지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

이 절차의 전반적인 목표는 지리적 위축의 큰 눈 동물 모델을 만들어 인간 배아 유래 망막 색소 상피 세포를 눈에 이식하고 광 간섭 단층 촬영을 사용하여 기증자 세포 통합을 평가하는 것입니다. 이 방법은 퇴행성 질환에 대한 줄기세포 기반 치료와 같은 재생 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 수술 환경의 주요 장점은 건강한 세포를 무제한으로 얻을 수 있고 환자를 대상으로 하는 절차와 많은 유사점이 있는 망막하 주사를 위한 수술 환경입니다.

이 기술의 의미는 인간 배아 줄기 세포에서 유래한 망막 색소 상피 세포의 과시를 통한 노화 관련 황반 변성 치료로 확장됩니다. 동물 기술자인 Monica Aronsson은 광간섭 단층 촬영으로 망막을 시각화하고 이미지화할 수 있도록 토끼의 위치를 잡고 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 토끼를 마취한 후 머리가 외과의를 향하도록 토끼를 수술용 현미경 아래에 놓습니다.

그런 다음 뚜껑 견인기를 사용하여 눈꺼풀을 제거하고 멸균 천을 사용하여 nictitans 막을 제거합니다. 미세 수술의 경우, 미세 수술 기구를 삽입하기 위해 밸브가 없는 투관침과 함께 2포트 또는 옵션인 3포트 25게이지 transvitreal pars plana 기술을 사용하십시오. 다기능 유리체 절제술기에는 주입 캐뉼라, 내비조명, 유리체 교정기 및 내시레이저를 연결할 수 있는 포트가 있습니다.

망막하 주사의 경우, 내시계측(endoillumination)만 필수이므로 2포트 설정으로 충분합니다. 응고 집게를 사용하여 결막을 잡고 옮기고 삽입 부위를 덮습니다. 윤부에서 1-2mm 떨어진 두 개의 상부 투관침 중 하나를 30-45도 변부 평행 각도로 경상으로 삽입합니다.

팁 중앙에 투관침을 삽입하십시오. 그런 다음 투관침을 90도 돌려 후극을 조준하여 눈으로 전진시킵니다. 이렇게 하면 이 경화절개술로 인한 수술 후 누출을 방지하고 안구내염의 위험도 줄일

두 번째 위쪽 투관침으로 반복합니다. 투관침을 삽입할 때 윤부에서 1-2mm 떨어져 삽입물을 터널을 뚫고 후극을 조준하여 감염, 유리체 출혈, 망막 박리 및 렌즈 접촉의 위험을 최소화하는 것이 중요합니다. 합성 눈물을 수축 젤로 각막에 바르고 각막에 일회용 평면 콘택트렌즈를 삽입하여 망막을 시각화합니다.

다음으로, 500마이크로리터의 요오드산나트륨을 조수가 조작하는 연장 튜브와 외과의가 조작하는 38게이지 폴리 팁 캐뉼라에 연결된 1밀리리터 주사기에 떨어뜨립니다. 왼쪽 상단 투관침을 통해 내광 프로브를 삽입합니다. 그런 다음 오른쪽 상단 투관침을 통해 주입 캐뉼라를 삽입하고 시신경 머리 바로 아래 영역을 목표로 유리체 공간을 통해 망막을 향해 캐뉼라를 전진시킵니다.

국소 미백이 보일 때까지 캐뉼라의 끝이 망막에 천천히 닿도록 합니다. 캐뉼라가 망막을 관통하지 않도록 하면 출혈이 발생할 수 있습니다. 이제 바늘로 망막을 관통하여 50 마이크로 리터의 요오드산 나트륨을 5 초 동안 망막하 주사합니다.

망막과 기저 맥락막 사이에는 자연적인 분열면이 있기 때문에 주입 중에 명확하게 보이는 반투명 bleb가 점차적으로 형성되어야 합니다. 주입하는 동안 바늘을 천천히 집어넣되 역류를 최소화하기 위해 팁이 흠집 내에서 유지되는지 확인하십시오. 내경 및 주입 캐뉼라를 제거한 후 응고 집게를 사용하여 투관침을 제거합니다.

그런 다음 집게의 끝이나 뭉툭한 끝을 사용하여 연봉합 봉합사 무경화술에 30초 동안 가벼운 압력을 가합니다. 회복하는 동안 텍스트 프로토콜에 따라 동물을 돌보고 이식을 위해 7일을 기다립니다. 요오드산나트륨 주입 후 7일 및 유리체강내 트리암시놀론 투여 후 텍스트 프로토콜에 따라 24웰 융합 hESC-RPE 단층에서 세포 분화 배지를 제거하고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 500마이크로리터를 사용하여 각 웰을 세척합니다.

세포를 트립신화한 후 플레이트를 기울이고 트립신을 조심스럽게 제거하여 세포가 플레이트에 부착된 상태를 유지할 수 있도록 합니다. 섭씨 37도의 신선한 예열 분화 배지 800마이크로리터에 부드럽게 피펫팅하거나 필요한 경우 긁어내어 단일 세포 현탁액을 얻어 세포를 수집합니다. zero point 2 percent trypan blue를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 혈구계 챔버의 세포를 계수합니다.

그런 다음 세포 현탁액에 5ml의 분화 배지를 추가하고 실온에서 5분 동안 300배 g으로 세포를 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 마이크로리터당 1,000개 세포의 최종 농도로 갓 여과한 멸균된 PBS에 다시 현탁시킵니다. 이전 세포 현탁액을 600마이크로리터 분취액으로 분취하고 수술 전과 수술 중에 얼음 위에 보관합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 토끼를 마취하고 동공을 확장한 후 토끼의 머리가 외과의를 향하도록 놓습니다. 뚜껑 견인기를 사용하여 눈꺼풀을 제거하고 멸균 천을 사용하여 nictitans 멤브레인을 제거합니다. 미세 수술의 경우, 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것과 동일한 위치에 투관침을 배치하는 2포트 또는 옵션인 3포트 25게이지 transvitreal pars plana 기술을 사용합니다.

이전 경화절제술이 보이는 경우, 이러한 삽입 부위를 통하지 않고 바로 인접하여 투관침 삽입을 수행하여 수술 후 누출의 위험을 최소화합니다. 이전과 같이 인조눈물을 눈에 바르고 각막의 용액 위에 일회용 평면 콘택트렌즈를 놓아 망막을 시각화합니다. 팁을 적절하게 배치하고 특징적인 금속 내시막 반사로 구별되는 요오드산나트륨 전처리 영역의 중심을 조준한 후 부드럽게 혼합된 hESC-RPE 현탁액 50마이크로리터를 망막하 주입합니다.

신경감각 망막은 쉽게 분리되어 명확하게 보이는 기포를 만들어야 합니다. 주사하는 동안 바늘을 천천히 집어넣되 역류를 최소화하기 위해 팁이 블렙 내에 유지되는지 확인하십시오. 내비루미네이션 및 주입 캐뉼라를 제거한 후 응고 집게를 사용하여 투관침을 제거하고 집게의 뭉툭한 끝을 사용하여 이전과 같이 30초 동안 가벼운 압력을 가합니다.

제조업체의 지침에 따라 스펙트럼 도메인 광 간섭 단층 촬영(SD-OCT) 장치를 함께 제공되는 소프트웨어와 함께 사용하여 처리된 동물의 단면 B 스캔을 얻습니다. 마취 및 동공 확장 동물을 조정 가능한 마운트에 놓아 기구 광원에서 토끼 망막까지 장애물 없는 경로를 얻습니다. 이미지가 흐려지는 것을 방지하려면 30-60초마다 국소 식염수로 씻어내어 각막을 촉촉하게 유지하십시오.

동시 적외선 컨포칼 스캐닝 레이저 검안경 또는 주입된 영역의 상부, 중앙 및 하부를 나타내는 컨포칼 SLO 반사 참조 이미지로 최소 3개의 OCT 스캔을 얻습니다. 컨포칼 SLO 블루, 그린, 적외선 및 다색 레이저 반사율을 가진 en-face 안저 이미지의 여러 동시 레이저 색상을 얻을 수 있습니다. SD-OCT 장치의 청색광 레이저 기능을 사용하여 청색광 자가형광 이미지를 캡처합니다.

정상 알비노 토끼 망막의 BAF, IR-cSLO 및 SD-OCT의 대표적인 생체 내 이미지가 여기에 나와 있습니다. SD-OCT 이미지를 확대하면 SD-OCT 기기가 포착한 독특한 수준의 빛 반사를 통해 다양한 망막층을 볼 수 있습니다. 이 SD-OCT 이미지에서 볼 수 있듯이, 50마이크로리터의 요오드산나트륨 용액 50마이크로리터를 주입한 후 3개월 후에 촬영한 결과, 외부 망막을 분해하고 점진적으로 퇴화시키는 기포가 생성됩니다.

RPE 손실에 해당하는 SD-OCT 및 hypo-BAF 영역에서 가장 바깥쪽 신경망막층의 얇아짐을 관찰할 수 있으며, 이를 통해 GA와 유사한 표현형을 재현할 수 있습니다. 손상 부위가 확인되면 이식을 위해 50,000개의 hESC-RPE 세포를 다시 주입하여 두 번째 bleb를 생성했습니다. 경증에서 중등도의 hyper-BAF 영역은 손상 영역의 경계선에 국소적으로 증가된 hyper-BAF와 함께 존재하며, 이는 천연 RPE의 만성 스트레스를 나타냅니다.

전처리되지 않은 눈에 hESC-RPE를 주입한 것에 해당하는 bleb는 MC 이미지에서 색소 세포의 패치를 보여주고 SD-OCT 스캔에서 잘 보존된 망막 구조를 보여줍니다. 망막하 주사를 위한 이 멋진 임상 방법을 마스터하면 노화 관련 황반 변성과 같은 상태에 대한 세포 기반 치료의 임상 이식을 용이하게 할 것입니다. 이 동영상을 시청한 후에는 생명형 모델에서 망막하 주사를 설정하는 방법, 망막하 주사를 위해 인간 배아 줄기 세포 유래 세포를 준비하는 방법, 광간섭 단층촬영을 사용하여 기증자 세포의 통합을 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.