기를 세척 하 고 마지막으로에 증류수. 제대로 종이 수건으로 그들을 건조.</li>
	<li>그들은 충분 한의 식을 회복 하 고 모든 단일 encaged 배치 될 때까지 동물을 참석. (예를 들어, immunohistochemistry 목적을 위해) 필요한 경우 100 mg/kg pentobarbital에의 정 맥 주입 하 여 동물을 안락사 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>HESC RPE 세포의 이식으로 진행 7 일 기다립니다.</li>
</ol>2. subretinal 이식 치료 동물에서 hESC RPE 세포의
<ol><li>삽입 1-2 m m 낮은 임시 사분면 limbus에서 hESC RPE의 이식 하기 전에 1 주 30 g 주사 바늘을 사용 하 여 마 취 동물에 intravitreal triamcinolone의 2 mg (100 µ L)를 관리 하 고 다시 3 개월 마다 그것을 관리. 렌즈 터치를 피하기 위해 눈의 후부 극으로 팁을 가리키고 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>앞에서 설명한1hESC RPE 단층 문화.</li>
	<li>셀 차별화 ( 재료의 표참조)의 미디어 24 잘 confluent hESC RPE 단층을 제거 하 고 각을 세척 없이 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +PBS의 500 µ L로 잘. 2 세척의 총에 대 한이 작업을 한 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>상쾌한 삭제, 잘, 당 trypsin의 500 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 12 분 동안 품 어</li>
	<li>접시를 기울기와 트립 신 (셀 플레이트에 연결 된 남아 있어야 한다)를 조심 스럽게 제거. 부드러운 pipetting, 또는 심지어 필요한 경우, 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 근 근이 살아가고에 의해 신선한 37 ° C prewarmed 차별화 미디어의 800 µ L에서 세포를 수집 합니다. 참고: 셀 덩어리는 관찰 하는 경우 40 µ m 셀 스 트레이너를 사용 합니다.</li>
	<li>0.2%를 사용 하 여 hemocytometer 챔버에 Count 셀 Trypan 블루, 제조업체의 지침에 따라.</li>
	<li>실 온에서 차별화 미디어와 원심 분리기 세포, 5 분 300g x 5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>상쾌한 무시 하 고 갓 필터 소독 PBS (25 m m 주사기 필터를 통해 전달) 1, 000 셀 / µ L의 최종 농도에 있는 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>약 수 600 µ L aliquots와 얼음까지 하 고 수술 하는 동안에 계속 이전 세포 현 탁 액.</li>
	<li>30 G 주사기를 사용 하 여 염 분 35 mg/kg 케 타 민 및 5 mg/kg xylazine의 혼합물으로 허벅지에 근육 관리 하 여 동물을 anesthetize. 0.75 %cyclopentolate 및 2.5 %phenylephrine amix 사용 안 하는 국 소 약으로 눈동자를 같은데요. 적절 한 anesthetization 확인 동물 그것의 뒤 다리에 하드 핀치에 반응 하지 않는 경우.</li>
	<li>외과 의사를 직면 하 고 머리와 토끼를 놓습니다. 뚜껑 견인을 사용 하 여 오염 위험을 최소화 하기 위해 살 균 헝겊으로 눈 꺼 풀과 nictitans 멤브레인을 제거. BSS를 사용 하 여 양쪽 눈에 마 취에서 건조를 방지 하기 위해.</li>
	<li>
미세, 2 포트 사용 (또는 옵션 3-포트)에 대 한 25 G transvitreal는 플 기술 단계 1.3과 그림 2에 설명 된 대로 동일한 위치에 배치 하는 trocars와 함께 갈 거 예요. 이전 sclerotomies 표시 되는 경우 단지 인접 trocar 삽입을 수행 하지만 하지 이들을 통해, 수술 후 누설의 위험을 최소화 하기 위해.
	<ol>
<li>눈과 콘택트 렌즈 (그림 1A) 사이의 연락처 젤으로 합성 눈물으로 망막을 시각화 하기 위해 각 막에 단일 사용 평면 콘택트 렌즈를 넣어.</li>
		<li>적절 한 팁 (참조 단계 1.3.5 1.3.6) 위치, 후 부드럽게 혼합 hESC RPE 정지 (50000 셀)의 50 µ L를 subretinally 주사. NaIO3 청소용된 지역 특성 "금속" 엔도 조명 반사에 의해 구별의 센터에 대 한 목표. Neurosensory 망막 명확 하 게 보이는 bleb을 만들기 쉽게 구분 해야 합니다. 플러시 바늘 때문에 셀 막힘을 피하기 위해 사용 토끼/후 살 균 H2O 사이 바늘을 묶습니다. 변경 바늘 막힘 때 것으로 나타났습니다.</li>
		<li>주입, 동안 천천히 바늘을 취소 하지만 팁 역류를 최소화 하기 위해 bleb 내에서 유지 됩니다.</li>
		<li>Endoillumation 및 주입 정 맥의 제거 후, 발톱된 집게를 사용 하 여 trocars를 제거 하 고 30에 대 한 가벼운 압력 끝 이나는 집게의 무뚝뚝한 끝을 사용 하 여 자체 봉인 봉합 덜 sclerotomies s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Post-surgically 10 mL 피하 탈수를 방지 하기 위해 염 분을 제공 합니다. 수술 후 국 소 스테로이드 나 항생제를 주지 않는다. 진통제에 대 한 수술 후 하루 buprenorphine 0.3 mg/ml 피하 후 수술의 0.5 mL를 제공 합니다.</li>
	<li>사용 후, 그들 immersing 몇 초, 첫째로 70% 에탄올에 둘째 45% 에탄올에 의해 모든 악기를 세척 하 고 마지막으로에 증류수. 제대로 종이 수건으로 그들을 건조.</li>
	<li>그들은 충분 한의 식을 회복 하 고 모든 단일 encaged 배치 될 때까지 동물을 참석. (예: immunohistochemistry 목적), 필요한 경우 100 mg/kg pentobarbital에의 정 맥 주입 하 여 동물을 안락사.</li>
</ol>3. Vivo에서 망막 및 Subretinal 이미징
<ol><li>
함께 제공 된 소프트웨어와 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 장치를 사용 하 여 (재료의 표 참조)를 제조업체의 지침에 따라 치료 동물의 횡단면 b-스캔. 이미지 흐림 방지, 매 30-60 s 국 소 염 분으로 홍 조에 의해 각 막 촉촉한을 유지 해야 합니다.
	<ol>
<li>마 취 및 눈동자 크기 동물 (단계 1.1 및 2.10 참조)를 가리지 경로에서 악기 광원 토끼 망막에 조정 산에 놓습니다.</li>
		<li>3 10 월 스캔 동시 적외선 공초점 레이저 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy (IR-cSLO) 반사율 참조 이미지 삽입 된 영역의 상단, 중앙, 및 더 낮은 부분을 나타내는 얻을.</li>
		<li>CSLO 블루와 en 얼굴 저 이미지를 얻을, 녹색, 적외선, 그리고 다 색 레이저 반사율 (즉, 여러 개의 동시 레이저 색상), 각각.</li>
		<li>SD-10 월 장치의 블루 빛 레이저 기능을 사용 하 여 블루 라이트 autofluorescence (BAF) 이미지를 캡처하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Plaza Reyes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-Free+and+Defined+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+Functionally+Integrate+in+a+Large-Eyed+Preclinical+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model.</a> Stem Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Bartuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+Subretinal+Bleb-Induced+Outer+Retinal+Degeneration+in+the+Rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of Subretinal Bleb-Induced Outer Retinal Degeneration in the Rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (4), 2423-2430 (2015).</li>
<li>Petrus-Reurer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Subretinal+Suspension+Transplants+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Retinal+Pigment+Epithelial+Cells+in+a+Large-Eyed+Model+of+Geographic+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Integration of Subretinal Suspension Transplants of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells in a Large-Eyed Model of Geographic Atrophy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1314-1322 (2017).</li>
<li>Carido, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+model+with+complete+RPE+loss+and+its+use+for+RPE+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse model with complete RPE loss and its use for RPE cell transplantation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 5431-5444 (2014).</li>
<li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+phenomenon+of+HESC-derived+RPE%3A+anatomy+of+cell+genesis%2C+expansion+and+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Elucidating the phenomenon of HESC-derived RPE: anatomy of cell genesis, expansion and retinal transplantation.</a> Exp Neurol. 214 (2), 347-361 (2008).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rabbit.</a> Vision Res. 12 (1), 123-138 (1972).</li>
<li>Blanch, R. J., Ahmed, Z., Berry, M., Scott, R. A., Logan, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22603978">Animal models of retinal injury.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 2913-2920 (2012).</li>
<li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li>
</ol>

작가의 아무도 경쟁 관심사 또는 상반 되는 관심사를 있다.

이 프로토콜에서 hESC RPE 통합에서 vivo에서 평가 대 한 조지아와 그것의 임상 사용의 눈이 큰 모델의 생성을 설명 합니다.
번역에 대 한 재생 치료의 조지아 및 관련된 질병에 대 한 클리닉7에, 그것은 개발 하 고 충실 하 게 이식 및 이미징에 대 한 임상 메서드를 캡처하는 방법을 최적화 하는 것이 중요. 매력적인이 측면에서 토끼가: 비교적 큰 눈 안 구내 수술 및 표준 이미징의 사용을 허용 하 고 저렴 하 고 쉽게 지 내게 다른 눈이 큰 동물에 비해입니다.
우리는 하위 망막 blebs 하위 망막 손상을 유발 하거나 이식 hESC RPE의 창조에 대 한 표준 transvitreal 25 게이지 동위 플 vitrectomy 기술의 사용을 설명 합니다. 그림 1B에 나와 있는 경우는 vitrectomy 절차 동안 ...

이 프로토콜 subretinal 공간에 이식된 hESC RPE의 통합의 평가 허용 하는 지리적 위축 (GA)의 큰 눈이 전 임상 모델의 생성을 설명 합니다. 여기에 설명 된 방법은 hESC1, 외부 망막 손상 및 GA 같은 표현 형의 창조에서 RPE 세포의 풍부한, 순수, 고 기능 인구 생산을 보여 주는 3 최근 출판물에 사용 된 생리 소금 솔루션 (즉, BSS와 PBS) 또는 토끼 눈2,3NaIO3 의 subretinal 주입에 의해 유도. 우리 hESC RPE의 하위 망막 정지 이식 포토 리셉터 구조 용량2광범위 한 기능 monolayers 형태로 입증 되었습니다.
몇 가지 장점이 동반 질병의 조지아 모델의 생성에 대 한 토끼 눈의 사용. 첫째, 크기 토끼 눈의 70%는 성인 인간의 눈의 볼륨은, 일상적으로 사용 하는 작은 설치류 눈 (1000 셀 / µ L 대 50, 000 셀 / µ L)4 보다 훨씬 낮은 세포 밀도 사용 하 여 임상적으로 의미 있는 이식 수 , 5. 둘째, 설치류에 수술은 일반적으로 맥락 막의, 망막 장벽을 타협 하 고 잠재적으로 염증 반응과 가능한 거부6을 통해 transscleral. 두 요소는 함께 multilayering와 이식된 세포와 방해 네이티브 망막 조직에 이식된 세포의 전반적인 가난한 통합의 응집을 발생할 수 있습니다. 그러나, 큰 눈 토끼 모델 계측 임상 설정으로 동일과 수술 기법을 수행할 수 있습니다. 셋째, 눈이 큰 모델도 고해상도 허용 vivo에서 이미징 및 이식된 세포와 시간1,2,3overlying 망막의 모니터링 합니다. 따라서, 우리는 정상 및 병에 걸리는 망막과 망막 하 공간의 연구에 관심을 가진 사람에 대 한 설치류에 매력적인 대안이 되어야 임상적으로 적절 하 고 비용 효율적인 전 임상 모델을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>NutriStem hESC XF 분화 배지 &ndash; bFGF 및 &ndash; TGFb</td><td>Biological Industries</td><td>06-5100-01-1A</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 1x</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>PBS without Ca2+ and Mg2+</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific Corp</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 40 &mu; m 나일론</td><td>VWR</td><td>732-2757</td><td></td></tr><tr><td>바늘 30 G 0.5' &rsquo;; 0.3mm x 13mm</td><td>BD Microlance</td><td>304827</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25mm 주사기 필터</td><td>Acrodisc</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 트리판 블루</td><td>ThermoFisher Scientific Corp</td><td>15250061</td><td>0.2%</td></tr><tr><td>NaIO에서 사용 3</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>S4007</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>65079550</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>Solveco AB</td><td>1047</td><td></td></tr><tr><td>케타미놀, 100mg/mL</td><td>인터벳, Boxmeer</td><td>511519</td><td>35mg/kg 케타민</td></tr><tr><td>Rompun 수의사, 20mg/mL</td><td>Bayer Animal Health</td><td>22545</td><td>5mg/kg 자일라진</td></tr><tr><td>트리에스센스 사용, 40mg/mL</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td></td><td>412915 2mg 유리체내</td></tr><tr><td>사이클로펜톨라트-페닐에프린, 0.75% + 2.5%</td><td>APL</td><td>321968</td><td>각 눈에</td></tr> <tr>1방울 사용<td>Viscotears</td><td>Laboratoires Th&eacute; 597562</td><td></td><td></td></tr><tr><td>국소 식염수</td><td>Apotea AB</td><td>7053249369080</td><td></td></tr><tr><td>Allfatal vet. 100 mg/mL</td><td>Omnidea</td><td>77168</td><td>100 mg/mL 펜토바르비탈</td></tr><tr><td>확장 튜브 사용(해머)</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3223</td><td></td></tr><tr><td>25 G/38 G 폴리팁 망막하 캐뉼라</td><td>MedOne Surgical Inc</td><td>3219</td><td>25 G/38 G</td></tr><tr><td>일회용 평면 렌즈</td><td>Volk</td><td></td><td></td>#VWFD10</tr><tr><td>Barraquer Colibri 뚜껑 견인</td>기 <td>AgnTho's AB</td><td>42-020-030</td><td></td></tr><tr><td>밸브가 없는 투관침</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751448</td><td></td></tr><tr><td>발톱 집게 집게</td><td>Bausch & Lomb Nordic AB</td><td>ET1811</td><td></td></tr><tr><td>Alcon Accurus 400VS 유리체 절제술 기계</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065740238</td><td></td></tr><tr><td>Accurus 25+ 게이지 유리체 절제술 TotalL Plus Pak</td><td>Alcon Nordic A/S</td><td>8065751493</td><td></td></tr><tr><td>SD-OCT 장치</td><td>하이델베르크 엔지니어링</td><td>Spectralis HRA+OCT</td><td>하이델베르크 아이 익스플로러 버전 1.9.10.0</td></tr><tr><td>사용 24웰 플레이트</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 혈구계</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>뉴질랜드 알비노 토끼</td><td>Lidk&ouml; pings Rabbit Farm, Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hESC-RPE 세포</td><td></td><td></td><td>참조 번호 참조 1</td></tr><tr><td>Buprenodale Vet, 0.3 mg/ml</td><td>Dechra</td><td>660500</td><td>0.5 mL 부프레노르핀 피하 사용</td></tr></tbody></table>

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

지리적 위축 (GA), 건조 연령 관련 황 반 변성의 늦은 단계는 망막 안료 상피 (RPE) 계층, 중요 한 망막 구조 (예를 들면, 대뇌)의 후속 퇴보로 연결의 손실에 의해 특징은 발생 심한 시력 장애입니다. 마찬가지로, RPE 손실 및 시력 감소는에서 보인다 장기 따라 최대 intravitreal 항 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF) 치료를 받고 고급 젖은 연령 관련 황 반 변성 (AMD)과 환자의. 따라서, 한편으로, 그것은 근본적인 RPE 세포 대체 요법으로 사용할 수 있는 무제한 소스에서 효율적으로 파생. 다른 한편으로, 동작 및 질병 반하는의 모델에서 파생 된 셀의 통합 수술을 평가 하는 것이 중요 하다 고 이미징 방법으로 인 간에 적용 된 수로 닫습니다. 여기, 우리 제공 조지아의 전 임상 모델의 생성을 설명 하는 우리의 이전 간행물에 따라 상세한 프로토콜 흰둥이 토끼 눈을 사용 하 여 인간 배아 줄기 세포의 평가 파생 된 망막 색소 상피 세포 (hESC-RPE) 대에 임상 관련 설정입니다. 차별화 된 hESC RPE는 순진한 눈 또는 NaIO3눈에 이식-25 G transvitreal 동위 플 기술을 사용 하 여가 같은 망막 변성을 유도. 퇴 화와 이식 분야의 평가 복합 고해상도 비-침략 적 실시간 이미징에 의해 수행 됩니다.

BAF, IR-cSLO, 및 정상적인 흰둥이 토끼 망막의 SD-10 월의 대표 vivo에서 이미지 그림 2에 표시 됩니다. 빛의 반사 SD 10 월 악기에 의해 점령의 그들의 독특한 레벨 다른 망막 층 note
그림 1A , 그림 1B하위 망막 blebs 만들려면 설치 설명 된다: 쓰는 렌즈를 피하기 위하여 3 trocars (그림 1B) limbus까지 1-2 m m의 삽입을 허용 하도록 눈 뚜껑으로 뚜껑 견인 위치 터치, 그리고 30-45 ˚ limbus 병렬 각도에서. Trocars는 선택적 주입 정 빛, 및 공 막 엔 통해 주사 ...

망막 색소 상피 세포 건조 연령 관련 황 반 변성의 고급 형태에 대 한 세포 보충 치료 될 수 있습니다. 이 프로토콜 지리적 위축의 눈이 큰 모델 및 질병의이 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식의 생성을 설명합니다.

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

이 절차의 전반적인 목표는 지리적 위축의 큰 눈 동물 모델을 만들어 인간 배아 유래 망막 색소 상피 세포를 눈에 이식하고 광 간섭 단층 촬영을 사용하여 기증자 세포 통합을 평가하는 것입니다. 이 방법은 퇴행성 질환에 대한 줄기세포 기반 치료와 같은 재생 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 수술 환경의 주요 장점은 건강한 세포를 무제한으로 얻을 수 있고 환자를 대상으로 하는 절차와 많은 유사점이 있는 망막하 주사를 위한 수술 환경입니다.이 기술의 의미는 인간 배아 줄기 세포에서 유래한 망막 색소 상피 세포의 과시를 통한 노화 관련 황반 변성 치료로 확장됩니다. 동물 기술자인 Monica Aronsson은 광간섭 단층 촬영으로 망막을 시각화하고 이미지화할 수 있도록 토끼의 위치를 잡고 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 토끼를 마취한 후 머리가 외과의를 향하도록 토끼를 수술용 현미경 아래에 놓습니다.그런 다음 뚜껑 견인기를 사용하여 눈꺼풀을 제거하고 멸균 천을 사용하여 nictitans 막을 제거합니다. 미세 수술의 경우, 미세 수술 기구를 삽입하기 위해 밸브가 없는 투관침과 함께 2포트 또는 옵션인 3포트 25게이지 transvitreal pars plana 기술을 사용하십시오. 다기능 유리체 절제술기에는 주입 캐뉼라, 내비조명, 유리체 교정기 및 내시레이저를 연결할 수 있는 포트가 있습니다.망막하 주사의 경우, 내시계측(endoillumination)만 필수이므로 2포트 설정으로 충분합니다. 응고 집게를 사용하여 결막을 잡고 옮기고 삽입 부위를 덮습니다. 윤부에서 1-2mm 떨어진 두 개의 상부 투관침 중 하나를 30-45도 변부 평행 각도로 경상으로 삽입합니다.팁 중앙에 투관침을 삽입하십시오. 그런 다음 투관침을 90도 돌려 후극을 조준하여 눈으로 전진시킵니다. 이렇게 하면 이 경화절개술로 인한 수술 후 누출을 방지하고 안구내염의 위험도 줄일 수 있습니다.두 번째 위쪽 투관침으로 반복합니다. 투관침을 삽입할 때 윤부에서 1-2mm 떨어져 삽입물을 터널을 뚫고 후극을 조준하여 감염, 유리체 출혈, 망막 박리 및 렌즈 접촉의 위험을 최소화하는 것이 중요합니다. 합성 눈물을 수축 젤로 각막에 바르고 각막에 일회용 평면 콘택트렌즈를 삽입하여 망막을 시각화합니다.다음으로, 500마이크로리터의 요오드산나트륨을 조수가 조작하는 연장 튜브와 외과의가 조작하는 38게이지 폴리 팁 캐뉼라에 연결된 1밀리리터 주사기에 떨어뜨립니다. 왼쪽 상단 투관침을 통해 내광 프로브를 삽입합니다. 그런 다음 오른쪽 상단 투관침을 통해 주입 캐뉼라를 삽입하고 시신경 머리 바로 아래 영역을 목표로 유리체 공간을 통해 망막을 향해 캐뉼라를 전진시킵니다.국소 미백이 보일 때까지 캐뉼라의 끝이 망막에 천천히 닿도록 합니다. 캐뉼라가 망막을 관통하지 않도록 하면 출혈이 발생할 수 있습니다. 이제 바늘로 망막을 관통하여 50 마이크로 리터의 요오드산 나트륨을 5 초 동안 망막하 주사합니다.망막과 기저 맥락막 사이에는 자연적인 분열면이 있기 때문에 주입 중에 명확하게 보이는 반투명 bleb가 점차적으로 형성되어야 합니다. 주입하는 동안 바늘을 천천히 집어넣되 역류를 최소화하기 위해 팁이 흠집 내에서 유지되는지 확인하십시오. 내경 및 주입 캐뉼라를 제거한 후 응고 집게를 사용하여 투관침을 제거합니다.그런 다음 집게의 끝이나 뭉툭한 끝을 사용하여 연봉합 봉합사 무경화술에 30초 동안 가벼운 압력을 가합니다. 회복하는 동안 텍스트 프로토콜에 따라 동물을 돌보고 이식을 위해 7일을 기다립니다. 요오드산나트륨 주입 후 7일 및 유리체강내 트리암시놀론 투여 후 텍스트 프로토콜에 따라 24웰 융합 hESC-RPE 단층에서 세포 분화 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 500마이크로리터를 사용하여 각 웰을 세척합니다.세포를 트립신화한 후 플레이트를 기울이고 트립신을 조심스럽게 제거하여 세포가 플레이트에 부착된 상태를 유지할 수 있도록 합니다. 섭씨 37도의 신선한 예열 분화 배지 800마이크로리터에 부드럽게 피펫팅하거나 필요한 경우 긁어내어 단일 세포 현탁액을 얻어 세포를 수집합니다. zero point 2 percent trypan blue를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 혈구계 챔버의 세포를 계수합니다.그런 다음 세포 현탁액에 5ml의 분화 배지를 추가하고 실온에서 5분 동안 300배 g으로 세포를 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 마이크로리터당 1,000개 세포의 최종 농도로 갓 여과한 멸균된 PBS에 다시 현탁시킵니다. 이전 세포 현탁액을 600마이크로리터 분취액으로 분취하고 수술 전과 수술 중에 얼음 위에 보관합니다.텍스트 프로토콜에 따라 토끼를 마취하고 동공을 확장한 후 토끼의 머리가 외과의를 향하도록 놓습니다. 뚜껑 견인기를 사용하여 눈꺼풀을 제거하고 멸균 천을 사용하여 nictitans 멤브레인을 제거합니다. 미세 수술의 경우, 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것과 동일한 위치에 투관침을 배치하는 2포트 또는 옵션인 3포트 25게이지 transvitreal pars plana 기술을 사용합니다.이전 경화절제술이 보이는 경우, 이러한 삽입 부위를 통하지 않고 바로 인접하여 투관침 삽입을 수행하여 수술 후 누출의 위험을 최소화합니다. 이전과 같이 인조눈물을 눈에 바르고 각막의 용액 위에 일회용 평면 콘택트렌즈를 놓아 망막을 시각화합니다. 팁을 적절하게 배치하고 특징적인 금속 내시막 반사로 구별되는 요오드산나트륨 전처리 영역의 중심을 조준한 후 부드럽게 혼합된 hESC-RPE 현탁액 50마이크로리터를 망막하 주입합니다.신경감각 망막은 쉽게 분리되어 명확하게 보이는 기포를 만들어야 합니다. 주사하는 동안 바늘을 천천히 집어넣되 역류를 최소화하기 위해 팁이 블렙 내에 유지되는지 확인하십시오. 내비루미네이션 및 주입 캐뉼라를 제거한 후 응고 집게를 사용하여 투관침을 제거하고 집게의 뭉툭한 끝을 사용하여 이전과 같이 30초 동안 가벼운 압력을 가합니다.제조업체의 지침에 따라 스펙트럼 도메인 광 간섭 단층 촬영(SD-OCT) 장치를 함께 제공되는 소프트웨어와 함께 사용하여 처리된 동물의 단면 B 스캔을 얻습니다. 마취 및 동공 확장 동물을 조정 가능한 마운트에 놓아 기구 광원에서 토끼 망막까지 장애물 없는 경로를 얻습니다. 이미지가 흐려지는 것을 방지하려면 30-60초마다 국소 식염수로 씻어내어 각막을 촉촉하게 유지하십시오.동시 적외선 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경 또는 주입된 영역의 상부, 중앙 및 하부를 나타내는 컨포칼 SLO 반사 참조 이미지로 최소 3개의 OCT 스캔을 얻습니다. 컨포칼 SLO 블루, 그린, 적외선 및 다색 레이저 반사율을 가진 en-face 안저 이미지의 여러 동시 레이저 색상을 얻을 수 있습니다. SD-OCT 장치의 청색광 레이저 기능을 사용하여 청색광 자가형광 이미지를 캡처합니다.정상 알비노 토끼 망막의 BAF, IR-cSLO 및 SD-OCT의 대표적인 생체 내 이미지가 여기에 나와 있습니다. SD-OCT 이미지를 확대하면 SD-OCT 기기가 포착한 독특한 수준의 빛 반사를 통해 다양한 망막층을 볼 수 있습니다. 이 SD-OCT 이미지에서 볼 수 있듯이, 50마이크로리터의 요오드산나트륨 용액 50마이크로리터를 주입한 후 3개월 후에 촬영한 결과, 외부 망막을 분해하고 점진적으로 퇴화시키는 기포가 생성됩니다.RPE 손실에 해당하는 SD-OCT 및 hypo-BAF 영역에서 가장 바깥쪽 신경망막층의 얇아짐을 관찰할 수 있으며, 이를 통해 GA와 유사한 표현형을 재현할 수 있습니다. 손상 부위가 확인되면 이식을 위해 50,000개의 hESC-RPE 세포를 다시 주입하여 두 번째 bleb를 생성했습니다. 경증에서 중등도의 hyper-BAF 영역은 손상 영역의 경계선에 국소적으로 증가된 hyper-BAF와 함께 존재하며, 이는 천연 RPE의 만성 스트레스를 나타냅니다.전처리되지 않은 눈에 hESC-RPE를 주입한 것에 해당하는 bleb는 MC 이미지에서 색소 세포의 패치를 보여주고 SD-OCT 스캔에서 잘 보존된 망막 구조를 보여줍니다. 망막하 주사를 위한 이 멋진 임상 방법을 마스터하면 노화 관련 황반 변성과 같은 상태에 대한 세포 기반 치료의 임상 이식을 용이하게 할 것입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 생명형 모델에서 망막하 주사를 설정하는 방법, 망막하 주사를 위해 인간 배아 줄기 세포 유래 세포를 준비하는 방법, 광간섭 단층촬영을 사용하여 기증자 세포의 통합을 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

세포 이식은 광수용체 손실을 특징으로 하는 망막 변성의 치료를 위한 전략을 나타낸다. 여기에서 우리는 이식 가능한 광수용체의 농축 및 성인 마우스로그들의 감하 이식을 위한 방법을 기술합니다.

성인 마우스 망막으로 MACS 정제 광수용체 전구체 세포의 감하 이식

여기에서 우리는 쥐와 생쥐에 RPE 세포 덩어리를 망막하 주입하기 위한 멀티미디어 형식의 커뮤니티 승인 프로토콜을 제시합니다. 이 접근 방식은 망막 변성의 동물 모델에 이식할 때 이식된 RPE 세포의 구조 가능성, 안전성 프로필 및 생존 능력을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서스펜션에 망막 색소 상피 세포를 제공하기 위해 설치류에서 망막 주사를 수행

망막 색소 상피 (RPE) 대체 전략 및 유전자 기반 치료는 여러 망막 퇴행성 조건이 고려된다. 임상 번역, 큰 눈 동물 모델은 환자에 적용 할 수있는 수술 기법을 연구해야합니다. 여기에서 우리는 다양하고 비용 효율적인 RPE 이식에 맞 망막 수술 토끼 모델을 제시한다.

토끼의 망막 수술에 대한 단계 프로토콜에 의해 단계

Subretinal 주입은 나이 관련 황 반 변성에 대 한 줄기 세포 대체 요법의 전 임상 연구에 널리 적용 되었다. 이 시각화 된 문서에서는, 우리 쥐 눈 세포를 제공 하는 트랜스 scleral 접근을 통해 덜 위험 하 고, 재현 고 정확 하 게 수정 subretinal 주입 기술을 설명 합니다.

쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

망막 조직을 인간의 양수 막과 동물 모델에 이식의 준비 위에 경작 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 망막 색소 상피 세포의 구성 하는 방법을 설명 합니다.

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

여기서는 인간 만능줄기세포(hPSC) 유래 망막 조직을 대형 동물 모델의 망막하 공간에 이식하는 수술 기법을 제시합니다.

고양이과 거대 동물 모델에서 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 조직의 망막하 이식

비인간 영장류 (NHP)는 해부학적 및 유전적 유사성으로 인해 인간의 망막 세포 치료법을 연구하기위한 이상적인 모델입니다. 이 원고는 NHP 눈의 망막 색소 상피 세포의 피하 학적 이식 방법과 황반 조작과 관련된 수술 내 합병증을 방지하기위한 전략을 설명합니다.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

이 프로토콜은 망막 변성이 있거나 없는 마우스 수용자에서 수술 합병증 발생률이 낮은 망막하 세포 이식편을 안전하고 정확하게 전달하기 위한 동공 시야 유도 경공막 접근법을 제시합니다.

망막 변성 마우스 모델에서 망막하 이식편의 Transpupillary-Guided Trans-Scleral Transplantation

동결 보존 후 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조 및 rd10 마우스에서 이러한 세포의 망막하 전달에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달

인간의 배아 줄기 (ES) 세포의 전파

학습하세요 지리적 위축의 큰 눈 모델에서 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식 및 광학 일관성 단층 촬영을 통한 세포 통합 평가 방법. 이 기술은 재생 의학 연구에 활용됩니다.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

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